CN109470673B

CN109470673B - 一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN109470673B
Application number: CN201811589771.3A
Authority: CN
Inventors: 黄加栋; 王敬锋; 王玉; 刘素; 王海旺; 宋晓蕾; 张雪; 赵一菡; 瞿晓南; 张儒峰
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2038-12-25
Also published as: CN109470673A

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大方法检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4 DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述的荧光生物传感器的制备方法：（1）构建环形模板，制备复合探针；（2）复合探针与内切酶、目标物结合，实现信号放大。该探针可实现高特异性及超灵敏性检测；且反应温和、检测快、重复性好。

Description

一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大方法检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）是一种不稳定的高能量化合物。ATP是生物体中的重要能量物质，能够为各种生命活动提供能量。ATP提供能量的方式是高能磷酸键的分子内水解：当一个分子中的高能磷酸键被水解时释放的能量是正常化学键的两倍以上，高达30.54 kJ/mol。因此，ATP在细胞内可以大量储存和转移化学能。在细胞的各种生化反应和代谢中，ATP在提供能量中起重要的作用。所以可以根据其含量的变化进监测生物体的指标。异常的ATP活性会导致局部贫血，帕金森综合症以及低血糖等疾病，并且可以用来评价药物。传统的检测ATP的方法主要有：光学分析法、电泳法、色谱法。但存在一下缺点：检测精度相对较低；检测时间较长，操作复杂；检测仪器昂贵，成本高。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测ATP的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大荧光法检测ATP的生物传感器，还涉及其制备方法。

一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4 DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；

所述的适配体-1的序列如SEQ No.1所示；

所述的适配体-2的序列如SEQ No.2所示；

所述的线性挂锁探针的序列如SEQ No.3所示；

所述的连接探针的序列如SEQ No.4所示；

所述的AP探针的序列如SEQ No.5所示。

所述的适配体-1的3’端修饰的反向 dT。

所述的线性挂锁探针5’修饰磷酸基团。

所述的AP探针的3’端修饰的反向 dT，其中3’端序列第七个碱基上修饰无嘌呤无嘧啶位点。

所述的T4 DNA连接酶缓冲液为50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM DTT和1 mMATP。

所述的PBS缓冲液为10 mM Na₂HPO₄、10 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl、1 mM KCl、1 mMMgCl₂、1 mM CaCl₂、pH=7.4。

上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建环形模板，制备复合探针；

（2）复合探针与内切酶、目标物结合，实现信号放大。

所述的步骤（1），包括以下步骤：

S1 将线性挂锁探针与连接探针加入到T4 DNA连接酶缓冲液，灭活体系中的T4DNA连接酶；

S2 加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得到环形模板，4℃条件下保藏；

S3 向环形模板中加入适配体-1、PBS缓冲液，孵育，得到复合探针I；向环形模板中加入无嘌呤无嘧啶探针，孵育，得到复合探针II。

所述的步骤（2）的过程为：将复合探针I、dNTP、复合探针II、适配体-2、phi29 DNA聚合酶、NMM溶液、核酸内切酶IV、缓冲液混合，加入目标物ATP，恒温反应。

所述的NMM为N-methyl mesoporphyrin IX的缩写，所示的NMM溶液为：称取NMM粉末0.0009 g，溶于90 μL 二甲基亚砜中，于-20 ℃保存。

所述的缓冲液为Phi29 DNA聚合酶的缓冲液，含有50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM (NH₄)₂SO₄、4 mM DTT，pH 7.5。

所述的步骤（2）中，核酸内切酶IV最低浓度为0.5 U/μL；phi29 DNA聚合酶最低浓度为1 U/μL；NMM的最低浓度为2.4 μM。

所述的恒温反应的温度为37℃，时间大于等于90min。

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

适配体-1: CACACGAATTCATCTGTTTTTTACCTGGGGGAGTAT-Inverted dT；

适配体-2:

TGCGGAGGAAGGTTTTTTTGGGTATTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCT；

线性挂锁探针:

P-ATTCGTGTGTAGCTTACATGGCTTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTAGCTTACATGGCTTTTCCCAACCCGCCCTACCCCAGATGA；

连接探针: CACACGAATTCATCTG；

AP探针:

CACACGAATTCATCTGTTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCTXACATGGC-Inverted dT。

其中在适配体-1和适配体-2中加粗部分是ATP的两段适配体序列，斜体的部分则是与环形模板的互补序列，3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。在线性挂锁探针中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4 DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板。并且是富含C的序列，使滚环扩增产生富含G的序列形成G-四联体。AP 探针中斜体部分表示能与环状模板的结合序列，X表示无嘌呤无嘧啶位点（AP位点），3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。

本发明中ATP的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现ATP的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；适配体与目标物ATP的识别过程；滚环扩增及内切酶反馈信号放大反应。

（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。在含有一段ATP适配体序列的Apt-1能够与制备好的环状模板通过碱基互补配对结合形成复合探针I；而AP probe能够与制备好的环状模板结合形成复合探针II。

（2）目标物ATP与两段适配体结合作用。当有目标物存在时，基于邻近分析原理，ATP能够同时与复合探针 I和Apt-2结合，产生特定的空间构型。使原本不能杂交的Apt-2与环状模板靠近杂交，同时phi29 DNA聚合酶能够水解游离的不匹配碱基，使不成熟引物转化成成熟引物。

（3）滚环扩增及内切酶反馈信号放大反应。上述反应产生的RCA前体能够进行滚环扩增反应，产生的RCA产物是富含G的序列能够形成G-四联体，NMM嵌入其中使荧光信号增强。同时复合探针II的3’端能够与RCA产物结合，形成双链。当有核酸内切酶IV存在时，能够切断AP位点释放引物-环状模板结构，在phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性作用下，反馈形成反应第（2）步中相同的引物-环状模板的RCA前体。从而实现多倍数放大循环的反馈滚环扩增。

本发明的有益效果：

1. 高特异性检测

两段适配体序列与目标物基于邻近分析原理的特异性识别，利用适配体与ATP的绑定作用、phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性实现反馈放大以及核酸内切酶IV的辅助作用实现了对目标物的高特异性检测。

2. 超灵敏性检测

核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放转化更多引物进入到新一轮的RCA反应中；RCA产物富含碱基G，能够形成G-四联体，嵌入NMM使其荧光增强；利用phi29 DNA聚合酶的聚合作用和3’-5’外切酶活性，在实现滚环扩增放大作用的同时实现反馈再放大以及核酸内切酶放大，实现了荧光信号放大，提高了检测的灵敏度，实现对目标物ATP的超灵敏性检测。

3. 反应温和、检测快、重复性好

该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于与疾病相关的ATP检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该试验的原理图；

图2为实施例2的检测结果图；

图3为实施例3的检测结果图；

图4为实施例4的检测结果图；

图5为实施例5的检测结果图。

图6为实施例6中检测ATP的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1 环形模板及复合探针的制备

配制含50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，10 mM DTT和1 mM ATP的T4 DNA连接酶反应缓冲液。配制含10 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaH₂PO₄, 140 mM NaCl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl₂,1 mM CaCl₂, pH=7.4的PBS缓冲液。

（1）将42 μL灭菌水，6 μL线性模板（10 μM），6 μL连接探针（10 μM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶。

（2）向上述反应体系中加入3 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和3 μL的核酸外切酶Ⅲ（100 U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。

（3）将24 μL灭菌水，4 μL环形模板（1 μM），4 μL Apt-1（1 μM），8 μL PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min，使环形模板与U-DNA充分杂交，制备成复合探针I；以相同方法，将4 μL环形模板（1 μM），4 μL AP probe（1 μM）在37℃孵育40 min制备成复合探针II。

实施例2

一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL复合探针II（1 μM）、2 μLApt-2（1 μM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（浓度分别为0.1 U/μL、0.2 U/μL 、0.25 U/μL、0.5 U/μL、0.75 U/μL、1 U/μL）、2 μL NMM（2.4 μM）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入ATP（100 nM），混匀后37℃恒温反应90 min；

（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。

检测结果见图2，从图中可以看出，随着核酸内切酶IV量的增加，荧光强度不断增强，在核酸内切酶IV量达到0.5 U/μL之后，荧光强度基本不变。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。

实施例3

（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL复合探针II（1 μM）、2 μLApt-2（1 μM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（浓度分别为0.1 U/μL、0.2 U/μL 、0.25 U/μL、0.5U/μL、1 U/μL、1.5 U/μL、2 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、2 μL NMM（2.4 μM）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入ATP（100 nM），混匀后37℃恒温反应90 min；

检测结果见图3，从图中可以看出，随着phi29 DNA聚合酶量的增加，荧光强度不断增强，在phi29 DNA聚合酶量达到1 U/μL之后，荧光强度基本不变。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

实施例4 荧光强度随NMM浓度的变化

（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL复合探针II（1 μM）、2 μLApt-2（1 μM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、2 μL NMM（浓度分别为0.6 μM 、1.2 μM 、1.8 μM 、2.4 μM、3.0 μM、 3.6 μM）在2 μL缓冲液（50 mMTris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入ATP（100 nM），混匀后37℃恒温反应90 min；

检测结果见图4，从图中可以看出，随着NMM量的增加，荧光强度不断增强，在NMM量达到2.4 μM之后，荧光强度基本不变。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

实施例5 荧光强度随反应时间的变化

（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL复合探针II（1 μM）、2 μLApt-2（1 μM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、2 μL NMM（2.4 μM）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM DTT,pH 7.5）中混合后分别加入ATP（100 nM），混匀后37℃恒温反应时间分别为10 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。

检测结果见图5，从图中可以看出，随着反应时间的增加，荧光强度不断增强，在反应时间达到90 min之后，荧光强度基本不变。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

实施例6 对ATP的检测

（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL复合探针II（1 μM）、2 μLApt-2（1 μM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、2 μL NMM（2.4 μM）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM DTT,pH 7.5）中混合后分别加入不同浓度的ATP，混匀后37℃恒温反应时间90 min。

（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。检测结果见图6。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

cacacgaatt catctgtttt ttacctgggg gagtat 36

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213>人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

tgcggaggaa ggtttttttg ggtatttttt ttttttactc ttcctagct 49

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213>人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

attcgtgtgt agcttacatg gcttttccca acccgcccta ccctttttag cttacatggc 60

ttttcccaac ccgccctacc ccagatga 88

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

cacacgaatt catctg 16

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213>人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

cacacgaatt catctgtttt ttttttttac tcttcctagc tacatggc 48

Claims

1.一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，其特征在于，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4 DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29 DNA聚合酶、NMM溶液、核酸内切酶IV；

所述的适配体-1的序列如SEQ No.1所示；

所述的适配体-2的序列如SEQ No.2所示；

所述的线性挂锁探针的序列如SEQ No.3所示；

所述的连接探针的序列如SEQ No.4所示；

所述的AP探针的序列如SEQ No.5所示；

所述的线性挂锁探针5’ 修饰磷酸基团；

所述的NMM为N-methyl mesoporphyrin IX的缩写。

2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的适配体-1的3’端修饰的反向 dT。

3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的AP探针的3’端修饰的反向 dT，其中3’端序列第七个碱基上修饰无嘌呤无嘧啶位点。

4.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的T4 DNA连接酶缓冲液为50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM DTT和1 mM ATP；所述的PBS缓冲液为10 mM Na₂HPO₄、10 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl、1 mM KCl、1 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、pH=7.4。

5.一种权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建环形模板，制备复合探针；

（2）复合探针与内切酶、目标物结合，实现信号放大。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1），包括以下步骤：

S1 将线性挂锁探针与连接探针加入到T4 DNA连接酶缓冲液，灭活体系中的T4 DNA连接酶；

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的过程为：将复合探针I、dNTP、复合探针II、适配体-2、phi29 DNA聚合酶、NMM溶液、核酸内切酶IV、缓冲液混合，加入目标物ATP，恒温反应。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的NMM为N-methylmesoporphyrin IX的缩写，所示的NMM溶液为：称取NMM粉末0.0009 g，溶于90 μL 二甲基亚砜中，于-20 ℃保存；所述的缓冲液为Phi29 DNA聚合酶的缓冲液，含有50 mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10 mM (NH₄)₂SO₄、4 mM DTT，pH 7.5；所述的步骤（2）中，核酸内切酶IV最低浓度为0.5 U/μL；phi29 DNA聚合酶最低浓度为1 U/μL；NMM的最低浓度为2.4 μM。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的恒温反应的温度为37℃，时间大于等于90min。