CN116448637A - 一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境污染物检测技术领域，具体涉及一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，本方法采用烷基硫醇修饰且粒径小于30 nm的金纳米颗粒作为标记物，通过暗场显微成像技术对纳米塑料进行检测，可以实现对尺寸小于100 nm的纳米塑料进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染物检测技术领域，具体涉及一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法。
背景技术
微塑料是指直径小于5 mm的塑料颗粒或碎片，作为一种新污染物，近年来由其带来的环境污染问题已经引起了广泛的关注。从来源上讲，微塑料可以分为原生微塑料和次生微塑料。原生微塑料是指人们生产生活中直接排入环境中的微塑料颗粒，次生微塑料是指塑料垃圾在物理、化学及微生物作用后发生分解而形成的微塑料颗粒。微塑料具有大的比表面积和亲脂性，易在环境中富集重金属和有机物，其会造成土壤、水体、大气环境和食物链的污染，增大环境污染治理的成本和难度，建立有效的方法对微塑料进行检测分析是非常重要的。目前，对于微塑料的检测方法主要有裂解气质联用（Py-GC-MS）、傅里叶变换红外光谱法和拉曼光谱法，然而，上述方法能检测到的微塑料的尺寸主要在1-20 μm，而对于尺寸更小的纳米塑料（1-100 nm）进行检测难以实现。
近年来，暗场显微镜成像技术引起了科研工作者的广泛关注，暗场显微镜又称暗视野显微镜，暗场显微镜是利用斜射照明法阻挡透过标本细节的直射光，以反射光和衍射光来观察样本。采用暗场显微镜可以检测到贵金属纳米颗粒的散射光，该散射光的强度和颜色与贵金属纳米颗粒的类型和尺寸大小是相关的。目前，暗场显微成像方法已经被广泛用于对多种目标物的检测，而针对纳米塑料的暗场显微成像识别检测方法尚未见公开报道，因此，有必要提供一种采用暗场显微成像技术对纳米塑料进行精准分析的检测方法。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有适用于准确检测纳米塑料的暗场显微成像识别检测方法的缺陷，从而提供一种改性金颗粒标记的暗场显微成像技术检测纳米塑料的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，包括：
获取不同浓度的纳米塑料标准溶液和烷基硫醇修饰的金纳米颗粒；
将烷基硫醇修饰的金纳米颗粒溶于溶剂制得金颗粒溶液并与不同浓度的纳米塑料标准溶液混合制得混合溶液，再通过暗场显微镜对混合溶液中的烷基硫醇修饰的金纳米颗粒进行成像检测并采集暗场图像，获取散射斑点的数量与混合溶液中纳米塑料浓度之间的关系；
将纳米塑料待测液与金颗粒溶液混合，采用暗场显微镜进行成像检测并采集暗场图像，得到散射斑点的数量，根据散射斑点的数量与混合溶液中纳米塑料浓度之间的关系计算得到纳米塑料待测液中的纳米塑料浓度；
所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸小于30 nm。
优选的，所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸为8-12 nm；
和/或，所述纳米塑料的尺寸为30-50 nm。
优选的，所述烷基硫醇为1-癸硫醇、1-辛硫醇、1-庚硫醇；
和/或，所述混合为等体积混合。
优选的，所述纳米塑料为聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的至少一种。
优选的，所述金颗粒溶液的浓度为1.4-2.5 nmol/L；
和/或，所述溶剂为无水乙醇。
优选的，所述纳米塑料标准溶液的溶剂为甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮中的至少一种；
和/或，所述纳米塑料待测液的溶剂为甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮中的至少一种。
优选的，所述散射斑点的数量通过ImageJ软件进行统计分析。
优选的，所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的获取过程为：将氯金酸溶液与四辛基溴化铵溶液进行混合处理，随后静置分离出有机相，再加入烷基硫醇、硼氢化钠水溶液进行反应制得。
优选的，所述氯金酸、四辛基溴化铵、烷基硫醇和硼氢化钠的体积比为（10-30）：（20-60）：（0.1-0.3）：（5-20）。
优选的，所述四辛基溴化铵溶液的浓度为0.5 mmol/L；
和/或，所述四辛基溴化铵溶液的溶剂为甲苯；
和/或，所述氯金酸溶液的浓度为0.1 mmol/L；
和/或，所述氯金酸溶液的溶剂为超纯水；
和/或，所述硼氢化钠水溶液的浓度为5 mmol/L。
优选的，所述混合处理的时长为30-60 min；
和/或，所述反应的时长为6-10 h；
和/或，所述反应后还进行静置并分离有机相、旋蒸、洗涤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1．一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，包括：获取不同浓度的纳米塑料标准溶液和烷基硫醇修饰的金纳米颗粒；将烷基硫醇修饰的金纳米颗粒溶于溶剂中并与不同浓度的纳米塑料标准溶液混合制得混合溶液，再通过暗场显微镜对混合溶液中的烷基硫醇修饰的金纳米颗粒进行成像检测并采集暗场图像，获取散射斑点的数量与纳米塑料浓度之间的关系；将纳米塑料待测液与金颗粒溶液混合，采用暗场显微镜进行成像检测并采集暗场图像，得到散射斑点的数量，根据散射斑点的数量与纳米塑料浓度之间的关系计算得到纳米塑料待测液中的纳米塑料浓度；所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸小于30 nm。暗场显微镜只能检测到尺寸在30 nm以上的金颗粒的散射光，检测不到单分散的尺寸小于30 nm的金颗粒的散射光，本方法的烷基硫醇修饰的金纳米颗粒具有疏水性，可以与疏水的纳米塑料发生疏水相互作用，从而标记到纳米塑料的表面，进而形成较大的纳米塑料-金颗粒聚集体，该聚集体可以产生较强的散射光斑点，纳米塑料的浓度越高，形成的散射光斑点的数量也越多，根据散射光斑点的数量与纳米塑料浓度的定量关系，从而实现对纳米塑料的灵敏检测。
2．在本发明提供的改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法中，烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸为8-12 nm，检测纳米塑料的尺寸为30-50 nm，当纳米塑料的尺寸较小（小于30 nm）时，结合到纳米塑料上的金颗粒数量比较少，不能形成散射光斑，当纳米塑料的尺寸较大（大于50 nm）时，结合到纳米塑料上的金颗粒数量比较多，形成非常大的聚集体，形成的散射光斑强度较大，但是散射光斑数量减少了，也不能用于对纳米塑料的定量检测，当纳米塑料的尺寸在30-50 nm时，结合到纳米塑料上的金颗粒的数量比较适中，可以形成均匀的纳米塑料-金颗粒聚集体，在暗场显微镜下检测到散射光斑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒的透射电镜图；
图2是本发明实施例1中1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒的粒径分布图；
图3是本发明实施例1中1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒通过暗场显微成像技术检测尺寸为30 nm的聚苯乙烯（PS）纳米塑料的浓度与散射斑点数量的关系图；
图4是本发明实施例2中1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒通过暗场显微成像技术检测尺寸为40 nm的聚苯乙烯（PS）纳米塑料的浓度与散射斑点数量的关系图；
图5是本发明实施例2中1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒通过暗场显微成像技术检测尺寸为50 nm的聚苯乙烯（PS）纳米塑料的浓度与散射斑点数量的关系图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，所述纳米塑料为尺寸为30 nm的聚苯乙烯（PS），包括如下步骤：
1）将10 mL 0.1 mmol/L氯金酸的超纯水溶液与20 mL 0.5 mmol/L四辛基溴化铵的甲苯溶液混合，磁搅拌混合处理30分钟后，静置分离出有机相。在有机相中加入100 μL1-癸硫醇，然后在磁搅拌下缓慢加入新配制的5 mL 5 mmol/L NaBH4水溶液，继续反应6小时，静置后分离出有机相，旋蒸除去甲苯，加入无水乙醇，离心后得到金颗粒固体沉淀，并用无水乙醇洗涤3次。最后，将得到的固体沉淀重新分散到无水乙醇中，制得浓度为1.4 nmol/L的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液；对其进行透射电镜和粒径表征，如图1和图2所示，通过图1和图2可以看到制得的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸在8.5 nm左右。
2）称取2 mg尺寸为30 nm的PS纳米塑料粉末，溶于1 mL甲醇中，配制得到2 mg/mL的PS纳米塑料标准储备溶液，然后逐级稀释到浓度为1 μg/mL、4 μg/mL、20 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、200 μg/mL，得到不同浓度的纳米塑料标准溶液；
3）量取6组10 μL步骤1）的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液，分别与10 μL步骤2）的浓度为1 μg/mL、4 μg/mL、20 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、200 μg/mL的纳米塑料标准溶液进行等体积混合，混合后得到的混合溶液中PS纳米塑料的浓度分别为0.5 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL，然后将混合溶液滴加到载玻片表面，并在液滴上方盖上方形的盖玻片。采用暗场显微镜对样品溶液中的金纳米颗粒进行成像检测，并采集暗场图像，通过ImageJ软件对图像中的散射斑点的数量进行统计分析，记录每个样品的暗场图像中散射斑点的数量分别为n1=16，n2=25，n3=32，n4=54，n5=76，n6=95，根据散射斑点的数量n与PS纳米塑料溶液浓度之间的关系，获得的关系图如图3所示，对尺寸为30 nm的PS纳米塑料检测的线性范围为0.5-100 μg/mL。
实施例2
本实施例提供一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，所述纳米塑料为尺寸为40 nm的聚苯乙烯（PS），包括如下步骤：
1）将20 mL 0.1 mmol/L氯金酸的超纯水溶液与40 mL 0.5 mmol/L四辛基溴化铵的甲苯溶液混合，磁搅拌混合处理45分钟后，静置分离出有机相。在有机相中加入200 μL1-癸硫醇，然后在磁搅拌下缓慢加入新配制的10 mL 5 mmol/L NaBH4水溶液，继续反应8小时，静置后分离出有机相，旋蒸除去甲苯，加入无水乙醇，离心后得到金颗粒固体沉淀，并用无水乙醇洗涤3次。最后，将得到的固体沉淀重新分散到无水乙醇中，制得粒径为9 nm左右，浓度为1.8 nmol/L的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液；
2）称取2 mg尺寸为40 nm的PS纳米塑料粉末，溶于1 mL甲醇中，配制得到2 mg/mL的PS纳米塑料标准储备溶液，然后逐级稀释到浓度为2 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、90 μg/mL、180 μg/mL、240 μg/mL，得到不同浓度的纳米塑料标准溶液；
3）量取6组10 μL步骤1）的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液，分别与10 μL步骤2）的浓度为2 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、90 μg/mL、180 μg/mL、 240 μg/mL的纳米塑料标准溶液进行等体积混合，混合后得到的混合溶液中PS纳米塑料的浓度分别为1 μg/mL、5 μg/mL、15 μg/mL、45 μg/mL、90 μg/mL、120 μg/mL，然后将混合溶液滴加到载玻片表面，并在液滴上方盖上方形的盖玻片。采用暗场显微镜对样品溶液中的金纳米颗粒进行成像检测，并采集暗场图像，通过ImageJ软件对图像中的散射斑点的数量进行统计分析，记录每个样品的暗场图像中散射斑点的数量分别为n1=18，n2=29，n3=35，n4=58，n5=83，n6=103，根据散射斑点的数量n与PS纳米塑料溶液浓度之间的关系，获得的关系图如图4所示，对尺寸为40 nm的PS纳米塑料检测的线性范围为1-120 μg/mL。
实施例3
本实施例提供一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，所述纳米塑料为尺寸为50 nm的聚苯乙烯（PS），包括如下步骤：
1）将30 mL 0.1 mmol/L氯金酸的超纯水溶液与60 mL 0.5 mmol/L四辛基溴化铵的甲苯溶液混合，磁搅拌混合处理60分钟后，静置分离出有机相。在有机相中加入300 μL1-癸硫醇，然后在磁搅拌下缓慢加入新配制的20 mL 5 mmol/L NaBH4水溶液，继续反应10小时，静置后分离出有机相，旋蒸除去甲苯，加入无水乙醇，离心后得到金颗粒固体沉淀，并用无水乙醇洗涤3次。最后，将得到的固体沉淀重新分散到无水乙醇中，制得粒径为10 nm左右，浓度为2.5 nmol/L的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液；
2）称取2 mg尺寸为50 nm的PS纳米塑料粉末，溶于1 mL甲醇中，配制得到2 mg/mL的PS纳米塑料标准储备溶液，然后逐级稀释到浓度为1.6 μg/mL、8 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL，得到不同浓度的纳米塑料标准溶液；
3）量取6组10 μL步骤1）的1-癸硫醇修饰的金纳米颗粒溶液，分别与10 μL步骤2）的浓度为1.6 μg/mL、8 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL的纳米塑料标准溶液进行等体积混合，混合后得到的混合溶液中PS纳米塑料的浓度分别为0.8 μg/mL、4 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL，然后将混合溶液滴加到载玻片表面，并在液滴上方盖上方形的盖玻片。采用暗场显微镜对样品溶液中的金纳米颗粒进行成像检测，并采集暗场图像，通过ImageJ软件对图像中的散射斑点的数量进行统计分析，记录每个样品的暗场图像中散射斑点的数量分别为n1=14，n2=23，n3=36，n4=53，n5=72，n6=118，根据散射斑点的数量n与PS纳米塑料溶液浓度之间的关系，获得的关系图如图5所示，对尺寸为50nm的PS纳米塑料检测的线性范围为0.8-128 μg/mL。
对比例1
本对比例提供一种未改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，未改性金颗粒一般是指采用柠檬酸钠作为稳定剂和还原剂制备得到的柠檬酸修饰的金颗粒，所述纳米塑料为尺寸为30 nm的聚苯乙烯（PS），包括如下步骤：
1）将1 mL 25 mmol/L HAuCl4溶液注入到100 mL超纯水中，并将溶液加热到110℃，然后快速加入10 mL 15 mmol/L柠檬酸钠溶液，反应物在110℃下反应20 min。溶液的颜色逐渐变为酒红色，将溶液冷却至室温，即得到柠檬酸修饰的金纳米颗粒溶液，金颗粒的尺寸为15 nm左右。
2）称取2 mg尺寸为30 nm的PS纳米塑料粉末，溶于1 mL甲醇中，配制得到2 mg/mL的PS纳米塑料标准储备溶液，然后逐级稀释到浓度为1 μg/mL、4 μg/mL、20 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、200 μg/mL，得到不同浓度的纳米塑料标准溶液；
3）量取6组10 μL步骤1）的柠檬酸修饰的金纳米颗粒溶液，分别与10 μL步骤2）的浓度为1 μg/mL、4 μg/mL、20 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、200 μg/mL的纳米塑料标准溶液进行等体积混合，混合后得到的混合溶液中PS纳米塑料的浓度分别为0.5 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL，然后将混合溶液滴加到载玻片表面，并在液滴上方盖上方形的盖玻片。采用暗场显微镜对样品溶液中的金纳米颗粒进行成像检测，发现暗场图像中没有出现散射斑点，无法统计到散射斑点的数量，表明未改性金颗粒（即柠檬酸修饰的金颗粒）不能与纳米塑料发生有效的相互作用，不能形成纳米塑料-金颗粒聚集体，因此在暗场图像中不能观察到散射斑点，即不能实现对纳米塑料的检测。
根据实施例1-实施例3和对比例1的测试结果可知，未改性的金纳米颗粒无法对纳米塑料进行有效检测，而本发明实施例1-实施例3制得的改性的金纳米颗粒溶液能够对粒径在30-50 nm的纳米塑料进行检测，为纳米塑料的检测提供了一种暗场显微成像识别检测方法。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法，其特征在于，包括：
获取不同浓度的纳米塑料标准溶液和烷基硫醇修饰的金纳米颗粒；
将烷基硫醇修饰的金纳米颗粒溶于溶剂制得金颗粒溶液并与不同浓度的纳米塑料标准溶液混合制得混合溶液，再通过暗场显微镜对混合溶液中的烷基硫醇修饰的金纳米颗粒进行成像检测并采集暗场图像，获取散射斑点的数量与混合溶液中纳米塑料浓度之间的关系；
将纳米塑料待测液与金颗粒溶液混合，采用暗场显微镜进行成像检测并采集暗场图像，得到散射斑点的数量，根据散射斑点的数量与混合溶液中纳米塑料浓度之间的关系计算得到纳米塑料待测液中的纳米塑料浓度；
所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸小于30 nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的尺寸为8-12 nm；
和/或，所述纳米塑料的尺寸为30-50 nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述烷基硫醇为1-癸硫醇、1-辛硫醇、1-庚硫醇；
和/或，所述混合为等体积混合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纳米塑料为聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述金颗粒溶液的浓度为1.4-2.5nmol/L；
和/或，所述溶剂为无水乙醇。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纳米塑料标准溶液的溶剂为甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮中的至少一种；
和/或，所述纳米塑料待测液的溶剂为甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述烷基硫醇修饰的金纳米颗粒的获取过程为：将氯金酸溶液与四辛基溴化铵溶液进行混合处理，随后静置分离出有机相，再加入烷基硫醇、硼氢化钠水溶液进行反应制得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氯金酸溶液、四辛基溴化铵溶液、烷基硫醇和硼氢化钠水溶液的体积比为（10-30）：（20-60）：（0.1-0.3）：（5-20）。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述四辛基溴化铵溶液的浓度为0.5mmol/L；
和/或，所述四辛基溴化铵溶液的溶剂为甲苯；
和/或，所述氯金酸溶液的浓度为0.1 mmol/L；
和/或，所述氯金酸溶液的溶剂为超纯水；
和/或，所述硼氢化钠水溶液的浓度为5 mmol/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合处理的时长为30-60 min；
和/或，所述反应的时长为6-10 h；
和/或，所述反应后还进行静置并分离有机相、旋蒸、洗涤。
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