WO2023118692A1 - Procede de dosage avec des particules magnetiques - Google Patents

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WO2023118692A1
WO2023118692A1 PCT/FR2022/052334 FR2022052334W WO2023118692A1 WO 2023118692 A1 WO2023118692 A1 WO 2023118692A1 FR 2022052334 W FR2022052334 W FR 2022052334W WO 2023118692 A1 WO2023118692 A1 WO 2023118692A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
interfering
complexes
magnetic particles
liquid medium
aggregates
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052334
Other languages
English (en)
Inventor
Aurélien DAYNES
Nevzat TEMUROK
Original Assignee
Horiba Abx Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Horiba Abx Sas filed Critical Horiba Abx Sas
Publication of WO2023118692A1 publication Critical patent/WO2023118692A1/fr

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format

Definitions

  • the invention relates to a method for assaying a target analyte in a liquid sample, and to an assay device arranged to carry out this method.
  • the invention relates to the field of assaying soluble molecules of interest in a liquid medium. This is in particular the field of the immunological assay of proteins, for example in a sample of whole blood.
  • the state of the art offers assay methods which use magnetic particles for the capture and/or extraction of analytes present in a liquid sample.
  • the magnetic particles carry one or more receptors specific to the target analyte, which allows them to bind to the analyte to form complexes.
  • the complexes can then be captured by the application of a magnetic field.
  • Applications concerning the extraction of nucleic acids generally comprise a plurality of successive steps including the lysis of the cells to release the nucleic acids, the bringing into contact of the lysed solution with the magnetic particles to capture the nucleic acids, applying a magnetic field (also called “magnetization”) and washing. This is followed by the elution of nucleic acids (usually by a change in pH) and the removal of magnetic particles. The isolated nucleic acids can then be processed and assayed.
  • Heterogeneous methods require a greater number of steps, which generally makes them long to implement. They are also complex to implement. Kourilov, Vitaly, and Michael Steinitz, "Magnetic-bead enzyme-linked immunosorbent assay verifies adsorption of ligand and epitope accessibility" Analytical biochemistry 311.2 (2002): 166-170 describes a heterogeneous method.
  • a non-specific signal is notably measured when at least one interfering analyte is in competition with T target analyte to bind to magnetic particles or to the receptor specific to T target analyte.
  • interfering analyte can vary. For example, it may be a protein whose three-dimensional structure is close to that of the target analyte or even a molecule carrying an electrical charge. More generally, an interfering analyte can be any molecule exhibiting a non-negligible affinity for the magnetic particles or for the receptors grafted to their surface. It follows that the signal measured during the assay test is never zero. Existing methods therefore seek to reduce the probability of a non-specific signal. However, the existing methods generally do not make it possible to differentiate between a specific signal and a non-specific signal.
  • the present invention improves the situation.
  • the present invention relates to a method for assaying a target analyte in a biological sample in a liquid medium, comprising the following steps: a. bringing the biological sample into contact with first magnetic particles carrying a first receptor specific to a first attachment site of the target analyte so as to form first complexes by binding the first magnetic particles with the target analyte, this bringing into contact being accompanied, when an interfering analyte is present in the sample, by the formation of interfering complexes by the non-specific binding of said interfering analyte to the first magnetic particles; b.
  • step a the application of a first magnetic field, and its maintenance, so as to locally bring together all the complexes formed in step a., and if necessary to agglomerate interfering complexes with each other to form interfering aggregates;
  • step b the cancellation of the magnetic field applied in step b. and the addition to the liquid medium of second magnetic particles carrying a second receptor specific to a second attachment site of the target analyte;
  • step d the measurement of a first quantity representative of the quantity of interfering aggregates in the liquid medium, to identify the presence or absence of said interfering aggregates;
  • step a includes the formation of interfering complexes by the binding of the first magnetic particles with the interfering analyte;
  • step b. thus includes the formation of aggregates between interfering complexes;
  • step d. then provides for the quantitative measurement of interfering aggregates trained;
  • step f. provides a calculation to determine the amount of target analyte present in the biological sample, as well as the amount of interfering analyte.
  • the method of the invention makes it possible to overcome excessive dilution and consequently to ensure good analytical sensitivity. Furthermore, the invention limits the steps in order to simplify the whole test. This results in particular in a drastically reduced time which does not exceed the maximum duration of approximately 15 minutes.
  • the interfering complexes do not form. It follows that the quantity measured in step d. is zero or does not exceed a predefined threshold value.
  • the method of the invention thus makes it possible not only to identify the presence of an interfering analyte in the biological sample, but also to quantify it.
  • the method makes it possible to deduce the quantity of target analyte in the biological sample.
  • Step f. may include the calculation of the difference between the second quantity measured at this step f. and the first quantity measured in step c. to determine the amount of target analyte.
  • the cancellation of the first magnetic field in step c. is followed or accompanied by the addition of second magnetic particles, then the measurement of step d. of the first quantity representative of the quantity of interfering aggregates.
  • this measurement can be carried out directly after the cancellation of the magnetic field, that is to say before the introduction of the second magnetic particles into the liquid medium (or reaction medium).
  • the second magnetic field is preferably canceled prior to said measure. This increases the sensitivity of the measurement.
  • each first receptor is specific to a first attachment site of the target analyte and each second receptor is specific to a second attachment site, different from the first, of the analyte. target.
  • the flexibility resulting from two distinct attachment sites makes it possible to quickly adapt the method of the invention to the various needs according to the nature of the application implemented.
  • the magnetic field applied in step b. is greater than or equal to 100 mT, and the maintenance of the magnetic field is less than or equal to 5 minutes, and preferably less than or equal to 3 minutes.
  • the application of the first magnetic field in step b. and applying the second magnetic field in step e. comprises magnetization at 8 mT for 1 second, followed by three successive sequences of magnetizations and the following breaks: 15 mT for 60 seconds, 0 mT for 28 seconds, 8 mT for 1 second, 0 mT for 1 second.
  • the magnetization and cut-off sequence chosen allows increased precision of the method of the invention by promoting the formation of complexes between the analytes and the magnetic particles on the one hand, and by allowing a more precise reading on the other. go.
  • the measurements performed in steps d. and F. are chosen from the group consisting of a measurement by turbidimetry, a measurement by nephelometry and a measurement by counting (by analysis and/or image processing or by flow in particular). This allows you to obtain reliable results quickly.
  • step a. involves the addition of a diluent so as to dilute the biological sample, the ratio between the sample and the diluent being greater than or equal to 1:10.
  • This dilution makes it possible in particular to reduce the viscosity of the medium to facilitate the capture of the molecule to be assayed, or in other words the formation of the first complexes.
  • the diluent may contain agents to reduce the likelihood of magnetic particles clumping together.
  • nonionic surfactants anionic surfactants, cationic surfactants, zwitterionic surfactants, proteins (albumin, casein, gelatin, antibodies in particular) or polymers (such as polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol).
  • the application of the first magnetic field in step b. makes it possible to extract the first complexes from the liquid medium. This makes it particularly possible to work in complex media (in whole blood for example).
  • the biological sample is whole blood.
  • An advantage of the invention is that the steps of the method can be applied directly to a blood sample, without requiring washing and/or dilution.
  • step b. involves removal of liquid medium and addition of reaction buffer.
  • the reaction buffer may contain an anti-aggregation agent (nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, zwitterionic surfactants, proteins or polymers) and/or contain a cell lysing agent (saponins, quaternary ammoniums, sodium dodecyl sulphate notably). It is also possible to provide at least one wash between the removal of the liquid medium and the addition of the reaction buffer. This washing makes it possible to further increase the specificity of the method of the invention.
  • the anti-aggregation agents make it possible to dissociate any aggregates of magnetic particles formed, while the cell lysing agent makes it possible to lyse potential cells which would not have been evacuated with the elimination of the liquid medium. It can be noted that unlike the methods of the prior art, the lysing agent does not require an additional dilution of the sample. In this embodiment, it is then possible to provide for a more or less long incubation so as to allow sufficient action of the agent(s) present in the reaction buffer.
  • FIG.1 shows a block diagram of the invention.
  • FIG.2 shows a principle figure of a first step of incubation of a biological sample with first magnetic particles according to the invention
  • FIG.3 shows a principle figure of a first magnetization step of the method of the invention
  • FIG.4 shows a principle figure of a second step of incubation of a biological sample with second magnetic particles according to the invention
  • FIG.5 shows a basic figure of a second magnetization step of the method of the invention
  • FIG.6 shows a basic figure of a first step of incubation of a biological sample comprising molecules interfering with first magnetic particles according to the invention
  • FIG.7 shows a basic figure of a first magnetization step of the method of the invention applied to a biological sample comprising interfering molecules
  • FIG.8 shows a basic figure of a second step of incubation of a biological sample comprising molecules interfering with second magnetic particles according to the invention
  • FIG.9 shows a graph of the optical density as a function of a concentration of prostate-specific antigen (PSA) in a first embodiment
  • FIG.10 shows a graph of the optical density as a function of an antibody (Ac) concentration of a second embodiment
  • FIG.11 shows a graph of the optical density as a function of an antibody (Ac) concentration of the second embodiment
  • FIG.12 shows a graph of the optical density as a function of a concentration of anti-PCT antibody (procalcitonin) of a third embodiment
  • FIG.13 shows a graph of the optical density as a function of a concentration of prostate specific antigen (PSA) of a sixth example (not according to the invention).
  • PSA prostate specific antigen
  • FIG.14 shows a graph of the optical density as a function of a concentration of prostate specific antigen (PSA) of a seventh example (according to the invention).
  • the present invention relates to the identification of an analyte in a liquid biological sample.
  • the sample can be of any suitable type, such as for example a sample of bone marrow, cerebrospinal fluid, lymph, urine, or preferably a whole blood sample.
  • the target analyte can be, for example, a protein, a nucleic acid or any other molecule of interest present in the sample.
  • the target analyte is present in a greater or lesser quantity in the sample.
  • a sample may comprise a target molecule present in a higher or lower number of copies.
  • the target analyte concentration can be more or less important in the sample. This also applies to any other non-target analytes potentially present in the sample.
  • the invention uses a technique for capturing the target analyte(s) by magnetic particles which have been functionalized at the surface with ligands specific to each target analyte. These may be particles of the type described above.
  • the diameter of the magnetic particles used is generally between 5 nm and 10,000 nm, preferably between 100 nm and 500 nm.
  • a first step a involves bringing the biological sample into contact with first magnetic particles
  • FIG.1 shows a block diagram of the invention.
  • this diagram generally shows an embodiment of the implementation of the method of the invention.
  • a first step a. the first magnetic particles are mixed with a liquid biological sample in which there is or is not a target analyte to be assayed in the presence of a buffer.
  • the biological sample may additionally, but need not, contain an interfering analyte.
  • the biological sample is brought into contact with first magnetic particles.
  • Each magnetic particle carries a receptor specific to a first attachment site of the target analyte so as to form first complexes by the binding of first magnetic particles with the target analyte when the latter is in the biological sample.
  • This contact is accompanied when an interfering analyte is present in the sample, by the formation of interfering complexes by the non-specific binding of the interfering analyte to the first magnetic particles.
  • no interfering complexes are formed.
  • the [Fig.2] shows a biological sample comprising a liquid medium containing molecules.
  • FIG.2] shows first magnetic particles 10 or PMI carrying specific receptors, here called first receptors 101. These first magnetic particles 10 are brought into contact with the molecule to be assayed present in the biological sample.
  • the molecule to be assayed qualifies as a target analyte 20.
  • the biological sample also comprises other species or molecules 40, 50 which may be, for example, soluble molecules, cells or particles (or interfering molecules 30 as will see later).
  • step a has the consequence that the molecule 20 is captured by the first receptors 101.
  • the first receptors 101 are specific to the target analyte 20.
  • monoclonal antibodies or parts of antibodies are used in particular as receptors.
  • the binding between each receptor and each target analyte results in the formation of complexes, which are referred to here as first CL complexes.
  • the complexes are therefore formed by the first magnetic particles 10 associated with the target analytes 20. These complexes are dispersed in the liquid medium.
  • the contacting of step a. can last about 10 minutes, preferably less than 5 minutes.
  • provision may be made to mix or agitate the liquid medium during the incubation phase in order to increase the capture yield.
  • Step a. may include the addition of a diluent so as to dilute the biological sample, or more particularly the liquid medium. Generally one will choose a dilution not exceeding a division by ten of the initial concentration (i.e. lOx).
  • the method of the invention then provides a step b., in which a first magnetic field is applied.
  • a first magnetic field is applied.
  • uniting the complexes locally is meant an organization of the latter within the liquid medium. Depending on the applied magnetic field, the location may vary.
  • step b. a main effect of this step b., and more particularly of the application of the magnetic field, is indeed the formation of interfering aggregates resulting from the agglomeration of interfering complexes between them, when the latter formed in step a. bringing the biological sample into contact with the first magnetic particles.
  • this step provides for attracting the first magnetic particles towards a magnet. Consequently, the first complexes formed in step a., which essentially consist of the association of the first magnetic particles with the target analyte, are attracted towards the magnet. It follows that all the complexes formed in step a. are gathered locally against the magnet, or against an environment close to the magnet. This makes it possible to isolate the first complexes and separate them from the liquid medium. In other words, in this particular embodiment, the first complexes are extracted from the liquid medium of the biological sample. Logically, the separation of the first complexes from the liquid medium will only be complete when the liquid medium is evacuated later in the process. In this embodiment, step b. may provide for the maintenance of the magnetic field for a certain time, for example 5 to 10 minutes, preferably less than 5 minutes. This contributes to the good extraction of all the first complexes formed in step a. of the liquid medium.
  • the [Eig.3] shows the magnetic particles 10 attracted or organized according to the field B o generated by a magnet.
  • the first Cl complexes are assembled locally.
  • a reaction buffer which is also liquid.
  • the liquid medium is first evacuated from the reaction vessel, then the reaction buffer is poured into the vessel.
  • a permanent magnet is generally provided which makes it possible to assemble the first complexes Cl carrying the target analyte 20 locally against the latter.
  • Target analyte molecules 20, bound to receptors 101 are isolated and retained during the evacuation of the liquid medium from the biological sample.
  • the reaction buffer is added in place of the liquid medium.
  • one or more washes can be provided between the removal of the liquid medium and the addition of the reaction buffer.
  • This washing makes it possible to increase the specificity of the method of the invention.
  • the magnetic field can be maintained or cut off. In the latter case, it is necessary to reapply the magnetic field for a given time after each washing so as to again capture the magnetic particles in suspension.
  • the reaction buffer may comprise one or more anti-aggregation agents and/or one or more cell lysing agents.
  • the anti-aggregation agents make it possible to dissociate any aggregates or clusters of magnetic particles formed in step a. and/or in step b. The precision of the method of the invention is thus increased.
  • the cell lysing agent makes it possible to lyse potential cells which would not have been evacuated with the elimination of the liquid medium described above. It can be noted that unlike the methods of the prior art, the lysing agent does not require an additional dilution of the sample.
  • Step c. of the method of the invention comprises the cancellation of the magnetic field B o .
  • the particles and complexes disperse in the liquid medium, as well as any aggregates formed.
  • Step c. further comprises the addition in the liquid medium of second magnetic particles 11, or PM2, carrying a second receptor 111 specific to the target analyte 20.
  • the second receptors 111 of the second magnetic particles 11 do not bind, or very little, at F target analyte 20. If necessary, stirring of the reaction medium can be provided.
  • the target analytes 20 generally have a three-dimensional shape making it possible to choose specific receptors 101, 111, which are diversified.
  • each first receptor 101 is specific to a first target analyte attachment site 20 and each second receptor 111 is specific to a second target analyte attachment site, different from the first.
  • This makes it possible to increase the specificity of the method of the invention.
  • This flexibility resulting from two attachment sites also makes it possible to quickly adapt the method of the invention to various needs, and in particular according to the nature of the application implemented. It is thus possible to diversify the receptors according to the target analyte to be assayed.
  • the method of the invention then provides for a step d., in which a first quantity representative of the quantity of interfering aggregates in the liquid medium is measured, to identify the presence or absence of said interfering aggregates.
  • a predefined threshold value When the measured quantity is zero or is below a predefined threshold value, there are no (or extremely few) interfering aggregates in the liquid medium. In this case, it can be assumed that there are no (or very few) interfering analytes in the biological sample.
  • the measured quantity is non-zero or exceeds the predefined threshold value, there are interfering aggregates in the liquid medium, and therefore an interfering analyte in the biological sample.
  • the measurement can in particular be carried out by turbidimetry, by nephelometry or by counting (by analysis and/or image processing or by flow in particular).
  • the method of the invention then provides a step e., in which a second magnetic field is applied so as to form second complexes by binding the first complexes C1 to the second magnetic particles 11, or more precisely to the receptors 111 carried by the second magnetic particles.
  • a second magnetic field is applied so as to form second complexes by binding the first complexes C1 to the second magnetic particles 11, or more precisely to the receptors 111 carried by the second magnetic particles.
  • these second complexes are comparable to interfering aggregates, namely that they can be detected relatively easily by measurements optical density in particular.
  • the [Fig.5] shows the second complexes 61 generated by the application of the second magnetic field B1.
  • the target analyte 20 is sandwiched by the first and second receptors respectively carried by the first 10 and second 11 particles magnetic.
  • this step e. aims to generate links or clusters of magnetic particles.
  • the “sandwich” complexes or molecules, formed by the first 10 and second 11 magnetic particles bordering the target analyte 20, can be detected by various techniques including in particular an optical density measurement.
  • the documents WO 2009/034271, FR2919390 and FR2959820 describe assay methods in which a series of cycles of applications and interruptions of a magnetic field is applied to the liquid reaction medium to cause the formation of links or clumps of magnetic particles during the reaction between magnetic particles and a target analyte.
  • Each application of the field results in an increase in the number of analyte/magnetic particle bonds and each interruption of the field causes a dispersion of the unbound magnetic particles in the liquid medium.
  • the number and/or the size of the links or clusters of bound particles increase. This proportionally increases the turbidity of the reaction medium.
  • the measurements of the optical density of the medium after each break in the magnetic field thus make it possible to calculate the concentration of F target analyte in the sample.
  • the first magnetic field B o applied during step b. may be identical to or different from the second magnetic field B1 applied in step e.
  • the field B o of step b. must combine a large intensity (typically greater than 100 mT) with a large gradient in the direction of magnetization.
  • a field B1 of moderate intensity typically less than 50 mT
  • the application of the second magnetic field B1 includes preferably a plurality of magnetic pulses, separated by rest times.
  • this step e. foresees a magnetization at 8 mT for 1 second, followed by three successive sequences of magnetizations and the following breaks: 15 mT for 60 seconds, 0 mT for 28 seconds, 8 mT for 1 second, 0 mT for 1 second:
  • the different pulses at 8 mT for 1 second essentially allow a more precise reading of the state of aggregation of the PMI particles in the event of the presence of an interfering analyte.
  • the pulse/rest series of 15 mT for 60 seconds, followed by rest (0 mT) for 28 seconds, followed by 8 mT for 1 second, followed by rest (0 mT) for 1 second essentially allows complexes to form.
  • the second complexes 61 form aggregates which can be detected by measuring the optical density or by counting, for example. More generally, the second complexes can be detected due to the fact that the magnetic particles are aggregated together due to the binding of the target analyte to the two receptors (sandwich), whereas the signal of a first complex does not differ significantly from that of a free magnetic particle, given the difference in size (and/or optical index and/or magnetic moment) between a magnetic particle and a target analyte molecule.
  • step f. of the method of the invention aims to determine the quantity of second complexes formed in order to deduce therefrom the quantity of target analytes present in the biological sample.
  • step f. provides for the measurement of all the aggregates, i.e. all of the second complexes and, where applicable, of the interfering aggregates.
  • this measurement makes it possible to determine the quantity of second complexes 61 formed in step e., and this in particular according to the measurement of interfering aggregates alone carried out beforehand in step d.
  • the result of the measurement is then used to calculate the quantity of target analyte 20 present in the biological sample.
  • the invention has the advantage of identifying not only the target analyte, but also an interfering analyte, or even several interfering analytes.
  • Step a. includes in this case not only the formation of the first Cl complexes, but also the formation of interfering complexes Cint by the bond between the first magnetic particles 10 and an interfering analyte 30.
  • the interfering complexes Cint are then dispersed in the liquid medium of the biological sample.
  • step a the magnetic particles 10 carrying re-specific receptors 101 are brought into contact with the molecule to be assayed 20, in the presence of other species 30, 40, which may be soluble molecules, cells, particles, or other.
  • species 30, 40 which may be soluble molecules, cells, particles, or other.
  • One of these species molecules 30 in [Fig.6]
  • Molecule 20 is nevertheless captured by receptors 101.
  • step b. (see [Fig.7]), the first magnetic particles 10 are attracted or organized locally within the liquid medium according to the field B o generated by the magnet.
  • the liquid medium is replaced by the reaction buffer.
  • a permanent magnet (not shown in the drawings) which attracts the magnetic particles.
  • the molecules 20 (target analyte) bound to the receptors 101 as well as the molecules 30 bound non-specifically to the magnetic particles 10 are brought together locally within the liquid medium.
  • This local assembly at a given location within the liquid medium of the first Cl complexes and the interfering complexes Cint results in the formation of non-specific aggregates 60 (or interfering aggregates 60) between the first Cl complexes and the interfering complexes Cint.
  • These non-specific aggregates can also be formed by the agglomeration of interfering Cint complexes with each other. More generally, non-specific aggregates form essentially identically to the complexes of interest, i.e. between a Cint complex and a nearby magnetic particle.
  • step d allows the quantitative measurement of these in the liquid medium.
  • step f. uses the measurement made in step d. to calculate the quantity of the specific aggregates constituted by the second complexes. For this purpose, the calculation takes into account both the measurement made in step d. and that performed in step f. It is thus possible to deduce the quantity of target analyte present in the biological sample.
  • step d. limits the risk of interference that can lead to false positive results.
  • step b. can lead to the formation of non-specific aggregates of first magnetic particles (PMI).
  • PMI first magnetic particles
  • step f. these aggregates would be detected during step f. only, and this without it being possible to distinguish specific aggregates, caused by the presence of the molecule to be assayed (target analyte), from non-specific aggregates, caused by the presence of another molecule (interfering analyte).
  • step d. it is for example possible to determine an initial aggregation threshold beyond which no result will be returned, due to interference, thus avoiding returning erroneous results.
  • An advantage of the invention is that the aggregation measurements during steps d. and F. can be combined to calculate an estimate of specific aggregation, excluding non-specific aggregation.
  • step d it is also possible to stop the process of the invention after step d. If the quantity of non-specific aggregates measured is too high and/or exceeds a predefined sensitivity threshold, the method of the invention can be interrupted after carrying out the measurement of step d. It is then possible to repeat the method of the invention by selecting other receptors specific to the target analyte.
  • the method described above is therefore stopped after step d, namely after the measurement of the first quantity representative of the quantity of interfering aggregates in the liquid medium.
  • a threshold value can be set beyond which the results are not sufficiently sensitive. This avoids the execution of subsequent steps which become useless or at least unusable. Unnecessary additional costs and loss of time can thus be avoided.
  • a PSA (prostate-specific antigen) assay test is implemented.
  • Magnetic particles Carboxyl Adembeads 200 nm, Ademtech
  • a batch of particles is functionalized with a first clone (P4, reference 7820-0370, available from Bio-Rad). Referring to the general description, these are the first PMI magnetic particles.
  • a second batch is functionalized with a second clone recognizing a different epitope (214, reference 7820-0217, available from Bio-Rad). Referring to the general description, these are the second PM2 magnetic particles.
  • the samples consist of PSA (reference P3338, available from the company Sigma-Aldrich) purified to 100 nM diluted in horse serum (reference H1270, available from the company Sigma-Aldrich) at different concentrations.
  • the target concentration of PSA in the samples is therefore known.
  • the assaying of the samples is carried out as follows:
  • the medium is magnetized for 3 min on a permanent magnet, and the supernatant is removed;
  • the particles are taken up in 73.5 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108 0.8%; 800mM NaCl; NaN 3 0.09% and 1.5 ⁇ l of functionalized particles PM2 (214) at 1% are added.
  • the light intensity through the reaction medium illuminated by an RC-LED at 650 nm is measured and the difference in optical density before and after application of the last pulse of 8 mT intensity (Dodiff 3 ) is used as signal of interest.
  • Control measurements are carried out with the same samples and the same particles, but without an extraction step (step c. with reference to the general description).
  • the reaction medium consisting of 57 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108 0.8%; 800mM NaCl; NaN 3 0.09%, 15 pL of sample and 1.5 pL of each batch of functionalized particles, is subjected to the same magnetic field cycle as described above.
  • FIG.9 shows the results and the corresponding curves of Dodiff3 as a function of the PSA concentration.
  • the method using the method according to the invention makes it possible to obtain a signal which increases with the concentration of PSA in the sample, and with a higher activity than the control tests.
  • Magnetic particles (Carboxyl Adembeads 200 nm, from the company Ademtech), are functionalized with anti-PSA antibodies.
  • a batch of PMI particles is functionalized with a first clone (P4, reference 7820-0370, available from Bio-Rad), and a second batch PM2 is functionalized with a second clone recognizing a different epitope (214, reference 7820-0217, available from Bio-Rad).
  • the samples consist of a 9 g/L NaCl solution to which is added an anti-mouse IgG antibody (Ab) (M8642, available from Sigma-Aldrich) capable of binding non-specifically to the antibodies anti-PSA grafted onto the particles.
  • Ab anti-mouse IgG antibody
  • the assaying of the samples is carried out as follows:
  • the medium is magnetized for 3 min on a permanent magnet, and the supernatant is eliminated;
  • the particles are taken up in 73.5 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108
  • Control measurements are carried out with the same samples and the same particles, but without an extraction step.
  • the reaction medium consisting of 57 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108 0.8%; 800mM NaCl; NaN 3 0.09%, 15 pL of sample and 1.5 pL of each batch of functionalized particles, is subjected to the same magnetic field cycle as described above.
  • the [Fig.10] shows the results and the corresponding curves of Dodiff3 in function of the Ac concentration before aggregation.
  • FIG.11 shows the results and the corresponding curves of Dodiff3 as a function of the Ac concentration after aggregation.
  • the aggregation signal is increased in the presence of the interfering antibody.
  • the sample contains PSA or an interfering molecule.
  • Tests making it possible to verify the applicability of the method of the invention on a sample of whole blood are carried out.
  • Magnetic particles (Carboxyl Adembeads 200 nm, available from the company Ademtech), are functionalized with anti-PCT antibodies (procalcitonin).
  • a batch of PMI particles is functionalized with a first clone (E86813M, available from Meridian Life Sciences), and a second batch PM2 is functionalized with a second clone recognizing a different epitope (E01342M, available from Meridian Life Sciences).
  • the samples consist of 400 nM recombinant PCT diluted in human blood at different concentrations. The target concentration of PCT in the samples is therefore known.
  • the samples are assayed as follows:
  • E86813M at 1% and 71.5 pL of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108 0.8%; 800mM NaCl; DTT 10mM; NaN3 0.09% for 2 min; The medium is magnetized for 3 min on a permanent magnet, and the supernatant is removed;
  • the particles are taken up in 73.5 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer, pH 7.5; F108
  • the light intensity through the reaction medium illuminated by an RC-LED at 650 nm is measured and the difference in optical density before and after application of the last pulse of 8 mT intensity (Dodiff3) is used as the diff signal. 'interest.
  • the signal measured as a function of the PCT concentration in the sample is independent of the nature of the latter, blood or plasma. This demonstrates the possibility of applying the described method to a whole blood sample.
  • the first and second magnetic particles are introduced into the liquid medium simultaneously. Consequently, it is not an example according to the invention.
  • Samples prepared include:
  • the prepared samples include:
  • the Cagg cycle (detailed above) is applied to this sample, then 3 ⁇ L of 1% w/v 214 particles are added to the medium and the Cagg cycle is applied again.
  • the ADO 2 or Dodiff 3 2 indicators increase with the concentration of antibody introduced.
  • the values of ADO 1 or Dodiff d can be used to detect the presence of aggregates prior to the application of the second cycle, linked to an interference in the sample.
  • the application of a threshold chosen at 5 mOD makes it possible to detect the samples containing the in- terferent.
  • the first and second magnetic particles (PMI and
  • a dose-response curve is produced without interfering antibodies.
  • the samples include:
  • the samples include:
  • the Dodiffo value does not vary significantly, and therefore does not make it possible to predict the presence of an interfering molecule.
  • this molecule leads to an overestimation of the Dodiff 3 or ADO values.
  • the sample containing no PSA would be titrated at approximately 5 nM, and the sample containing InM of PSA would be titrated at more than 8 nM.
  • a dose-response curve is produced without interfering antibodies.
  • the samples include:
  • the Cagg cycle is applied to this sample, then 3 ⁇ l of 214 1% w/v particles are added to the middle and the Cagg cycle is again applied.
  • a dose-response curve is then produced by adding an anti-mouse antibody.
  • the samples include:
  • the Cagg cycle is applied to this sample, then 3 ⁇ l of 1% w/v 214 particles are added to the medium and the Cagg cycle is again applied.
  • the Dodiff 3 2 or ADO 2 values are higher, at a given PSA concentration, than in the case without interfering antibodies.
  • the Dodiff 1 or ADO 1 measurement makes it possible to detect the presence of the interfering molecule. It is therefore possible to apply an alarm to avoid giving an erroneous result.
  • FIG. 14 shows the differences in optical density (mOD) of Dodiff 1 , respectively with and without interfering antibody.
  • the method of the invention can be carried out in a device of known type, if necessary adapted using the knowledge of those skilled in the art.

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Abstract

L'invention vise un procédé de de dosage d'un analyte cible dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes suivantes (a.) la mise en contact de l'échantillon biologique avec de premières particules magnétiques (10) portant un premier récepteur (101) spécifique à un premier site d'attache de l'analyte cible (20) de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques (10) avec l'analyte cible (20) cette mise en contact s'accompagnant, lorsqu'un analyte interférent (30) est présent dans l'échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique dudit analyte interférant (30) aux premières particules magnétiques (10); (b.) l'application d'un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l'ensemble des complexes formés à l'étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents; (c.) l'annulation du champ magnétique appliqué à l'étape b. et l'ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques (11) portants un deuxième récepteur (111) spécifique à un deuxième site d'attache de l'analyte cible (20); (d.) la mesure d'une première grandeur repré- sentative de la quantité d'agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents; (e.) l'application d'un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes (61) par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques (11); et (f.) la mesure d'une deuxième grandeur repré- sentative de l'ensemble de la quantité d'agrégats interférents et de la quantité des deuxième complexes (61) dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes (61) formés à l'étape e. en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d'analyte cible (20) présent dans l'échantillon biologique, et le cas échéant la quantité d'analyte interférent.

Description

Description
Titre de l’invention : PROCÉDÉ DE DOSAGE
[0001] L’invention se rapporte à un procédé de dosage d’un analyte cible dans un échantillon liquide, et à un dispositif de dosage agencé pour réaliser ce procédé.
[0002] Plus généralement, l’invention relève du domaine du dosage de molécules d’intérêt solubles dans un milieu liquide. Il s’agit en particulier du domaine du dosage immunologique de protéines, par exemple dans un échantillon de sang total.
[0003] L’état de la technique propose des méthodes de dosage qui utilisent des particules magnétiques pour la capture et/ou l’extraction d’ analytes présents dans un échantillon liquide. Pour cela, les particules magnétiques portent un ou plusieurs récepteurs spécifiques à 1’ analyte cible, ce qui leur permet de se lier à F analyte pour former des complexes. Les complexes peuvent ensuite être capturés par l’application d’un champ magnétique.
[0004] Les applications des dosages à base de particules magnétiques sont vastes. Certaines visent des applications en oncologie, voir par exemple le document Xu, Hengyi, et al. " Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood" , Biomaterials 32.36 (2011): 9758-9765. D’autres visent des applications dans l’extraction d’acides nucléiques, comme décrit notamment dans les documents US9976136 ou Tan, Siun Chee, and Beow Chin Yiap. "DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present" BioMed Research International, 2009.
[0005] Les applications concernant l’extraction d’acides nucléiques comportent généralement une pluralité d’étapes successives dont la lyse des cellules pour libérer les acides nucléiques, la mise en contact de la solution lysée avec les particules magnétiques pour capturer les acides nucléiques, l’application d’un champ magnétique (aussi appelé « aimantation ») et le lavage. Ceci est suivi de l’élution des acides nucléiques (généralement par un changement de pH) et l’élimination des particules magnétiques. Les acides nucléiques isolés peuvent ensuite être traités et dosés.
[0006] Toutefois, la lyse des cellules suivie du lavage entraîne une dilution de l’échantillon et en conséquence une diminution des performances de la capture. De plus, une fois capturés, les acides nucléiques doivent être séparés des particules magnétiques pour être traités, ce qui augmente le nombre d’étapes.
[0007] D’autres applications, telles qu’en diagnostic ou en oncologie, visent le dosage d’ analytes directement dans le sang. L’état de la technique propose ainsi des méthodes de dosage immunologique qui tentent de doser des protéines dans un échantillon de sang total. On connaît notamment les documents US6030845, US6855562, et US7326579, ou encore le document de la Demanderesse EP2810042. Mais ces méthodes reposent, elles aussi, sur une première étape de lyse du sang pour détruire les cellules. La lyse est suivie d’une étape de dosage par immuno- agglutination sur l’échantillon lysé. Si cette étape de lyse permet de réaliser la mesure d’agglutination dans de bonnes conditions, elle implique une dilution de l’échantillon relativement importante, ce qui a un impact négatif sur la limite de détection.
[0008] D’autres méthodes de dosage immunologique avec des particules magnétiques existent. Il existe en particulier les méthodes qualifiées d’homogènes et celles qualifiées d’hétérogènes.
[0009] Les méthodes homogènes ont l’avantage de s’affranchir de l’étape de lavage. Les documents Baudry, Jean, et al., "Acceleration of the recognition rate between grafted ligands and receptors with magnetic forces" , Proceedings of the National Academy of Sciences 103.44 (2006): 16076-16078; Ranzoni, Andrea, et al. "One-step homogeneous magnetic nanoparticle immunoassay for biomarker detection directly in blood plasma" Acs Nano 6.4 (2012): 3134-3141; et Aurich, Konstanze, et al. " Determination of the magneto-optical relaxation of magnetic nanoparticles as a homogeneous immunoassay" , Analytical chemistry 79.2 (2007): 580-586, décrivent des tests homogènes. Toutefois, l’absence d’étape de lavage rend ces méthodes de dosage difficilement utilisables dans des milieux complexes tels que le sang. En effet, la présence de cellules, dans le sang en particulier, perturbe fortement les mesures.
[0010] Les méthodes hétérogènes nécessitent un plus grand nombre d’étapes, ce qui les rend généralement longues à mettre en œuvre. Elles sont par ailleurs complexes à implémenter. Le document Kourilov, Vitaly, and Michael Steinitz, "Magnetic-bead enzyme-linked immunosorbent assay verifies adsorption of ligand and epitope accessibility" Analytical biochemistry 311.2 (2002): 166-170 décrit une méthode hétérogène.
[0011] Quelle que soit la méthode de dosage, il existe un risque de mesurer un signal non- spécifique. Un signal non-spécifique est notamment mesuré lorsqu’au moins un analyte interfèrent est en concurrence avec T analyte cible pour se lier aux particules magnétiques ou au récepteur spécifique à T analyte cible.
[0012] La nature de l’analyte interfèrent peut varier. A titre d’exemple, il peut s’agir d’une protéine dont la structure tridimensionnelle est proche de celle de l’analyte cible ou encore d’une molécule portant une charge électrique. Plus généralement, un analyte interfèrent peut être toute molécule présentant une affinité non négligeable pour les particules magnétiques ou pour les récepteurs greffés à leur surface. Il s’ensuit que le signal mesuré lors du test de dosage n’est jamais nul. Les méthodes existantes cherchent donc à réduire la probabilité d’un signal non-spécifique. Toutefois, les méthodes existantes ne permettent généralement pas de différencier entre un signal spécifique et un signal non-spécifique.
[0013] Tout cela fait que les méthodes de dosage d’échantillons complexes, et en particulier le dosage d’échantillon de sang total, ne sont pas satisfaisantes. La présence de cellules dans l’échantillon, le besoin le lyser celles-ci suivi d’au moins une étape de lavage, et le risque de signal non-spécifique peuvent dégrader les performances de la méthode.
[0014] La présente invention vient améliorer la situation.
Ainsi, la présente invention vise un procédé de dosage d’un analyte cible dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques portant un premier récepteur spécifique à un premier site d’attache de 1’ analyte cible de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques avec F analyte cible, cette mise en contact s’accompagnant, lorsqu’un analyte interfèrent est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non- spécifique dudit analyte interfèrent aux premières particules magnétiques ; b. l’application d’un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents ; c. l’annulation du champ magnétique appliqué à l’étape b. et l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques portant un deuxième récepteur spécifique à un deuxième site d’attache de F analyte cible ; d. la mesure d’une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents ; e. l’application d’un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques ; et f. la mesure d’une deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes formés à l’étape e. en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d’ analytes cibles présents dans l’échantillon biologique, et le cas échéant la quantité d’ analytes interférents.
[0015] L’invention permet ainsi de vérifier la présence ou non d’un analyte interfèrent dans l’échantillon biologique. Ainsi, lorsque l’échantillon biologique comporte à la fois un analyte cible et un analyte interfèrent, l’étape a. comprend la formation de complexes interférents par la liaison des premières particules magnétiques avec F analyte interfèrent; l’étape b. comprend ainsi la formation d’agrégats entre les complexes interférents ; l’étape d. prévoit ensuite la mesure quantitative des agrégats interférents formés ; et l’étape f. prévoit un calcul pour déterminer la quantité d’ analyte cible présent dans l’échantillon biologique, ainsi que la quantité d’ analyte interfèrent.
[0016] En outre, le procédé de l’invention permet de s’affranchir d’une dilution trop importante et en conséquence d’assurer une bonne sensibilité analytique. En outre, l’invention limite les étapes afin de simplifier l’ensemble du test. Cela résulte notamment en un temps drastiquement réduit qui ne dépasse pas la durée maximale de 15 minutes environ.
[0017] Bien évidemment, lorsqu’aucun analyte interfèrent est présent dans l’échantillon biologique, les complexes interférents, et de ce fait les agrégats interférants, ne se forment pas. Il s’ensuit que la grandeur mesurée à l’étape d. est nulle ou ne dépasse pas une valeur seuil prédéfinie.
[0018] Le procédé de l’invention permet ainsi, non seulement d’identifier la présence d’un analyte interfèrent dans l’échantillon biologique, mais également de quantifier celui-ci. En parallèle, le procédé permet de déduire la quantité d’ analyte cible dans l’échantillon biologique.
[0019] L’étape f. peut comporter le calcul de la différence entre la deuxième grandeur mesurée à cette étape f. et la première grandeur mesurée à l’étape c. afin de déterminer la quantité d’ analyte cible.
Dans le mode de réalisation principal, l’annulation du premier champ magnétique à l’étape c. est suivie ou accompagnée de l’ajout de deuxièmes particules magnétiques, puis on procède à la mesure de l’étape d. de la première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents. Dans un autre mode de réalisation, cette mesure peut être réalisée directement après l’annulation du champ magnétique, c’est-à-dire avant l’introduction des deuxièmes particules magnétiques dans le milieu liquide (ou milieu réactionnel).
[0020] Pour la mesure à l’étape f., c’est-à-dire la mesure de la deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes, le deuxième champ magnétique est de préférence annulé au préalable de ladite mesure. Ceci augmente la sensibilité de la mesure.
[0021] Pour assurer la spécificité du procédé de l’invention chaque premier récepteur est spécifique à un premier site d’attache de F analyte cible et chaque deuxième récepteur est spécifique à un deuxième site d’attache, différent du premier, de F analyte cible. La flexibilité provenant de deux sites d’attaches distincts permet d’adapter rapidement le procédé de l’invention aux besoins divers selon la nature de l’application mise en œuvre.
[0022] Dans un mode particulier de l’invention qui vise l’extraction de particules magnétiques du milieu liquide, le champ magnétique appliqué à l’étape b. est supérieur ou égal à 100 mT, et le maintien du champ magnétique est inférieur ou égal à 5 minutes, et de préférence inférieur ou égal à 3 minutes. Dans un autre mode particulier, l’application du premier champ magnétique à l’étape b. et l’application du deuxième champ magnétique à l’étape e. comporte une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde.
[0023] Cela permet de réaliser le procédé de l’invention dans un temps rapide et notamment dans un temps inférieur à 15 minutes. De plus, la séquence d’aimantation et de coupure choisie permet une précision augmentée du procédé de l’invention en favorisant la formation des complexes entre les analytes et les particules magnétiques d’une part, et en permettant une lecture plus précise d’autre part.
[0024] Dans un mode de réalisation préférentiel, les mesures effectuées aux étapes d. et f. sont choisies parmi le groupe constitué d’une mesure par turbidimétrie, une mesure par néphélométrie et une mesure par comptage (par analyse et/ou traitement d’image ou par flux notamment). Cela permet d’obtenir des résultats fiables, et ce de manière rapide.
[0025] Dans un autre mode de réalisation, l’étape a. comporte l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, le rapport entre l’échantillon et le diluant étant supérieur ou égal à 1:10.
[0026] Cette dilution permet en particulier de diminuer la viscosité du milieu pour faciliter la capture de la molécule à doser, ou autrement dit de la formation des premiers complexes. De plus, le diluant peut contenir des agents permettant de réduire la probabilité d’agrégation des particules magnétiques entre elles. À cet effet on peut utiliser des tensioactifs non ioniques, des tensioactifs anioniques, des tensioactifs cationiques, des tensioactifs zwitterioniques, des protéines (albumine, caséine, gélatine, anticorps notamment) ou des polymères (tels que polyvinylpyrrolidone, alcool poly vinylique).
[0027] Dans un mode de réalisation particulier, l’application du premier champ magnétique à l’étape b. permet d'extraire les premiers complexes du milieu liquide. Cela permet tout particulièrement de travailler dans des milieux complexes (dans le sang total par exemple). Ainsi, un mode de réalisation particulier, prévoit spécifiquement que l’échantillon biologique est du sang total. Un avantage de l’invention est que les étapes du procédé peuvent directement s’appliquer sur un échantillon de sang, et ce sans nécessiter de lavage et/ou de dilution.
[0028] Dans un autre mode de réalisation, l’étape b. comporte l’élimination du milieu liquide et l’ajout d’un tampon de réaction. Le tampon de réaction peut comporter un agent anti- agrégation (tensioactifs non ioniques, tensioactifs anioniques, tensioactifs cationiques, tensioactifs zwitterioniques, protéines ou polymères) et/ou comporter un agent de lyse cellulaire (saponines, ammoniums quaternaires, sodium dodecyl sulfate notamment). On peut en outre prévoir au moins un lavage entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction. Ce lavage permet d’augmenter davantage la spécificité du procédé de l’invention.
[0029] Les agents anti- agrégation permettent de dissocier des éventuels agrégats de particules magnétiques formés, tandis que l’agent de lyse cellulaire permet de lyser des potentielles cellules qui n’auraient pas été évacuées avec l’élimination du milieu liquide. On peut noter que contrairement aux méthodes de l’art antérieur, l’agent de lyse ne nécessite pas une dilution supplémentaire de l’échantillon. Dans ce mode de réalisation, on peut alors prévoir une incubation plus ou moins longue de sorte à permettre une action suffisante du ou des agents présents dans le tampon de réaction.
[0030] D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels :
[0031] [Fig.1] montre un schéma de principe de l’invention.
[0032] [Fig.2] montre une figure de principe d’une première étape d’incubation d’un échantillon biologique avec des premières particules magnétiques selon l’invention ;
[0033] [Fig.3] montre une figure de principe d’une première étape d’aimantation du procédé de l’invention ;
[0034] [Fig.4] montre une figure de principe d’une deuxième étape d’incubation d’un échantillon biologique avec des deuxièmes particules magnétiques selon l’invention ;
[0035] [Fig.5] montre une figure de principe d’une deuxième étape d’aimantation du procédé de l’invention ;
[0036] [Fig.6] montre une figure de principe d’une première étape d’incubation d’un échantillon biologique comportant des molécules interférantes avec des premières particules magnétiques selon l’invention ;
[0037] [Fig.7] montre une figure de principe d’une première étape d’aimantation du procédé de l’invention appliqué sur un échantillon biologique comportant des molécules interférantes ;
[0038] [Fig.8] montre une figure de principe d’une deuxième étape d’incubation d’un échantillon biologique comportant des molécules interférantes avec des deuxièmes particules magnétiques selon l’invention ;
[0039] [Fig.9] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) dans un premier exemple de réalisation ;
[0040] [Fig.10] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps (Ac) d’un deuxième exemple de réalisation ;
[0041] [Fig.11] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps (Ac) du deuxième exemple de réalisation ;
[0042] [Fig.12] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps anti-PCT (procalcitonine) d’un troisième exemple de réalisation ; [0043] [Fig.13] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) d’un sixième exemple (non selon l’invention) ; et
[0044] [Fig.14] montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) d’un septième exemple (selon l’invention).
[0045] Les figures, tableaux et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Les figures et tableaux font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
[0046] D’une manière générale, la présente invention concerne l’identification d’un analyte dans un échantillon biologique liquide. L’échantillon peut être de tout type adapté, tel que par exemple un échantillon de moelle osseuse, de liquide céphalorachidien, de lymphe, d’urine, ou de préférence un échantillon de sang total. L’ analyte cible peut être par exemple une protéine, un acide nucléique ou toute autre molécule d’intérêt présente dans l’échantillon. L’ analyte cible est présent en une quantité plus ou moins grande dans l’échantillon. Ainsi, un échantillon peut comprendre une molécule cible présente en un nombre d’exemplaires plus ou moins élevé. Autrement dit, la concentration en analyte cible peut être plus ou moins importante dans l’échantillon. Ceci s’applique également à tout autre analyte non-cible potentiellement présent dans l’échantillon.
[0047] L’invention utilise une technique de capture du ou des analytes cibles par des particules magnétiques qui ont été fonctionnalisées en surface avec des ligands spécifiques à chaque analyte cible. Il peut s’agir de particules du type décrit plus haut. Le diamètre des particules magnétiques employées est généralement compris entre 5 nm et 10000 nm, préférentiellement entre 100 nm et 500 nm.
[0048] Dans le procédé de dosage de l’invention, une première étape a. comporte la mise en contact de l’échantillon biologique avec des premières particules magnétiques
[0049] La [Fig.1] montre un schéma de principe de l’invention.
[0050] Ainsi ce schéma montre de manière générale un mode de réalisation de la mise en œuvre du procédé de l’invention. Dans une première étape a. on mélange des premières particules magnétiques avec un échantillon biologique liquide dans lequel se trouve ou pas un analyte cible à doser en présence d’un tampon. L’échantillon biologique peut en outre, mais pas nécessairement, comporter un analyte interfèrent.
[0051] Dans un premier temps, on procède à la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques. Chaque particule magnétique porte un récepteur spécifique à un premier site d’attache de F analyte cible de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques avec F analyte cible lorsque ce dernier se trouve dans l’échantillon biologique. Cette mise en contact s’accompagne lorsqu’un analyte interfèrent est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique de F analyte interfèrent aux premières particules magnétiques. Logiquement, lorsqu’il n’existe pas d’ analyte interfèrent dans l’échantillon biologique, il ne se forme pas de complexes interférents.
[0052] La [Fig.2] montre un échantillon biologique comportant un milieu liquide contenant des molécules. La [Fig.2] montre des premières particules magnétiques 10 ou PMI portant des récepteurs spécifiques, appelés ici premiers récepteurs 101. Ces premières particules magnétiques 10 sont mises en contact avec la molécule à doser présente dans l’échantillon biologique. La molécule à doser se qualifie d’ analyte cible 20. L’échantillon biologique comporte en outre d’autres espèces ou molécules 40, 50 qui peuvent être par exemple des molécules solubles, des cellules ou des particules (ou des molécules interférentes 30 comme on le verra plus loin).
[0053] Cette mise en contact de l’étape a. a pour conséquence que la molécule 20 est capturée par les premiers récepteurs 101. Pour cela les premiers récepteurs 101 sont spécifiques à F analyte cible 20. Pour une bonne spécificité on utilise notamment des anticorps monoclonaux ou des parties d’anticorps en tant que récepteurs. La liaison entre chaque récepteur et chaque analyte cible a pour conséquence la formation de complexes, que l’on qualifie ici de premiers complexes CL Les complexes sont donc formés par les premières particules magnétiques 10 associées aux analytes cibles 20. Ces complexes sont dispersés dans le milieu liquide.
[0054] Généralement, la mise en contact de l’étape a. peut durer environ 10 minutes, de préférence moins de 5 minutes. Optionnellement, on peut prévoir de mélanger ou d’agiter le milieu liquide durant la phase d’incubation en vue d’augmenter le rendement de capture.
[0055] L’étape a. peut comporter l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, ou plus particulièrement le milieu liquide. Généralement on choisira une dilution ne dépassant pas une division par dix de la concentration initiale (c’est-à-dire lOx).
[0056] Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape b., dans laquelle on applique un premier champ magnétique. Cela permet de réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents. On entend par réunir localement les complexes une organisation de ces derniers au sein du milieu liquide. Selon le champ magnétique appliqué la localisation peut varier.
[0057] Il faut retenir qu’un effet principal de cette étape b., et plus particulièrement de l’application du champ magnétique, est bien la formation d’agrégats interférents provenant de l’agglomération de complexes interférents entre eux, lorsque ces derniers se sont formés à l’étape a. de mise en contact entre l’échantillon biologique et les premières particules magnétiques.
[0058] Dans un mode particulier de l’invention, cette étape prévoit d’attirer les premières particules magnétiques vers un aimant. En conséquence, les premiers complexes formés à l’étape a., lesquels sont pour l’essentiel constitués de l’association des premières particules magnétiques avec F analyte cible, sont attirés vers l’aimant. Il s’ensuit que l’ensemble des complexes formés à l’étape a. sont réunis localement contre l’aimant, ou contre un environnement proche de l’aimant. Cela permet d’isoler les premiers complexes et de les séparer du milieu liquide. Autrement dit, dans ce mode de réalisation particulier, on extrait les premiers complexes du milieu liquide de l’échantillon biologique. Logiquement la séparation des premiers complexes du milieu liquide ne sera que totale lorsque le milieu liquide est évacué dans la suite du procédé. Dans ce mode de réalisation, l’étape b. peut prévoir le maintien du champ magnétique pendant un certain temps, par exemple 5 à 10 minutes, de préférence moins de 5 minutes. Cela contribue à la bonne extraction de l’ensemble des premiers complexes formés à l’étape a. du milieu liquide.
[0059] La [Eig.3] montre les particules magnétiques 10 attirées ou organisées selon le champ Bo généré par un aimant. Les premiers complexes Cl sont assemblés localement.
[0060] Dans un mode de réalisation particulier, on prévoit l’élimination du milieu liquide de l’échantillon biologique, puis l’ajout d’un tampon de réaction. Autrement dit, on remplace le milieu liquide par un tampon de réaction, lui aussi liquide. Pour cela on évacue d’abord le milieu liquide de la cuve de réaction, puis on verse le tampon de réaction dans la cuve. Dans ce mode de réalisation, on prévoit généralement un aimant permanent qui permet d’assembler les premiers complexes Cl portant F analyte cible 20 localement contre celui-ci. Les molécules d’ analyte cible 20, liées aux récepteurs 101 sont isolées et conservées pendant l’évacuation du milieu liquide de l’échantillon biologique. Le tampon de réaction est ajouté en remplacement du milieu liquide.
[0061] Dans ce mode de réalisation, on peut prévoir un ou plusieurs lavages entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction. Ce lavage permet d’augmenter la spécificité du procédé de l’invention. Durant le ou les lavages, le champ magnétique peut être maintenu ou coupé. Dans ce dernier cas, il est nécessaire de réappliquer le champ magnétique pendant un temps donné après chaque lavage de façon à capturer de nouveau les particules magnétiques en suspension.
[0062] Dans un mode de réalisation, le tampon de réaction peut comprendre un ou plusieurs agents anti- agrégation et/ou un ou plusieurs agents de lyse cellulaire. Les agents antiagrégation permettent de dissocier des éventuels agrégats ou amas de particules magnétiques formés à l’étape a. et/ou à l’étape b. On augmente ainsi la précision du procédé de l’invention. L’agent de lyse cellulaire permet de lyser des potentielles cellules qui n’auraient pas été évacuées avec l’élimination du milieu liquide décrit plus haut. On peut noter que contrairement aux méthodes de l’art antérieur, l’agent de lyse ne nécessite pas une dilution supplémentaire de l’échantillon.
[0063] L’étape c. du procédé de l’invention comporte l’annulation du champ magnétique Bo. Lorsque le champ est coupé, les particules et complexes se dispersent dans le milieu liquide, ainsi que les éventuels agrégats formés.
[0064] La [Fig.4] montre les complexes Cl remis en suspension. L’étape c. comporte en outre l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques 11, ou PM2, portants un deuxième récepteur 111 spécifique à F analyte cible 20. À ce stade, les deuxièmes récepteurs 111 des deuxièmes particules magnétiques 11 ne se lient pas, ou très peu, à F analyte cible 20. Au besoin, on peut prévoir une agitation du milieu réactionnel.
[0065] On notera que les analytes cibles 20 présentent généralement une forme tridimensionnelle permettant de choisir des récepteurs spécifiques 101, 111, diversifiés. Ainsi, chaque premier récepteur 101 est spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible 20 et chaque deuxième récepteur 111 est spécifique à deuxième site d’attache de l’analyte cible, différent du premier. Cela permet d’augmenter la spécificité du procédé de l’invention. Cette flexibilité provenant de deux sites d’attaches permet en outre d’adapter rapidement le procédé de l’invention au besoins diverses, et notamment selon la nature de l’application mise en œuvre. On peut ainsi diversifier les récepteurs selon l’analyte cible à doser.
[0066] Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape d., dans laquelle on mesure une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents. Lorsque la grandeur mesurée est nulle ou se situe en dessous d’une valeur seuil prédéfinie, il n’existe pas (ou extrêmement peu) d’agrégats interférents dans le milieu liquide. Dans ce cas on peut partir du principe qu’il n’existe pas (ou extrêmement peu) d’ analytes interférents dans l’échantillon biologique. Lorsque la grandeur mesurée est non nulle ou dépasse la valeur seuil prédéfinie, il existe des agrégats interférents dans le milieu liquide, et donc un analyte interfèrent dans l’échantillon biologique.
[0067] La mesure peut notamment être réalisée par turbidimétrie, par néphélométrie ou par comptage (par analyse et/ou traitement d’image ou par flux notamment).
[0068] Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape e., dans laquelle on applique un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes par la liaison des premiers complexes Cl aux deuxièmes particules magnétiques 11, ou plus précisément aux récepteurs 111 portés par les deuxièmes particules magnétiques. En termes de détectabilité, ces deuxièmes complexes sont comparables aux agrégats interférents, à savoir qu’on arrive relativement facilement à les détecter par des mesures de densité optique notamment.
[0069] La [Fig.5] montre les deuxièmes complexes 61 générés par l’application du deuxième champ magnétique Bl. L’ analyte cible 20 est pris en sandwich par les premiers et deuxièmes récepteurs respectivement portés par les premiers 10 et deuxièmes 11 particules magnétiques. D’une manière générale, cette étape e. a pour but de générer des chaînons ou amas de particules magnétiques. Les complexes ou molécules « sandwich », formés par les premiers 10 et deuxièmes 11 particules magnétiques bordant F analyte cible 20, sont détectables par différentes techniques dont notamment une mesure de densité optique.
[0070] Les documents WO 2009/034271, FR2919390 et FR2959820 décrivent des procédés de dosage dans lesquels on applique au milieu réactionnel liquide une série de cycles d’applications et de coupures d’un champ magnétique pour provoquer la formation de chaînons ou d’amas de particules magnétiques lors de la réaction entre les particules magnétiques et un analyte cible. Chaque application du champ a pour conséquence une augmentation du nombre de liaisons analyte / particule magnétique et chaque coupure du champ cause une dispersion des particules magnétiques non liées dans le milieu liquide. Durant le procédé, le nombre et/ou la taille des chaînons ou amas de particules liées augmentent. Cela augmente proportionnellement la turbidité du milieu réactionnel. Les mesures de la densité optique du milieu après chaque coupure du champ magnétique permettent ainsi de calculer la concentration de F analyte cible dans l’échantillon.
[0071] D’autre types de séquences d’impulsions magnétiques sont possible. Des exemples sont décrits dans la publication Fast Magnetic Field-Enhanced Linear Colloidal Agglutination immunoassay, Daynès et al., Anal. Chem. 2015, 87, 7583-7587.
[0072] Dans la présente invention, le premier champ magnétique Bo appliqué durant l’étape b. peut être identique ou différent du deuxième champ magnétique B1 appliqué à l’étape e.
[0073] Il peut être avantageux d’appliquer des champs magnétiques ayant des propriétés différentes durant ces deux étapes. Ceci est le cas dans le mode de réalisation où l’on prévoit l’extraction des premiers complexes du milieu liquide. Dans ces conditions, pour permettre une capture optimale des premières particules magnétiques 10, le champ Bo de l’étape b. doit combiner une intensité importante (typiquement supérieure à 100 mT) avec un gradient important dans la direction d’aimantation. Au contraire, il est préférable d’appliquer un champ B1 d’intensité modérée (typiquement inférieure à 50 mT) et dont le gradient est faible pour l’étape e. On pourra également appliquer le champ B1 de l’étape e. sous la forme de plusieurs impulsions, séparées par des périodes de relaxation. La durée et l’intensité de ces impulsions peut être variable.
[0074] Plus généralement, l’application du deuxième champ magnétique B1 comporte de préférence une pluralité d’impulsions magnétiques, séparées par des temps de repos. Dans un mode de réalisation, cette étape e. prévoit une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde :
[0075] 1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, OmT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT],
[0076] Les différentes impulsions à 8 mT pendant 1 seconde permettent essentiellement une lecture plus précise de l’état d’agrégation des particules PMI en cas de présence d’ analyte interfèrent. La série d’impulsions/repos de 15 mT pendant 60 secondes, suivie de repos (0 mT) pendant 28 secondes, suivie de 8 mT pendant 1 seconde, suivie de repos (0 mT) pendant 1 seconde permet essentiellement la formation de complexes.
[0077] Les deuxièmes complexes 61 forment des agrégats qui sont détectables par une mesure de densité optique ou par comptage par exemple. Plus généralement, les deuxièmes complexes peuvent être détectés du fait que les particules magnétiques sont agrégées entre elles du fait de la liaison de T analyte cible aux deux récepteurs (sandwich), alors que le signal d’un premier complexe ne diffère pas significativement de celui d’une particule magnétique libre, étant donné la différence de taille (et/ou indice optique et/ou moment magnétique) entre une particule magnétique et une molécule d’ analyte cible.
[0078] Ainsi, l’étape f. du procédé de l’invention vise la détermination de la quantité de deuxièmes complexes formés afin d’en déduire la quantité d’ analytes cibles présents dans l’échantillon biologique. Pour cela, l’étape f. prévoit la mesure de l’ensemble des agrégats, c’est-à-dire la totalité des deuxièmes complexes et le cas échéant des agrégats interférents. In fine, cette mesure permet de déterminer la quantité de deuxièmes complexes 61 formés à l’étape e., et ce en particulier en fonction de la mesure d’agrégats interférents seuls effectuée au préalable à l’étape d. Le résultat de la mesure permet ensuite de calculer la quantité d’ analyte cible 20 présent dans l’échantillon biologique.
[0079] L’invention a l’avantage d’identifier non seulement 1’ analyte cible, mais également un analyte interfèrent, voire plusieurs analytes interférents.
[0080] Il est maintenant fait référence aux figures 6, 7 et 8 pour décrire plus en détail les étapes du procédé avec la présence d’un analyte interfèrent.
[0081] L’étape a. (voir [Fig.6]) comprend dans ce cas non seulement la formation des premiers complexes Cl, mais également la formation de complexes interférents Cint par la liaison entre les premières particules magnétiques 10 et un analyte interférant 30. Les complexes interférents Cint sont alors dispersés dans le milieu liquide de l’échantillon biologique.
[0082] Plus généralement, dans l’étape a. les particules magnétiques 10 portant des ré- cepteurs spécifiques 101 sont mises en contact avec la molécule à doser 20, en présence d’autres espèces 30, 40, qui peuvent être des molécules solubles, des cellules, des particules, ou autre. L’une parmi ces espèces (les molécules 30 sur la [Fig.6]) se lie de manière non spécifique aux premières particules magnétiques 10. La molécule 20 est néanmoins capturée par les récepteurs 101.
[0083] Lors de l’étape b. (voir [Fig.7]), les premières particules magnétiques 10 sont attirées ou organisées localement au sein du milieu liquide selon le champ Bo généré par l’aimant. Dans le mode particulier de l’invention décrit plus haut en référence à l’extraction des particules magnétiques, le milieu liquide est remplacé par le tampon de réaction. Dans ce cas précis, il convient d’utiliser un aimant permanent (non montré sur les dessins) qui attire les particules magnétiques.
[0084] Plus généralement, les molécules 20 (analyte cible) liées aux récepteurs 101 ainsi que les molécules 30 liées de manière non- spécifique au particules magnétiques 10 sont réunies localement au sein du milieu liquide. Cet assemblage local à un endroit donné au sein du milieu liquide des premiers complexes Cl et des complexes interférents Cint a pour conséquence la formation d’agrégats non-spécifiques 60 (ou agrégats interférents 60) entre les premiers complexes Cl et les complexes interférents Cint. Ces agrégats non spécifiques peuvent également se former par l’agglomération des complexes interférents Cint entre eux. Plus généralement, les agrégats non spécifiques se forment de manière essentiellement identique aux complexes d’intérêt, c’est-à-dire entre un complexe Cint et une particule magnétique voisine. Celle-ci peut être liée à une molécule d’analyte (Cl), à une molécule interférente (Cint), ou être une particule libre PMI. Ces agrégats non-spécifiques 60 sont détectables en milieu liquide, par mesure de turbidimétrie par exemple (voir [Fig.8]).
[0085] Une fois les agrégats formés, l’étape d. permet la mesure quantitative de ceux-ci dans le milieu liquide.
[0086] Comme expliqué plus haut, l’étape f. utilise la mesure faite durant l’étape d. pour calculer la quantité des agrégats spécifiques constitués par les deuxièmes complexes. À cet effet, le calcul tient compte à la fois de la mesure réalisée à l’étape d. et de celle effectuée à l’étape f. On peut ainsi en déduire la quantité d’analyte cible présent dans l’échantillon biologique.
[0087] La mesure de l’état d’agrégation lors de l’étape d. permet de limiter le risque d’interférences pouvant mener à des résultats faux positifs. En présence d’une molécule pouvant entraîner de telles interférences, l’étape b. peut mener à la formation d’agrégats non-spécifiques de premières particules magnétiques 10 (PMI). En l’absence de l’étape d., ces agrégats seraient détectés lors de l’étape f. seulement, et ce sans qu’il soit possible de distinguer les agrégats spécifiques, provoqués par la présence de la molécule à doser (analyte cible), des agrégats non- spécifiques, provoqués par la présence d’une autre molécule (analyte interfèrent). En appliquant l’étape d., il est par exemple possible de déterminer un seuil d’agrégation initial au- delà duquel aucun résultat ne sera rendu, du fait d’interférences, évitant ainsi de rendre des résultats erronés. Un avantage de l’invention est que les mesures d’agrégation lors des étapes d. et f. peuvent être combinées pour calculer une estimation de l’agrégation spécifique, en excluant l’agrégation non-spécifique.
[0088] Optionnellement, il est aussi possible de stopper le procédé de l’invention après l’étape d. Si la quantité d’agrégats non spécifiques mesurée est trop élevée et/ou dépasse un seuil de sensibilité prédéfini, le procédé de l’invention peut être interrompu après réalisation de la mesure de l’étape d. Il est alors possible de recommencer le procédé de l’invention en sélectionnant d’autres récepteurs spécifiques à F analyte cible.
[0089] Dans un mode particulier de l’invention, le procédé décrit ci- avant est donc stoppé après l’étape d, à savoir après la mesure de la première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide. À cet effet on peut fixer une grandeur seuil au-delà de laquelle les résultats ne sont pas suffisamment sensible. On évite ainsi l’exécution des étapes subséquentes qui deviennent inutiles ou du moins inexploitables. Des surcoûts et des pertes de temps inutiles peuvent ainsi être évités.
[0090] EXEMPLES DE RÉALISATION
[0091] Une première série d’expériences (exemples 1 à 3) est réalisée en vue de démontrer la faisabilité et la sensibilité de l’invention.
[0092] EXEMPLE 1
[0093] Un test de dosage de la PSA (prostate-specific antigen) est mis en œuvre. Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200nm, Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PSA. Un lot de particules est fonctionnalisé avec un premier clone (P4, référence 7820-0370, disponible auprès de la société Bio-Rad). En référence à la description générale, il s’agit des premières particules magnétiques PMI. Un deuxième lot est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (214, référence 7820-0217, disponible auprès de la société Bio-Rad). En référence à la description générale, il s’agit des deuxièmes particules magnétiques PM2. Les échantillons consistent en PSA (référence P3338, disponible auprès de la société Sigma- Aldrich) purifiée à lOOnM diluée dans du sérum de cheval (référence H1270, disponible auprès de la société Sigma-Aldrich) à différentes concentrations. La concentration cible de PSA dans les échantillons est donc connue.
[0094] Le dosage des échantillons est mené comme suit :
[0095] 71.5 pL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5pL de particules fonctionnalisées
PMI (P4) à 1% pendant 2 min ;
[0096] Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ; [0097] Les particules sont reprises par 73.5 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN3 0.09% et 1.5 pL de particules fonctionnalisées PM2 (214) à 1% sont ajoutés.
[0098] Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :
[0099] 1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, OmT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT],
[0100] L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650 nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff3) est utilisée comme signal d’intérêt.
[0101] Des mesures témoins sont réalisées avec les mêmes échantillons et les mêmes particules, mais sans étape d’extraction (étape c. en référence à la description générale). Le milieu réactionnel, constitué de de 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN3 0.09%, 15 pL d’échantillon et 1.5 pL de chaque lot de particules fonctionnalisées, est soumis au même cycle de champ magnétique que décrit ci-dessus.
[0102] On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 1 ci-dessous, en fonction de la concentration en PSA dans les échantillons testés.
[0103] [Tableaux 1]
Figure imgf000017_0001
[0104] Tableau 1.
[0105] La [Fig.9] montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en PSA.
[0106] On constate que la méthode utilisant le procédé selon l’invention permet d’obtenir un signal croissant avec la concentration en PSA dans l’échantillon, et avec une activité supérieure aux essais témoin.
[0107] EXEMPLE 2
[0108] Des essais permettant de simuler la présence d’une molécule interférante dans l’échantillon d’intérêt sont mis en œuvre. Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200 nm, de la société Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PSA. Un lot de particules PMI est fonctionnalisé avec un premier clone (P4, référence 7820-0370, disponible auprès de la société Bio-Rad), et un deuxième lot PM2 est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (214, référence 7820-0217, disponible auprès de la société Bio-Rad). Les échantillons consistent en une solution de NaCl à 9 g/L dans laquelle est ajouté un anticorps (Ac) anti-IgG de souris (M8642, disponible auprès de la société Sigma-Aldrich) capable de se lier de manière non- spécifique aux anticorps anti-PSA greffés sur les particules.
[0109] Le dosage des échantillons est mené comme suit :
[0110] 71.5 pL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5pL de particules fonctionnalisées
PMI (P4) à 1% pendant 2 min ;
[0111] Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ;
[0112] Les particules sont reprises par 73.5 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108
0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN3 0.09% et 1.5 pL de particules fonctionnalisées PM2 (214) à 1% sont ajoutés.
[0113] Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :
[0114] 1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, OmT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT],
[0115] L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff3) est utilisée comme signal d’intérêt. Ce même signal peut être mesuré lors de l’application de la première impulsion de 8 mT d’intensité (DodiffO) pour déterminer l’agrégation du milieu avant application du champ magnétique.
[0116] Des mesures témoin sont réalisées avec les mêmes échantillons et les mêmes particules, mais sans étape d’extraction. Le milieu réactionnel, constitué de de 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN3 0.09%, 15 pL d’échantillon et 1.5 pL de chaque lot de particules fonctionnalisées, est soumis au même cycle de champ magnétique que décrit précédemment.
[0117] On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 2 ci-dessous, en fonction de la concentration en anticorps dans les milieux réactionnels, en ce qui concerne la mesure avant agglutination :
[0118] [Tableaux2]
Figure imgf000018_0001
[0119] Tableau 2.
[0120] La [Fig.10] montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en Ac avant agrégation.
[0121] Alors que le signal avant application du champ ne dépend pas de la concentration en anticorps interfèrent sur la mesure témoin, on constate que l’ajout de cet anticorps entraîne une augmentation du signal d’agrégation avant application du champ du fait de l’étape d’aimantation, ce qui permet d’envisager d’alarmer ces mesures.
[0122] On obtient les résultats suivants qui figurent dans le tableau 3 ci-dessous, en fonction de la concentration en anticorps dans les milieux réactionnels, en ce qui concerne la mesure après agglutination :
[0123] [Tableaux3]
Figure imgf000019_0001
[0124] Tableau 3.
[0125] La [Fig.11] montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en Ac après agrégation.
[0126] Dans les deux cas, le signal d’agrégation est augmenté en présence de l’anticorps interfèrent. Ainsi, en l’absence de la mesure initiale menée lors de l’extraction, il serait impossible de déterminer si l’échantillon contient le la PSA ou une molécule interférante.
[0127] EXEMPLE 3
[0128] Des essais permettant de vérifier l’applicabilité du procédé de l’invention sur un échantillon de sang total sont menés.
[0129] Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200nm, disponibles auprès de la société Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PCT (procalcitonine). Un lot de particules PMI est fonctionnalisé avec un premier clone (E86813M, disponibles auprès de la société Meridian Life Sciences), et un deuxième lot PM2 est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (E01342M, disponibles auprès de la société Meridian Life Sciences). Les échantillons consistent en PCT recombinante à 400 nM diluée dans du sang humain à différentes concentrations. La concentration cible de PCT dans les échantillons est donc connue.
[0130] Le dosage des échantillons est mené comme suit :
[0131] 71.5 pL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5pL de particules fonctionnalisées
E86813M à 1% et 71.5 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; DTT lOmM ; NaN3 0.09% pendant 2 min ; [0132] Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ;
[0133] Les particules sont reprises par 73.5 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108
0.8% ; NaCl 800 mM ; DTT lOmM ; NaN3 0.09% et 1.5 pL de particules fonctionnalisées E01342M à 1% sont ajoutés.
[0134] Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :
[0135] 1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, OmT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT],
[0136] L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff3) est utilisée comme signal d’intérêt.
[0137] Les mêmes essais sont réalisés sur les échantillons de plasma issus des échantillons de sang. Ceux-ci sont centrifugés 10 min à 1500g pour en extraire le plasma. L’hématocrite de l’échantillon de sang étant de 40.4%, Il est alors possible de calculer la concentration plasmatique attendue en PCT en fonction de la concentration attendue de PCT dans le sang.
[0138] On obtient les résultats qui figurent dans les tableaux 4 (sang) et 5 (plasma) suivants : [0139] [Tableaux4]
Figure imgf000020_0001
[0140] Tableau 4.
[0141] [Tableaux5]
Figure imgf000020_0002
[0142] Tableau 5.
[0143] La [Fig.12] montre ces résultats dans un graphe.
[0144] On constate que le signal mesuré en fonction de la concentration en PCT dans l’échantillon est indépendant de la nature de celui-ci, sang ou plasma. Ceci démontre la possibilité d’appliquer la méthode décrite à un échantillon de sang total.
[0145]
[0146] Une deuxième série d’expériences (exemples 4 à 7) est réalisée en vue de démontrer l’effet d’un anticorps interfèrent sur l’agrégation de particules magnétiques.
[0147] Pour cela des mesures d’agrégation en présence de différentes concentrations en anticorps anti-souris sont réalisées. Ceci est fait pour simuler ou mimer l’effet d’un anticorps interfèrent. [0148] On utilise pour cette série d’expériences des particules Adembeads 200 nm fonctionnalisées soit par l’anticorps P4 (référence 7820-0370, disponibles auprès de la société Bio-Rad), soit par l’anticorps 214 (référence 7820-0217, disponibles auprès de la société Bio-Rad).
[0149] EXEMPLE 4 : Mesures sans PSA
[0150] Dans cette exemple les premières et deuxièmes particules magnétiques (PMI et PM2) sont introduits dans le milieu liquide simultanément. En conséquence, il ne s’agit pas d’un exemple selon l’invention.
[0151] Dans un premier temps on réalise un cycle standard. Les échantillons préparés comprennent :
[0152] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;
[0153] - 15 pL d’anticorps anti-souris (M8642, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ;
[0154] - 3 pL de particules P4 1% w/v weight per volume, ou p/v c.à.d. poids par unité de volume) ; et
[0155] - 3 pL de particules 214 1% w/v.
[0156] On applique ensuite aux échantillons le cycle suivant (Cagg) :
[0157] 1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, OmT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT],
[0158] On peut mesurer pour chaque échantillon la différence de densité optique avant et après la première impupulsion d’intensité 8 mT (Dodiff0) comme indicateur du niveau initial d’agrégation des particules. Pour mesurer le niveau d’agrégation final, on peut mesurer la différence de densité optique avant et après la dernière impulsion d’intensité 8 mT (Dodiff3) ou la différence de densité optique entre la fin et le début du cycle Cagg (ADO).
[0159] On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 6, en fonction de la concentration en anticorps (Ac) dans le milieu réactionnel :
[0160] | Tableau x6|
Figure imgf000021_0001
[0161] Tableau 6.
[0162] On constate que l’anticorps choisi provoque une interférence puisque la Dodiff3 ou le ADO augmentent avec la concentration en anticorps introduit. La mesure de la Dodiff0, quant à elle, ne varie pas significativement avec la concentration en anticorps, ce qui ne permet donc pas d’alarmer cette interférence.
[0163] EXEMPLE 5 : Mesures sans PSA
[0164] Les échantillons préparés comprennent :
[0165] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM;
[0166] - 15 pL d’anticorps anti-souris (M8642, Sigma- Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ; et
[0167] - 3 pL de particules P4 1% w/v.
[0168] On applique le cycle Cagg (détaillé ci-dessus) à cet échantillon, puis on ajoute 3 pL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.
[0169] On peut mesurer les mêmes indicateurs que précédemment sur le premier cycle, appliqué seulement aux particules P4 (Dodiffo1, Dodiff,1, ADO1), ou sur le second cycle, appliqué à l’ensemble des particules (Dodiff0 2, Dodiff3 2, ADO2). On obtient les résultats figurants dans le tableau 7 ci-après :
[0170] [Tableaux7]
Figure imgf000022_0001
[0171] Tableau 7.
[0172] Les indicateurs ADO2 ou Dodiff3 2 augmentent avec la concentration en anticorps introduit. Cependant, avec ce protocole, on peut utiliser les valeurs de ADO1 ou Dodiff d pour détecter la présence d’agrégats préalablement à l’application du second cycle, liés à une interférence dans l’échantillon. Ainsi, dans cet exemple, l’application d’un seuil choisi à 5 mDO permet de détecter les échantillons contenant l’anticorps in- terférent.
[0173] EXEMPLE 6 : Courbes dose-réponse PSA
[0174] Dans cette exemple les premières et deuxièmes particules magnétiques (PMI et
PM2) sont introduits dans le milieu liquide simultanément. En conséquence, il ne s’agit pas d’un exemple selon l’invention.
[0175] Dans un premier temps, on réalise une courbe dose-réponse sans anticorps interfèrent.
[0176] Les échantillons comprennent :
[0177] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;
[0178] - 15 pL de PSA (P3338, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ;
[0179] - 3 pL de particules P4 1% w/v ; et
[0180] - 3 pL de particules 214 1% w/v.
[0181] Après application du cycle Cagg, on obtient les résultats figurants dans le tableau 8 ci-dessous :
[0182] [Tableaux8]
Figure imgf000023_0001
[0183] Tableau 8.
[0184] Ensuite, une courbe dose-réponse en ajoutant un anticorps anti-souris est réalisée.
[0185] Pour cela, les échantillons comprennent :
[0186] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;
[0187] - 15 pL de PSA (P3338, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L + 5 nM d’anticorps anti-souris ;
[0188] - 3 pL de particules P4 1% w/v ; et
[0189] - 3 pL de particules 214 1% w/v.
[0190] On a donc une concentration en anticorps de 1 nM dans le milieu réactionnel. Après application du cycle Cagg, on obtient les résultats figurants dans le tableau 9 ci- dessous : [0191] [Tableaux9]
Figure imgf000024_0001
[0192] Tableau 9
[0193] La [Fig.13] reporte ces résultats dans un graphe.
[0194] On constate qu’en l’absence ou en présence d’anticorps anti-souris, la valeur de Dodiffo ne varie pas significativement, et ne permet donc pas de prédire la présence d’une molécule interférente. Or, cette molécule mène à une surestimation des valeurs de Dodiff3 ou de ADO. Ainsi, en reportant les valeurs de ADO mesurées en présence de l’anticorps sur la courbe dose réponse en l’absence d’anticorps, employée comme courbe étalon, on aboutirait à une surestimation des titres en PSA. Par exemple, l’échantillon ne comportant pas de PSA serait dosé à 5 nM environ, et l’échantillon contenant InM de PSA serait titré à plus de 8 nM.
[0195] Exemple 7 : Courbes dose-réponse PSA
[0196] Dans un premier temps, on réalise une courbe dose-réponse sans anticorps interfèrent.
[0197] Les échantillons comprennent :
[0198] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;
[0199] - 15 pL de PSA (M8642, Sigma- Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ; et
[0200] - 3 pL de particules P4 1% w/v.
[0201] On applique le cycle Cagg à cet échantillon, puis on ajoute 3 pL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.
[0202] On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 10 ci-dessous, en fonction de la quantité de PSA présente dans le milieu réactionnel : [0203] [TableauxlO]
Figure imgf000025_0001
[0204] Tableau 10.
[0205] On constate qu’ alors que les valeurs de Dodiff3 ou de ADO augmente avec la quantité de PSA après le second cycle d’agglutination, comme attendu, elles ne varient pas significativement après le premier cycle agglutination, puisque les agrégats spécifiques ne se forment qu’entre des particules portant l’anticorps P4 et des particules portant l’anticorps 214. Ces échantillons ne seront donc pas alarmés en conservant l’hypothèse d’un seuil à 5 mDO comme décrit plus haut.
[0206] On réalise ensuite une courbe dose-réponse en ajoutant un anticorps anti-souris.
[0207] Les échantillons comprennent :
[0208] - 57 pL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;
[0209] - 15 pL de PSA (M8642, Sigma- Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L + 5nM d’anticorps anti-souris ; et
[0210] - 3 pL de particules P4 1% w/v.
[0211] On applique le cycle Cagg à cet échantillon, puis on ajoute 3 pL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.
[0212] On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 11 ci-dessous, en fonction de la quantité de PSA présente dans le milieu réactionnel : [0213] [Tableauxl l]
Figure imgf000026_0001
[0214] Tableau 11
[0215] Les valeurs de Dodiff3 2 ou de ADO2 sont plus élevées, à concentration en PSA donnée, que dans le cas sans anticorps interfèrent. Cependant, contrairement à la mesure standard, ici la mesure de Dodiff,1 ou de ADO1 permet de détecter la présence de la molécule interférente. Il est donc possible d’appliquer une alarme pour éviter de rendre un résultat erroné.
[0216] La [Fig.14] montre les différences de densité optique (mDO) des Dodiff ,1 respectivement avec et sans anticorps interférant.
[0217] Le procédé de l’invention peut être réalisé dans un dispositif de type connu, au besoin adapté au moyen des connaissances de l’homme du métier.

Claims

25 Revendications
[Revendication 1] Procédé de dosage d’un analyte cible (20) dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques (10) portant un premier récepteur (101) spécifique à un premier site d’attache de
1’ analyte cible (20) de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques (10) avec 1’ analyte cible (20) cette mise en contact s’accompagnant, lorsqu’un analyte interfèrent (30) est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non- spécifique dudit analyte interfèrent (30) aux premières particules magnétiques (10) ; b. l’application d’un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents ; c. l’annulation du premier champ magnétique appliqué à l’étape b. et l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques (11) portants un deuxième récepteur (111) spécifique à un deuxième site d’attache de F analyte cible (20) ; d. la mesure d’une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents ; e. l’application d’un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes (61) par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques (11) ; et f. la mesure d’une deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes (61) dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes (61) formés à l’étape e. en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d’ analyte cible (20) présent dans l’échantillon biologique, et le cas échéant la quantité d’ analyte interfèrent (30).
[Revendication 2] Procédé de dosage selon la revendication 1, dans lequel l’étape f. comporte le calcul de la différence entre la deuxième grandeur mesurée à cette étape f. et la première grandeur mesurée à l’étape d.
[Revendication 3] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les étapes c. et d. sont exécutées sensiblement simultanément.
[Revendication 4] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape d. est réalisée après l’annulation du premier champ magnétique, avant l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques.
[Revendication 5] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le maintien du champ magnétique appliqué à l’étape b. est inférieur ou égal à une durée de 5 minutes, de préférence inférieur ou égal à une durée de 3 minutes.
[Revendication 6] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’application du deuxième champ magnétiques comporte une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde.
[Revendication 7] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la mesure de la première et/ou de la deuxième grandeur est choisie parmi le groupe constitué d’une mesure par turbidimétrie, une mesure par né- phélométrie et une mesure par comptage.
[Revendication 8] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape a. comporte l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, le rapport entre l’échantillon et le diluant étant supérieur ou égal à 1:10 (volume).
[Revendication 9] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape b. comporte l’extraction des premiers complexes du milieu liquide.
[Revendication 10] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape b. comporte une sous -étape bl. comprenant l’élimination du milieu liquide suivi de l’ajout d’un tampon de réaction, et de préférence au moins un lavage entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction.
[Revendication 11] Procédé selon la revendication 10, dans lequel le tampon de réaction comprend au moins un agent anti-agrégation et/ou un agent de lyse cellulaire.
[Revendication 12] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon est un échantillon de sang total.
[Revendication 13] Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les agrégats interféreras sont identifiés lorsque la première grandeur dépasse une grandeur seuil prédéfinie.
[Revendication 14] Dispositif agencé pour réaliser le procédé selon l’une des revendications précédentes.
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