CN113774111A - 一种纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米探针及其制备方法和应用。端粒酶可以通过触发扩增反应保持端粒的长度，从而导致细胞永生和致癌作用。端粒酶在几乎所有癌细胞中均过表达。因此，开发灵敏检测端粒酶的技术对于肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。本发明设计开发了一种基于阻断材料S1和S2的检测端粒酶活性的荧光探针。采用能够触发端粒酶重复扩增反应的端粒酶引物S1及能够与扩增产物发生多重杂交反应的S2作为多孔纳米载体的阻断材料模拟构建智能锁，实现了癌细胞中端粒酶活性的高特异、超灵敏检测及成像，克服了传统方法检测灵敏度低、样品需求量大、步骤繁琐、费用昂贵等缺点，为活体、细胞检测及原位成像提供了新的策略和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物的检测，具体涉及一种检测癌细胞中端粒酶活性的纳米荧光探针及其制备方法和应用，属于光电化学生物传感分析及生物医学临床诊断领域。
背景技术
研究表明，端粒、端粒酶与细胞衰老、细胞分裂、细胞永生化及细胞恶变等密切相关，是衰老和肿瘤的重要因素。端粒是存在于大多数真核生物细胞染色体末端的一段核苷酸重复序列，对于人类而言，端粒序列(TTAGGG)n的重复约为2500次。端粒自身的长度会随着细胞分裂代数的增加不断变短，极短的长度使得细胞停止分裂并进入凋亡和衰老期。因此，端粒的作用相当于给染色体的末端加了一个帽子，以自身长度的不断减少，来“牺牲性”保护染色体内部重要遗传信息在复制时免于丢失。端粒酶是人体内一种特殊的具有逆转录活性的核糖核蛋白聚合酶，它能利用自身的RNA组分作为模板，催化合成端粒重复序列，维持端粒的长度，增加细胞的分裂次数，从而使细胞具有无限增殖的能力。癌细胞之所以能够无限分裂、生生不息，是因为其染色体的端粒受到端粒酶的保护，其长度通过端粒酶触发的扩增反应得到不断延续。
除了在少数细胞如生殖细胞睾丸、卵巢、胎盘及胎儿细胞中端粒酶为阳性以外，正常人体细胞中检测不到端粒酶活性的表达，因其活性在正常细胞中受到抑制。但是在肿瘤细胞及大多数肿瘤组织中，端粒酶活性均异常高表达，使得癌细胞拥有无限增殖的能力。端粒酶阳性的肿瘤包括卵巢癌、淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌等等。研究认为，可以通过抑制端粒酶的活性达到选择性杀死癌细胞的目的，以端粒酶为靶点的抗癌疗法具有潜在的应用价值。同时，端粒酶活性的灵敏检测也为癌症的早期诊断提供依据。因此，作为早期癌症诊断和治疗的特异性肿瘤生物标志物，端粒酶得到了广泛的关注和研究。
因此，开发灵敏检测端粒酶活性的技术对于肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。传统的检测方法如放射性标记法、端粒重复扩增方案(TRAP)等技术，存在样本需求量大、检测灵敏度低、处理繁琐、耗时、费用昂贵、残留污染风险高以及产生假阳性/阴性信号等缺点，同时，最大的问题在于这些技术无法完全地定量检测细胞中的端粒酶活性，给临床实际应用带来一定的困难。为了克服端粒酶传统检测技术的缺点和不足，迫切需要开发出简单、灵敏、特异及准确度高的荧光检测技术来满足生物医疗领域对癌症的早期诊断及治疗的实际需求。与其他方法相比，基于荧光探针的检测技术因其具有操作简便、灵敏度高、样品需求量低、适合于高通量检测等优点得到广泛研究和应用。
本发明为了克服传统技术检测灵敏度低、样品需求量大、步骤繁琐、费用昂贵等缺点，提出了一种基于多重信号放大策略的超灵敏荧光探针检测体系。本发明采用空心多孔的金纳米载体构建端粒酶活性的检测体系。由于金纳米载体材料的结构特性，可以很容易地在其内部装载信号分子，因此是实现可控释放策略的理想选择。尽管如此，如何优化金纳米多孔载体材料表面的阻断策略，防止信号分子泄漏造成的假阳性/阴性结果仍是一个挑战。本发明合成了一种基于端粒酶引物链的生物分子S1，并将其作为纳米可控释放载体的阻断材料。只有端粒酶存在的时候，才可以触发端粒酶引物链的重复扩增反应，使其脱离载体表面，这将破坏引物链对于信号分子的阻断作用，产生信号增强的结果，据此实现端粒酶活性的检测。由于阻断材料的设计模拟了智能锁的作用，只有靶标分子才能被阻断材料识别，实现信号分子的可控释放，得到显著放大的检测信号。这种信号放大作用不再是传统技术的1对1，而是1个靶标分子可以获得更多个信号分子，灵敏度得到显著提高。为了进一步提高灵敏度，本发明在智能锁-可控释放信号放大的基础上，设计了多重杂交放大策略，即在阻断材料中，设计、合成并引入了阻断性能更加优越的互补型长链分子S2，该合成分子不但具有更加优越的阻断性能，而且，它还能够和端粒酶引物链的扩增产物发生杂交反应，形成双链复合物，最终使其脱离载体表面，阻断作用被破坏，导致更多的智能锁被打开，释放出来的信号分子呈指数型增加，灵敏度得到进一步提高。该策略的最大优点在于，设计、合成的互补型长链分子S2由2部分组成，一部分是端粒酶引物链S1，另一部分则是端粒酶引物链的扩增产物的互补链S3，该部分可以和端粒酶引物链的扩增产物发生杂交反应，形成双链复合物。由于引物链的重复扩增，每一条引物链的扩增产物可以结合多个互补型长链分子S2，再次实现1对多的策略。因此，荧光信号显著增强。最后，为了实现对端粒酶活性的超灵敏检测，最大限度地降低样品需求量，本发明在基于扩增-多重杂交信号放大的基础上，将核酸外切酶Ⅲ(EXO III)介导的酶辅助循环放大策略应用于该体系。由于EXO III可以对形成的双链复合物进行裂解，扩增后的引物链可以从中释放出来并不断循环，从而释放出更多的信号分子；同时，裂解反应还产生了更多的端粒酶引物链S1，这为循环扩增反应提供了源源不断的原料分子。因此，扩增-多重杂交策略与循环酶放大策略相结合，可以实现端粒酶活性的超灵敏检测。
基于该检测机理，不但实现了阻断材料对于靶标分子的特异性识别和响应，释放出大量的信号分子从而获得显著增强的荧光信号，而且由于引物链与端粒酶的扩增反应特性，引物链得到循环扩增，导致更多的阻断材料与其杂交，同时，又结合了外切酶Ⅲ介导的酶辅助循环放大作用，最终使靶标分子的作用被循环放大，因此，即便很微量的端粒酶，也能够通过不断地扩增-多重杂交-剪切的循环方式打开更多的智能锁，不断释放出更多的信号分子，使荧光信号呈指数型增强，最终实现靶标分子的超灵敏检测。
本发明基于上述策略，设计开发了一种基于阻断材料S1和S2的检测端粒酶活性的可控释放荧光探针。采用能够触发端粒酶重复扩增反应的端粒酶引物S1及能够与扩增产物发生多重杂交反应的S2作为多孔纳米载体的阻断材料模拟构建智能锁，有效抑制了信号分子的泄露，避免了假阳性信号的产生，实现了信号分子的可控释放。与其他传统的荧光检测策略相比，基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的荧光探针的优势在于可以通过简单的修饰实现对端粒酶的选择性响应，显示出优异的特异性。更重要的是，该系统不需要任何外部刺激(如辐射或pH值)，只需目标物的触发即可释放大量信号分子，实现灵敏度的大幅提升。因此，该荧光探针为端粒酶活性的检测和原位成像提供了一种新策略。迄今为止，利用S1和S2作为多孔纳米载体的阻断材料构建基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的端粒酶活性检测的荧光探针还未见文献报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，针对利用S1和S2作为多孔载体的阻断材料构建基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的检测端粒酶活性的荧光探针的文献还未见报道，因此，本发明的第一目的：提出一种新型的利用S1和S2作为多孔载体的阻断材料构建基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针；本发明的第二目的：提供一种本发明提出的纳米荧光探针的制备方法；本发明的第三目的：提供一种利用本发明提出的纳米荧光探针检测端粒酶活性的方法。本发明设计、合成了S1和S2，将其作为多孔载体的阻断材料，通过简单的修饰模拟构建了智能锁，实现了多孔载体内信号分子的可控释放，有效抑制了信号分子的泄露，避免了假阳性信号的产生。检测原理图见图1所示。其中，S1是能够被端粒酶触发而发生重复扩增反应的端粒酶引物链，S2是能够与扩增产物发生多重杂交反应的互补型长链分子，它由2部分组成，一部分是端粒酶引物链S1，另一部分则是端粒酶引物链的扩增产物的互补链S3，该部分可以和端粒酶引物链的扩增产物发生杂交反应，形成双链复合物。由于端粒酶的存在，引物链重复扩增，每一条引物链的扩增产物可以结合多个互补型长链分子S2，形成双链复合物，这将导致更多的智能锁被打开，释放出来的信号分子呈指数型增加，灵敏度得到大幅提升，通过检测增强的荧光信号实现端粒酶活性的检测。本发明的最大优势在于：利用设计、合成的S1和S2，通过简单的修饰实现对端粒酶的选择性响应，显示出优异的特异性；更重要的是，不需要任何外部条件的刺激如辐射或pH值，即可实现由目标物触发的大量信号分子的释放。由于引物链与端粒酶的扩增反应特性，引物链得到循环扩增，导致更多的阻断材料S2与其杂交，同时，又通过外切酶Ⅲ介导的酶辅助循环放大作用，使引物链及引物链的扩增产物被循环利用，最终使靶标分子的作用被循环放大，因此，即便很微量的端粒酶，也能够通过不断地扩增-多重杂交-剪切的循环方式打开更多的智能锁，释放出更多的信号分子，使荧光信号呈指数型增强，最终实现靶标分子的超灵敏检测。正是由于采用了S1和S2模拟构建了智能锁，通过扩增-多重杂交-剪切的循环方式使靶标的作用被循环放大，使检测体系得到优化和改进，克服了传统方法检测灵敏度低、样品需求量大、步骤繁琐、费用昂贵等缺点，对活体、细胞检测及其实际应用具有重要意义。
本发明的优点是，最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测体系、降低了检测成本及样品使用量、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格昂贵、特异性和灵敏度不足等实际困难，在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有潜在的应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。具体是设计、合成了具有优异阻断性能的分子S1和S2，利用S1和S2，通过简单修饰，在装载了大量信号分子的多孔载体表面模拟构建了智能锁。一方面能够阻断信号分子的泄漏，降低空白、避免假阳性信号，另一方面能够在靶标分子存在时，打开智能锁、释放信号分子，实现可控释放。采用S1和S2作为阻断材料，不但简化了探针的制备过程，获得了最佳的阻断效果，而且实现了可控释放及信号的循环放大。模拟构建的智能锁仅对靶标分子端粒酶产生特异性响应，除此之外，对其它物质如NaCl、KCl、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白均没有响应，显示了优良的选择性和特异性。当加入不同活性的端粒酶时，荧光信号的增强与端粒酶活性存在强的相关性。因此，根据增强的荧光信号实现对端粒酶活性的检测。结果表明，该检测体系能够获得远高于传统技术的灵敏度，最重要的是，本发明提出的检测体系不但可以实现特异性的可控释放，而且由于合成的特殊的阻断材料，无需任何外部条件刺激就可以产生信号的循环放大，为活体及细胞成像等应用提供了新的方法和技术。
一种制备本发明提出的新型的利用S1和S2作为多孔载体的阻断材料构建基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)设计并合成S1和S2，二者的序列从5'到3'分别为：AATCCGTCGAGCAGAGTT和AATCCGTCGAGCAGAGTTCCCTAACCCTAA；
(2)分别配制浓度为20μM的S1和S2溶液；
(3)分别取上步配制好的10μLS1和S2溶液，加入到载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液中，37℃摇床过夜；
(4)磁分离、清洗，最终制得本发明用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针；
其中，载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液的制备是将终浓度为20μMRhB的PBS溶液加入到多孔金纳米载体中，37℃摇床过夜。
本发明的有益效果：本发明提出的纳米荧光探针，采用了设计合成的S1和S2模拟构建智能锁，通过扩增-多重杂交-剪切的循环方式使靶标的作用被循环放大，为端粒酶活性的检测提供了特异、高效的多重循环放大检测技术，克服了传统方法检测灵敏度低、样品需求量大、步骤繁琐、费用昂贵等缺点，对活体、细胞检测及成像提供了新的技术和方法，在生物医学及临床诊断领域具有潜在的应用价值。与传统技术相比，无需任何外部条件如温度、激光照射、pH等刺激，实现了端粒酶触发的多重信号循环放大，为活体、细胞检测及成像提供了简单、高效的放大策略。本发明的优点在于：不但使检测方法得到优化和改进，而且，最大限度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术。
本发明提出的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针具有高效、灵敏、性能稳定、结构简单、易制备、生物相容性好、适用范围广等优点，表现出高的特异性和选择性，不会受到其它物质如NaCl、KCl、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白的干扰。实验结果表明，采用本发明提出的纳米荧光探针检测宫颈癌细胞中的端粒酶活性，不但显示了远高于现有技术的灵敏度和选择性，而且，还获得了更宽的细胞检测范围，检测限低至46个HeLa细胞，如图2所示，实验检测了HeLa细胞裂解液中端粒酶活性的大小，通过考察不同细胞数目的裂解液与荧光信号的关系，从而确定目标物端粒酶活性与荧光信号增强之间的关系。在0至10000个HeLa细胞范围内，荧光信号随着细胞个数的增多而增强，在70至1100个细胞范围内，荧光信号与细胞数目呈现良好的线性关系，线性方程：F＝0.38n+194.18，R2＝0.997。F为荧光强度，n为细胞数目。
得益于优异的生物相容性，本发明提出的纳米荧光探针还可以实现细胞内端粒酶的原位成像，很好地解决了传统技术易受其他酶类及生物基质干扰的难题。因此，该方法也为开发高灵敏肿瘤生物标志物的细胞原位成像探针提供了新的途径和策略。
附图说明
图1.检测原理图；
图2.(A)本发明探针与不同数量的HeLa细胞裂解液反应后的荧光光谱图，细胞数量分别为：0、70、100、200、400、600、800、1000、2000、4000、6000、8000、10000；(B)荧光信号与HeLa细胞数量的线性关系图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)；TDL-40B 4000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；TGL-16B 10000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；SCIEWTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；Leica TCS SP5II激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。
实验试剂：聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)，丙酮(C3H6O)，氯化钠(NaCl)，乙二醇(EG)购自中国国药化学公司；硝酸银(AgNO3)，九水硫化钠(Na2S·9H2O)，3'-叠氮-3'-脱氧胸苷(AZT)，二甲基亚砜(DMSO)，磷酸盐缓冲液(PBS)购自Admas-beta；四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)购自Sigma-Aldrich；宫颈癌Hela细胞(青岛大学)；二次水等，所用试剂均为分析纯。罗丹明B(RhB)，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(Pdda)从上海阿拉丁生物科技股份有限公司获得；核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)，核苷酸(dNTPs)购自Thermo Scientific；3～4μm巯基修饰磁珠从天津市倍思乐色谱技术开发中心获得；本实验所用的S1和S2序列设计如表1所示：二者均是委托上海生工生物有限公司合成。
表1详细的脱氧核糖核苷酸序列(5'to3')
实施例1：
一种制备本发明提出的新型的利用S1和S2作为多孔载体的阻断材料构建基于扩增-多重杂交-循环酶放大策略的用于检测癌细胞端粒酶活性的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)设计并合成S1和S2，其序列从5'到3'分别为：AATCCGTCGAGCAGAGTT和AATCCGTCGAGCAGAGTTCCCTAACCCTAA；
(2)分别配制浓度为20μM的S1和S2溶液；
(3)分别移取上步配制好的10μLS1和S2溶液，加入到100μL载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液中，37℃摇床过夜；
(4)磁分离、清洗，最终制得本发明用于检测癌细胞端粒酶活性的纳米荧光探针；
(5)将上步产物分散在200μL PBS缓冲液中，获得荧光探针溶液；
其中，载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液的制备是将终浓度为20μMRhB的PBS溶液加入到多孔金纳米载体中，37℃摇床过夜；所述的多孔金纳米载体按文献方法制备(Sun,Y.；Xia,Y.Science2002,298,2176.)，然后按文献方法先将制备的多孔金纳米载体与巯基磁珠反应后再进行表面正电性修饰而获得(Analytica Chimica Acta,2018,998,45-51.)。
实施例2:
一种利用本发明提出的纳米荧光探针检测癌细胞中端粒酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)2.0mL含有HeLa细胞1.0×107cell/mL的培养液，用PBS缓冲液(pH＝7.4)重复清洗三次，随后在2000rpm的转速下离心5min，加入200μL细胞裂解缓冲液进行30min的冰浴，最后在4℃，12000rpm的转速下离心20min获得细胞裂解液；
(2)为了检测HeLa细胞裂解液中端粒酶的活性，将上述获取的细胞裂解液逐级稀释，分别获得含有不同细胞数目的溶液，具体细胞数目包括：70、100、200、400、600、800、1000、1100、2000、4000、6000、8000、10000个细胞；
(3)将上述稀释好的细胞裂解液分别与20μL探针溶液(10nM)，1.0μL EXO Ⅲ剪切酶(20U/μL)和10μL dNTPs(10mM)混匀，并用PBS缓冲液稀释至100μL；
(4)37℃孵育80min后，采用F-4600型荧光光谱仪进行检测，激发波长：488nm，狭缝宽度5.0nm。
实验结果表明，在0至10000个HeLa细胞范围内，荧光信号随着细胞个数的增多而增强，在70至1100个细胞范围内，荧光信号与细胞数目呈现良好的线性关系，线性方程：F＝0.38n+194.18，R2＝0.997，检测限低至46个HeLa细胞。利用本发明探针，即可实现癌细胞中端粒酶活性的检测，证明该方法同时具备高灵敏、高特异性的优点。
实施例3:
(1)分别移取10μL 20μM的S1和S2溶液，加入到100μL载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液中，37℃摇床过夜，磁分离、清洗；
(2)将上步产物分散在200μL PBS缓冲液中，获得荧光探针溶液；
(3)将150μL HeLa细胞与10μL dNTPs(10mM)、20μL荧光探针溶液在37℃、5％CO2中孵育2h；
(4)将细胞放置在激光共聚焦显微镜上进行荧光成像，选择激发波长：488nm；
其中，载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液的制备是将终浓度为20μMRhB的PBS溶液加入到多孔金纳米载体中，37℃摇床过夜；所述的多孔金纳米载体按文献方法制备(Sun,Y.；Xia,Y.Science2002,298,2176.)，然后直接进行表面正电性修饰后获得(Analytica Chimica Acta,2018,998,45-51.)。
实验结果表明，细胞经过探针和碱基dNTPs的共同孵育后，二者进入到细胞内，由于细胞内存在端粒酶，触发了探针上的端粒酶引物链发生循环扩增反应，随着引物链的扩增，导致探针上的S2与扩增产物发生多重杂交反应，所有这些反应都能够导致智能锁被打开，释放出大量的荧光分子。因此，细胞内的荧光信号明显增强。证实本发明采用的荧光探针能够特异、灵敏地实现细胞内端粒酶的原位荧光成像。
本发明提出的纳米荧光探针，为癌细胞中端粒酶活性的检测及原位成像提供了高效、简单、经济的多重循环放大技术。通过采用设计合成的S1和S2模拟构建智能锁，形成扩增-多重杂交-剪切的循环方式使靶标的作用被循环放大，克服了传统方法检测灵敏度低、样品需求量大、步骤繁琐、费用昂贵等缺点，与传统技术相比，无需任何外部条件如温度、激光照射、pH等刺激，实现了靶标分子触发的多重循环信号放大，为活体、细胞检测及成像提供了简单、高效的放大策略。本发明的优点在于：不但使检测方法得到优化和改进，而且，最大限度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术，在生物医学及临床诊断领域具有潜在的应用价值。
Claims (7)
1.一种用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针，其特征在于：该探针采用S1和S2作为多孔载体的阻断材料模拟构建智能锁，有效抑制了载体中信号分子的泄露，避免了假阳性信号的产生。
2.一种如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针，其特征在于：所述的S1是能够被端粒酶触发而发生重复扩增反应的端粒酶引物链，S2是能够与扩增产物发生多重杂交反应的互补型长链分子，它由2部分组成，一部分是端粒酶引物链S1，另一部分则是端粒酶引物链的扩增产物的互补链S3。
3.一种如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针，其特征在于：S1和S2的序列从5'端到3'端分别为：AATCCGTCGAGCAGAGTT和AATCCGTCGAGCAGAGTTCCCTAACCCTAA。
4.一种如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针，其特征在于：所述的多孔载体是表面多孔、中空的金纳米载体。
5.一种如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针，其特征在于：所述的信号分子是罗丹明B。
6.一种如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)设计并合成阻断材料S1和S2，其序列从5'到3'分别为：AATCCGTCGAGCAGAGTT和AATCCGTCGAGCAGAGTTCCCTAACCCTAA；
(2)分别配制浓度为20μM的S1和S2溶液；
(3)分别移取上步配制好的10μL S1和S2溶液，加入到100μL载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液中，37℃摇床过夜；
(4)磁分离、清洗，最终制得本发明用于检测端粒酶活性的纳米荧光探针。
7.一种如权利要求1所述的纳米荧光探针的应用，其特征在于癌细胞中端粒酶的原位成像，方法如下：
(1)分别移取10μL 20μM的S1和S2溶液，加入到100μL载有罗丹明B信号分子的多孔金纳米载体溶液中，37℃摇床过夜，磁分离、清洗；
(2)将上步产物分散在200μL PBS缓冲液中；
(3)将150μLHeLa细胞与10μL dNTPs、20μL上步获得的荧光探针溶液在37℃、5％CO2中孵育2h；
(4)将细胞放置在激光共聚焦显微镜上进行荧光成像，选择激发波长：488nm。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20211210 |