CN111424072B - 一种检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

一种检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及OTA特异识别的拱形探针及CHA和链置换等温循环放大检测OTA的生物传感器，为了解决以上现有技术中检测OTA的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种检测OTA的生物传感器，在电极上依次修饰有ST‑BK‑S1层、aptamer‑T‑HP1‑HP2‑HP3‑F层、血红素层。制备方法：对电极进行预处理；将ST‑BK‑S1层修饰到电极表面；将aptamer‑T‑HP1‑HP2‑HP3‑F层修饰到电极表面；将血红素层修饰到电极表面。利用了OTA的特异性识别实现了对目标物OTA的高特异性检测；利用CHA反应和链置换等温放大技术，实现了目标物信号的两步放大。

Description

一种检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及一种检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由玉米、豆类蔬菜等农作物上的曲霉菌和青霉菌所分泌的一种重要真菌毒素，对动物和人类具有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌和免疫抑制作用。
目前检测赭曲霉毒素A的方法有很多，如光学分析法、电泳法、色谱法等。但这些分析方法存在程序繁琐、仪器昂贵、设备复杂等缺点，不适合现场检测。因此，开发一种快速、准确检测OTA的方法，对控制食品安全与质量具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂、设备昂贵且需专业人员操作的缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，在电极上依次修饰有ST-BK-S1层、aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层、血红素层；
所用到得碱基序列为：
aptamer碱基序列如SEQ No.1所示；具体为: GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA；
T碱基序列如SEQ No.2所示；具体为: GTG CCC TGT CCG ATG CAA TGA CAC CCGATC；
HP1碱基序列如SEQ No.3所示；具体为: GAT CGG GTG TCG TTG CAT CGG ACA GGGCAC CCG ATC CGA CCC GTG CCC TGA CCG CTG TAG CGA CGC GTT CAT；
HP2碱基序列如SEQ No.4所示；具体为: CTA CAG CGG TCG GGG TAC GGG TCG GATCGG ATG CAA CGA TAC CCG ATC CGA CCC CTA GTC CGA CGC GTT CAT；
HP3碱基序列如SEQ No.5所示；具体为: AAC TAG GGG TCG GAT CGG GTG TCG TTGCAT GTG CCC TGT CCG ATG CAA CGA CAC CCG ATC CGA CGC GTT CAT；
F碱基序列如SEQ No.6所示；具体为: GTT CAT GAC TCT GAG GGT GGG；
BK碱基序列如SEQ No.7所示；具体为: TCA TGA CTC T；
S1碱基序列如SEQ No.8所示；具体为: GAG GGT GGG GAG GGT GGG GCC AA-SH(CH3)6；
ST碱基序列如SEQ No.9所示；具体为: ACC CTC CCC ACC CTC AGA GTC ATG AACGCG TCG；
所述的S1链的3’端修饰有巯基-SH。
所述的ST-BK-S1层中ST、BK、S1的摩尔比为1:1:1；aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层中aptamer、T、HP1、HP2、HP3、F的摩尔比为1:1:5:5:5:25。
上述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将ST-BK-S1层修饰到电极表面；
（3）将aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层修饰到电极表面；
（4）将血红素层修饰到电极表面。
所述步骤（1）预处理过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗。
所述步骤（2）将ST-BK-S1层修饰到电极表面的操作步骤如下：将ST、BK、S1在37℃中反应2 h，滴加10 μL到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2 h，清洗。
所述步骤（3）将aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层修饰到电极表面的操作步骤如下：
a.将aptamer和T加入灭菌的离心管中，振荡，放入95℃的水浴锅中保持，形成拱形探针后冷却至室温；
b.取灭菌水，5×PBS缓冲液，拱形探针，HP1、HP2、HP3，5 µL赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡，放入37℃的水浴锅中孵育2 h；
c.将F链加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h，清洗。
所述步骤（4）将血红素层修饰到电极表面的操作步骤如下：
将血红素滴加到步骤（3）反应完成的电极上，孵育，清洗。
所述电极为金电极。
上述制备方法制备电化学生物传感器在检测食品、环境中赭曲霉毒素A上的应用。
上述应用的具体方法为：以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。
本发明一共用到了9条DNA链，其序列（5’-3’）分别是：
aptamer：GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA
T：GTG CCC TGT CCG ATG CAA TGA CAC CCG ATC
HP1：GAT CGG GTG TCG TTG CAT CGG ACA GGG CAC CCG ATC CGA CCC GTG CCCTGA CCG CTG TAG CGA CGC GTT CAT
HP2：CTA CAG CGG TCG GGG TAC GGG TCG GAT CGG ATG CAA CGA TAC CCG ATCCGA CCC CTA GTC CGA CGC GTT CAT
HP3：AAC TAG GGG TCG GAT CGG GTG TCG TTG CAT GTG CCC TGT CCG ATG CAACGA CAC CCG ATC CGA CGC GTT CAT
F：GTT CAT GAC TCT GAG GGT GGG
BK：TCA TGA CTC T
S1：GAG GGT GGG GAG GGT GGG GCC AA-SH(CH3)6
ST：ACC CTC CCC ACC CTC AGA GTC ATG AAC GCG TCG
其中，T链可与aptamer两端杂交形成拱形探针。OTA可与aptamer特异性结合。T链可诱导三个发夹探针（HP1，HP2，HP3）产生催化发夹组装（CHA）形成三通路构型的DNAWalker，并暴露出各自的斜体部分序列（DNA Walker的三足）。
S1链的3’端修饰有巯基（-SH），可通过金硫键固定在金电极表面。ST的5’端与S1链杂交，中间斜体序列与BK链结合，3’端与HP1、HP2、HP3形成的DNA Walker的三足杂交。F链与ST链能够稳定杂交。S1在K+和血红素存在的条件下形成G-四联体，产生电化学信号。我们就是通过该信号来达到定量检测目标物的目的。
均相中发生的反应主要有：在有目标物OTA存在的情况下，OTA可以将拱形探针上的aptamer竞争下来，释放的T链能够诱导HP1，HP2和HP3产生CHA反应形成三通路构型的DNAWalker，同时释放T链去继续诱导其他的CHA反应，这是第一步循环放大。暴露出的DNAWalker的三足可以与电极上修饰的三链中的ST链杂交，将BK链置换下来，暴露F链与ST链的杂交位点。F链与ST链杂交，DNA Walker序列与S1链都被置换下来。DNA Walker可以继续去诱导电极上其他的三链发生置换反应，这是信号的第二步放大。S1链在血红素和K+的作用下形成G-四联体，从而获得电化学信号。
该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将ST-BK-S1固定到电极表面。将反应后的aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层修饰到电极表面。在加入血红素后，继续孵育30 min。然后用三电极工作体系检测信号峰。电位设置0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号，检测待测目标物。
本发明基于OTA与拱形探针的特异性识别，CHA反应，链置换放大反应构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、特异、灵敏检测
利用OTA的特异性识别实现了对目标物OTA的高特异性检测；利用CHA反应，实现了目标物的循环利用，起到了第一步信号增大的作用；利用DNA Walker诱导的链置换等温放大技术，实现了信号的第二次循环放大，实现了对目标物的高灵敏检测，提高了检测的灵敏度。
2、反应条件温和、速度快
该传感器的反应条件温和，反应速度快；检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
3、适用于产业化
由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品中OTA的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该发明原理示意图；
图2为实施例1拱形探针浓度优化检测结果图；
图3为实施例2 HP1浓度优化检测结果图；
图4为实施例3 S1浓度优化检测结果图；
图5为实施例4传感器检测OTA的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b.取25 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL BK链（2.5 µM），5 µL S1链（2.5 µM），5 µL ST链（2.5 µM）于灭菌离心管中，振荡30 s后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a.将5 µL aptamer（10 µM）和5 µL T（10 µM）加入灭菌的离心管中，振荡30 s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成拱形探针，后冷却至室温；
b.取10 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL拱形探针（0 µM、0.01 µM、0.05 µM、0.1 µM、0.2 µM、0.3 µM、0.4 µM、0.5 µM），5 µL HP1、HP2、HP3（0.5 µM），5 µL浓度为500 μg/L的赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h；
c.将5 µL F链（2.5 µM）加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h；
d.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；
e.取5 µL血红素（10 µM）滴在电极表面，于37℃恒温箱中孵育30 min，清洗；
f.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安技术读取G-四联体电信号的变化，检测待测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着拱形探针的浓度在0-0.1 μM区间内增大而增大，当浓度超过0.1 μM后，电流趋于稳定，所以拱形探针的最佳浓度为0.1μM。
实施例2
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b.取25 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL BK链（2.5 µM），5 µL S1链（2.5 µM），5 µL ST链（2.5 µM）于灭菌离心管中，振荡30 s后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a.将5 µL aptamer（10 µM）和5 µL T（10 µM）加入灭菌的离心管中，振荡30 s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成拱形探针，后冷却至室温；
b.取10 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL 0.1 µM的拱形探针，5 µL（0 μM，0.25 μM，0.5 μM，1 μM，1.5 μM，2 μM）的HP1、5 µL HP2、HP3（0.5 µM），5 µL浓度为500 μg/L的赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h。
c.将5 µL F链（2.5 µM）加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h；
d.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；
e.取5 µL血红素（10 µM）滴在电极表面，于37℃恒温箱中孵育30 min，清洗；
f.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安技术读取G-四联体电信号的变化，检测待测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HP1的浓度在0-0.5 μM区间内增大而增大，当浓度超过0.5 μM后，电流趋于稳定，所以HP1的最佳浓度为0.5 μM。此外，由于HP1，HP2和HP3能够在T链作用下产生CHA反应，因此，三者的浓度应该是1：1：1的关系。即：HP1，HP2和HP3的最佳浓度都是0.5 μM。
实施例3
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b.取25 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL BK链（2.5 µM），5 µL S1链（0.5 µM、1 µM、1.5 µM、2 µM、2.5 µM、3 µM、3.5 µM、4 µM），5 µL ST链（2.5 µM）于灭菌离心管中，振荡30 s后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a.将5 µL aptamer（10 µM）和5 µL T（10 µM）加入灭菌的离心管中，振荡30 s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成拱形探针，后冷却至室温；
b.取10 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL 0.1 µM的拱形探针，5 µL HP1、HP2、HP3（0.5 µM），5 µL浓度为500 μg/L的赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h。
c.将5 µL F链（2.5 µM）加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h；
d.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；
e.取5 µL血红素（10 µM）滴在电极表面，于37℃恒温箱中孵育30 min，清洗；
f.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安技术读取G-四联体电信号的变化，检测待测目标物。
结果见图4，从图中可以看出，检测到的电流信号随着S1的浓度在0.5-2.5 μM区间内增大而增大，当浓度超过2.5 μM后，电流趋于稳定，所以S1的最佳浓度为2.5 μM。
实施例4
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b.取25 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL BK链（2.5 µM），5 µL S1链（2.5 µM），5 µL ST链（2.5 µM）于灭菌离心管中，振荡30 s后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a.将5 µL aptamer（10 µM）和5 µL T（10 µM）加入灭菌的离心管中，振荡30 s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成拱形探针，后冷却至室温；
b.取10 µL灭菌水，10 µL 5×PBS缓冲液，5 µL 0.1 µM的拱形探针，5 µL HP1、HP2、HP3（0.5 µM），5 µL浓度为（0 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL）的赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h。
c.将5 µL F链（2.5 µM）加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h；
d.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；
e.取5 µL血红素（10 µM）滴在电极表面，于37℃恒温箱中孵育30 min，清洗；
f.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安技术读取G-四联体电信号的变化，检测待测目标物。
结果见图5。从图5A中可以看出，检测到的电流信号随着目标物浓度在100 ng/mL-500 ng/mL区间内增大而增大，图5B显示OTA浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线：I=0.801+ 0.679 lgC(ng/mL) （相关系数是0.968，其中C代表了OTA的浓度），同时，我们在100 ng/mL的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100 ng/mL时，OTA浓度的对数与电流峰值大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流峰值最低值。因此，可得到该方法检测下限为100 ng/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
gtgccctgtc cgatgcaatg acacccgatc 30
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
gatcgggtgt cgttgcatcg gacagggcac ccgatccgac ccgtgccctg accgctgtag 60
cgacgcgttc at 72
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
ctacagcggt cggggtacgg gtcggatcgg atgcaacgat acccgatccg acccctagtc 60
cgacgcgttc at 72
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
aactaggggt cggatcgggt gtcgttgcat gtgccctgtc cgatgcaacg acacccgatc 60
cgacgcgttc at 72
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
gttcatgact ctgagggtgg g 21
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
tcatgactct 10
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 8
gagggtgggg agggtggggc caa 23
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 9
accctcccca ccctcagagt catgaacgcg tcg 33

Claims (7)

1.一种利用电化学生物传感器检测待测目标物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，在电极上依次修饰有ST-BK-S1层、aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层、血红素层；
所用到的碱基序列为：
aptamer碱基序列如SEQ ID No.1所示；具体为: GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA；
T碱基序列如SEQ ID No.2所示；具体为: GTG CCC TGT CCG ATG CAA TGA CAC CCGATC；
HP1碱基序列如SEQ ID No.3所示；具体为: GAT CGG GTG TCG TTG CAT CGG ACA GGGCAC CCG ATC CGA CCC GTG CCC TGA CCG CTG TAG CGA CGC GTT CAT；
HP2碱基序列如SEQ ID No.4所示；具体为: CTA CAG CGG TCG GGG TAC GGG TCG GATCGG ATG CAA CGA TAC CCG ATC CGA CCC CTA GTC CGA CGC GTT CAT；
HP3碱基序列如SEQ ID No.5所示；具体为: AAC TAG GGG TCG GAT CGG GTG TCG TTGCAT GTG CCC TGT CCG ATG CAA CGA CAC CCG ATC CGA CGC GTT CAT；
F碱基序列如SEQ ID No.6所示；具体为: GTT CAT GAC TCT GAG GGT GGG；
BK碱基序列如SEQ ID No.7所示；具体为: TCA TGA CTC T；
S1碱基序列如SEQ ID No.8所示；具体为: GAG GGT GGG GAG GGT GGG GCC AA-SH(CH3)6；
ST碱基序列如SEQ ID No.9所示；具体为: ACC CTC CCC ACC CTC AGA GTC ATG AACGCG TCG；
所述的S1链的3’端修饰有巯基-SH；
所述检测方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将ST-BK-S1层修饰到电极表面；
（3）将aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层修饰到电极表面；
（4）将血红素层修饰到电极表面；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物；
所述步骤（3）将aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层修饰到电极表面的操作步骤如下：
a.将aptamer和T加入灭菌的离心管中，振荡，放入95℃的水浴锅中保持，形成拱形探针后冷却至室温；
b.取灭菌水，5×PBS缓冲液，拱形探针，HP1、HP2、HP3，待测目标物于灭菌的离心管中，振荡，放入37℃的水浴锅中孵育2 h；
c.将F链加入b步反应后的溶液，取10 μL滴加到预先修饰好的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h，清洗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ST-BK-S1层中ST、BK、S1的摩尔比为1:1:1；aptamer-T-HP1-HP2-HP3-F层中aptamer、T、HP1、HP2、HP3、F的摩尔比为1:1:5:5:5:25。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）预处理过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）将ST-BK-S1层修饰到电极表面的操作步骤如下：将ST、BK、S1在37℃中反应2 h，滴加10 μL到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2 h，清洗。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）将血红素层修饰到电极表面的操作步骤如下：
将血红素滴加到步骤（3）反应完成的电极上，孵育，清洗。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电极为金电极。
7.采用权利要求1所述的方法在检测食品、环境中赭曲霉毒素A上的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112345751A (zh) * 2020-11-06 2021-02-09 济南大学 一种检测赭曲霉毒素a的比色生物传感器
CN112378977B (zh) * 2020-11-12 2022-06-10 济南大学 一种检测啶虫脒的电化学传感器
CN113552189B (zh) * 2021-07-23 2022-06-10 济南大学 一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器
CN113552188B (zh) * 2021-07-23 2022-06-10 济南大学 一种基于dna四面体的检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102912020A (zh) * 2012-10-20 2013-02-06 江南大学 一种测定赭曲霉毒素a的适配体传感器的构建方法
CN107462570A (zh) * 2017-08-03 2017-12-12 南京师范大学 基于DNAzyme–aptamer化学发光法检测OTA的光子晶体修饰微球及其应用
CN108956568A (zh) * 2018-07-18 2018-12-07 江南大学 一种用于检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法
CN109444102A (zh) * 2018-12-18 2019-03-08 济南大学 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN110501411A (zh) * 2019-09-17 2019-11-26 济南大学 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用
CN111024791A (zh) * 2019-12-26 2020-04-17 中国科学院生态环境研究中心 检测赭曲霉毒素a的电化学传感器和方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102912020A (zh) * 2012-10-20 2013-02-06 江南大学 一种测定赭曲霉毒素a的适配体传感器的构建方法
CN107462570A (zh) * 2017-08-03 2017-12-12 南京师范大学 基于DNAzyme–aptamer化学发光法检测OTA的光子晶体修饰微球及其应用
CN108956568A (zh) * 2018-07-18 2018-12-07 江南大学 一种用于检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法
CN109444102A (zh) * 2018-12-18 2019-03-08 济南大学 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN110501411A (zh) * 2019-09-17 2019-11-26 济南大学 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用
CN111024791A (zh) * 2019-12-26 2020-04-17 中国科学院生态环境研究中心 检测赭曲霉毒素a的电化学传感器和方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A novel electrochemical sensor for ochratoxin A based on the hairpin aptamer and double report DNA via multiple signal amplification strategy;Xiaoying Wang 等;《Sensor & Actuators B: Chemical》;20190215;第281卷;595-601 *
Aptamer-based fluorescent detection of ochratoxin A by quenching of gold nanoparticles;Xin Lv 等;《RSC Adv》;20170314;第7卷;16290-16294 *
Aptamer-based fluorometric ochratoxin A assay based on photoinduced electron transfer;Han Zhao等;《Toxins》;20190124;第11卷;1-10 *
Nanozymes and aptamer-based biosensing;Chatterjee B.等;《Materials Science for Energy Technologies》;20190915;第3卷;127-135 *

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