CN110305939B

CN110305939B - 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110305939B
Application number: CN201910608584.3A
Authority: CN
Inventors: 黄加栋; 赵一菡; 刘素; 王玉
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2039-07-08
Also published as: CN110305939A

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于DNA三股螺旋结构引发滚环扩增超灵敏检测MicroRNA的荧光生物传感器。为了解决检测MicroRNA的方法中特异性和灵敏度都比较低，且成本高的问题。本发明提供了一种基于基于DNA三股螺旋结构引发滚环扩增超灵敏检测MicroRNA生物传感器，将DNA聚合酶phi29，切刻内切酶Nt.Bbvcl的辅助靶标回收，以及滚环扩增，实现荧光信号循环放大作用；制备方法包括：THSS的合成、环形探针的构建、荧光检测实现信号放大的作用；本申请制备的荧光生物传感器可实现定量检测MicroRNA。

Description

一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于DNA三股螺旋结构引发滚环扩增超灵敏检测MicroRNA的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

MicroRNA（miRNA）是一类长度为17-25个核苷酸的非编码RNA，在RNA沉默和基因的转录调节中起作用，它们在许多生物过程中发挥着关键的调节功能，如肿瘤发生，转移，预后，细胞分化，细胞凋亡和蛋白质合成。异常的miRNA表达会诱发多种疾病，如癌症，糖尿病，心血管疾病和神经病学障碍。因此，miRNA已成为癌症等多种疾病的诊断以及治疗的生物标志物。

近几十年来，许多分析策略包括Northern blotting，实时聚合酶链反应（RT-PCR）和微阵列，已经开发用于鉴定和量化miRNA。然而，Northern印迹耗时，工艺复杂，灵敏度低。至于PCR，需要专业技术人员和处理过程中受污染的脆弱性在很大程度上限制了其低灵敏度，特异性和重复性差。因此，提高miRNA检测的超高灵敏度和特异性需求迫在眉睫。

发明内容

为了解决以上现有技术中，检测miRNA浓度的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性、灵敏度高、检测速度快的基于DNA三股螺旋结构引发滚环扩增荧光法检测miRNA的荧光生物传感器。

一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括缓冲液、目标物、THS链、SP链、padlockprobe链、ligation probe链、T4 DNA连接酶、核酸外切酶 I、核酸外切酶 III、DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl；

所述的DNA链的序列如下：

THS如SEQ No.1所示；

SP如SEQ No.2所示；

padlock probe如SEQ No.3所示；

ligation probe如SEQ No.4所示；

所述的THS 链的5’末端修饰荧光基团FAM， 3’末端修饰猝灭基团BHQ1, padlockprobe链 5’末端磷酸化；

所述的目标物为miRNA-21序列如SEQ No.5所示。

所述的缓冲液PH=7.4，包括50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂。

上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备THSS：将THS链和SP链同时加入到缓冲液中，反应结束后得到THSS即DNA三螺旋结构；

（2）建立环形模板：padlock probe链与ligation probe链结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接探针的复合体，加入核酸外切酶I和外切酶III，对引物进行消化，形成环形模板，备用；

（3）均相反应：将合成好的THSS、环形模板、dNTP、DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl 在缓冲液中混合后，加入不同浓度的目标物miRNA。

（3）荧光仪设置激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530nm。

所述的步骤（1）的反应条件为30℃，3h。

所述的步骤（2）中T4 DNA连接酶的反应温度为16-20℃，反应时间为2 h。灭活T4DNA连接酶的条件优选为65℃下15 min。

所述的步骤（2）中核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的反应温度为37℃，反应时间为2h，灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的条件优选为85℃下10 min。

所述的步骤（3）的反应条件为30℃，2h。

上述荧光生物传感器的检测条件为：荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述荧光生物传感器在定量检测miRNA上的应用。

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

THS: 5’-(FAM) TTTTTTTTTTTTTTTGCTGAGGTCAACATCAGTCCTGGACGGACTCTAACCTTTTTTTTTTTTTTT-(BHQ1)- 3’

SP ：5’-AAAAAAAAAAAAAAA - 3’

miR-21: 5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA- 3’

padlock probe:5’-p-GAGCATGCCCTGGACGGACTCTAACCTTTTTTTTTTTTTTTCTGTTCGCC -3’

ligation probe: 5’- GGCATGCTCGGCGAACAG- 3’

其中THS 链的5’末端修饰荧光基团FAM， 3’末端修饰猝灭基团BHQ1，padlockprobe链 5’末端磷酸化。THS链与SP链可由Watson-Crick和Hoogsteen键形成DNA三股螺旋，将合成好的DNA三股螺旋结构命名为THSS，此时THS链的荧光基团和猝灭基团相互靠近，荧光猝灭。当THSS与目标物miRNA-21相结合后，在DNA聚合酶phi29，切刻内切酶Nt.Bbvcl的辅助靶标回收作用下，不断循环得到类SP链，同时挤下SP链，THSS结构破坏，产生荧光信号，SP链和类SP链又可与环形模板进行碱基互补配对从而进行滚环扩增（RCA），滚RCA的产物可以打开更多的THSS结构，释放荧光，实现荧光信号的增强。通过测量荧光强度来定量检测miRNA。

本发明中miRNA的检测是在均相溶液中实现的，通过DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl辅助的靶标回收，以及借助滚环扩增实现信号的循环放大，从而实现miRNA的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：THS链与SP链可由Watson-Crick和Hoogsteen键形成DNA三股螺旋，将合成好的DNA三股螺旋结构命名为THSS，此时THS链的荧光基团和猝灭基团相互靠近，荧光猝灭。当THSS与目标物miRNA-21相结合后，在DNA聚合酶phi29，切刻内切酶Nt.Bbvcl的辅助靶标回收作用下，不断循环得到类SP链，同时挤下SP链，THSS结构破坏，产生荧光信号，SP链和类SP链又可与环形模板进行碱基互补配对从而进行滚环扩增，滚环扩增的产物可以打开更多的THSS结构，释放荧光，实现荧光信号的增强。通过测量荧光强度来定量检测miRNA。

本发明基于THSS三螺旋的结构形成，荧光猝灭，当结合了miRNA后，DNA聚合酶phi29，切刻内切酶Nt.Bbvcl的辅助靶标回收作用下，挤下SP链，破坏THSS结构，荧光恢复，同时生成多条类SP链，SP链和类SP链与环形模板结合，进行RCA，RCA的产物可以打开更多的THSS结构，释放荧光，产生一定强度的荧光信号的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，弥补了现有对miRNA浓度的检测不足，实现对miRNA的快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1. 特异性识别

THS链与SP链可由Watson-Crick和Hoogsteen键形成DNA三股螺旋，将合成好的DNA三股螺旋结构命名为THSS，此时THS链的荧光基团和猝灭基团相互靠近，荧光猝灭。当THSS与目标物miRNA-21相结合后，在DNA聚合酶phi29，切刻内切酶Nt.Bbvcl的辅助靶标回收作用下，不断循环得到类SP链，同时挤下SP链，THSS结构破坏，产生荧光信号，SP链和类SP链又可与环形模板进行碱基互补配对从而进行滚环扩增（RCA），滚RCA的产物可以打开更多的THSS结构，释放荧光，实现荧光信号的增强。因此合成好的THSS结构与目标物miRNA特异性识别，具有高特异性。

2. 高灵敏及定量检测

本发明中miRNA的检测是在均相溶液中实现的，通过DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl辅助的靶标回收，以及借助滚环扩增实现信号的循环放大，从而实现miRNA的高灵敏检测，最低检测下限为1.1 aM。

3. 速度快

该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短。

4. 可产业化

制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于与多种miRNA的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1环形模板的制备。

配制含50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂ ，10mM DTT和1mM ATP的T4 DNA连接酶缓冲液。

（1）将42 μL灭菌水，6 μL线性模板（100 nM），6 μL连接探针（100 nM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μLT4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶；

（2）向上述反应体系中加入3 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和3 μL的核酸外切酶Ⅲ（100U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。

实施例2 荧光强度随目标物浓度的变化

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

a、将缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂ PH=7.4），10μM THS链、10μM SP链、加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在30℃下孵育3h。

b、向该EP管中加入a反应完成的10μM THSS、10nM的环形模板、3μL dNTP（1 mM）、5unit DNA聚合酶phi29 、2μL切刻内切酶Nt.Bbvcl（10000units/ml）、缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂、 PH=7.4）、不同浓度miRNA（10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、100nM）,总体系为30μL ，30℃的恒温箱中孵育2h；

c、将b步反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。

根据系列miRNA的浓度的荧光强度，作标准曲线。计算回归方程为F=355.4134+107.3559×logC，R²=0.9997, 计算处最低检测下限为1.1 aM。

实施例3 荧光强度随RCA时间的变化

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

b、向该EP管中加入a反应完成的10μM THSS、10nM的环形模板、3μL dNTP（1 mM）、5unit DNA聚合酶phi29 、2μL切刻内切酶Nt.Bbvcl（10000units/ml）、缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂、 PH=7.4）、1nM miRNA,总体系为30μL ，30℃的恒温箱中孵育（0.5h、 1h、 2h、 4h）；

c、将b步反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置

为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果：随着RCA时间的增加，荧光强度不断增强，当时间达到2h后，荧光强度基本不变。说明实验所需的时间为2h。

实施例4荧光强度随DNA聚合酶phi29浓度的变化

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

b、向该EP管中加入a反应完成的10μM THSS、10nM的环形模板、3μL dNTP（1 mM）、DNA聚合酶phi29 （1unit、 2 unit、 4 unit、 5 unit、10 unit）、2μL切刻内切酶Nt.Bbvcl（10000units/ml）、缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂、 PH=7.4）、1nMmiRNA，总体系为30μL ，30℃的恒温箱中孵育2h；

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果：随着DNA聚合酶phi29浓度的增加，荧光强度不断增强，当浓度达到5unit后，荧光强度基本不变。说明实验所需的DNA聚合酶phi29浓度为5unit。

实施例5荧光强度随THSS浓度的变化

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

a、将缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂ PH=7.4），10μM THS链、10μM SP链、加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在30℃下孵育3h；

b、向该EP管中加入a反应完成的THSS（ 1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、20μM）、10nM的环形模板、3μL dNTP（1 mM）、5 unit DNA聚合酶phi29 、2μL切刻内切酶Nt.Bbvcl（10000units/ml）、缓冲液（50 mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂、 PH=7.4）、1nMmiRNA，总体系为30μL，30℃的恒温箱中孵育2h；

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果：随着THSS浓度的增加，荧光强度不断增强，当浓度达到10μM后，荧光强度基本不变。说明实验所需的THSS浓度为10μM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

tttttttttt tttttgctga ggtcaacatc agtctgataa gctagtctgc cttttttttt 60

tttttt 66

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

aaaaaaaaaa aaaaa 15

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

gagcatgccc tggacggacg tctgcctttt tttttttttt tctgttcgcc 50

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

ggcatgctcg gcgaacag 18

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims

1.一种检测miRNA的荧光生物传感器，其特征在于，包括缓冲液、目标物、THS链、SP链、padlock probe链、ligation probe链、T4 DNA连接酶、核酸外切酶 I、核酸外切酶 III、DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl；

DNA链的序列如下：

THS如SEQ No.1所示；

SP如SEQ No.2所示；

padlock probe如SEQ No.3所示；

ligation probe如SEQ No.4所示；

所述的目标物为miRNA-21序列如SEQ No.5所示。

2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的缓冲液PH=7.4，包括50mM Tris-HCl 、150mM KCl、10mM MgCl₂。

3.权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）均相反应：将合成好的THSS、环形模板、dNTP、DNA聚合酶phi29、切刻内切酶Nt.Bbvcl 在缓冲液中混合后，加入不同浓度的目标物miRNA；

（3）荧光仪设置激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）的反应条件为30℃，3h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中T4 DNA连接酶的反应温度为16-20℃，反应时间为2 h；灭活T4 DNA连接酶的条件优选为65℃下15 min。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的反应温度为37℃，反应时间为2 h，灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的条件优选为85℃下10 min。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）的反应条件为30℃，2h。

8.权利要求3所述的制备方法制备的荧光生物传感器的检测方法，其特征在于，包括：荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。