KR20180105198A - 자기적 전기화학적 감지 - Google Patents
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Abstract
표적 분석물 검출 디바이스들은 정전위기를 갖는 하우징 및 정전위기에 커플링된 마이크로컨트롤러를 포함한다. 디바이스는 또한 기판의 제1 표면 상에 복수의 전극을 갖는 기판을 포함한다. 복수의 전극의 제1 전극 세트는 제1 샘플 검출 영역을 정의한다. 기판은, 기판을 하우징에 부착시킬 때 제1 전극 세트가 정전위기에 커플링되도록, 하우징에 분리가능하게 부착가능하다. 디바이스는 또한 기판의 제2 표면에 커플링가능한 자석 어셈블리를 포함한다. 자석 어셈블리는, 자석 어셈블리를 기판에 커플링시킬 때 자석으로부터의 자기장이 기판 및 제1 전극 세트를 통해 제1 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록, 자석 어셈블리에 배치된 자석을 포함한다.
Description
관련 출원들의 상호 참조
본 출원은 2016년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/287,719호를 바탕으로, 2016년 1월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/288,254호를 바탕으로, 그리고 2016년 5월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/339,519호를 바탕으로 우선권을 주장하며, 이 출원들 전부는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 자기적 전기화학적 감지를 사용하여 분석물들을 검사하기 위한 시스템들 및 기법들에 관한 것이다.
생물학적 샘플들은, 펩티드들, 단백질들, 지질들, 대사물들, 및 다른 저분자들과 같은, 특정의 분석물들의 존재 및 만연(prevalence)에 대해 종종 검사된다. 일부 경우들에서, 특정 분석물들의 존재 및 만연은 피검자의 특정의 생물학적 또는 발병 과정, 특정의 질병의 진행, 또는 어떤 다른 생물학적 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 일부 경우들에서, 특정 분석물들의 존재 및 만연은 특정의 물질 또는 재료의 조성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 정전위기(potentiostat)를 포함하는 하우징 및 정전위기에 커플링된 마이크로컨트롤러를 포함하는 표적 분석물 검출 디바이스들을 제공한다. 디바이스들은 또한 기판의 제1 표면 상에 복수의 전극을 갖는 기판을 포함한다. 복수의 전극의 제1 전극 세트는 제1 샘플 검출 영역을 정의한다. 기판은, 기판을 하우징에 부착시킬 때 제1 전극 세트가 정전위기에 커플링되도록, 하우징에 분리가능하게 부착가능할 수 있다. 디바이스들은 또한 기판의 제2 표면에 커플링가능한 자석 어셈블리를 포함한다. 자석 어셈블리는, 자석 어셈블리를 기판에 커플링시킬 때 자석으로부터의 자기장이 기판 및 제1 전극 세트를 통해 제1 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록, 자석 어셈블리에 배치된 자석을 포함한다.
이 양태의 구현들은 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 하우징은 디지털-아날로그 변환기(DAC) 회로를 포함할 수 있다. DAC의 출력은 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링될 수 있다. 하우징은 또한 아날로그-디지털 변환기(ADC) 회로를 포함할 수 있다. 컨테인 회로의 입력은 정전위기의 출력에 커플링될 수 있다. 하우징은 또한 DAC 회로에 그리고 ADC 회로에 전기적으로 커플링된 마이크로컨트롤러를 포함할 수 있다. 마이크로컨트롤러는 전압 신호를 DAC 회로의 입력에 제공하도록 구성될 수 있다. 마이크로컨트롤러는 ADC 회로의 출력으로부터 측정 신호를 수신하도록 구성될 수 있다.
일부 구현들에서, 디바이스들은 복수의 정전위기를 포함할 수 있다. 복수의 전극은 적어도 하나의 부가 전극 세트를 포함할 수 있다. 각각의 전극 세트는 복수의 정전위기의 상이한 각자의 정전위기에 커플링가능할 수 있고, 각각의 전극 세트는 상이한 대응하는 샘플 검출 영역을 정의할 수 있다.
다른 구현들에서, 디바이스들은 복수의 정전위기의 각각의 정전위기의 출력에 전기적으로 커플링된 멀티플렉서를 포함할 수 있다. 멀티플렉서는 선택된 출력을 ADC 회로의 입력에 전기적으로 커플링시키도록 구성될 수 있다.
특정 구현들에서, 디바이스들은 기판의 표면 상에 배열된 웰 플레이트(well-plate) - 웰 플레이트는 복수의 웰(well)을 가짐 - 를 포함할 수 있다. 복수의 웰의 각각의 웰은 상이한 대응하는 샘플 검출 영역 바로 위에 배열될 수 있다.
일부 구현들에서, 자석 어셈블리는 복수의 자석을 포함할 수 있다. 복수의 자석의 각각의 자석은 기판에 인접하여 배치되고 대응하는 전극 세트와 정렬될 수 있어서, 자석 어셈블리를 기판에 커플링시킬 때, 자기장이 자석으로부터 기판 및 대응하는 전극 세트를 통해 대응하는 전극 세트에 의해 정의된 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록 한다.
부가의 구현들에서, 기판은 카드 에지 커넥터(card-edge connector)를 포함할 수 있고, 하우징은 카드 에지 커넥터 리셉터클(card-edge connector receptacle)을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 디바이스는 전자 통신 인터페이스를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현들에서, 전자 통신 인터페이스는 적어도 하나의 유니버설 직렬 버스 커넥터(universal serial bus connector) 또는 무선 트랜시버(wireless transceiver)를 포함할 수 있다. 특정 구현들에서, 제1 전극 세트는 3개의 개별 전극을 포함할 수 있다. 다른 구현들에서, 3개의 개별 전극 중 제1 전극 및 제2 전극은 제1 금속일 수 있고, 3개의 개별 전극 중 제3 전극은 제2 금속일 수 있다. 특정 구현들에서, 제1 전극 세트는 2개의 개별 전극으로 이루어질 수 있다. 일부 구현들에서, 제1 전극 세트는 서로 맞물린 전극(interdigitated electrode)들을 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 하우징은 마이크로컨트롤러에 커플링된 전원(power supply) 및 트랜시버를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현들에서, 디바이스는 마이크로컨트롤러에 커플링된 디스플레이를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 다른 양태에서, 본 개시내용은 표적 분석물의 존재를 검출하는 방법들을 제공한다. 새로운 방법들은 복수의 자성 비드(magnetic bead)를 제1 유체 샘플에 제공하는 단계를 포함한다. 복수의 자성 비드는 표적 분석물에 특이적으로 결합(specifically bind)하는 제1 결합 모이어티(binding moiety)들을 포함한다. 방법들은 또한 복수의 자성 비드가 제1 유체 샘플 내의 표적 분석물에 결합할 수 있게 해주는 단계, 및 자성 비드들을 제1 유체 샘플로부터 제2 유체 샘플로 이송(transfer)시키는 단계를 포함한다. 제2 유체 샘플은 표적 분석물에 특이적으로 결합하는(specific for binding) 제2 결합 모이어티들을 포함한다. 제2 결합 모이어티들은 반응성 효소(reactive enzyme) 또는 다른 리포터 기(reporter group)들에 결합될 수 있다. 자성 비드들을 이송시키는 단계는 시스(sheath)를 제1 유체 샘플 내에 침지시키는 단계, 자성 비드들이 시스에 부착되도록, 제1 유체 샘플 내에 침지된 시스 내에 자석을 위치시키는 단계, 자석을 포함하는 시스를 제1 유체 샘플로부터 제거하는 단계, 및 자석을 포함하는 시스를 제2 유체 샘플에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다.
방법들은 또한 제2 유체 샘플 내의 제2 결합 모이어티들이 자성 비드의 제1 결합 모이어티들에 결합된 표적 분석물에 결합할 수 있게 해주는 단계, 제3 유체 샘플을 획득하기 위해 복수의 자성 비드 및 제2 결합 모이어티들을 포함하는 제2 유체 샘플을 전자 매개체 용액(electron mediator solution)과 화합(combine)시키는 단계, 및 제3 유체 샘플을 기판의 샘플 검출 영역에 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 검출 영역은 제1 전극 상에 있거나 배열될 수 있다. 방법들은 또한 제3 유체 샘플 내의 복수의 자성 비드를 제1 전극 옆에 유지하기 위해 제3 유체 샘플을 자기장에 노출시키는 단계를 포함한다. 제1 전극은 정전위기에 전기적으로 커플링된다. 방법들은 또한 제3 유체 샘플 내의 전자 매개체들과 반응성 효소 간의 산화-환원 반응을 유도하는 단계, 및 제3 유체 샘플에서의 표적 분석물의 존재를 결정하기 위해 정전위기의 출력을 모니터링하는 단계를 포함한다. 정전위기의 출력이 산화-환원 반응에 의해 수정된다.
이 양태의 구현들은 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 산화-환원 반응을 유도하는 단계는 산화-환원 반응이 일어나도록 전위(electrical potential)를 제2 전극에 인가하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 전극은 정전위기에 전기적으로 커플링된다.
다른 구현들에서, 정전위기의 출력을 모니터링하는 단계는 제1 전극으로부터의 전압 또는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 전극으로부터의 전압 또는 전류는 산화-환원 반응의 결과로서 변할 수 있다. 일부 구현들에서, 정전위기의 출력을 모니터링하는 단계는 복수의 상이한 정전위기의 출력들 중에서 정전위기의 출력을 선택하는 단계, 선택된 출력을 마이크로컨트롤러 유닛에 제공하는 단계, 및 선택된 출력을 디스플레이 상에 제시하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현들에서, 반응성 효소는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)를 포함할 수 있고, 전자 매개체 용액은 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘(TMB)을 포함한다.
일부 구현들에서, 표적 분석물은 세포외 소포(extracellular vesicle)들을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 세포외 소포들은 엑소좀(exosome)들을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 표적 분석물은 CD24, EpCAM, CA125, EGFR, HER2, MUC1, CD44, CD44v6, CEA, 메소텔린(Mesothelin), Trop2, GPC1, WNT2, Grp94, SSTR2, EGFRv3, IDH1-R132, GPA33, KRAS, CD166, CD133, MET, B7H3, CD63, CD9, 및 CD81 바이오마커(biomarker)들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 방법들은 정전위기의 출력이 기준 레벨 초과 또는 미만인지를 결정하기 위해 출력을 기준 레벨과 비교하는 단계, 및 비교에 기초하여 환자 내의 암의 존재 또는 부존재(presence or absence)를 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현들에서, 표적 분석물은 CD2, CD3, CD45, CD52, HLA-ABC, CD81, CXCL10, 또는 CXCL9 바이오마커들과 같은 면역 세포 마커들을 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 방법들은 정전위기의 출력이 기준 레벨 초과 또는 미만인지를 결정하기 위해 출력을 기준 레벨과 비교하는 단계, 및 비교에 기초하여 환자가 장기 이식에 대해 거부반응을 보였는지 여부를 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 제1 유체 샘플은 혈액 또는 소변을 포함할 수 있다. 다양한 구현들에서, 표적 분석물은 단백질, 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 독소, 핵산들, 미생물들, 식품 항원들, 또는 대사물을 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 방법들은 제1 유체 샘플을 제공하기 위해 식품 샘플을 추출 완충액(extraction buffer)과 화합시키는 단계, 및 식품 샘플로부터 표적 분석물을 추출하기 위해 식품 샘플을 추출 완충액과 함께 인큐베이트(incubate)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 다른 양태에서, 본 개시내용은 샘플 튜브, 샘플 튜브 캡(sample tube cap), 제1 자석을 포함하는 가늘고 긴 바(elongated bar), 및, 예컨대, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 표적 분석물 검출 디바이스를 포함하는 키트들을 제공한다. 표적 분석물 검출 디바이스는 하우징, 하우징 내의 정전위기, 및 복수의 전극을 포함하는 제1 기판을 포함한다. 복수의 전극은 제1 샘플 검출 영역을 정의하는 제1 전극 세트를 포함한다. 제1 기판은 제1 기판이 하우징에 부착될 때 제1 전극 세트가 정전위기에 커플링하도록 하우징에 분리가능하게 부착되도록 구성된다. 표적 분석물 검출 디바이스는 또한 제2 자석으로부터의 자기장이 기판 및 제1 전극 세트를 통해 제1 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록 제1 기판에 인접하게 배치되도록 구성된 제2 자석을 포함한다.
이 양태의 구현들은 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 샘플 튜브 캡은 가늘고 긴 시스(elongated sheath) 내로 연장되는 개구부(opening)를 포함할 수 있다. 가늘고 긴 바는 가늘고 긴 시스 내에 피팅(fit)되도록 사이징(size)될 수 있다.
일부 구현들에서, 키트들은 복수의 자성 비드를 갖는 추출 완충 용액(extraction buffer solution), 세척 완충 용액, 표적 분석물 완충 용액, 및 산화 효소 완충 용액을 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 표적 분석물 검출 디바이스는 디지털-아날로그 변환기(DAC) 회로를 포함할 수 있다. DAC의 출력은 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링될 수 있다. 표적 분석물 검출 디바이스는 또한 아날로그-디지털 변환기(ADC) 회로를 포함할 수 있다. ADC 회로의 입력은 정전위기의 출력에 커플링될 수 있다. 표적 분석물 검출 디바이스는 또한 DAC 회로에 그리고 ADC 회로에 전기적으로 커플링된 마이크로컨트롤러를 포함할 수 있다. 마이크로컨트롤러는 전압 신호를 DAC 회로의 입력에 제공하도록 구성될 수 있다. 마이크로컨트롤러는 ADC 회로의 출력으로부터 측정 신호를 수신하도록 구성될 수 있다. 일부 구현들에서, 표적 분석물 검출 디바이스는 디스플레이를 포함할 수 있다.
일부 구현들에서, 키트들은 제2 샘플 검출 영역을 정의하는 부가의 복수의 전극을 갖는 제2 기판을 추가로 포함할 수 있다. 제2 기판은 하우징에 분리가능하게 부착되도록 구성될 수 있다. 다른 구현들에서, 키트들은 제3 자석을 포함할 수 있다. 제3 자석은 제2 기판에 분리가능하게 부착되도록 구성될 수 있다.
기술된 구현들 중 하나 이상이 다양한 이점들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 자기적 전기화학적 감지 시스템의 구현들은, 펩티드들, 단백질들, 지질들, 대사물들, 및 다른 저분자들과 같은, 특정의 분석물들의 존재 및 만연에 대해 생물학적 샘플들을 비침습적으로 검사하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 이 정보는 특정의 생물학적 또는 발병 과정, 특정의 질병의 특정의 진행, 또는 어떤 다른 생물학적 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 일부 경우들에서, 이 정보는 특정의 물질의 조성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
일부 경우들에서, 특수 장비를 요구할 수 있는, 광범위한 프로세싱 기법들(예컨대, 여과 또는 원심분리)을 수행할 필요 없이 샘플들이 분석(analyze)될 수 있다. 이와 같이, 사용자들은 보다 쉽게 그리고/또는 보다 비용 효과적인 방식으로 샘플들을 분석할 수 있다. 일부 경우들에서, 사용자들은, 많은 샘플들이 하나의 분석물 또는 다수의 상이한 분석물의 존재에 대해 효율적으로 검사될 수 있도록, 각각의 샘플을 신속하게 검사할 수 있다. 일부 경우들에서, 일반 사용자(lay user)들이 숙련된 기술자의 도움 없이 그리고 고가의 장비를 필요로 함이 없이 스스로 검사를 수행할 수 있다.
게다가, 일부 경우들에서, 세포 특이적 세포외 소포(cell-specific extracellular vesicle)들(예컨대, 엑소좀들, 미세소포(microvesicle)들, 막 입자(membrane particle)들, 및 세포사멸(apoptotic) 수포(bleb)들 또는 소포들)이 광범위한 여과 또는 원심분리를 필요로 함이 없이 복합 배지(complex media)로부터 직접 격리(isolate)될 수 있다. 게다가, 어세이(assay)는 자기 농축(magnetic enrichment) 및 효소 증폭(enzymatic amplification)을 통해 높은 검출 민감도(detection sensitivity)를 달성할 수 있다. 게다가 그 밖에, 전기적 검출 스킴을 통해, 센서들이 병행 측정들을 위해 소형화되고 확장(expand)될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 재료들이 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있더라도, 적당한 방법들 및 재료들이 이하에서 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물들, 특허 출원들, 특허들, 및 다른 참조문헌들은 참조에 의해 그 전체가 원용된다. 충돌의 경우에, 정의들을 비롯하여, 본 명세서가 우선한다. 그에 부가하여, 재료들, 방법들, 및 예들은 예시적인 것에 불과하고 제한하는 것으로 의도되어 있지 않다.
"표적 분석물"은, 달리 언급되지 않는 한, 특정의 유형의 단일 표적 분석물 또는 동일한 유형의 복수의 표적 분석물을 지칭한다.
"특이적 결합(specific binding)"은, 달리 언급되지 않는 한, 결합 모이어티와 특정의 유형의 분석물 간에 결합(bond)을 형성하는 것을 지칭한다.
하나 이상의 실시예들의 상세들이 첨부 도면들 및 이하의 설명에서 기재된다. 다른 특징들 및 장점들은 설명 및 도면들로부터 그리고 청구 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 분석물들을 검사하기 위한 자기적 전기화학적 감지 시스템의 일 예의 개략 다이어그램이다.
도 2는 자기적 전기화학적 감지 시스템의 사용법(usage)의 일 예의 다이어그램이다.
도 3은 분석물들을 검사하기 위한 기기(instrument)의 다른 예의 다이어그램이다.
도 4a 및 도 4b는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 4c는 도 4a 및 도 4b에 도시된 기기의 개략 다이어그램이다.
도 5a 및 도 5b는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 5c는 도 5a 및 도 5b에 도시된 기기의 개략 다이어그램이다.
도 6a 내지 도 6c는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 6d는 샘플 카드의 일 예의 다이어그램이다.
도 6e 및 도 6f는 디스플레이 디바이스의 일 예의 다이어그램들이다.
도 7a 내지 도 7c는 제어 애플리케이션의 그래픽 사용자 인터페이스들(GUI들)의 일 예의 다이어그램들이다.
도 8은 샘플 프로세싱 도구(sample processing tool)들의 일 예의 다이어그램이다.
도 9는 도 8에 도시된 샘플 프로세싱 도구들의 사용법의 일 예의 다이어그램이다.
도 10은 컴퓨터 시스템의 일 예의 다이어그램이다.
도 11은 소형화된 자기적 전기화학적 감지 시스템(통합된 자기적 전기화학적 엑소좀 시스템(integrated magnetic-electrochemical exosome system), iMEX)의 일 예의 다이어그램이다.
도 12a는 저역 통과 필터의 일 예의 개략 다이어그램이다.
도 12b는 iMEX 센서와 상용 시스템(SP200, Bio-Logic) 간의 측정 결과들의 비교를 도시하고 있다.
도 13a 내지 도 13d는 iMEX 시스템의 회로 다이어그램들이다.
도 14는 패키징된 iMEX 시스템의 다이어그램이다.
도 15는 커스터마이즈된 소프트웨어가 iMEX 시스템과 상호작용하기 위한 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스의 다이어그램이다.
도 16은 iMEX 어세이의 개략 다이어그램이다.
도 17은 iMEX 어세이의 다른 개략 다이어그램이다.
도 18은 iMEX 어세이에서의 전기화학적 측정의 개략 다이어그램이다.
도 19a는 측정된 전류에 대한 자성 비드 크기의 영향을 도시하고 있다.
도 19b는 측정된 신호에 대한 자기 농축의 영향을 도시하고 있다.
도 20은 암 세포외 소포(cancer extracellular vesicle)들에서의 세 가지 테트라스패닌(tetraspanin) 마커(CD63, CD9, 및 CD81)의 신호 비교를 도시하고 있다.
도 21은 iMEX와 ELISA의 비교를 도시하고 있다. 2개의 난소암 세포주(ovarian cancer cell line)(OV90 및 OVCA420)에서 6개의 표면 단백질이 프로파일링되었다.
도 22는 다양한 수의 세포외 소포가 인간의 혈장에 스파이크(spike)되었을 때의 iMEX 어세이와 ELISA 어세이 간의 비교를 도시하고 있다.
도 23은 난소암 세포들 및 그들의 분비 세포외 소포(secreting extracellular vesicle)들에서의 표면 단백질들의 프로파일링을 도시하고 있다.
도 24는 임상 샘플 분석을 위한 iMEX 어세이를 도시하고 있다.
도 25는 iMEX 어세이를 사용하여 획득된 난소암 환자들(n = 11)과 건강한 대조군들(n = 5)로부터의 혈장 샘플들의 분석을 도시하고 있다.
도 26은 iMEX 어세이를 사용하여 획득된 난소암 환자들로부터의 혈장 샘플들에서의 EpCAM, CD24, 및 CA125 레벨들을 도시하고 있다.
도 27은 iMEX 어세이를 사용한 약물 치료 반응들의 종적 모니터링(longitudinal monitoring)을 도시하고 있다.
도 28은 신장 내의 T 세포-유래 세포외 소포(EV) 분비 세뇨관(T cell-derived extracellular vesicle (EV) secreted tubule)의 개략적 예시이다.
도 29는 신장 이식 거부반응 환자 생검 샘플들의 조직구조(histology)를 도시하고 있다.
도 30은 Jurkat T 세포-유래 세포외 소포들의 검출을 위한 96 웰 플레이트 포맷 iMEX 시스템, CD3 항체-작용기화된(antibody-functionalized) 자성 비드들에 의해 포획(capture)된 EV의 SEM(scanning electron microscopy) 이미지들, iMEX에 의한 Jurkat 유래 EV 검출의 적정 곡선(titration curve)들, 및 iMEX의 개략도(schematic)를 도시하고 있다.
도 31a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이를 이용해 발견 세트(discovery set)에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다.
도 31b는 발견 세트에서 CD3 마커의 민감도(sensitivity), 특이도(specificity) 및 정확도(accuracy)를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
도 32a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이를 이용해 검증 세트(validation set)에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다.
도 32b는 검증 세트에서 CD3 마커의 민감도, 특이도 및 정확도를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
도 33a는 자기적 전기화학적 감지 시스템(통합된 외인성 항원 검사 시스템(integrated exogenous antigen testing system), iEAT)이다.
도 33b는 예시적인 iEAT 어세이 기법의 다이어그램이다.
도 34는 iEAT 시스템의 개략 다이어그램이다.
도 35는 상용 장비(SP-200, Bio-Logic)에 대비한 iEAT 성능 간의 비교 벤치마크를 도시하고 있다.
도 36a는 2-ME 완충액을 이용한 Ara h1 추출의 일 예를 도시하고 있다.
도 36b 및 도 36c는 5개의 검사된 항원에 대한 3개의 추출 완충액의 성능을 도시하고 있다.
도 37은 가열 디바이스의 일 예를 도시하고 있다.
도 38a는 땅콩 알레르겐 적정에 대한 전류 측정들을 도시하고 있다.
도 38b는 환원 전위가 샘플에 인가된 후의 동적 전류 응답들을 도시하고 있다.
도 39a 및 도 39b는 보관 이후의 동결건조된 시약들의 활성도(activity)를 도시하고 있다.
도 40a 및 도 40b는 다양한 알레르겐들에 대해 생성된 반응 곡선들을 도시하고 있다.
도 40c는 세 가지 상이한 표준 농도를 측정함으로써 추정된, 어세이내 변동(intra-assay variation)들을 도시하고 있다.
도 40d는 iEAT 결과들과 ELISA 측정들 간의 비교를 도시하고 있다.
도 40e는 다양한 표적 샘플들과 비표적 샘플들 간의 신호 응답들의 비교를 도시하고 있다.
도 41a 및 도 41b는 iEAT 시스템을 사용하여 획득된 프로파일링 결과들을 도시하고 있다.
도 41c는 iEAT 시스템과 상호작용하기 위한 스마트폰 애플리케이션의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스들을 도시하고 있다.
도 41d는 iEAT 시스템을 사용하여 획득된 프로파일링 결과들(좌측), 및 iEAT 시스템과 상호작용하기 위한 스마트폰 애플리케이션의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스를 도시하고 있다.
도 42는 표적 분석물들의 존재를 검출하는 프로세스의 일 예의 플로차트 다이어그램이다.
도 2는 자기적 전기화학적 감지 시스템의 사용법(usage)의 일 예의 다이어그램이다.
도 3은 분석물들을 검사하기 위한 기기(instrument)의 다른 예의 다이어그램이다.
도 4a 및 도 4b는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 4c는 도 4a 및 도 4b에 도시된 기기의 개략 다이어그램이다.
도 5a 및 도 5b는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 5c는 도 5a 및 도 5b에 도시된 기기의 개략 다이어그램이다.
도 6a 내지 도 6c는 분석물들을 검사하기 위한 기기의 다른 예의 다이어그램들이다.
도 6d는 샘플 카드의 일 예의 다이어그램이다.
도 6e 및 도 6f는 디스플레이 디바이스의 일 예의 다이어그램들이다.
도 7a 내지 도 7c는 제어 애플리케이션의 그래픽 사용자 인터페이스들(GUI들)의 일 예의 다이어그램들이다.
도 8은 샘플 프로세싱 도구(sample processing tool)들의 일 예의 다이어그램이다.
도 9는 도 8에 도시된 샘플 프로세싱 도구들의 사용법의 일 예의 다이어그램이다.
도 10은 컴퓨터 시스템의 일 예의 다이어그램이다.
도 11은 소형화된 자기적 전기화학적 감지 시스템(통합된 자기적 전기화학적 엑소좀 시스템(integrated magnetic-electrochemical exosome system), iMEX)의 일 예의 다이어그램이다.
도 12a는 저역 통과 필터의 일 예의 개략 다이어그램이다.
도 12b는 iMEX 센서와 상용 시스템(SP200, Bio-Logic) 간의 측정 결과들의 비교를 도시하고 있다.
도 13a 내지 도 13d는 iMEX 시스템의 회로 다이어그램들이다.
도 14는 패키징된 iMEX 시스템의 다이어그램이다.
도 15는 커스터마이즈된 소프트웨어가 iMEX 시스템과 상호작용하기 위한 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스의 다이어그램이다.
도 16은 iMEX 어세이의 개략 다이어그램이다.
도 17은 iMEX 어세이의 다른 개략 다이어그램이다.
도 18은 iMEX 어세이에서의 전기화학적 측정의 개략 다이어그램이다.
도 19a는 측정된 전류에 대한 자성 비드 크기의 영향을 도시하고 있다.
도 19b는 측정된 신호에 대한 자기 농축의 영향을 도시하고 있다.
도 20은 암 세포외 소포(cancer extracellular vesicle)들에서의 세 가지 테트라스패닌(tetraspanin) 마커(CD63, CD9, 및 CD81)의 신호 비교를 도시하고 있다.
도 21은 iMEX와 ELISA의 비교를 도시하고 있다. 2개의 난소암 세포주(ovarian cancer cell line)(OV90 및 OVCA420)에서 6개의 표면 단백질이 프로파일링되었다.
도 22는 다양한 수의 세포외 소포가 인간의 혈장에 스파이크(spike)되었을 때의 iMEX 어세이와 ELISA 어세이 간의 비교를 도시하고 있다.
도 23은 난소암 세포들 및 그들의 분비 세포외 소포(secreting extracellular vesicle)들에서의 표면 단백질들의 프로파일링을 도시하고 있다.
도 24는 임상 샘플 분석을 위한 iMEX 어세이를 도시하고 있다.
도 25는 iMEX 어세이를 사용하여 획득된 난소암 환자들(n = 11)과 건강한 대조군들(n = 5)로부터의 혈장 샘플들의 분석을 도시하고 있다.
도 26은 iMEX 어세이를 사용하여 획득된 난소암 환자들로부터의 혈장 샘플들에서의 EpCAM, CD24, 및 CA125 레벨들을 도시하고 있다.
도 27은 iMEX 어세이를 사용한 약물 치료 반응들의 종적 모니터링(longitudinal monitoring)을 도시하고 있다.
도 28은 신장 내의 T 세포-유래 세포외 소포(EV) 분비 세뇨관(T cell-derived extracellular vesicle (EV) secreted tubule)의 개략적 예시이다.
도 29는 신장 이식 거부반응 환자 생검 샘플들의 조직구조(histology)를 도시하고 있다.
도 30은 Jurkat T 세포-유래 세포외 소포들의 검출을 위한 96 웰 플레이트 포맷 iMEX 시스템, CD3 항체-작용기화된(antibody-functionalized) 자성 비드들에 의해 포획(capture)된 EV의 SEM(scanning electron microscopy) 이미지들, iMEX에 의한 Jurkat 유래 EV 검출의 적정 곡선(titration curve)들, 및 iMEX의 개략도(schematic)를 도시하고 있다.
도 31a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이를 이용해 발견 세트(discovery set)에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다.
도 31b는 발견 세트에서 CD3 마커의 민감도(sensitivity), 특이도(specificity) 및 정확도(accuracy)를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
도 32a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이를 이용해 검증 세트(validation set)에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다.
도 32b는 검증 세트에서 CD3 마커의 민감도, 특이도 및 정확도를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
도 33a는 자기적 전기화학적 감지 시스템(통합된 외인성 항원 검사 시스템(integrated exogenous antigen testing system), iEAT)이다.
도 33b는 예시적인 iEAT 어세이 기법의 다이어그램이다.
도 34는 iEAT 시스템의 개략 다이어그램이다.
도 35는 상용 장비(SP-200, Bio-Logic)에 대비한 iEAT 성능 간의 비교 벤치마크를 도시하고 있다.
도 36a는 2-ME 완충액을 이용한 Ara h1 추출의 일 예를 도시하고 있다.
도 36b 및 도 36c는 5개의 검사된 항원에 대한 3개의 추출 완충액의 성능을 도시하고 있다.
도 37은 가열 디바이스의 일 예를 도시하고 있다.
도 38a는 땅콩 알레르겐 적정에 대한 전류 측정들을 도시하고 있다.
도 38b는 환원 전위가 샘플에 인가된 후의 동적 전류 응답들을 도시하고 있다.
도 39a 및 도 39b는 보관 이후의 동결건조된 시약들의 활성도(activity)를 도시하고 있다.
도 40a 및 도 40b는 다양한 알레르겐들에 대해 생성된 반응 곡선들을 도시하고 있다.
도 40c는 세 가지 상이한 표준 농도를 측정함으로써 추정된, 어세이내 변동(intra-assay variation)들을 도시하고 있다.
도 40d는 iEAT 결과들과 ELISA 측정들 간의 비교를 도시하고 있다.
도 40e는 다양한 표적 샘플들과 비표적 샘플들 간의 신호 응답들의 비교를 도시하고 있다.
도 41a 및 도 41b는 iEAT 시스템을 사용하여 획득된 프로파일링 결과들을 도시하고 있다.
도 41c는 iEAT 시스템과 상호작용하기 위한 스마트폰 애플리케이션의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스들을 도시하고 있다.
도 41d는 iEAT 시스템을 사용하여 획득된 프로파일링 결과들(좌측), 및 iEAT 시스템과 상호작용하기 위한 스마트폰 애플리케이션의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스를 도시하고 있다.
도 42는 표적 분석물들의 존재를 검출하는 프로세스의 일 예의 플로차트 다이어그램이다.
자기적 전기화학적 감지를 사용하여 분석물들을 검사하기 위한 시스템들 및 기법들이 본 명세서에 기술되어 있다. 본 명세서에 기술된 구현들 중 하나 이상은 세포들, 미세 소포(micro vesicle)들, 막 입자들, 세포사멸 수포들 또는 소포들 또는 엑소좀들(예컨대, 막관통(transmembrane) 및 세포질(cytosolic) 단백질들, mRNA, DNA, 및 microRNA)과 같은 세포외 소포들(EV들), 펩티드들, 단백질들, 지질들, 대사물들, 및 (예컨대, 혈청 또는 용액 중에서) 자유 부동(free-floating)하거나 생물학적 구조물의 표면에(예컨대, 세포외 소포 또는 세포의 표면에) 발현되는 다른 분자들과 같은, 분석물들을 식별(identify)하는 데 사용될 수 있다.
구현의 일 예에서, 피검자로부터 샘플(예컨대, 혈액 또는 소변과 같은, 체액(biological fluid)의 샘플)이 수집된다. 특정의 관심 분석물들(예컨대, 특정의 생물학적 또는 발병 과정, 특정의 질병의 특정의 진행, 또는 어떤 다른 생물학적 상태를 나타내는 분석물들)이 측정 기기의 샘플 프로브 근방에 격리 및/또는 집중되도록, 샘플이 자기 분리(magnetic separation)를 사용하여 프로세싱된다. 샘플에서의 이 분석물들의 존재 및/또는 만연은 차후에 전기화학적 검출을 통해 측정 기기를 사용하여 조사된다. 결과적인 정보는 (예컨대, 간호자(caretaker)들이 보다 많은 정보를 바탕으로(in a more informed manner) 진단을 내리고 그리고/또는 치료를 행할 수 있게 해주는 것에 의해) 보다 효과적인 간호를 피검자에게 제공하는 데 사용될 수 있다.
구현의 다른 예에서, 물질로부터 샘플이 수집된다. 특정의 관심 분석물들(예컨대, 특정의 재료 또는 항원을 나타내는 분석물들)이 측정 기기의 샘플 프로브 근방에 격리 및/또는 집중되도록, 샘플이 자기 분리를 사용하여 프로세싱된다. 샘플에서의 이 분석물들의 존재 및/또는 만연은 차후에 전기화학적 검출을 통해 측정 기기를 사용하여 조사된다. 결과적인 정보는 물질의 조성에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용될 수 있다. 일 예로서, 소비자가 자신의 식단(diet)에 관해 보다 많은 정보에 근거한 선택을 할 수 있도록, 식품 제품의 샘플들이 특정의 알레르겐들의 존재에 대해 분석될 수 있다.
일부 경우들에서, 특수 장비를 요구할 수 있는, 광범위한 프로세싱 기법들(예컨대, 여과 또는 원심분리)을 수행할 필요 없이 샘플들이 분석될 수 있다. 이와 같이, 사용자들은 보다 쉽게 그리고/또는 보다 비용 효과적인 방식으로 샘플들을 분석할 수 있다. 일부 경우들에서, 사용자들은, 많은 샘플들이 하나의 분석물 또는 다수의 상이한 분석물의 존재에 대해 효율적으로 검사될 수 있도록, 각각의 샘플을 신속하게 검사할 수 있다. 일부 경우들에서, 일반 사용자들이 숙련된 기술자의 도움 없이 그리고 고가의 장비를 필요로 함이 없이 스스로 검사를 수행할 수 있다.
분석물들을 검사하기 위한 시스템(100)의 일 예가 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 시스템(100)은 프로브(120)에 전기적으로 커플링된 정전위기(110)를 포함한다. 시스템(100)은 또한 아날로그-디지털 변환기(ADC)(130), 마이크로컨트롤러 유닛(MCU)(140), 디지털-아날로그 변환기(DAC)(150), 및 자석 어셈블리(160)를 포함한다.
프로브(120)는 3개의 전극: "기준" 전극(122a), "카운터" 전극(122b), 및 "작동" 전극(122c)을 포함한다. 시스템(100)의 동작 중에, 이 전극들(122a 내지 122c) 각각은 분석될 유체 샘플과 접촉하게 위치된다. 자석 어셈블리(160)(예컨대, 프로브(120)에 인접하게 위치됨)는 (예컨대, 전극들을 통해 미치는 자기장을 유도하는 것에 의해) 유체 샘플 내의 자기적으로 표지된(magnetically labeled) 입자들을 전극들(122a 내지 122c) 쪽으로 끌어당긴다. 일부 경우들에서, 전극들(122a 내지 122c) 중 하나 이상의 전극 또는 표면들이 일괄하여 샘플 검출 영역이라고 지칭될 수 있다.
정전위기(110)는 전극들(122a 내지 122c) 각각에 전기적으로 커플링되고, 동작 동안, 작동 전극(122c)과 기준 전극(122a) 사이에 미리 정의된 전위차를 유지하도록 구성된다. 게다가, 정전위기(110)는 작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 유도된 전류를 측정하도록 구성된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 정전위기(110)는 2개의 연산 증폭기(112a 및 112b)를 포함한다. 제1 연산 증폭기(112a)는 작동 전극(122c)에 전기적으로 커플링되고, (예컨대, 기준 전극(122a)의 전위에 비례하는 바이어스로서의 전위를 작동 전극(122c)에 인가하는 것에 의해) 작동 전극(122c)과 기준 전극(122a) 사이에 미리 정의된 전위차를 유지하도록 구성된다. 일부 경우들에서, 전위는 대략 -1.65 V 내지 대략 1.65 V일 수 있다. 일부 경우들에서, 전위는 대략 -0.1 V일 수 있다. 제2 연산 증폭기(112b)는 기준 전극(122a) 및 카운터 전극(122b)에 전기적으로 커플링되고, 작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 유도된 전류를 전압 신호로 변환하도록 트랜스임피던스 증폭기(trans-impedance amplifier)로서 구성된다.
전극들(122a 내지 122c)은 다양한 재료들로 제조될 수 있다. 일부 경우들에서, 작동 전극(122c) 및 카운터 전극(122b)은, 부분적으로 또는 전체적으로, 제1 재료(예컨대, 금)로 제조될 수 있고, 기준 전극(122a)은, 부분적으로 또는 전체적으로, 제2 재료(예컨대, 은 또는 또는 염화은)로 제조될 수 있다. 일부 경우들에서, 전극들(122a 내지 122c) 중 일부 또는 전부에 대해 상이한 재료들이 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 상이한 재료들은 전극들의 유효 표면적을 증가시키는 것에 의해 신호 레벨을 증가시킬 수 있다.
(작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 전류를 나타내는) 전압 신호가 ADC(130)로 전송되도록, 정전위기(110)는 ADC(130)에 전기적으로 커플링된다. ADC(130)는 전압 신호를 (예컨대, 전압 신호를 표현하는 디지털 신호로) 디지털화하고, 디지털화된 전압 신호를 프로세싱을 위해 MCU(140)로 전송한다.
MCU(140)는 디지털화된 전압 신호를 프로세싱한다. 일부 경우들에서, MCU(140)는 디지털화된 전압 신호들에 기초하여 샘플의 특정의 특성들을 결정할 수 있다. 예를 들어, 디지털화된 전압 신호에 기초하여, MCU(140)는 특정의 분석물이 샘플에 존재하는지를 결정할 수 있다. 다른 예로서, 디지털화된 전압 신호에 기초하여, MCU는 샘플 내의 분석물의 절대 농도 및/또는 상대 농도를 결정할 수 있다.
MCU(140)는 또한 DAC(150)를 통해 정전위기(110)의 동작을 제어하도록 구성된다. 예를 들어, MCU(140)는 디지털 제어 신호들을 DAC(150)로 전송할 수 있고, DAC(150)는 디지털 제어 신호들을 대응하는 아날로그 신호들로 변환할 수 있다. 이 아날로그 신호들은 정전위기(110)의 동작을 제어하는 데 사용될 수 있다. 일 예로서, MCU(140)는, DAC(150)를 통해, 기준 전극(122a)에 상대적인 작동 전극(122c)의 전위를 증가 및/또는 감소시킬 수 있고, 아날로그 신호들을 연산 증폭기들(112a 및 112b)의 입력들에 인가하는 것에 의해 작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 전류의 샘플링을 제어할 수 있다.
비록 도 1과 관련하여 3 전극 구현이 기술되어 있지만, 다른 구성들이 샘플 내의 유도 전류를 측정하는 데 사용될 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 듀얼 작동 전극 구성들(예컨대, IDA(interdigitated electrode array)) 또는 2-전극 구성들(예컨대, 카운터 전극을 배제함)과 같은 구성들이 사용될 수 있다.
시스템(100)의 예시적인 사용법이 도 2에 도시되어 있다. 이 예에서, 시스템(100)은 분석물(204)의 존재에 대해 유체 샘플(202)을 분석하는 데 사용된다.
패널(200)에 도시된 바와 같이, 유체 샘플(202)(분석물(204)을 함유함)이 자성 비드들(206)을 함유하는 용액과 혼합된다. 각각의 자성 비드(206)는 자기 코어(208), 및 자기 코어(208)의 표면 상에 코팅된, 분석물(204)에 특이적인 하나 이상의 결합 모이어티(210)를 포함한다.
혼합 시에, 분석물(204)은 결합 모이어티(210)와 분석물(204) 사이의 상호작용으로 인해 자성 비드(206)에 의해 포획된다. (예컨대, 자성 비드들(206)을 자기적으로 수집(collect)하고, 수집된 자성 비드들(206)을 새 샘플 완충액(fresh sample buffer)으로 이송시키는 것에 의해) 비결합(unbound) 분석물들(204)을 제거하기 위해 샘플(202)이 세척될 수 있다.
패널(240)에 도시된 바와 같이, 샘플(202)이 2차 분자(secondary molecule)들(242)을 함유하는 용액과 혼합된다. 각각의 2차 분자(242)는 분석물(204)에 특이적인 결합 모이어티(244)를 포함한다. 혼합 시에, 2차 분자(242)는 또한 결합 모이어티(244)와 분석물(204) 사이의 상호작용으로 인해 자성 비드(206)에 의해 포획된다. 비결합 2차 분자들(242)을 제거하기 위해 샘플(202)이 세척될 수 있다.
패널(260)에 도시된 바와 같이, 샘플(202)이 3차 분자(tertiary molecule)들(262)을 함유하는 용액과 혼합된다. 각각의 3차 분자(262)는 2차 분자(242)에 특이적인 결합 모이어티(264), 및 반응성 효소(266)를 포함한다. 예시적인 반응성 효소들(266)은, 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 또는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase)와 같은, 산화 효소를 포함한다. 혼합 시에, 3차 분자(262)는 또한 결합 모이어티(264)와 2차 분자(242) 사이의 상호작용으로 인해 자성 비드(206)에 의해 포획된다. 비결합 3차 분자들(262)을 제거하기 위해 샘플(202)이 세척될 수 있다.
패널(280)에 도시된 바와 같이, 샘플(202)이 전자 매개체 용액과 혼합되고, 프로브(120)에 도포된다. 반응성 효소(266)에 따라, 상이한 전자 매개체 용액들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 효소(266)가 HRP를 포함하는 경우, 전자 매개체 용액은 ABTS(2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt), OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride), 및/또는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 같은 수용성 기질들을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 반응성 효소(266)가 알칼라인 포스파타제를 포함하는 경우, 전자 매개체 용액은 PNPP(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 수용성 기질들을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 반응성 효소(266)가 베타-갈락토시다제를 포함하는 경우, 전자 매개체 용액은 ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside), Nap-Gal(Naphthol-AS-Bl-beta-D-galactopyranosidase), 및/또는 MUm-Gal(4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-galactopyranosidase)과 같은 수용성 기질들을 포함할 수 있다.
프로브(120) 아래의 자석 어셈블리(160)에 의해 유도된 자기장으로 인해, 자성 비드(206)가 프로브(120) 쪽으로 끌어당겨진다. 게다가, 프로브(120)의 작동 전극(122c)과 기준 전극(122a)을 가로질러 유도된 전위로 인해, 전자 매개체들과 산화 효소 사이에 산화-환원 반응이 유도된다. 그 결과, 프로브(120)의 작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 전류가 유도된다. 차례로, 이 전류는 연산 증폭기(112a)에 의해 전압 신호로 변환되고, 전압 신호는 ADC(130)에 의해 디지털화되며, 디지털화된 전압 신호는 MCU(140)에 의해 해석된다.
일반적으로, 프로브(120)에 유도된 전류는 샘플(202)에서의 분석물(204)의 존재 및/또는 농도와 상관관계가 있을 수 있다. 예를 들어, 샘플(202)이 상대적으로 높은 농도의 분석물(204)을 함유하는 경우, 보다 많은 수의 분석물(204)이 자성 비드들(206)에 의해 포획될 것이다. 차례로, 보다 많은 수의 2차 분자(242) 및 3차 분자(262)가 또한 자성 비드(206)에 의해 포획되고, 프로브(120)와 근접하게 될 것이다. 이 결과, 보다 많은 수의 산화 효소가 전자 매개 용액(electron mediating solution)과 반응할 수 있게 된다. 그에 따라, 산화-환원 반응은 카운터 전극(122b)을 가로지르는 상대적으로 더 높은 전류를 초래한다.
이와 달리, 샘플(202)이 상대적으로 낮은 농도의 분석물(204)을 함유하는 경우, 보다 적은 수의 분석물(204)이 자성 비드들(206)에 의해 포획될 것이다. 차례로, 보다 적은 수의 2차 분자(242) 및 3차 분자(262)가 또한 자성 비드(206)에 의해 포획되고, 프로브(120)와 근접하게 될 것이다. 이 결과, 보다 적은 수의 산화 효소가 전자 매개 용액과 반응할 수 있게 된다. 그에 따라, 산화-환원 반응은 카운터 전극(122b)을 가로지르는 상대적으로 더 낮은 전류를 초래한다.
게다가, 샘플(202)이 어떠한 분석물(202)도 함유하지 않는다면, 실질적으로 어떠한 분석물들도 자성 비드들(204)에 의해 포획되지 않을 것이다. 차례로, 실질적으로 어떠한 2차 분자들(242) 및 3차 분자들(262)도 자성 비드들에 의해 포획되지 않을 것이다. 이와 같이, 실질적으로 어떠한 산화 효소들도 전자 매개 용액(electron mediation solution)과 반응할 수 없을 것이다. 그에 따라, 카운터 전극(122b)을 가로지르는 실질적으로 어떠한 전류도 유도되지 않을 것이다.
일부 경우들에서, MCU(140)는 유도 전류에 기초하여 분석물(204)의 절대 농도 및/또는 상대 농도를 추정할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현에서, 유도 전류와 분석물 농도 사이의 상관관계는 (예컨대, 기지의 농도들의 분석물을 갖는 샘플들을 획득하는 것, 분석 프로세스의 결과로서 생기는 유도 전류를 측정하는 것, 농도와 유도 전류 사이의 관계를 기술하는 함수를 도출하는 것에 의해) 경험적으로 결정될 수 있다. 이어서, 결정된 상관관계에 따라 관측된 전류 측정을 교정(calibrate)하는 것에 의해 미지의 샘플의 농도가 추정될 수 있다. 일부 경우들에서, 유도 전류와 분석물 농도 사이의 상관관계는, 분석물, 자성 비드들, 2차 및 3차 분자들, 및/또는 다른 파라미터들에 따라, 달라질 수 있다. 이와 같이, 각각의 파라미터 세트에 대해 상이한 상관관계들이 결정될 수 있고, 전류 측정을 해석하기 위해 적절히 선택적으로 적용될 수 있다.
일반적으로, 자성 비드(206)는 하나 이상의 내부 자기 코어 및 외부 코팅, 예컨대, 캡핑 폴리머(capping polymer)를 포함한다. 자기 코어들은 단일금속(monometallic)(예컨대, Fe, Ni, Co), 이중금속(bimetallic)(예컨대, FePt, SmCo, FePd, FeAu)일 수 있거나, 페라이트들(예컨대, Fe2O3, Fe3O4, MnFe2O4, NiFe2O4, CoFe2O4)로 제조될 수 있다. 자성 입자들은 나노미터 또는 마이크로미터 크기일 수 있고, 반자성(diamagnetic), 강자성(ferromagnetic), 상자성(paramagnetic), 또는 초상자성(superparamagnetic)일 수 있으며, 크기는 평균 직경 또는 평균 길이에 대응한다. 예를 들어, 자성 입자들은 대략 10 μm, 대략 1 μm, 대략 500 nm, 대략 300 nm, 또는 대략 100 nm의 크기를 가질 수 있다. 일부 경우들에서, 대략 10 μm의 크기를 갖는 자성 입자들은 어세이 동안 침강(sedimentation)의 정도를 감소시키는 데 유익할 수 있다. 다른 입자 크기들도 가능하다. 입자의 외부 코팅은 그의 수용성(water-solubility) 및 안정성을 증가시킬 수 있고 또한 결합 모이어티들로 추가 표면 처리하기 위한 사이트(site)들을 제공할 수 있다.
일반적으로, 결합 모이어티는, 예컨대, 표적 분자 또는 다른 결합 모이어티(또는, 특정 실시예들에서, 응집 유도 분자(aggregation inducing molecule))에 공유(covalently) 또는 비공유(non-covalently) 결합하거나 그와 혼성화(hybridize)하기 위해 특이적으로 결합(bind)하거나 다른 방식으로 링크(link)하는, 합성 또는 천연, 분자이다. 예를 들어, 결합 모이어티는 특이적 상보적 핵산 표적(specific complementary nucleic acid target)에 혼성화하는 합성 올리고뉴클레오티드(synthetic oligonucleotide)일 수 있다. 결합 모이어티는 또한 항원 또는 임의의 단백질-단백질 상호작용에 대한 항체일 수 있다. 또한, 결합 모이어티는 대응하는 표적에 결합하는 다당류(polysaccharide)일 수 있다. 특정 실시예들에서, 결합 모이어티들은, 다른 결합 모이어티에 결합될 때, 용액 중의 효소와 같은 표적 분자에 대한 기질들로서 역할하도록 설계되거나 선택될 수 있다. 결합 모이어티들은, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드들, 폴리펩티드들, 항체들, 및 다당류들을 포함한다. 일 예로서, 스트렙타비딘(streptavidin)은 비오틴(biotin)에 의해 인식될 분자당 4개의 사이트(결합 모이어티)를 갖는다. 임의의 주어진 분석물, 예컨대, 특이적 표면 마커(specific surface marker)를 갖는 특정 유형의 세포에 대해, 전형적으로 관련 분야들의 통상의 기술자에게 알려져 있는 많은 공지된 결합 모이어티들이 있다.
일부 경우들에서, 시스템은 분석 기기로서 구현될 수 있다. 일 예로서, 도 3은 자기적 전기화학적 감지를 사용하여 분석물들을 검사하기 위한 기기(300)를 도시하고 있다. 기기(300)는 도 1에 도시된 정전위기(110), ADC(130), MCU(140), 및 DAC(150)를 인클로징하는 하우징(310)을 포함한다. 기기(300)는 또한 하우징(300)의 외부를 따라 노출된 웰(320)을 포함하고, 프로브(120)는 웰(320)의 바닥(bottom)을 따라 배치되며 자석 어셈블리(160)는 프로브(120) 아래에 배치된다. 이 구성은 사용자가 유체 샘플(예컨대, 도 2와 관련하여 기술된 프로세스에 따라 처리된 샘플)을, 프로브(120) 위에 놓이도록, 웰(320)에 도포하고, 기기(300)를 사용하여 유체 샘플에서의 특정의 분석물의 존재 및/또는 만연을 확인할 수 있게 해준다. 일부 경우들에서, 기기(300)는 분석된 유체 샘플에 관한 정보를 디스플레이 디바이스(330)(예컨대, 디스플레이 화면 또는 모니터) 상에 출력하고 그리고/또는 정보를 추가 분석을 위해 컴퓨팅 디바이스(340)(예컨대, 컴퓨터, 스마트폰, 서버 시스템, 또는 다른 컴퓨팅 디바이스)에 출력할 수 있다.
도 3에 도시된 예에서, 기구는 한 번에 단일 샘플을 분석하기 위한 단일 프로브를 갖는 단일 웰을 포함한다. 그렇지만, 일부 경우들에서, 다수의 샘플이 동시에 또는 순차적으로 분석될 수 있도록, 기기는 다수의 상이한 웰과 프로브를 포함할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 사용자가 다수의 샘플을 보다 효율적인 방식으로 프로세싱할 수 있게 해주기 때문에, 유용할 수 있다.
일 예로서, 도 4a와 도 4b는, 제각기, 기기(400)를 조립도(assembled view) 및 분해도(exploded view)로 도시하고 있다. 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 기기(400)는 하우징(410), 하우징(400)의 외부를 따라 노출된 몇 개의 웰(420a 내지 420h), 및 각각의 웰(410a 내지 410h) 아래에 배치된 자석 어셈블리(160a 내지 160h)를 포함한다. 게다가, 기기(400)는, 각각이 대응하는 웰(420a 내지 420h)의 바닥을 따라 배치된 각자의 프로브(120a 내지 120h)에 전기적으로 커플링되는, 몇 개의 정전위기(110a 내지 110h)를 포함한다. 도 3과 관련하여 기술된 바와 유사한 방식으로, 사용자는 하나 이상의 유체 샘플(예컨대, 도 2와 관련하여 기술된 프로세스에 따라 처리된 샘플)을 웰들(420a 내지 420h) 중 하나 이상에 도포하고, 기기(400)를 사용하여 유체 샘플들에서의 특정의 분석물들의 존재 및/또는 만연을 확인할 수 있다. 이와 유사하게, 기기(400)는 분석된 유체 샘플에 관한 정보를 디스플레이 디바이스(430)(예컨대, 디스플레이 스크린 또는 모니터) 상에 출력하고 그리고/또는 정보를 추가 분석을 위해 컴퓨팅 디바이스(440)(예컨대, 컴퓨터, 스마트폰, 서버 시스템, 또는 다른 컴퓨팅 디바이스)에 출력할 수 있다.
일부 경우들에서, 자기 어셈블리(160a 내지 160h) 각각은 각각의 웰(420a 내지 420h)에 대응하는 하나 이상의 개별 자석(예컨대, 각각의 웰(420a 내지 420h) 아래에 매립된 자석)을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 자기 어셈블리(160a 내지 160h)는 다수의 상이한 웰(420a 내지 420h) 사이에서 연장되는 하나 이상의 자석을 포함할 수 있다.
일부 경우들에서, 기기(400)는, MCU가 정전위기들 각각으로부터의 신호들을 선택적으로 검색하고 웰들 내의 샘플들 각각의 특성들을 선택적으로 결정할 수 있도록, 정전위기들의 출력들을 MCU에 전기적으로 커플링시키기 위한 멀티플렉서를 포함할 수 있다.
일 예로서, 기기(400)는 도 4c에 개략적으로 도시되어 있다. 기기(400)는, 각각이 각자의 프로브(120a 내지 120h)에 전기적으로 커플링된, 몇 개의 정전위기(110a 내지 110h)(예컨대, 도 4c에서 "x8" 라벨로 표시된 바와 같이 총 8개)를 포함한다. 기기(400)는 또한 ADC(130), MCU(140), DAC(150), 및 자석 어셈블리(160a 내지 160h)를 포함한다. 이 컴포넌트들 각각은 도 1과 관련하여 기술된 바와 유사하게 동작할 수 있다.
그렇지만, 이 예에서, 기기(400)는 (ADC(130)를 통해) 정전위기들(110a 내지 110h)의 출력들을 MCU(140)에 전기적으로 커플링시키는 멀티플렉서(450)를 포함한다. 멀티플렉서(450)는 정전위기들(110a 내지 110h) 중 하나로부터의 전압 신호들을 선택하고, 신호를 ADC(130) 및 MCU(140)로 포워딩한다. 이와 같이, 단일 ADC(130) 및 MCU(140)는 다수의 상이한 프로브(120a 내지 120h)로부터의 신호들을 선택적으로 검색하고 웰들 내의 샘플들 각각의 특성들을 선택적으로 결정하도록 구성될 수 있다. 일부 경우들에서, 멀티플렉서(450)는 (예컨대, 스위치, 다이얼, 버튼, 터치스크린, 또는 다른 제어 메커니즘을 통해) 사용자에 의해 제어될 수 있다. 일부 경우들에서, 멀티플렉서(450)는 MCU(140)에 의해 (예컨대, MCU(140)로부터 멀티플렉서(450)로 전송되는, 특정의 선택된 웰을 나타내는 제어 신호를 통해) 제어될 수 있다. 이것은, 예를 들어, MCU(140)가 분석을 위한 웰들을 자동으로 선택할 수 있게(예컨대, 순차적인 방식으로 또는 어떤 다른 패턴에 따라 웰들로부터의 측정들을 자동으로 수집할 수 있게) 해주기 때문에, 유용할 수 있다.
비록 도 4에 도시된 기기(400)가 8개의 웰(및 8개의 대응하는 프로브 및 정전위기)을 포함하지만, 이것은 예시적인 예에 불과하다. 실제로, 디바이스는 임의의 수의 웰, 프로브, 및 정전위기(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상)를 포함할 수 있다.
게다가, 일부 경우들에서, 멀티플렉서는 다수의 상이한 프로브의 출력들을 공통 정전위기에 전기적으로 커플링시키는 데 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 단일 정전위기가 다수의 상이한 샘플의 특성들을 측정할 수 있게 해주고, 이는 기기 제작의 복잡성 및/또는 비용을 줄일 수 있기 때문에, 유용할 수 있다.
기기(500)의 다른 예가 도 5a 내지 도 5c에 도시되어 있다. 기기(500)는 하우징(510), 하우징(510)의 외부를 따라 노출된 다수의 웰(520), 및 각각의 웰(520) 아래에 배치된 자석 어셈블리(160)를 포함한다. 게다가, 기기(500)는, 각각이 대응하는 웰(520)의 바닥을 따라 배치된 각자의 프로브(120)에 전기적으로 커플링되는, 몇 개의 정전위기(110)를 포함한다.
웰들(520)은 표준화된 96 웰 플레이트(예컨대, ANSI(American National Standards Institute) 및/또는 SLAS(Society for Laboratory Automation and Screening)에 의해 확립된 규격들에 따라 제조된 96 웰 플레이트)와 유사한 배열 및 유사한 치수를 가질 수 있다. 이것은, 예를 들어, 사용자가 샘플들을 기기(500)에 로드(load) 및 언로드(unload)하기 위해 흔히 이용가능한 장비(예컨대, 표준화된 다중 채널 피펫(multi-channel pipette))를 사용할 수 있게 해주기 때문에, 유용할 수 있다.
도 5b에 도시된 바와 같이, 웰들(520) 및 정전위기들(110)의 전극들이 일련의 층들을 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 웰들(520)은 상부 층(530)에 제공될 수 있고, 정전위기들(110)의 전극들은 하부 층(540)(예컨대, 인쇄 회로 보드와 같은, 기판) 상에 제공될 수 있다. 웰들(520) 각각이 아래의 대응하는 전극과 정렬되도록, 상부 층(530)이 하부층(540) 위쪽에 배치될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 기기(500)가 보다 쉽게 제조될 수 있기 때문에(예컨대, 다수의 전극 세트가 단일 PCB 제조 프로세스를 사용하여 제조될 수 있기 때문에), 유용할 수 있다.
일부 경우들에서, 정전위기들(110)의 전극들은, 세라믹 기판, 유리 기판, 강성 플라스틱(rigid plastic) 기판, 종이 기판, 가요성 폴리머(flexible polymer) 기판(예컨대, PDMS), 실리콘 기판, 및/또는 PCB와 같은, 기판 상에 형성될 수 있다. 일부 경우들에서, 자석 어셈블리는 (예컨대, 자성 비드들을 기판 및 그 위에 형성된 전극들 쪽으로 끌어당기기 위해) 자석으로부터의 자기장이 기판을 통해 미치도록 기판에 상대적으로 배치된 하나 이상의 자석을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 자석 어셈블리는 또한 기판(예컨대, 하나 이상의 전극과 동일한 기판, 또는 별개의 기판) 상에 형성될 수 있다.
기기(500)는 도 5c에 개략적으로 도시되어 있다. 도 4c와 관련하여 기술된 바와 유사한 방식으로, 기기(500)는, 각각이 각자의 프로브(120)에 전기적으로 커플링되는, 몇 개의 정전위기(110)를 포함한다. 기기(500)는 또한 ADC(130), MCU(140), DAC(150), 및 자석 어셈블리(160)를 포함한다. 이와 유사하게, 기기(500)는 (ADC(130)를 통해) 정전위기들(110)의 출력들을 MCU(140)에 전기적으로 커플링시키는 멀티플렉서(450)를 포함한다. 멀티플렉서(450)는 정전위기들(110) 중 하나로부터의 전압 신호들을 선택하고, 신호를 ADC(130) 및 MCU(140)로 포워딩한다. 이와 같이, 단일 ADC(130) 및 MCU(140)는 다수의 상이한 프로브(120)로부터의 신호들을 선택적으로 검색하고 웰들 내의 샘플들 각각의 특성들을 선택적으로 결정하도록 구성될 수 있다.
기기(500)는 또한 멀티플렉서(450)와 ADC(130) 사이에 전기적으로 커플링된 프로그램가능 이득 증폭기(PGA)(550)를 포함한다. PGA(500)는 멀티플렉서(450)로부터의 신호들의 증폭 이득을 자동으로 변경하도록 그리고 기기(500)의 검출 다이내믹 레인지를 최대화하거나 다른 방식으로 증가시키도록 구성될 수 있다.
기기(500)는 또한 DAC(150)와 정전위기들(110) 사이에 전기적으로 커플링된 구동기(560)를 포함한다. 구동기(560)는 DAC(150)로부터 수신된 신호들에 기초하여 전류를 정전위기들의 전극들에 전달하도록 구성될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 어떤 DAC가 전류를 많은 수의 디바이스에 공급할 수 없거나 다른 방식으로 그에 부적당할 수 있기 때문에, 유익할 수 있다.
일부 경우들에서, 시스템이 휴대용 디바이스로서 구현될 수 있다. 일 예로서, 도 6a는 자기적 전기화학적 감지를 사용하여 분석물들을 검사하기 위한 휴대용 디바이스(600)를 도시하고 있다. 디바이스(600)는 ADC(130), MCU(140), 및 DAC(150)를 인클로징하는 하우징(610)을 포함한다. 디바이스(600)는 또한 배터리 모듈(620), 통신 인터페이스(630), 샘플 인터페이스들(640a 및 640b), 및 디스플레이 디바이스(650)를 포함한다.
일반적으로, 정전위기(110), ADC(130), MCU(140), 및 DAC(150)는 도 1과 관련하여 기술된 것들과 유사하게 기능할 수 있다. 예를 들어, ADC(130)는 작동 전극(122c)으로부터 카운터 전극(122b)을 가로지르는 유도된 전류에 대응하는 정전위기(110)로부터의 전압 신호들을 수신하고, 전압 신호를 디지털화하며, 디지털화된 신호를 처리를 위해 MCU(140)로 전송할 수 있다. 이와 유사하게, MCU(140)는, 특정의 분석물의 존재 및/또는 만연을 결정하고, DAC(150)를 통해 정전위기의 동작을 제어하기 위해, 디지털화된 전압 신호를 프로세싱할 수 있다.
이 예에서, 디바이스(600)는 하우징(610) 내에 샘플 프로브를 포함하지 않는다. 그 대신에, 디바이스(600)는 2개의 샘플 인터페이스(640a 및 640b)(예컨대, 통신 포트들 또는 커넥터들) - 이를 통해 사용자가 하나 이상의 프로브(및 하나 이상의 대응하는 웰 및 자석 어셈블리)를 포함하는 샘플 카드를 삽입할 수 있음 - 을 포함한다.
예를 들어, 도 6b에 도시된 바와 같이, 사용자는 단일 프로브(및 단일의 대응하는 웰 및 자석 어셈블리)를 갖는 샘플 카드(650a)를 샘플 인터페이스(640a)에 삽입할 수 있고, 프로브는 하우징(610) 내의 대응하는 정전위기에 전기적으로 커플링될 수 있다. 샘플 카드(650a)는, 예를 들어, 기판의 일부로서 포함되거나 샘플 카드(650a)의 기판 상에 배치된 카드 에지 커넥터(예컨대, 핀 헤더(pin header), 리셉터클, 또는 소켓)를 통해, 샘플 인터페이스(640a)에 커플링할 수 있다. 이것은 기판을 디바이스(600)(예컨대, 하우징)에 부착시킬 때 전극들이 정전위기에 커플링되도록 기판이 디바이스(600)의 나머지(예컨대, 디바이스(600)의 하우징 및/또는 다른 부분들)에 분리가능하게 부착가능하도록 해준다.
다른 예로서, 도 6c에 도시된 바와 같이, 사용자는 다수의 프로브(및 다수의 대응하는 웰 및 자석 어셈블리)를 갖는 샘플 카드(650b)를 샘플 인터페이스(640b)에 삽입할 수 있고, 프로브 각각은 하우징(610) 내의 대응하는 정전위기에 전기적으로 커플링될 수 있다. 이와 유사하게, 샘플 카드(650b)는, 예를 들어, 기판의 일부로서 포함되거나 샘플 카드(650b)의 기판 상에 배치된 카드 에지 커넥터(예컨대, 핀 헤더, 리셉터클, 또는 소켓)를 통해, 샘플 인터페이스(640b)에 커플링할 수 있다. 이와 유사하게, 이것은 기판을 디바이스(600)(예컨대, 하우징)에 부착시킬 때 전극들이 정전위기에 커플링되도록 기판이 디바이스(600)의 나머지(예컨대, 디바이스(600)의 하우징 및/또는 다른 부분들)에 분리가능하게 부착가능하도록 해준다.
이것은, 예를 들어, 사용자가 그의 필요에 따라 디바이스(600)를 커스터마이즈할 수 있게 해주기 때문에, 유용할 수 있다. 게다가, 이것은 사용자가 디바이스(600)를 부분적으로 분해(disassemble)할 수 있게 해주며, 이는 유지보수를 용이하게 할 수 있고, 보관 또는 운송에 보다 편리할 수 있다. 일부 경우들에서, 하나 이상의 정전위기가 또한 (예컨대, 하우징(610) 내에 포함되는 대신에) 샘플 카드들 상에 포함될 수 있다.
일부 경우들에서, 샘플 카드는 다수의 분리가능 부품(detachable part)으로 구성될수 있다. 예를 들어, 도 6d에 도시된 바와 같이, 샘플 카드(650a)는 전극 부분(660a), 및 자석 어셈블리(160)를 포함하는 슬리브(sleeve) 부분(660b)을 가질 수 있다. 전극들이 자석 어셈블리 위쪽에 배치되도록(예컨대, 자석 어셈블리의 하나 이상의 자석이 전극 위치들 각각 아래에 배치되도록), 전극 부분(660a)이 슬리브 부분(660b)에 삽입될 수 있다. 게다가, 전극 부분(660a)이 슬리브 부분(660b)으로부터 분리될 수 있으며, 이는 전극 부분(660a) 및/또는 슬리브 부분(660b)이 개별적으로 교체될 수 있게(예컨대, 전극들을 갖는 기판을 자석 어셈블리로부터 분리시킬 수 있게) 해준다.
일부 경우들에서, 샘플 인터페이스(640a) 및 샘플 인터페이스(640b) 각각은 카드 에지 커넥터의 대응하는 전극들에 전기적으로 연결하도록 배열된 핀들 또는 다른 전기 콘택트들을 갖는 리셉터클을 포함할 수 있다.
일부 경우들에서, 디바이스는 샘플 인터페이스들(640a 및 650b)의 핀들을 사용하여 샘플 인터페이스들에 삽입된 샘플 카드들 간에 그리고/또는 샘플 카드들 상의 프로브들 간에 자동으로 선택하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 샘플 인터페이스들(640a 및 650b) 각각은 샘플 카드의 존재를 검출하기 위한 핀(예컨대, 샘플 카드가 삽입될 때 샘플 카드로부터 신호를 수신하는 핀), 및 샘플 카드 상의 프로브들 중 하나 이상을 선택하기 위한 핀(예컨대, 특정의 프로브를 식별해주는 신호를 삽입된 샘플 카드로 전송하는 핀)을 포함할 수 있다.
통신 인터페이스(630)는 디바이스(600)가 다른 컴퓨팅 디바이스들과 통신(예컨대, 측정 데이터를 다른 컴퓨팅 디바이스들로 전송하고 그리고/또는 다른 컴퓨팅 디바이스들로부터 커맨드들을 수신)할 수 있게 해준다. 예를 들어, 통신 인터페이스(630)는 디바이스(600)와 다른 컴퓨팅 디바이스 사이의 통신 채널을 제공하는 통신 포트 또는 커넥터(예컨대, 유니버설 직렬 버스, USB, 커넥터, 플러그, 소켓, 또는 리셉터클과 같은, 전자 통신 인터페이스)일 수 있다. 일부 경우들에서, 통신 인터페이스(630)는 디바이스(600)가 다른 컴퓨팅 디바이스들과 무선으로 통신할 수 있게 해주는 무선 통신 인터페이스(예컨대, Wi-Fi 또는 블루투스 트랜시버와 같은, 무선 트랜시버)일 수 있다.
디스플레이 디바이스(650)는 정보를 사용자에게 시각적으로 제시한다. 일부 경우들에서, 디스플레이 디바이스(650)는 LCD(liquid crystal display), LED(light emitting diode) 디스플레이, 또는 OLED(organic light emitting diode) 디스플레이일 수 있다. 일부 구현들에서, 디스플레이 디바이스(650)는 MCU(140)에 의해 수행된 분석의 결과를 디스플레이(예컨대, 특정의 분석물이 샘플에 존재하는지 및/또는 샘플에서의 분석물의 만연에 관한 정보를 디스플레이)할 수 있다. 일 예로서, 도 6e는 디스플레이 디바이스(650)가 샘플에서의 분석물의 제1 농도(예컨대, 상대적으로 안전한 양의 특정의 분석물)를 표시하는 것을 도시하고, 도 6f는 디스플레이 디바이스(650)가 샘플에서의 분석물의 제2 농도(예컨대, 상대적으로 위험한 양의 특정의 분석물)를 표시하는 것을 도시하고 있다.
일부 경우들에서, 본 명세서에 기술된 시스템들 중 하나 이상은, 컴퓨터, 스마트폰, 서버 시스템, 또는 다른 컴퓨팅 디바이스와 같은, 컴퓨팅 디바이스를 통해 제어될 수 있다. 예를 들어, 디바이스(600)는 통신 인터페이스(630)를 통해 컴퓨팅 디바이스와의 통신 채널을 구축하고, 측정 데이터를 컴퓨팅 디바이스로 전송하고 컴퓨팅 디바이스로부터 커맨드들을 수신하기 위해 채널을 사용할 수 있다.
일부 경우들에서, 컴퓨팅 디바이스는 자기적 전기화학적 감지 시스템과 연관된 제어 애플리케이션을 실행할 수 있다. 제어 애플리케이션은 시스템의 동작에 관련된 다양한 기능들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 제어 애플리케이션은 시스템을 동작시키기 위한 다양한 옵션들 및 커맨드들을 제시하는 사용자 인터페이스를 사용자에게 제시하고, 사용자가 특정의 옵션들 및 커맨드들을 선택하는 것으로부터 입력들을 수신할 수 있다. 게다가, 제어 애플리케이션은 시스템으로부터 수신된 측정 데이터를 프로세싱할 수 있다(예컨대, 디지털화된 전압 신호들을 전류 측정의 표시로 변환하고, 전류에 기초하여 특정의 분석물이 존재하는지를 결정하며, 그리고/또는 전류에 기초하여 특정의 분석물의 농도를 결정함).
예시하기 위해, 도 7a는 자기적 전기화학적 감지 시스템과 연관된 제어 애플리케이션을 실행하는 스마트폰(700)을 도시하고 있다. 제어 애플리케이션은, 시스템을 구성하기 위한 다양한 옵션들(예컨대, 측정을 위한 특정의 샘플 또는 "채널"을 선택하기 위한 옵션, 및 분석될 특정의 분석물을 입력하기 위한)을 제시하는, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(710)를 사용자에게 제시한다. 게다가, GUI(710)는 선택된 웰들 각각과 연관된 측정 정보(예컨대, 선택된 샘플에서 측정된 전류의 표시, 및 측정에 기초한 대응하는 분석물 농도의 표시)를 디스플레이한다. 게다가, GUI(710)는 (예컨대, 특정의 분석물의 농도가, 잠재적으로 안전하지 못할 정도로, 충분히 높은 경우, 또는 특정의 분석물의 농도가 특정의 문턱 또는 기준 값을 초과하는 경우) 경고 또는 통지를 사용자에게 디스플레이할 수 있다.
다른 예로서, 도 7b에 도시된 바와 같이, 제어 애플리케이션은 특정의 샘플에 관한 보다 상세한 정보를 제시하는 GUI(720)를 사용자에게 제시할 수 있다. 예를 들어, 사용자가 몇 개의 상이한 분석물(예컨대, 알레르겐)과 관련하여 특정의 물질(예컨대, 식품)을 분석하기 위해 시스템을 사용한 경우, GUI(720)는 이 분석들의 결과들을 요약하고, 결과들을 사용자에게 시각적으로(예컨대, 각각의 알레르겐의 농도를 서로에 대해 상대적으로 디스플레이하는 차트의 형태로) 제시할 수 있다. 이것은 사용자가 샘플에서의 특정 분석물들의 존재 및 만연을 신속하게 식별할 수 있게 해준다.
다른 예로서, 도 7c에 도시된 바와 같이, 제어 애플리케이션은 샘플들에 관한 지리적 정보를 제시하는 GUI(730)를 사용자에게 제시할 수 있다. 예를 들어, GUI(730)는 지리적 지도를 디스플레이하고, 특정 샘플들이 수집된 위치를 식별해주는 관심 지점들을 디스플레이할 수 있다. 이것은, 사용자가 장래에 그 위치들을 검색 및/또는 회피할 수 있도록, 사용자가 특정의 샘플들의 소스를 신속하게 식별할 수 있게 해준다. 예를 들어, 사용자는 식품 샘플들을 획득한 다양한 상점들 및 식당들의 위치를 입력하고, 샘플 분석들의 결과들을 각각의 해당 위치와 연관시킬 수 있다. 특정의 위치로부터의 샘플이 고농도의 특정의 알레르겐을 함유한 경우, GUI(730)는, 사용자가 장래에 그 위치를 회피할 수 있도록, (예컨대, 컬러 코딩된(color coded) 아이콘을 사용하여) 이것을 사용자에게 시각적으로 표시할 수 있다. 특정의 위치로부터의 샘플이 저농도의 특정의 알레르겐을 함유한 경우, GUI(730)는, 사용자가 장래의 방문들을 위해 그 위치를 용이하게 식별할 수 있도록, (예컨대, 상이한 컬러의 아이콘을 사용하여) 이것을 사용자에게 시각적으로 표시할 수 있다.
일부 경우들에서, 자기적 전기화학적 감지 시스템은 분석 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 감지 시스템에 부가하여, 키트는 분석을 위한 샘플들의 준비를 용이하게 하는 재료들을 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 8에 도시된 바와 같이, 키트는, 샘플 튜브들(800), 슬리브들(810), 및 자성 바(magnetic bar)들(820)과 같은, 샘플 프로세싱 도구들을 포함할 수 있다.
샘플 튜브(800)는, 본 명세서에 기술된 감지 시스템들 중 임의의 것과 같은, 감지 시스템을 사용하여 분석될 유체 샘플을 수용(receive)하도록 구성된다. 샘플 튜브(800)는 제1 단부(802a)에서 실링(seal)되고, 제2 단부(802b)에서 개구(aperture)(804b)를 정의하며, 개구(804b)를 통해 샘플이 퇴적(deposit)될 수 있다.
슬리브(810)는 가늘고 긴 채널(812)을 정의한다. 채널(812)은 제1 단부(814a)에서 실링되고, 제2 단부(814b)에서 개구(816)를 정의한다. 채널(812)은 개구(816)를 통해 삽입된 자성 바(820)를 수용(accept)하도록 치수가 정해진다(dimensioned)(예컨대, 채널(812)은 자성 바(820)의 직경보다 약간 큰 직경을 갖는다). 슬리브(810)는 또한 샘플 튜브(800)에 (예컨대, 각각에 있는 나사산(screw thread)들을 통해) 물리적으로 커플링하도록 구성된 캡(cap)(818)을 포함한다.
자성 바(820)는 그의 팁(tip)에 배치된 자석(822)을 포함하고, 개구(816)를 통해 슬리브(810) 내로 삽입하도록 구성된다.
샘플 튜브들(800), 슬리브들(810), 및 자성 바(820)는 (예컨대, 샘플 튜브로부터 자성 비드들을 수집하고, 수집된 자성 비드들을 다른 샘플 튜브로 이송하는 것에 의해) 감지 시스템에 의한 분석을 위해 샘플들을 프로세싱하는 데 사용될 수 있다.
일 예로서, 도 9에 도시된 바와 같이, 사용자는 분석될 샘플(예컨대, 식품 제품의 일부분)을 추출 완충액을 포함하는 제1 샘플 튜브(800a) 내로 삽입할 수 있다. 추출 완충액은 후속 분석을 위해 (예컨대, 단백질 및/또는 펩티드들을 완충액에 가용화(solubilize)하는 것에 의해) 표적 분석물들(예컨대, 단백질들)을 추출하는 데 사용된다. 2-메르캅토에탄올, 구아니딘(TECP/GUA)으로 보강된 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀, N-라우로일사르코신을 갖는 TECP, PBS(phosphate buffered saline) 완충액, 트리스-HCl 완충액, 및/또는 에탄올(예컨대, 60% 에탄올)을 비롯한 다양한 물질들이 추출 완충액으로서 사용될 수 있다. 일 예로서, 2-메르캅토에탄올 완충 용액은 특정 샘플들(예컨대, 가열되거나 가열되지 않은 식품 제품들)의 단백질 추출성(protein extractability)을 증가시킬 수 있으며, 단백질 다이설파이드 결합(protein disulfide bond)들을 환원시키는 것 및, 각각의 펩티드가 완충 용액 내로 이동(migrate)하도록, 단백질의 소단위체들이 분리될 수 있게 해주기 위해 분자간 다이설파이드 결합(intermolecular disulfide bond)들(예컨대, 소단위체(subunit)들 간의 결합들)을 절단(cleave)시키는 것에 적당할 수 있다. 다른 예로서, 무취(odor-free) 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀은 단백질 및 펩티드 다이설파이드들의 환원에 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 구아니딘 하이드로클로라이드는 강한 카오트로픽제(strong chaotropic agent)이며, 단백질들의 변성(denaturation) 및 후속 리폴딩(refolding)에 유용할 수 있다. 이 강한 변성제(denaturant)는 불용성(insoluble) 또는 변성된 단백질들을 가용화시킬 수 있다. 또 다른 예로서, N-라우로일사르코신은 음이온 계면활성제(anionic surfactant)이며, 단백질들 및 펩티드들의 가용화 및 분리에 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 칵테일 추출 완충 용액들(예컨대, 다수의 상이한 유형들의 성분 완충 용액(constituent buffer solution)들을 함유한 추출 완충 용액)이 추출에 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 매우 다양한 사용 사례들에서 추출을 가능하게 해주고, 추출 프로세스를 단순화시키며, 그리고/또는 사용자 경험을 향상시키기 때문에, 유익할 수 있다.
사용자는 이어서 추출된 재료를 제1 샘플 튜브(800a)로부터 샘플 완충액(예컨대, PBS 또는 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin: BSA)을 함유하는 PBS)을 포함하는 제2 샘플 튜브(800b)로 이송시킨다. 사용자는 또한 자성 비드들(예컨대, 특정의 알레르겐과 같은, 특정의 관심 분석물에 특이적인 결합 모이어티들로 코팅된 자성 비드들)을 함유하는 용액을 샘플 튜브(800b)에 추가한다. 사용자는 (예컨대, 제2 샘플 튜브(800b)를 캡 및 슬리브(810)로 실링하고 제2 샘플 튜브(800b)를 진탕(shaking)하는 것에 의해) 제2 샘플 튜브(800b)의 내용물을 혼합한다.
사용자는 자성 바(820)를 슬리브(810)에 삽입하는 것에 의해 자성 비드들(및 포획된 분석물들)을 분리시킨다. 바(820)로부터의 자석(822)은, 자성 비드들이 보유(retain)되도록, 자성 비드들을 슬리브(810)의 주변부(periphery)로 끌어당긴다. 사용자는 이어서 자성 바(820)가 여전히 삽입된 상태로 슬리브(810)를 빼내고, 그에 의해 자성 비드들(및 포획된 분석물들)을 제2 샘플 튜브(800b)로부터 제거한다.
사용자는 (자성 바(820)가 여전히 삽입된 상태로) 슬리브(810)를 전자 매개체 용액(예컨대, TMB, ABTS, OPD, PNPP, ONPQ Nap-Gal, 및/또는 MUm-Gal을 함유하는 용액)을 포함하는 제3 샘플 튜브(800c) 내로 삽입한다. 사용자는 이어서 슬리브(810)로부터 자성 바(820)를 제거한다. 이것은 자성 비드들이 슬리브(810)로부터 방출(release)되고 제3 샘플 튜브(800c) 내로 분산(disperse)되게 한다. 이러한 방식으로, 사용자는 부가의 여과 또는 원심분리 장비를 필요로 함이 없이 하나의 샘플 튜브로부터 자성 비드들(및 자성 비드들에 결합된 임의의 분자들)을 선택적으로 제거하고 그들을 다른 샘플 튜브로 이송시킬 수 있다.
사용자는 또한 분석물에 특이적인 2차 분자들(예컨대, 결합 모이어티들) 및 2차 분자들에 특이적이고 반응성 효소를 갖는 3차 분자들(예컨대, 도 2와 관련하여 기술된 2차 분자들(242) 및 3차 분자들(262))을 함유하는 용액을 제3 샘플 튜브(800c)에 첨가한다. 이 2차 분자들(242) 및 3차 분자들(262)은 자성 비드들에 결합된다. 사용자는 제3 샘플 튜브(800c)를 진탕시키고, (예컨대, 제3 샘플 튜브(800c)의 내용물을 정전위기의 프로브에 퇴적시키는 것에 의해) 제3 샘플 튜브(800c)의 내용물을 분석을 위해 감지 디바이스로 이송한다.
일부 경우들에서, 키트는 또한, 예를 들어, 도 37에 도시된 바와 같은, 가열 디바이스를 포함할 수 있다. 가열 디바이스는 추출 프로세스를 가속화하기 위해 추출 프로세스 동안 (예컨대, 샘플 튜브와 그의 내용물을 약 60 ℃에서 약 2 분 동안 가열하는 것에 의해) 샘플 튜브들을 가열하도록 구성될 수 있다. 일부 경우들에서, 추출 프로세스 동안 샘플 튜브와 그의 내용물을 가열하기 위해 다른 가열 디바이스들(예컨대, 전자레인지, 오븐, 또는 가열 램프(heat lamp))이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술되는 바와 같이, 프로브 아래의 자석 어셈블리에 의해 유도된 자기장으로 인해, 자성 비드들이 프로브 쪽으로 끌어당겨진다. 게다가, 프로브의 작동 전극과 기준 전극을 가로질러 유도된 전위로 인해, 전자 매개체들과 산화 효소 사이에 산화-환원 반응이 유도된다. 그 결과, 프로브의 작동 전극으로부터 카운터 전극을 가로지르는 전류가 유도된다. 차례로, 이 전류는 연산 증폭기에 의해 전압 신호로 변환되고, 전압 신호는 ADC에 의해 디지털화되며, 디지털화된 전압 신호는 MCU에 의해 해석된다.
일부 구현들에서, 사용자는 본 명세서에 기술된 단계들 중 일부 또는 전부 사이에서 샘플들을 세척할 수 있다. 예를 들어, 샘플 튜브들 사이에서 샘플을 이송시킬 때, 사용자는, 튜브로부터 자성 비드들(및 임의의 결합된 분자들)을 수집하고 자성 비드들을 세척 완충액(wash buffer)을 포함하는 샘플 튜브로 이송시키기 위해, 슬리브(810) 및 자성 바(820)를 사용할 수 있다. 사용자는 샘플들을 세척 완충액 내로 분산시키기 위해 자성 바(820)를 제거할 수 있다. 사용자는 이어서 자성 비드들을 재수집(recollect)하기 위해 자성 바(820)를 슬리브(810) 내에 재삽입하고, 샘플 준비 프로세스를 계속할 수 있다. 이러한 방식으로, 사용자는 본 명세서에 기술된 프로세싱 단계들 중 일부 또는 전부 사이에서 (예컨대, 비결합 분자들을 제거하기 위해) 자성 비드들을 세척할 수 있다.
본 명세서에 기술된 발명 요지 및 동작들의 일부 구현들은, 본 명세서에 개시된 구조물들 및 그의 구조적 등가물들을 비롯하여, 디지털 전자 회로부로, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어로, 또는 이들 중 하나 이상의 조합들로 구현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현에서, 시스템들(100, 300, 400, 500, 600, 및 700)은, 적어도 부분적으로, 디지털 전자 회로부를 사용하여, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어로, 또는 이들 중 하나 이상의 조합들로 구현될 수 있다. 일부 구현들에서, 정전위기(예컨대, 정전위기(110)), ADC(예컨대, ADC(130)), MCU(예컨대, MCU(140)) 및/또는 DAC(예컨대, DAC(150)), 및/또는 디지털-아날로그 변환기(DAC)(150)는, 적어도 부분적으로, 디지털 전자 회로부를 사용하여, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어로, 또는 이들 중 하나 이상의 조합들로 구현될 수 있다.
본 명세서에 기술된 일부 구현들은 디지털 전자 회로부, 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어의 하나 이상의 그룹 또는 모듈로서, 또는 이들 중 하나 이상의 조합들로서 구현될 수 있다. 비록 상이한 모듈들이 사용될 수 있지만, 각각의 모듈이 별개일 필요는 없으며, 다수의 모듈이 동일한 디지털 전자 회로부, 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어, 또는 이들의 조합 상에 구현될 수 있다.
본 명세서에 기술된 일부 구현들은 하나 이상의 컴퓨터 프로그램, 즉 데이터 프로세싱 장치에 의해 실행하기 위한 또는 데이터 프로세싱 장치의 동작을 제어하기 위한, 컴퓨터 저장 매체 상에 인코딩된, 컴퓨터 프로그램 명령어들의 하나 이상의 모듈로서 구현될 수 있다. 예를 들어, 도 7과 관련하여 본 명세서에 기술된 제어 애플리케이션은 컴퓨터 프로그램으로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 저장 매체가 컴퓨터 판독가능 저장 디바이스, 컴퓨터 판독가능 저장 기판, 랜덤 또는 직렬 액세스 메모리 어레이 또는 디바이스, 또는 이들 중 하나 이상의 조합일 수 있거나, 그에 포함될 수 있다. 더욱이, 컴퓨터 저장 매체가 전파 신호(propagated signal)는 아니지만, 컴퓨터 저장 매체는 인위적으로 발생된 전파 신호에 인코딩된 컴퓨터 프로그램 명령어들의 소스 또는 목적지일 수 있다. 컴퓨터 저장 매체는 또한 하나 이상의 개별 물리적 컴포넌트 또는 매체(예컨대, 다수의 CD, 디스크, 또는 다른 저장 디바이스)일 수 있거나 그에 포함될 수 있다.
"데이터 프로세싱 장치"라는 용어는, 예로서, 프로그램가능 프로세서, 컴퓨터, 시스템 온 칩, 또는 전술한 것들 중 다수의 것들 또는 전술한 것들의 조합들을 비롯한, 데이터를 프로세싱하는 모든 종류의 장치들, 디바이스들, 및 머신들을 포괄한다. 장치는 특수 목적 논리 회로부, 예컨대, FPGA(field programmable gate array) 또는 ASIC(application specific integrated circuit)을 포함할 수 있다. 장치는 또한, 하드웨어에 부가하여, 문제의 컴퓨터 프로그램에 대한 실행 환경을 생성하는 코드, 예컨대, 프로세서 펌웨어, 프로토콜 스택, 데이터베이스 관리 시스템, 운영 체제, 크로스-플랫폼 런타임 환경, 가상 머신, 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 구성하는 코드를 포함할 수 있다. 장치 및 실행 환경은, 웹 서비스들, 분산 컴퓨팅 및 그리드 컴퓨팅 인프라스트럭처들과 같은, 각종의 상이한 컴퓨팅 모델 인프라스트럭처들을 실현할 수 있다.
컴퓨터 프로그램(프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 애플리케이션, 스크립트, 또는 코드라고도 함)은, 컴파일(compile)되거나 인터프리트(interpret)되는 언어들, 선언적(declarative) 또는 절차적(procedural) 언어들을 비롯하여, 임의의 형태의 프로그래밍 언어로 작성될 수 있다. 컴퓨터 프로그램이 파일 시스템에서의 파일에 대응할 수 있지만 그럴 필요는 없다. 프로그램은 다른 프로그램들 또는 데이터(예컨대, 마크업 언어 문서에 저장된 하나 이상의 스크립트)를 보유하는 파일의 일부분에, 문제의 프로그램에 전용된 단일 파일에, 또는 다수의 통합 파일(coordinated file)(예컨대, 하나 이상의 모듈, 서브 프로그램(sub program), 또는 코드 부분(portion of code)을 저장하는 파일)에 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 하나의 컴퓨터 상에서 또는 하나의 사이트에 위치되거나 다수의 사이트에 걸쳐 분산되고 통신 네트워크에 의해 상호연결되는 다수의 컴퓨터 상에서 실행되도록 배포(deploy)될 수 있다.
본 명세서에 기술된 프로세스들 및 논리 흐름들 중 일부는 입력 데이터를 조작하여 출력을 발생시키는 것에 의해 액션들을 수행하기 위해 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로그램가능 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 프로세스들 및 논리 흐름들이 또한, 예컨대, FPGA(field programmable gate array) 또는 ASIC(application specific integrated circuit)과 같은, 특수 목적 논리 회로부에 의해 수행될 수 있고, 장치가 또한 그로서 구현될 수 있다.
컴퓨터 프로그램의 실행에 적당한 프로세서들은, 예로서, 범용 및 특수 목적 마이크로프로세서들 둘 다, 및 임의의 종류의 디지털 컴퓨터의 프로세서들을 포함한다. 일반적으로, 프로세서는 판독 전용 메모리 또는 랜덤 액세스 메모리 또는 둘 다로부터 명령어들 및 데이터를 수신할 것이다. 컴퓨터는 명령어들에 따라 액션들을 수행하기 위한 프로세서와 명령어들 및 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 메모리 디바이스를 포함한다. 컴퓨터는 또한 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 대용량 저장 디바이스, 예컨대, 자기, 자기 광학 디스크들 또는 광학 디스크들을 포함하거나, 그로부터 데이터를 수신하거나 그에게로 데이터를 전송하도록, 또는 둘 다를 하도록 동작가능하게 커플링될 수 있다. 그렇지만, 컴퓨터가 이러한 디바이스들을 가질 필요는 없다. 컴퓨터 프로그램 명령어들 및 데이터를 저장하기에 적당한 디바이스들은, 예로서, 반도체 메모리 디바이스들(예컨대, EPROM, EEPROM, 플래시 메모리 디바이스들, 및 다른 것들), 자기 디스크들(예컨대, 내부 하드 디스크들, 이동식 디스크들, 및 다른 것들), 자기 광학 디스크들, 그리고 CD ROM 및 DVD-ROM 디스크들을 비롯한, 모든 형태들의 비휘발성 메모리, 매체 및 메모리 디바이스를 포함한다. 프로세서 및 메모리가 특수 목적 논리 회로부에 의해 보완되거나 그에 통합될 수 있다.
사용자와의 상호작용을 제공하기 위해, 정보를 사용자에게 디스플레이하기 위한 디스플레이 디바이스(예컨대, 모니터, 또는 다른 유형의 디스플레이 디바이스) 및 사용자가 입력을 컴퓨터에 제공할 수 있는 키보드 및 포인팅 디바이스(예컨대, 마우스, 트랙볼, 태블릿, 터치 감지 스크린, 또는 다른 유형의 포인팅 디바이스)를 갖는 컴퓨터 상에서 동작들이 구현될 수 있다. 사용자와의 상호작용을 제공하기 위해 다른 종류의 디바이스들도 사용될 수 있고; 예를 들어, 사용자에게 제공되는 피드백은 임의의 형태의 감각적 피드백, 예컨대, 시각적 피드백, 청각적 피드백, 또는 촉각적 피드백일 수 있으며; 사용자로부터의 입력은, 음향, 음성, 또는 촉각적 입력을 비롯하여, 임의의 형태로 수신될 수 있다. 그에 부가하여, 컴퓨터는 사용자에 의해 사용되는 디바이스로 문서들을 송신하고 그로부터 문서들을 수신하는 것에 의해; 예를 들어, 웹 브라우저로부터 수신된 요청들에 응답하여 웹 페이지들을 사용자의 클라이언트 디바이스 상의 웹 브라우저로 송신하는 것에 의해 사용자와 상호작용할 수 있다.
컴퓨터 시스템은 단일 컴퓨팅 디바이스, 또는 근접하여 또는 일반적으로 서로로부터 떨어져서 동작하고 전형적으로 통신 네트워크를 통해 상호작용하는 다수의 컴퓨터를 포함할 수 있다. 통신 네트워크들의 예들은 로컬 영역 네트워크("LAN") 및 광역 네트워크("WAN"), 인터-네트워크(inter-network)(예컨대, 인터넷), 위성 링크를 포함하는 네트워크, 및 피어-투-피어 네트워크들(예컨대, 애드혹 피어-투-피어 네트워크들)을 포함한다. 클라이언트와 서버의 관계는 컴퓨터 프로그램들이 각자의 컴퓨터들 상에서 실행되고 서로 클라이언트-서버 관계를 갖는 것에 의해 생길 수 있다.
도 10은 프로세서(1010), 메모리(1020), 저장 디바이스(1030) 및 입력/출력 디바이스(1040)를 포함하는 예시적인 컴퓨터 시스템(1000)을 도시하고 있다. 컴포넌트들(1010, 1020, 1030 및 1040) 각각은, 예를 들어, 시스템 버스(1050)에 의해 상호연결될 수 있다. 프로세서(1010)는 시스템(1000) 내에서 실행하기 위한 명령어들을 프로세싱할 수 있다. 일부 구현들에서, 프로세서(1010)는 단일 스레드 프로세서(single-threaded processor), 멀티 스레드 프로세서(multi-threaded processor), 또는 다른 유형의 프로세서이다. 프로세서(1010)는 메모리(1020)에 또는 저장 디바이스(1030) 상에 저장된 명령어들을 프로세싱할 수 있다. 메모리(1020) 및 저장 디바이스(1030)는 시스템(1000) 내의 정보를 저장할 수 있다.
입력/출력 디바이스(1040)는 시스템(1000)에 대한 입력/출력 동작들을 제공한다. 일부 구현들에서, 입력/출력 디바이스(1040)는 네트워크 인터페이스 디바이스, 예컨대, 이더넷 카드, 직렬 통신 디바이스, 예컨대, RS-232 포트, 및/또는 무선 인터페이스 디바이스, 예컨대, 802.11 카드, 3G 무선 모뎀, 4G 무선 모뎀 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 입력/출력 디바이스는 입력 데이터를 수신하고 출력 데이터를 다른 입력/출력 디바이스들, 예컨대, 키보드, 프린터 및 디스플레이 디바이스들(1060)로 송신하도록 구성된 드라이버 디바이스(driver device)들을 포함할 수 있다. 일부 구현들에서, 모바일 컴퓨팅 디바이스들, 이동 통신 디바이스들, 및 다른 디바이스들이 사용될 수 있다.
유체 샘플에서의 표적 분석물의 존재를 검출하는 예시적인 프로세스(4200)가 도 42에 도시되어 있다.
프로세스(4200)에서, 복수의 자성 비드가 제1 유체 샘플에 제공된다(4202). 복수의 자성 비드는 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 제1 결합 모이어티들을 포함한다.
복수의 자성 비드가 제1 유체 샘플 내의 표적 분석물에 결합할 수 있게 된다(4204).
자성 비드들이 제1 유체 샘플로부터 제2 유체 샘플로 이송된다(4206). 제2 유체 샘플은 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 결합 모이어티들을 포함하고, 제2 결합 모이어티들은 반응성 효소에 결합된다. 자성 비드들을 이송시키는 단계는 시스를 제1 유체 샘플 내에 침지시키는 단계, 자성 비드들이 시스에 부착되도록, 제1 유체 샘플 내에 침지된 시스 내에 자석을 위치시키는 단계, 자석을 포함하는 시스를 제1 유체 샘플로부터 제거하는 단계, 및 자석을 포함하는 시스를 제2 유체 샘플에 침지시키는 단계를 포함한다.
제2 유체 샘플 내의 제2 결합 모이어티들이 자성 비드들의 제1 결합 모이어티들에 결합된 표적 분석물에 결합할 수 있게 된다(4208).
제3 유체 샘플을 획득하기 위해 복수의 자성 비드 및 제2 결합 모이어티들을 포함하는 제2 유체 샘플이 전자 매개체 용액과 화합된다(4210).
제3 유체 샘플이 기판의 샘플 검출 영역에 제공된다(4212). 샘플 검출 영역은 제1 전극 상에 배열된다.
제3 유체 샘플 내의 복수의 자성 비드를 제1 전극 옆에 유지하기 위해 제3 유체 샘플이 자기장에 노출된다(4214). 제1 전극은 정전위기에 전기적으로 커플링된다.
제3 유체 샘플과 반응성 효소 내에서 전자 매개체들 간의 산화-환원 반응이 유도된다(4216).
제3 유체 샘플에서의 표적 분석물의 존재를 결정하기 위해 정전위기의 출력이 모니터링된다(4218). 정전위기의 출력이 산화-환원 반응에 의해 수정된다.
프로세스(4200)는, 적어도 부분적으로, 본 명세서에 기술된 디바이스들 및 키트들 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우들에서, 세포들, 미세 소포들, 막 입자들, 세포사멸 수포들 또는 소포들 또는 엑소좀들(예컨대, 막관통 및 세포질 단백질들, mRNA, DNA, 및 microRNA)과 같은 세포외 소포들, 펩티드들, 단백질들, 지질들, 대사물들, 및 (예컨대, 혈청 또는 용액 중에서) 자유 부동하거나 생물학적 구조물의 표면에(예컨대, 세포외 소포 또는 세포의 표면에) 발현되는 다른 분자들과 같은, 분석물들을 식별하기 위해 프로세스(4200)가 수행될 수 있다. 일부 경우들에서, (예컨대, 간호자들이 보다 많은 정보를 바탕으로 진단을 내리고 그리고/또는 치료를 행할 수 있게 해주는 것에 의해) 보다 효과적인 간호를 환자에게 제공하기 위해 프로세스(4200)가 수행될 수 있다. 일부 경우들에서, 물질(예컨대, 식품 제품)의 조성에 대한 통찰력을 제공하기 위해 프로세스(4200)가 수행될 수 있다.
새로운 검출기 디바이스들의 적용분야들의 예들
본 명세서에 기술된 구현들은, 다양한 펩티드들, 단백질들, 지질들, 대사물들, 및 (예컨대, 혈청 또는 용액 중에서) 자유 부동하거나 생물학적 구조물의 표면에(예컨대, 세포외 소포 또는 세포의 표면에) 발현되는 다른 분자들의 검출 및 정량화를 비롯한, 각종의 상이한 적용분야들에서 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 분자들의 검출 및 정량화는 특정의 생물학적 또는 발병 과정, 특정의 질병의 특정의 진행, 또는 어떤 다른 생물학적 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
다양한 적용분야들의 예들이 이하에서 그리고 예들 섹션에서 보다 상세히 논의된다.
세포외 소포 스크리닝 - 암 진단
일 예로서, 자기적 전기화학적 감지가 세포외 소포들에서 암의 바이오마커들의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
점점 더 많은 증거는 세포외 소포들(EV들)을 암 관리의 효과적인 판독(readout)으로서 자리잡게 하였다. 예를 들어, 엑소좀들이 유력한 바이오마커로 부상하였다. 엑소좀들은 세포들에 의해 활성적으로 분비되는(actively secreted) 나노스케일 소포들이다. 이 소포들은, 막관통 및 세포질 단백질들, mRNA, DNA, 및 microRNA를 비롯하여, 그들의 기원 세포(originating cell)들의 분자 성분들을 담고 있으며, 따라서 세포 대리(cellular surrogate)들로서 역할할 수 있다. 체액들(예컨대, 혈청, 복수, 소변, CSF)에 상대적으로 풍부하고 유비쿼터스하게 존재하는 것과 결합하여, 엑소좀들은 종적 모니터링에 대한 독특한 장점들을 제공할 수 있다. 엑소좀 분석들은 최소 침습적이고, 샘플들의 희소성(scarcity) 또는 종양내 이질성(intra-tumoral heterogeneity)에 의해 덜 영향을 받는, 전체 종양 부담(entire tumor burden)의 상대적으로 공평한 판독들을 제공한다.
전기화학적 감지는 임상 환경에 쉽게 적용가능한 효과적인 검출 모달리티(detection modality)일 수 있다. 전기화학적 감지는 산화 환원 활성 리포터(redox-active reporter)들을 이용한 신호 증폭을 통해 높은 감도를 달성할 수 있다. 본 명세서에 기술되는 바와 같이, 감지 시스템은 산화 환원 활성 리포터들에 의해 유도된 전류들을 측정할 수 있고, 콤팩트한 저전력 휴대용 디바이스로서 실현될 수 있다.
본 명세서에 기술되는 바와 같이, 감지 시스템의 구현들은 다양한 이점들을 제공한다. 예를 들어, 세포 특이적 엑소좀들이 광범위한 여과 또는 원심분리를 필요로 함이 없이 복합 배지로부터 직접 격리될 수 있다. 게다가, 어세이는 자기 농축 및 효소 증폭을 통해 높은 검출 민감도를 달성할 수 있다. 게다가 그 밖에, 전기적 검출 스킴을 통해, 센서들이 병행 측정들을 위해 소형화되고 확장될 수 있다.
일 예로서, 난소암 엑소좀들은 종종 CD63과 함께 농축(enrich)된다. 이와 같이, 감지 시스템의 구현들은 난소암을 진단하는 수단으로서 CD63 발현 EV 집단(CD63 expressing EV population)들(예컨대, 엑소좀들)을 프로파일링하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 자성 비드들이 CD63에 특이적인 항체들에 접합(conjugate)될 수 있다. CD63을 발현하는 엑소좀들이 자기적으로 포획될 수 있도록, 이 자성 비드들이 엑소좀들을 함유하는 생물학적 샘플(예컨대, 혈장)과 혼합될 수 있다. 차례로, 샘플이 CD63 발현 엑소좀들에 특이적인 2차 분자들(예컨대, CD63에 특이적인 비오틴화된 항체들과 같은, 표지 리간드(labeling ligand))로 처리되고, 2차 분자들에 특이적이고 산화 효소(예컨대, 스트렙타비딘-HRP)를 갖는 3차 분자로 처리될 수 있다. 샘플이 이어서 전자 매개체 용액(예컨대, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 함유하는 용액)과 화합될 수 있다.
샘플이 본 명세서에 기술된 감지 시스템들을 사용하여 차후에 분석될 수 있다. CD63 발현 엑소좀들이 자성 비드들에 의해 포획되었기 때문에, CD63 발현 엑소좀들은 감지 시스템의 전극들 근방에 집중된다. 게다가, 전극들(예컨대, 작동 전극 및 기준 전극)을 가로질러 유도된 전위로 인해, 전자 매개체들과 산화 효소 사이에 산화-환원 반응이 유도된다. 그 결과, CD63 발현 엑소좀들의 존재 및 만연과 상관관계가 있는, 전류가 전극 중 하나(예컨대, 카운터 전극)에 걸쳐 유도된다. 차례로, 이 전류는 MCU 또는 다른 컴퓨팅 디바이스에 의해 측정될 수 있고, 결과적인 정보가 조사 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 높은 전류는 상대적으로 높은 농도의 CD63 발현 엑소좀들에 대응할 수 있고, 환자에서의 난소암의 지표(indicator)일 수 있다.
일부 경우들에서, 정전위기의 출력이 문턱 또는 기준 레벨과 비교될 수 있고, 환자 내의 암의 존재 또는 부존재가 비교에 기초하여 진단될 수 있다. 예를 들어, 정전위기의 출력이 충분히 높은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하는 전류) 경우, 암의 존재에 관한 진단이 행해질 수 있다. 그렇지만, 정전위기의 출력이 상대적으로 낮은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하지 않는 전류) 경우, 암의 부존재에 관한 진단이 행해질 수 있다. 일부 경우들에서, 기기는 측정들에 기초하여 자동으로 또는 반자동으로 진단을 행할 수 있다.
비록 혈액에서의 CD63 발현 엑소좀들의 검출이 앞서 기술되었지만, 이것은 일 예에 불과하다. 실제로, 감지 시스템의 구현들은, 자유 부동하거나(예컨대, 혈장, 소변, 임의의 다른 생물학적 샘플에서 자유 부동하거나) 생물학적 구조물의 표면에(예컨대, 세포외 소포 또는 세포의 표면에) 발현되는, 임의의 바이오마커(예컨대, 상이한 생물학적 또는 발병 과정들, 질병들, 또는 다른 생물학적 상태들과 연관된 바이오마커들)를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일 예로서, 일부 구현들에서, 감지 시스템은 하기의 바이오마커들: CD2, CD3, CD45, CD52, HLA-ABC, CD81, CXCL10, 또는 CXCL9 또는 임의의 다른 면역 세포 마커들 중 하나 이상을 검출하는 데 사용할 수 있다. 다른 예로서, 일부 구현들에서, 감지 시스템은 하기의 바이오마커들: CD24, EpCAM, CA125, EGFR, HER2, MUC1, CD44, CD44v6, CEA, 메소텔린, Trop2, GPC1, WNT2, Grp94, SSTR2, EGFRv3, IDH1-R132, GPA33, KRAS, CD166, CD133, MET, B7H3, CD63, CD9, 또는 CD81 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다.
세포외 소포 스크리닝 - 장기 거부반응 검사
다른 예로서, 자기적 전기화학적 감지는 환자에서의 이식된 장기 거부반응을 검출하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 이식된 신장 거부반응을 겪고 있는 환자들에서, CD3 발현 EV들이 종종 환자의 소변에서 발견된다. 이와 같이, 감지 시스템의 구현들은 거부반응의 초기 단계들에서 이식된 신장 거부반응을 검출하는 수단으로서 CD3 발현 EV 집단들(예컨대, 엑소좀들)을 프로파일링하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 자성 비드들이 CD3에 특이적인 항체들에 접합될 수 있다. CD3을 발현하는 엑소좀들이 자기적으로 포획될 수 있도록, 이 자성 비드들이 엑소좀들을 함유하는 생물학적 샘플(예컨대, 소변)과 혼합될 수 있다. 차례로, 샘플이 CD3 발현 엑소좀들에 특이적인 2차 분자들(예컨대, CD3에 특이적인 비오틴화된 항체들과 같은, 표지 리간드)로 처리되고, 2차 분자들에 특이적이고 산화 효소(예컨대, 스트렙타비딘-HRP)를 갖는 3차 분자로 처리될 수 있다. 샘플이 이어서 전자 매개체 용액(예컨대, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 함유하는 용액)과 화합될 수 있다.
샘플은 본 명세서에 기술된 감지 시스템들을 사용하여 차후에 분석될 수 있고, 결과적인 정보는 조사 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 높은 전류는 상대적으로 높은 농도의 CD3 발현 엑소좀들에 대응할 수 있고, 환자에 의한 신장 거부반응의 지표일 수 있다. 일부 경우들에서, 신장 거부반응이 초기 단계에 신속하게 검출되도록, 환자는 신장 이식 후에 정기적으로 스크리닝될 수 있다. 모니터링 프로세스가 비침습적이기 때문에, 모니터링 프로세스가 환자에 대한 최소한의 위험으로 그리고 비용 효과적인 방식으로 반복될 수 있다.
일부 경우들에서, 정전위기의 출력이 문턱 또는 기준 레벨과 비교될 수 있고, 환자가 장기 이식에 대해 거부반응을 보였는지 여부에 관한 결정이 비교에 기초하여 진단될 수 있다. 예를 들어, 정전위기의 출력이 충분히 높은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하는 전류) 경우, 환자가 장기에 대해 거부반응을 보였다는 결정이 행해질 수 있다. 그렇지만, 정전위기의 출력이 상대적으로 낮은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하지 않는 전류) 경우, 환자가 장기에 대해 거부반응을 보이지 않았다는 결정이 행해질 수 있다. 일부 경우들에서, 기기는 측정들에 기초하여 자동으로 또는 반자동으로 결정을 할 수 있다.
비록 소변에서의 CD3 발현 엑소좀들의 검출이 앞서 기술되었지만, 이것은 예시적인 예에 불과하다. 본원에 기술되는 바와 같이, 감지 시스템의 구현들은, 이식된 신장 거부반응 또는 다른 이식된 장기들의 거부반응을 프로빙(probe)하기 위해, 자유 부동하거나 생물학적 구조물의 표면에 발현된, 임의의 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.
식품 검사
다른 예로서, 자기적 전기화학적 감지가 식품 제품들에서의 알레르겐들의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
5천만 명 초과의 미국인이 어떤 종류의 식품 반응(food reaction)을 가지고 있다. 게다가, 미량의 식품 항원들조차도, 에피네프린 주사를 필요로 하는 잠재적으로 생명을 위협하는 과민성 반응인, 급성 아나필락시스(acute anaphylaxis)를 촉발할 수 있다. 비록 면역치료 시도(immunotherapeutic trial)들의 결과들은 고무적이었지만, 주된 접근법은 계속해서 음식 회피에 의존한다. FALCPA(Food Allergen Labeling and Consumer Protection Act)는 제품들 내의 알레르기 원인 물질(allergenic substance)들에 관해 고객들에게 알리기 위해 식품 표시(food labeling)를 의무화한다. 그럼에도, 제조에서의 미스라벨링(mislabeling) 또는 교차 오염(cross-contamination)은 규제 문제들을 계속 제기한다. 게다가, FALCPA는, 식당들에서 서빙되는 식품이 아니라, 포장된 식품만을 감독한다. 미국 밖에서의 식품 표시는 덜 엄격하며, 식품 알레르기들이 종종 여행자들에게 영향을 미친다. 이와 같이, 흔한 알레르겐들에 대해 식품들을 신속하게 검사할 수 있는 것은 소비자들에게 상당한 이익들을 제공할 수 있다.
일 예로서, 소비자들은, 도 6 내지 도 9와 관련하여 본 명세서에 기술된 키트와 같은, 자기적 전기화학적 감지 시스템 및 샘플 준비 시스템을 갖는 검사 키트를 제공받을 수 있다. 소비자들은 검사를 위한 식품 제품의 샘플을 준비하고, 항원 특이적 자성 비드들을 사용하여 샘플로부터 관심 식품 항원들(예컨대, 밀, 땅콩, 헤이즐넛, 우유, 및 달걀 흰자위와 같은, 사용자에게 알레르기 반응을 일으킬 수 있는 알레르겐들)을 추출하며, 항원들을 감지 시스템의 전극들 상에 집중시키기 위해 키트를 사용할 수 있다. 소비자들은 이어서, 그들의 식단에 관해 보다 많은 정보에 근거한 결정을 할 수 있도록, 식품 제품에서의 항원의 존재 및/또는 만연을 확인하기 위해 감지 시스템을 사용하여(예컨대, 2차 분자들, 3차 분자들, 및 전자 매개 용액을 사용하여) 샘플을 분석할 수 있다.
일부 경우들에서, 소비자들은 또한 소비자가 감지 시스템을 제어하고 그리고/또는 감지 시스템으로부터의 측정 정보를 검토할 수 있게 해주는 컴퓨팅 디바이스(예컨대, 스마트폰)에 대한 제어 애플리케이션을 제공받을 수 있다. 예를 들어, 제어 애플리케이션은 (예컨대, 특정의 알레르겐 및 그의 대응하는 샘플 준비 프로세스에 대한 측정들을 교정하는 것에 의해) 특정 알레르겐에 대한 감지 애플리케이션을 커스터마이즈하는 데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 제어 애플리케이션은 장래의 검토를 위해 측정들을 기록하는 데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 제어 애플리케이션은, 사용자가 (예컨대, 특정의 알레르겐을 포함하지 않은 식품 제품들을 획득하기 위해) 나중에 특정의 위치를 또다시 방문하거나 (예컨대, 특정의 알레르겐을 포함하는 식품 제품들을 획득하는 것을 피하기 위해) 장래에 특정의 위치를 피할 수 있도록, 특정의 식품 제품들의 출처(source)를 추적하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우들에서, 정전위기의 출력이 문턱 또는 기준 레벨과 비교될 수 있고, 특정의 알레르겐이 식품 제품에 존재하는지에 관한 결정이 비교에 기초하여 행해질 수 있다. 예를 들어, 정전위기의 출력이 충분히 높은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하는 전류) 경우, 식품 제품이 (예컨대, 알레르기 반응들을 일으키거나 잠재적으로 일으키기에 충분한 정도로) 특정의 알레르겐을 포함한다는 결정이 행해질 수 있다. 그렇지만, 정전위기의 출력이 충분히 낮은(예컨대, 기준 또는 문턱 레벨을 초과하지 않는 전류) 경우, 식품 제품이 (예컨대, 알레르기 반응들을 일으키지 않거나 일으킬 가능성이 없는 정도로) 특정의 알레르겐을 포함하지 않는다는 결정이 행해질 수 있다. 일부 경우들에서, 기기는 측정들에 기초하여 자동으로 또는 반자동으로 결정을 할 수 있다.
비록 예시적인 알레르겐들이 앞서 기술되어 있지만, 이들은 예시적인 예들에 불과하다. 실제로, 감지 시스템의 구현들은 적절한 알레르겐 특이적 자성 비드들을 사용하여 임의의 알레르겐을 검출하는 데 사용될 수 있다.
예들
본 발명은, 청구항들에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는, 하기의 예들에 추가로 기술된다.
예 1 - 암 진단
이 예의 목적은, CD63과 같은, 난소암의 진행과 상관관계가 있는 바이오마커들이 있는지 엑소좀들을 스크리닝하기 위해 자기적 전기화학적 감지를 사용하는 것을 보여주는 것이었다.
디바이스 요약
8개의 독립적인 채널을 갖는 소형화된 자기적 전기화학적 감지 시스템(본 명세서에서 "iMEX"라고 지칭되는, 통합된 자기적 전기화학적 엑소좀 시스템)이 구성되었다(도 11을 참조). 각각의 채널은 광범위한 전류(±7.5 μA)를 측정할 수 있는 정전위기를 갖추고 있다. 센서는 8개의 전극으로부터의 신호들을 동시에 측정할 수 있다. 면역자기적으로(immunomagnetically) 포획된 엑소좀들을 집중시키기 위해 작은 원통형 자석들이 전극들 아래에 위치되었다.
입력 신호는 고주파 잡음을 억제하기 위해 저역 통과 필터(차단 주파수, 5Hz)에 의해 컨디셔닝되었다. 각각의 정전위기에 임베딩된 저역 통과 필터의 회로도. Vw-set는 전위 제어를 위해 디지털-아날로그 변환기에 연결되었고, Vw는 작동 전극에 연결되었으며, Vout은 신호 디지털화를 위해 아날로그-디지털 변환기에 연결되었다(도 12a를 참조). 저역 통과 필터의 차단 주파수는 5 Hz로 설정되었다(Rf = 300 kΩ, Cf = 0.1 μF). iMEX 센서와 상용 장비(SP200, Bio-Logic) 사이의 측정 결과들의 비교가 도 12b에 도시되어 있다. (0.1 M KCl 중의) 0.2 mM 페로시안화물의 용액에서 (Ag/AgCl 기준 전극 대비) 200 mV의 전위가 인가되었다. iMEX 센서 및 상용 장비로 측정된 전류 레벨들은 양호한 매치를 보였다. 저역 통과 필터에 의해, 잡음 레벨들이 상당히 감소되었다.
8개의 정전위기가 전위 제어를 위한 디지털-아날로그 변환기, 신호 디지털화를 위한 아날로그-디지털 변환기, 채널 선택을 위한 멀티플렉서, 및 시스템 동작을 위한 마이크로컨트롤러 유닛에 연결되었다(도 4c 및 도 13a 내지 도 13d를 참조). 센서 시스템은 8개의 정전위기, 8대1 멀티플렉서, 아날로그-디지털 변환기(ADC), 디지털-아날로그 변환기(DAC), 및 마이크로컨트롤러 유닛(MCU)을 가졌다. 각각의 정전위기는 3개의 전극: 기준(R), 카운터(C), 및 작동(W)을 가졌다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 시스템은 2개의 정전위기(AD8608, Analog Devices)를 포함하였다. R2와 C2(또는 R4와 C4)의 병렬 회로는 차단 주파수 5Hz를 갖는 저역 통과 필터를 있는 트랜스임피던스 증폭기를 형성하였다. 도 13c에 도시된 바와 같이, 마이크로컨트롤러 유닛(Arduino Nano, Arduino)은 USB를 통해 외부 디바이스들과의 직렬 통신하기 위해 사용되었다. 도 13d에 도시된 바와 같이, 시스템은 또한 디지털-아날로그 변환기 유닛(DAC8552, Texas Instruments)을 포함하였다. 하나의 출력은 아날로그-디지털 변환기 유닛(DAC_OUT1)에 연결되었고, 다른 출력은 모든 정전위기들(DAC_OUT2)에 연결되었다. 각각의 출력 포트는 잡음을 최소화하기 위해 저역 통과 필터(DAC_OUT1의 경우 L1, C15, C17, R20, 및 DAC_OUT2의 경우 L2, C19, C20, R22)에 연결되었다. 도 13e에 도시된 바와 같이, 시스템은 또한 8-채널 멀티플렉서(ADG708, Analog Devices) 및 아날로그-디지털 변환기 유닛(ADC161 S626, Texas Instruments)을 포함하였다. 멀티플렉서는 그의 3개의 주소 포트(MUX_A0 내지 MUX_A2)를 통해 마이크로컨트롤러 유닛에 의해 제어되었다.
도 14에 도시된 바와 같이, 우리는 디바이스를 핸드헬드 유닛으로서 패키징하였다. 디바이스는 작은 폼 팩터(9 x 6 x 2 cm3)를 가졌다. 카드 에지 커넥터는 전극 카트리지의 신속한 부착을 위해 사용되었다. 8개의 원통형 자석을 포함하는, 자석 홀더가 전극 카트리지 아래에 위치되었다. 이 자석들은 자성 비드들을 센서 표면에 집중시키는 데 사용되었다. iMEX는 각각의 채널의 신속한 폴링(채널당 50 msec)을 통해 모든 전극들로부터의 동시적인 판독을 효과적으로 제공하였다.
모든 데이터가 커스텀 설계된 소프트웨어에 의해 모니터링되고 분석되었다. iMEX 센서는 USB 인터페이스를 통해 컴퓨터를 거쳐 제어되었다. 전기화학 반응들로부터 발생된 전류들이 선택된 채널들에서 모니터링되었다. 60 초 후에, 40 내지 45 초의 범위에 걸친 전류들의 평균화된 레벨이 디스플레이되었다(도 15를 참조).
어세이 스킴
도 16은 iMEX 어세이 스킴을 요약한 것이다. 엑소좀들이 먼저 면역자성 비드(immunomagnetic bead)들 상에 포획되었다. 산화 효소(서양고추냉이 과산화효소; HRP)를 갖는 2차 항체들이 이어서 사용되었고, 뒤이어서 HRP를 만날 때 전류를 발생시키는 발색 전자 매개체(chromogenic electron-mediator)들(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; TMB)과 비드들을 혼합하였다. 어세이 스킴이 도 17에 보다 상세히 도시되어 있다. CD63에 대한 항체들과 접합된 자성 비드들이 엑소좀 분리를 위해 체액들(또는 PBS)에 로드되었다. 포획된 엑소좀들이 표적 단백질 마커들(예컨대, EpCAM 또는 HER2)에 대한 항체들로 표지되었다. 항체들이 비오틴과 접합되었다. 스트렙타비딘과 접합된 HRP 효소들이 비드들과 혼합되었다. 각각의 단계 이후에 1분 자기 세척 단계가 뒤따랐다. 전체 어세이가 실온에서 1 시간 이내에 수행되었다.
자성 비드들을 사용하는 것은 어세이 절차들을 상당히 단순화시켰다: 과도한 작용제(agent)들(예컨대, 항체들, 효소들)이 자기 세척을 통해 제거되었고, 포획된 엑소좀들이 검출 민감도를 향상시키기 위해 전극들 상에 자기적으로 집중되었다.
우리는 신호 검출을 위해 크로노암페로메트리(chronoamperometry) 방법을 적용하였다: 환원 전위(Ag/AgCl 기준 전극 대비 -100 mV)가 작동 전극에 인가되는 동안 TMB 환원으로 인해 발생된 전류가 모니터링되었다. 전류 레벨(I)은 환원 전위가 인가된 후 1 분 이내에 평탄역(plateau)에 도달하였다(도 18을 참조). CD63 비드와 IgG 비드 샘플들 사이의 전류 차이(ΔIM)는 표적 단백질 마커의 대표 값으로 사용되었다. Abs, 항체들. M, 마커. 우리는 40 초부터 45 초까지의 전류 레벨(I)을 대표 값으로서 평균화하였다.
엑소좀들을 포획하기 위해, 우리는, 엑소좀들에 농축된 막관통 단백질들인, 테트라스패닌에 대한 항체들로 코팅된 자성 비드들을 사용하였다. 우리는 먼저 상이한 크기의 비드들(지름들, 2.7 μm 및 8.8 μm)에 대해 신호 레벨들을 비교하였다. 유사한 양의 엑소좀들을 포획하기 위해 비드들의 전체 표면적이 매칭되었을 때, 측정된 신호 레벨들은 거의 동일하였다(도 19a를 참조). iMEX 어세이들이 상이한 크기들의 자성 비드들(직경이 2.7 및 8.8 μm임)로 수행되었다. 동일한 포획 면적을 제공하기 위해 비드 농도들은, 제각기, 6x 107/mL 및 6x 106/mL이었다. 엑소좀들은 OV90 세포 배양물(cell culture)로부터 수집되었고, PBS 중에서 8x 108/mL의 농도로 희석되었다. 이 결과는 다공성 배지(porous media)에서의 확산계수(diffusivity)로 설명될 수 있다: 적층 비드(stacked bead)들에 대한 유효 확산계수(De)는 
으로 표현될 수 있으며, 여기서 D0은 자유 배지(free media)에서의 확산계수이고 ε은 구조물의 다공도(porosity)이다. 균일한 크기의 비드들 경우에, ε(≤0.47)과 m(= 3/2) 둘 다는 비드 크기 독립적이고; iMEX 신호들이 따라서 일정하게 유지될 것으로 예상된다. 우리는 2.7-μm 비드들을 사용하기로 했으며; 보다 큰 비드들은 침전하는 경향이 있어, 샘플들의 빈번한 진탕을 필요로 하였다. 비-농축 스킴(no-enrichment scheme)과 비교하여, 자기 농축은 분석 신호의 ~ 72% 증가를 가져왔다(도 19b를 참조). iMEX 어세이들이 자기 농축을 사용하여 그리고 자기 농축을 사용하지 않고 수행되었다. 자기 농축을 위해, 작은 코인 형상의 영구 자석이 작동 전극 뒤에 위치되었다. 모든 측정들이 두 번(in duplicate) 수행되었으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로서 디스플레이된다.
우리는 다음에 표적으로서 3개의 대표적인 테트라스패닌 단백질(CD63, CD9, CD81)을 검사하였으며; 이 마커들은 엑소좀들에 농축되어 있다고 한다. 우리는 각각의 마커에 특이적인 2.7-um 자성 비드들을 준비하였다. 상이한 세포주들로부터의 엑소좀들에 적용될 때, CD63 기반 포획은 일관되게 높은 신호를 보였다. 도 20은 암 엑소좀들에서의 세 가지 테트라스패닌 마커(CD63, CD9, 및 CD81)의 신호 비교를 도시하고 있다. CD63으로부터의 신호들은 난소암 세포주들(CaOV3, OV90, 및 OVCAR3)로부터 수집된 엑소좀들에서의 다른 마커들로부터의 신호들보다 훨씬 더 높았다. 우리는 따라서 엑소좀 농축에 대해 CD63을 마커로서 사용하기로 하였다.
각각의 표적 마커(M)에 대해, 우리는 한 쌍의 자성 비드를 준비하였다: 하나는 CD63에 대한 항체들(CD63-비드들)과 접합되고 다른 하나는 아이소타입 매칭된(iso-type matched) IgG에 대한 항체들(IgG-비드들)과 접합된다. 엑소좀들이 각각의 비드-유형과 혼합되었고 이어서 표적 마커에 대한 항체들로 표지되었으며; 순 신호 차이(net signal difference)ΔIM(
도 18을 참조)가 이어서 획득되었다. 우리는 총 엑소좀 부하(total exosome load)를 추정하기 위해 ΔICD63을 사용하였고, 정규화된 메트릭 
을 표적 마커(M)의 발현 레벨로서 정의하였다. 이러한 스케일링이 샘플들 간의 엑소좀 수들의 변동들을 보상할 것임에 주목한다.
iMEX 검증
우리는 막관통 단백질들에 대한 엑소좀들을 프로파일링하기 위해 개발된 iMEX 프로토콜을 적용하였다. 이 검증 연구를 위해, 우리는 종래의 방법을 통해 세포 배양물(OV90, OVCA420)로부터 엑소좀들을 채취(harvest)하였고, 이들을 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 스파이크하였다(~109 엑소좀/mL). 샘플들이 분액(aliquot)되었고 iMEX 어세이 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 프로세싱되었다. 비교 분석은, iMEX의 분석 능력(analytical capacity)을 확인해주는, 두 가지 방법(도 21을 참조; R2 = 0.931) 사이에 높은 상관관계를 보였다. 그렇지만, iMEX 어세이는 ELISA(5 시간, 100 μL)보다 더 빨랐고(1 시간) 더 적은 양의 샘플들(10 μL)을 소비하였다.
우리는 생물 유체(biofluid)들에서 엑소좀들을 검출하는 것에 대해 iMEX를 추가로 테스트하였다. 암 엑소좀들이 세포 배양물(OV90)로부터 수집되었고, 다양한 수의 엑소좀들이 희석되지 않은 인간 혈장에 스파이크되었다. 적정 실험들은 3 x 104개의 엑소좀의 검출 한계(limit of detection: LOD)를 입증하였으며, 다이내믹 레인지들은 네 자릿수에 걸쳐 있다(도 22를 참조). ELISA를 이용한 유사한 측정들은 신뢰성있는 검출을 위해 107개 초과의 엑소좀을 필요로 하였다. 매칭된 대조군(matched control)들(IgG-비드들)을 사용하는 것이 샘플 의존적이고 비특이적인 엑소좀 결합(exosome binding)으로부터의 배경 신호(background signal)들을 보상하는 데 중요하였다. 검출 한계들은 3x104 (iMEX) 및 3x107 (ELISA)였다. 모든 측정들이 세 번(in triplicate) 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SD로서 디스플레이된다.
세포 유래 엑소좀들에서의 단백질 마커들의 프로파일링
우리는 난소암 세포주들의 패널로부터 엑소좀 표면 마커들을 스크리닝하기 위해 iMEX를 적용하였다. iMEX가 CD63 양성(CD63-positive)(CD63+) 엑소좀들을 농축시키고 표적 단백질들에 대해 이들을 표지하기 때문에, 우리는 CD63+ 엑소좀들이 그들의 기원 세포들을 얼마나 면밀하게 반영하는지를 검사할 수 있었다. 우리는 종래의 연구들에 기초하여 6개의 대표적인 표면 마커들을 선택하였다: 상피 세포 부착 분자(EpCAM), CD24, 암 항원 125(CA125), 인간 표피 성장 인자 2(HER2), 뮤신 18(MUC18), 및 표피 성장 인자 수용체 2 EGFR). 이 마커들의 세포 발현 레벨들이 유세포 분석(flow cytometry)을 이용해 측정되었고; 엑소좀들이 컨디셔닝된 세포 배양 배지(cell-culture media)로부터 채취되고 iMEX를 이용해 프로파일링되었다. 세포들과 CD63+ 엑소좀들의 분자 프로파일들은 높은 상관 관계를 가졌으며(평균 형광 강도(MFI)들 - 보다 어두운 영역들은 보다 높은 MFI를 나타내고 보다 밝은 영역들은 보다 낮은 MFI를 나타냄 - 을 도시하는, 도 23을 참조), 이는 엑소좀들을 세포 대리들로서 사용하는 것을 지원하였다. 4개의 난소암 세포주(CaOV3, OV90, OVCAR3, 및 OVCA420)와 하나의 정상 세포주(TIOSE6)가 (유세포 분석을 통해, 도 23, 좌측 패널) 6개의 추정 암 마커(putative cancer marker)들이 있는지 스크리닝되었다. 세포 유래 엑소좀들이 면역자기적으로 포획되고(CD63 특이적) iMEX에 의해 어세이되었다(도 23, 우측 패널). 프로파일링 데이터는 세포들과 CD63 양성 엑소좀들 사이에 양호한 매치를 보였다. iMEX 어세이가 두 번 이루어졌고, 평균 값들이 디스플레이된다.
임상: 난소암을 가진 환자들로부터의 혈장의 직접 분석
iMEX 어세이는 혈장 또는 혈청으로부터 직접 EV들을 격리시키고, 고속, 고처리율 방식으로 프로파일링을 가능하게 해준다 - 임상 워크플로(clinical workflow)에의 성공적인 통합을 위해 중요함. 임상 타당성(clinical feasibility)을 입증하기 위해, 우리는 혈액에서의 난소암 EV 검출을 위해 iMEX 어세이를 커스터마이즈하였다(도 24를 참조). 임상 혈장 샘플들이 어떠한 정제도 없이 분액되었고, 각각의 분액(마커당 10 μL)이 EV 포획을 위해 자성 비드들과 함께 인큐베이트(incubate)되었으며(15 분), 이어서 자기 세척이 뒤따랐다. 비드-결합된 EV(bead-bound EV)들은 표적 마커들(15 분) 및 HRP(15 분)에 대해 연속적으로 표지되었고, 디바이스에 로드되었다. 독립적으로 작동되는 8개의 전극을 이용하여, 우리는 4개의 상이한 마커(CD63, EpCAM, CD24, 및 CA125)를 그 각자의 IgG 대조군들과 함께 동시에 측정할 수 있었다. IgG-대조군들은 정제되지 않은 임상 샘플들 중에서의 표적 분자들의 특이적 검출에 유리하였다. 어세이 전체가 여과 및 원심분리 프로세스들 없이 1 시간 이내에 완료되었다.
우리는 11 명의 난소암 환자와 5 명의 건강한 대조군의 단일 시점 혈장 샘플들을 검사하였다. EV들에서의 EpCAM과 CD24의 발현 레벨들은 건강한 대조군들보다 난소암 환자들에서 훨씬 더 높았고, 양쪽 메트릭은 높은 상관관계(R2 = 0.870)을 보였다(도 25 및 도 26을 참조). 우리는 다음에 약물 치료를 받고 있는 4 명의 난소암 환자로부터 2개의 시점(2 개월 떨어짐)에서 수집된 혈장에서 EpCAM과 CD24를 측정함으로써 직렬 EV 검사(serial EV testing)에 대한 iMEX의 잠재성을 조사하였다. iMEX 어세이들은 치료 반응에 대해 모르는 채로 수행되었다. "비-반응(non-responding)" 환자들의 경우, EpCAM과 CD24의 발현 레벨들이 증가한 반면, "반응(responding)" 환자는 양쪽 마커에서 상당한 감소를 보였다(도 27을 참조). 비-반응자들에 대해 CD24의 레벨은 EpCAM의 레벨보다 더 가파른 증가들을 보였다. 모든 측정들은 두 번 이루어졌고, a.u.(임의 단위)이다.
iMEX 시스템의 제조
이 디바이스는 마이크로컨트롤러(Atmega328, Atmel Corporation), 디지털-아날로그 변환기(DAC8552, Texas Instruments), 아날로그-디지털 변환기(ADC161S626, Texas Instruments), 멀티플렉서(ADG708, Analog Devices), 및 8개의 정전위기를 포함하였다. 각각의 정전위기는 2개의 연산 증폭기(AD8606, Analog Devices)를 포함하였다: 하나의 증폭기는 작동 전극과 기준 전극 사이의 전위차를 유지하고, 다른 하나는 전류를 전압 신호로 변환하기 위한 트랜스임피던스 증폭기로서 작동한다. 트랜스임피던스 증폭기의 전류 측정 범위는 ±7.5 μA였다. 8-채널 전극들은 상업적으로 이용가능하다(DropSens, Spain).
면역자성 비드들의 준비
에폭시 기(epoxy group)들(Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen)로 코팅된 5 mg의 자성 비드들이 1 mL의 0.1M 인산나트륨 용액에 실온에서 10 분 동안 현탁되었다. 자성 비드들이 영구 자석을 이용해 용액으로부터 분리되고 100 μL의 동일한 용액에 재현탁(re-suspend)되었다. CD63(Ancell) 또는 각자의 IgG(Ancell)에 대한 100 μg의 항체들이 첨가되고 완전히 혼합되었다. 100 μL의 3M 황산암모늄 용액이 첨가되었고, 전체 혼합물이 저속 틸트 회전(slow tilt rotation)을 이용해 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이트되었다. 비드들이 포스페이트 버퍼 살린(phosphate buffer saline: PBS) 용액으로 2 회 세척되었고, 최종적으로 1% 소혈청알부민(BSA)을 갖는 2 mL의 PBS에 재현탁되었다. 추가 상세들은 자성 비드들의 제조업체에 의해 제공된 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
표지 항체들의 비오틴화
PBS 중의 10 mM 설포-NHS-비오틴(Pierce) 용액이 실온에서 2 시간 동안 항체들과 함께 인큐베이트되었다. 반응되지 않은 설포-NHS-비오틴이 Zeba 스핀 탈염 컬럼(spin desalting column), 7K MWCO(Thermo Scientific)를 사용하여 제거되었다. 항체들은 사용할 때까지 4 ℃에서 보관되었다.
iMEX 어세이
10 μL의 엑소좀-스파이크된(exosome-spiked) PBS 용액(또는 혈장)이 실온에서 15 분 동안 50 μL의 면역자성 비드 용액과 혼합되었다. 비드 농도는 하기의 기준에 따라 결정되었다: 
, 여기서 Cb와 Ce는, 제각기, 비드 농도와 엑소좀 농도이고; Vb와 Ve는, 제각기, 비드 용액과 엑소좀-스파이크된 용액(또는 혈장)의 부피이며; Rb와 Re는, 제각기, 비드들과 엑소좀들의 평균 반경이다. 이 요구사항은 충분한 비드 표면이 엑소좀 포획에 이용가능하도록 보장하였다. 우리의 실험 조건에서, Re ~ 50 nm이고, Rb = 1.4 μm이며, Ce ~ 1010/mL이다. 따라서, 우리는 비드 농도를 ~108/mL로 조정하였다. 자성 비드들이 영구 자석을 이용해 용액으로부터 분리되고 80 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 5 초의 볼텍싱(vortexing) 이후에, 비드들이 분리되고 80 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 10 μL의 관심 항체들(PBS 중의 20 μg/mL)이 실온에서 15 분 동안 비드들과 혼합되었다. 자성 비드들이 이전에 기술된 바와 같이 분리되고 세척되었으며, 50 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 5 μL의 스트렙타비딘-접합된(streptavidin-conjugated) HRP 효소들(PBS에 1:100으로 희석됨)이 실온에서 15 분 동안 비드들과 혼합되었다. 자성 비드들이 이전에 기술된 바와 같이 분리되고 세척되었으며, 7 μL의 PBS에 재현탁되었다. 준비된 비드 용액과 20 μL의 UltraTMB 용액(ThermoFisher Scientific)이 스크린 인쇄된 전극 위에 로드되었다. 3 분 후에, 전기화학적 센서를 이용해 크로노암페로메트리 측정이 시작되었다. 40 내지 45 초의 범위에 있는 전류 레벨들이 평균화되었다.
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
CD63 항체(Ancell)와 IgG1 항체(Ancell)가 PBS에 5 μg/mL 농도로 희석되었고 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션을 위해 Maxisorp 96 웰 플레이트(Nunc)에 첨가되었다. PBS로 세척한 이후에, PBS 블로킹 용액 중의 2% BSA가 실온에서 1 시간 인큐베이션을 위해 플레이트에 첨가되었다. 이어서, 100 μL의 PBS 중의 108개의 엑소좀이 실온에서 1 시간 인큐베이션을 위해 각각의 웰에 첨가되었다. 블로킹 용액을 폐기한 후에, 다양한 마커들에 대한 항체들(1 μg/mL)이 각각의 웰에 첨가되었고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이트되었다. 비결합 항체들이 PBS로 3 회 세척되었다. 스트렙타비딘-HRP 분자들이 실온에서 1 시간 동안 각각의 웰에 첨가되었다. PBS로 세척한 후에, 화학발광 신호(chemiluminescence signal)가 측정되었다.
유세포 분석
항체 당 5x105개의 세포가 유세포 분석 실험들에 사용되었다. 세포들이 4% 파라포름알데히드를 이용해 실온에서 10 분 동안 고정(fix)되었으며, 이어서 PBS(0.5% BSA)로 세척되었다. 이어서, 세포들이 BSA(PBS에서 0.5%)를 이용해 블로킹되었고, 이어서 1차 항체(primary antibody)들(4 μg/mL)과 함께 인큐베이트되었다. 1차 항체 인큐베이션(primary antibody incubation) 이후에, 세포들이 세척되었고, 형광단 접합된(fluorophore conjugated) 2차 항체(secondary antibody)(2 μg/mL; Abeam)와 함께 인큐베이트되었으며 세척되었다. 표지된 세포들로부터의 형광 신호들이 BD LSRII Flow Cytometer(BD Biosciences)를 사용하여 측정되었다. 기록된 평균 형광 강도들(MFI들)이 하기의 수식 [(signal-IgG isotype control)/secondary]을 사용하여 정규화되었다. 블로킹 및 항체들(1차 및 2차)과 함께 인큐베이션하는 것이 실온에서 각각 30 분 동안 수행되었다. 모든 세척 단계는 300g으로 PBS(0.5% BSA)를 이용한 3 번의 5 분 세척을 포함하였다.
세포 배양(Cell Culture)
OV90, OVCAR3, OCVA420, 및 TIOSE6 세포들이 RPMI-1640 배지(Cellgro)에서 성장되었다. CaOV3는 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)(Cellgro)에서 배양되었다. 모든 배지는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신(Cellgro)으로 보충되었다. 모든 세포주들이 검사되었고, 마이코플라스마 오염(mycoplasma contamination)이 없었다(MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Lonza, LT07-418).
배양된 세포들로부터 엑소좀 격리
우리는 세포 배양 배지로부터 엑소좀들을 채취하기 위해 종래의 방법을 사용하였다. 계대(passage) 1 내지 계대 15에서의 세포들이 소포-고갈된 배지(vesicle-depleted medium)(5% 고갈된 FBS를 가짐)에서 48 시간 동안 배양되었다. ~ 107개의 세포로부터의 컨디셔닝된 배지가 수집되었고, 300g으로 5 분 동안 원심분리되었다. 상청액(supernatant)이 0.2-μm 멤브레인 필터(membrane filter)(Millipore)를 통해 여과되었고 1 시간 동안 100,000g만큼 농축(concentrate)되었다. 상청액이 제거된 후에, 엑소좀 펠릿(exosome pellet)이 PBS로 세척되었고 100,000g으로 1 시간 동안 원심분리되었다. 엑소좀 펠릿이 PBS에 재현탁되었다.
임상 샘플 준비
이 연구는 Dana-Farber/Harvard Cancer Center에 있는 Institutional Review Board에 의해 승인되었으며, 밟아야 하는 절차들은 기관 가이드라인들을 따랐다. 사전 동의서(informed consent)가 모든 피검자들(n = 11)로부터 획득되었다. 말초 혈액(~ 15 mL)이 난소암을 갖는 환자들로부터 채혈(withdraw)되었고, 적혈구들 및 버피 코트(buffy coat)로부터 혈장을 분리하기 위해, 400g으로 15 분 동안 원심분리되었다. 각각의 표면 마커 분석을 위해 10 μL의 혈장이 사용되었다.
결론
이 예는, CD63과 같은, 난소암의 진행과 상관관계가 있는 바이오마커들이 있는지 엑소좀들을 스크리닝하기 위해 자기적 전기화학적 감지를 사용하는 것을 보여주었다.
감지 시스템의 유익한 특징은 소포 격리 및 검출의 단일 플랫폼에의 통합이다. 자기 작동(magnetic actuation)의 사용은 소포 격리 및 후속 어세이 단계들을 단순화시키고, 전기화학적 감지는 고처리율 스크리닝 및 센서 소형화를 용이하게 한다. 본 연구는 다음의 개념들을 검증하였다: i) 병렬 측정들을 위한 능력을 갖는 휴대용 검출 시스템이 구현되었다; ii) 이 시스템은 엑소좀들을 혈액으로부터 직접 농축시켰고 그들을 분자 정보를 위해 프로파일링하였다; iii) 전체 시스템 어세이(즉, 엑소좀 격리, 표지, 검출)가 마커당 10 μL의 혈장만을 소비하면서 1 시간 이내에 완료되었다. 우리는 또한 난소암 환자들로부터 수집된 혈액 내에서 EV들을 프로파일링함으로써 시스템의 임상 가능성을 입증하였다.
비드 기반 자기 농축은 감지 시스템에서 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 이 방법은 신호 소스들을 전극들 상에 집중시키는 편리한 방법을 제공하며, 이는 검출 민감도를 향상시킨다. 둘째, 항체들이 칩 표면 상에 부동화(immobilize)되는 표면 기반 포획과 비교하여, 비드 기반 방법은 신뢰성있고 보다 간단한 접합 화학(conjugation chemistry)을 따르고, 항체들과 엑소좀들 사이의 보다 빠른 결합 키네틱스(binding kinetics)으로부터 이익을 본다. 셋째, 비드-결합된 소포들이 감지 시스템과 협력하는 하류 분자 분석(downstream molecular analysis)들을 위해 용이하게 회수될 수 있다. 예를 들어, 비드-결합된 EV들이 그들의 핵산 내용물을 프로파일링하기 위해 용출(elute)되거나 용해(lyse)될 수 있다.
이 예에서, 우리는 CD63+ EV 집단(엑소좀들)을 프로파일링하는 것에 중점을 두었으며, 이는 2가지 인자에 의해 동기부여되었다: i) CD63 포획으로부터의 신호가 검사된 테트라스패닌 마커들 중에서 가장 높았다; 및 ii) 우리와 다른 사람들은 난소암 엑소좀들이 CD63과 함께 농축되는 것을 이전에 보여주었다. 시스템의 프로파일링은 CD63 양성 엑소좀들과 그들의 부모 세포(parent cell)들 사이에서 단백질 발현에서의 높은 상관관계를 발견하였으며; 이 결과는 세포 대리들로서의 CD63 양성 엑소좀들의 잠재적 사용을 검증하였다. 그렇지만, 다양한 EV 유형들(예컨대, CD63-음성(CD63-negative))이 환자 샘플들에 존재할 수 있다는 것을 고려할 때, 엑소좀 포획 전략이 확장될 수 있다는 것에 우리는 주목한다. 이 집단들을 검사하는 것은 종양 이질성을 포획하기 위한 보다 정확한 정보를 제공할 수 있다. 감지 방법이 포획 항체들을 변경하는 것에 의해 이러한 목적으로 용이하게 채택될 수 있다.
우리는 기술을 더욱 발전시키기 위해 다수의 방향을 구상하고 있다. 첫째, 어세이 처리율(assay throughput)은 검출 사이트(detection site)들의 수를 증가시킴으로써 개선될 수 있다. 전기화학적 감지는 이상적으로는 이러한 스케일-업(scale-up)에 적합하다: 감지 요소들(전극들)이 대규모 어레이 포맷으로 용이하게 미세제조(microfabricate)될 수 있으며, 신호들(전류들)이 고속 멀티플렉싱(high-speed multiplexing)을 이용해 콤팩트한 전자장치에 의해 판독될 수 있다. 둘째, 전기화학적 신호 검출을 위한 새로운 설계들을 탐구함으로써 검출 민감도가 개선될 수 있다. 신호 레벨은 센서의 표면적 및 표적 엔티티(target entity)들에 결합된 효소의 양과 상관관계가 있고; 따라서, 보다 높은 민감도가 나노구조화된 센서 표면 또는 다중 표지 나노입자(multi-label nanoparticle)들을 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다. 셋째, 검출 표적들이 다른 엑소좀 성분들을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 엑소좀들은 다양한 핵산들(예컨대, mRNA, microRNA)을 담고 있으며; 엑소좀 단백질들과 함께 핵산들을 분석하는 것은 종양 상태들의 보다 정확한 스냅샷(snapshot)을 제공할 것이다. PCR 증폭 없이 미량의 핵산들(<1 pM)을 검출하기 위해 전기화학적 감지가 적용되었다. 우리는 엑소좀 핵산들을 프로파일링하기 위해 유사한 접근법들이 채택될 수 있을 것으로 기대한다. 결과적인 iMEX는 저렴하고 확장가능하며 포괄적인 엑소좀 분석들을 위한 강력한 임상 도구일 수 있으며, 그에 의해 종양 생물학에 대한 통찰력을 심화시키고 효과적인 암 관리를 가속화할 수 있다.
예 2 - 장기 거부반응 검사
이 예의 목적은 이식된 신장 거부반응과 상관관계가 있는 바이오마커들이 있는지 엑소좀들을 스크리닝하기 위해 자기적 전기화학적 감지를 사용하는 것을 보여주는 것이었다.
세포 배양
OV90, OVCAR3, OVCA420, 및 TIOSE6 세포들이 RPMI-1640 배지(Cellgro)에서 성장되었다. CaOV3는 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)(Cellgro)에서 배양되었다. 모든 배지는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신(Cellgro)으로 보충되었다. 모든 세포주들이 검사되었고, 마이코플라스마 오염이 없었다(MycoAlert mycoplasma detection kit, Lonza, LT07-418).
세포 배양물로부터 EV 격리
우리는 세포 배양 배지로부터 EV들을 채취하기 위해 종래의 방법을 사용하였다. 계대 1 내지 계대 15에서의 세포들이 소포-고갈된 배지(5% 고갈된 FBS를 가짐)에서 48 시간 동안 배양되었다. 107개의 세포로부터의 컨디셔닝된 배지가 수집되었고, 300 x g으로 5 분간 원심분리되었다. 상청액이 0.2 μm 멤브레인 필터(Millipore)를 통해 여과되었고 1 시간 동안 100,000 x g만큼 농축되었다. 상청액이 제거된 후에, EV 펠릿이 PBS로 세척되었고 100,000 x g으로 1 시간 동안 원심분리되었다. EV 펠릿이 PBS에 재현탁되었다.
표지 항체들의 비오틴화
PBS 중의 설포-NHS-비오틴(10 mM, Pierce) 용액이 실온에서 2 시간 동안 항체들과 함께 인큐베이트되었다. 반응되지 않은 설포-NHS-비오틴이 Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO(Thermo Scientific)를 사용하여 제거되었다. 항체들은 사용할 때까지 4 ℃에서 보관되었다.
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
CD63 및 IgG1 항체들(Ancell)이 PBS에 5 μg/mL로 희석되었고 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션을 위해, 제각기, Maxisorp 96 웰 플레이트(Nunc)에 첨가되었다. PBS로 세척된 후에, PBS 중에 2% BSA를 갖는 블로킹 용액이 플레이트에 첨가되었고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이트되었다. 이어서, 100 μL의 PBS 중의 ~108개의 엑소좀이 실온에서 1 시간 인큐베이션을 위해 각각의 웰에 첨가되었다. 블로킹 용액이 제거된 후에, 다양한 마커들에 대한 항체들(1 μg/mL)이 각각의 웰에 첨가되었고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이트되었다. 비결합 항체들이 PBS로 3 번 세척되었다. 스트렙타비딘-서양고추냉이 과산화효소(HRP) 분자들이 실온에서 1 시간 동안 각각의 웰에 첨가되었다. PBS로 세척된 후에, 화학발광 신호들이 측정되었다.
iMEX 어세이
10 μL의 엑소좀-스파이크된 PBS 용액이 실온에서 30 분 동안 50 μL의 면역자성 비드 용액과 혼합되었다. 비드 농도는 하기의 기준에 따라 결정되었다: 
, 여기서 Cb와 Ce는, 제각기, 비드 농도와 엑소좀 농도이고; Vb와 Ve는, 제각기, 비드 용액과 엑소좀-스파이크된 용액의 부피이며; Rb와 Re는, 제각기, 비드들과 엑소좀들의 평균 반경이다. 이 요구사항은 충분한 비드 표면이 엑소좀 포획에 이용가능하도록 보장하였다. 우리의 실험 조건에서, Re ~ 50 nm이고, Rb = 1.4 μm이며, Ce ~ 1010/mL이다. 따라서, 우리는 비드 농도를 ~108/mL로 조정하였다. 자성 비드들이 영구 자석을 이용해 용액으로부터 분리되고 80 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 5 초의 볼텍싱 이후에, 비드들이 분리되고 80 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 10 μL의 관심 항체들(PBS 중의 20 μg/mL)이 실온에서 30 분 동안 비드들과 혼합되었다. 자성 비드들이 이전에 기술된 바와 같이 분리되고 세척되었으며, 50 μL의 PBS(1% BSA)에 재현탁되었다. 5 μL의 스트렙타비딘-접합된 HRP 효소들(PBS에 1:100으로 희석됨)이 실온에서 15 분 동안 비드들과 혼합되었다. 자성 비드들이 이전에 기술된 바와 같이 분리되고 세척되었으며, 7 μL의 PBS에 재현탁되었다. 준비된 비드 용액과 20 μL의 UltraTMB 용액(Thermo-Fisher Scientific)이 스크린 인쇄된 전극 위에 로드되었다. 3 분 후에, 전기화학적 센서를 이용해 크로노암페로메트리 측정이 시작되었다. 40 내지 45 초의 범위에 있는 전류 레벨들이 평균화되었다.
임상 샘플들로부터 EV 격리
수행된 연구는 연구 기관의 IRB(Institutional Review Board)에 의해 승인되었으며, 밟아야 하는 절차들은 기관 가이드라인들을 따랐다. 사전 동의서가 모든 피검자들(n = xx)로부터 획득되었다. 소변 샘플(~15 mL)이 신장 이식을 갖는 환자들로부터 수집되었고, 적혈구들 및 버피 코트로부터 혈장을 분리하기 위해, 400g으로 15 분 동안 원심분리되었다. 각각의 표면 마커 분석을 위해 10 μL의 혈장이 사용되었다.
도 28은 신장 내의 T 세포-유래 EV 분비 세뇨관의 개략적 예시이다. 도 29는 신장 이식 거부반응 환자 생검 샘플들의 조직구조를 도시하고 있다. 도 30은 jurkat T 세포 유래 엑소좀의 검출을 위한 96 웰 플레이트 포맷 iMEX 시스템의 개략도를 도시하고 있다. 센서는 96개 샘플로부터의 신호들을 동시에 측정할 수 있다. SEM(Scanning Electron Microscopy)은 CD3 항체 작용기화된 자성 비드들에 의해 포획된 EV를 보여준다. iMEX 어세이의 개략도가 또한 도시되어 있다. jurkat 세포 또는 환자 소변으로부터의 EV들이 항-CD3 항체 접합된 자성 비드(anti-CD3 antibody conjugated magnetic bead)들에 의해 포획되었다. 후속하는 비오틴화된 항-CD63 항체 및 HRP 효소 표지(enzyme labeling)는 전기화학적 신호들을 제공하였다.
도 31a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이로 발견 세트에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다. 도 31b는 발견 세트에서 CD3 마커의 민감도, 특이도 및 정확도를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
도 32a는 CD3 발현을 갖는 EV들이 iMEX 어세이로 검증 세트에서 검출되었을 때의 측정된 전류를 도시하고 있다. 도 32b는 검증 세트에서 CD3 마커의 민감도, 특이도 및 정확도를 결정하는 데 사용되는 ROC 곡선을 도시하고 있다.
결론
이 예는 거부반응을 그의 초기 단계들에서 검출하는 수단으로서 이식된 신장 거부반응과 상관관계가 있는 바이오마커들이 있는지 엑소좀들을 스크리닝하기 위해 자기적 전기화학적 감지를 사용하는 것을 보여준다.
예 3 - 식품 검사
이 예의 목적은 식품 제품들에서 알레르겐들의 존재를 검출하기 위해 자기적 전기화학적 감지를 사용하는 것을 보여주는 것이었다.
식품 알레르기들, 식품 민감증들, 및 (셀리악병(celiac disease)과 같은) 자가면역 반응을 비롯한, 식품 유해 반응(adverse food reaction)들은 인구의 5 내지 15%에 영향을 미치며 엄격한 식품 회피와, 긴급 상황(emergency episode)들의 경우, 에피네프린 이용가능성을 요구하는 상당한 공중 보건 문제로 남아 있다. 오늘날 가공 식품(prepared food)들과 외식(out-of-home meals)들에 의존하는 것을 고려할 때, 문제가 되는 식품들을 회피하는 것이 말은 쉬우나 행하기는 어렵다. 우리는 신속한 외인성 식품 항원 검사(본 명세서에서 "iEAT"라고 지칭됨)를 위한 휴대가능한 사용 시점(point-of-use) 기술을 개발하였다. 이 시스템은 신속한 감지 및 통신을 위해 전자 키체인 판독기(electronic keychain reader)와 커플링된 일회용 항원 추출 디바이스를 포함한다. 우리는 땅콩, 헤이즐넛, 밀, 우유, 및 달걀에서 5 가지 주요 식품 항원을 검출하기 위해 프로토타입 iEAT 시스템을 최적화하였다. iEAT를 이용한 항원 추출 및 검출은 10 분 미만을 필요로 하며, 규제 한도(regulatory limit)들보다 훨씬 더 낮은, 0.003 ppm 미만의 검출 민감도들을 달성한다. 식당 상황(restaurant condition) 하에서 검사할 때, 우리는 "글루텐 프리(gluten-free)" 식품 항목들에서 글루텐과 같은 숨어 있는 식품 항원들을 검출할 수 있었다. iEAT 시스템의 작은 크기 및 신속하고 간단한 검사는 소비자들뿐만 아니라 임상의들, 식품 업계 및 규제 기관들이 식품 안전을 향상시키는 데 도움을 줄 것이다.
5천만 명 초과의 미국인이 어떤 종류의 식품 반응을 가지고 있다. 식품 알레르기들로 미국에서만 매년 250 억 달러의 비용을 치른다. 미량의 식품 항원들조차도, 에피네프린 주사를 필요로 하는 잠재적으로 생명을 위협하는 과민성 반응인, 급성 아나필락시스를 촉발할 수 있다. 비록 면역치료 시도들의 결과들은 고무적이었지만, 주된 접근법은 계속해서 음식 회피에 의존한다. FALCPA(Food Allergen Labeling and Consumer Protection Act)는 제품들 내의 알레르기 원인 물질들에 관해 고객들에게 알리기 위해 식품 표시를 의무화한다. 그럼에도, 제조에서의 미스라벨링 또는 교차 오염은 규제 문제들을 계속 제기한다. 게다가, FALCPA는, 식당들에서 서빙되는 식품이 아니라, 포장된 식품만을 감독한다. 미국 밖에서의 식품 표시는 덜 엄격하며, 식품 알레르기들이 종종 여행자들에게 영향을 미친다. 이와 같이, 흔한 알레르겐들에 대해 식품들을 신속하게 검사할 수 있는 것은 주요 미충족 요구이다.
이 시스템은 감지 및 통신을 위해 일회용 항원 추출 디바이스 및 전자 키체인 판독기를 포함한다. 추출 키트는 분산된 식품으로부터 식품 항원들을 포획하고 집중시킨다. 포획된 알레르겐들은 이어서 소형화된 키체인 판독기를 사용하여 정량화된다. 전반적으로, iEAT 시스템은 짧고 실행가능한(actionable) 시간 프레임(즉, 어세이 전체에 대해 10 분 미만)에서 정량적 알레르겐 검출을 가능하게 해준다. 우리는 iEAT를 소비자 기반 동작들을 증진하도록 특별히 설계하였다: i) 추출 키트는 사용하기 쉽고 저렴하며 일회용이다; ii) 검출이 빠르고 신뢰성있으며 정확하다; iii) 임베디드 통신 프로토콜들은 사용자들이 시간 및 로케일 스탬프들을 이용하여 정보를 기록하고 클라우드 서버에 업로드할 수 있게 해준다. 우리는 밀, 땅콩, 헤이즐넛, 우유, 및 달걀 흰자위로부터 5 가지 대표적인 알레르겐들을 검출하도록 iEAT 프로토타입을 최적화하였다. 신속한 iEAT 어세이는 황금 표준 ELISA를 훨씬 능가하는, 높은 민감도를 달성하였다. 우리는 또한 이 알레르겐들에 대한 일반 식품들의 조사에서 iEAT의 실용적인 사용을 보여준다.
iEAT 어세이
도 33a는 도 6 내지 도 9와 관련하여 본 명세서에 기술된 바와 같은, 키체인 판독기, 추출 키트, 및 스마트폰 앱을 포함하는 휴대용 iEAT 시스템을 묘사하고 있다. 시스템은 키체인-크기의 검출기, 전극 칩 및 알레르겐 추출을 위한 일회용 키트를 포함한다. 검출기는 시스템 제어 및 클라우드 서버로의 데이터 업로드를 위해 스마트폰과 연결한다.
감지에서의 첫 번째 단계는 면역자기적 농축을 사용하는 특수 설계된 일회용 키트를 통해 알레르겐을 추출하는 것이었다(도 33b를 참조). 알레르겐들은 자성 비드들 상에 포획되었고 산화 효소(서양고추냉이 과산화효소, HRP)와 접합된 2차 항체로 표지되었다. 샘플들을 핸들링하기 위해 일회용 키트가 개발되었고; 피복된 자석은 MB들을 수집하고 재분산(re-disperse)시킨다. 발색 전자 매개체들(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, TMB)과 혼합될 때, 비드들은 TMB 산화로 인한 전류를 발생시켰다. 전류는 이어서 전극에 의해 측정되었다. 신호는 효소 반응은 물론 MB들의 자기 농축을 통해 증폭된다. 전기적 검출 스킴은 소형화된 전자 디바이스로 정량적 측정들을 수행하는 것을 가능하도록 하였다. 게다가, 자성 비드들을 중실 기판(solid substrate)으로서 사용하는 것은 두 가지 면에서 어세이 성능을 개선시켰다.
첫째, 추출 프로세스와 샘플 핸들링이 자기 작동을 통해 단순화되었다. 휴대가능 조작(portable operation)들을 가능하게 해주기 위해, 우리는 특수 장비(예컨대, 원심분리기, 피펫들)의 필요성을 없애주는, 비드 수집 및 재현탁을 위한 간단한 피복된 자성 바(도 8을 참조)를 설계하였다. 추출 키트는 알레르겐 추출 및 표지 프로세스들을 단순화하였다. 자석이 유리 스틱(glass stick)의 단부에 부착되었고 석영 튜브로 피복되었다. 이 어셈블리는 식품 추출 유체와 면역자성 비드들의 혼합물을 포함하는 샘플 튜브에 삽입되었다. 수집된 비드들은 세척 및 표지를 위해 상이한 튜브들로 쉽게 이송되었다.
둘째, 전기화학적 신호들이 비드들을 전극 위에 자기적으로 집중시키는 것에 의해 증폭되었다. 이것을 위해, 우리는 작은 자석이 피팅된 전극 홀더를 설계하였다(도 6d를 참조). 홀더는 자성 비드들을 집중시키기 위해, 각각의 전극마다 하나씩, 작은 자석을 가졌다. 단일 전극에 대한 홀더가 도시되어 있다.
우리는 iEAT 판독기를 용이한 휴대성을 위해 키체인 크기의 디바이스로서 설계하였다(도 6a 내지 도 6c를 참조). 미니 판독기는 결과들을 검출하고 디스플레이할 뿐만 아니라, 사용자들 간의 웹 기반 데이터 수집 및 공유를 위해 검사 결과들 및 다른 정보를 클라우드 서버로 전송하기 위해, 블루투스를 통해 스마트폰들과 무선으로 통신하였다. 스마트폰 앱은 블루투스를 통해 iEAT 디바이스와 통신하고, 데이터를 클라우드 서버에 업로드하였다. 기능들은 (i) 사용자들 및 분석된 식품들의 사진을 촬영하는 것, (ii) 검출 채널들(예컨대, 알레르겐 유형들)을 설정하는 것, (iii) 측정 결과들을 디스플레이하는 것, (iv) 식품 섭취를 추적하는 것, 및 (v) 측정 시간 및 지도에서의 위치를 저장하는 것을 포함하였다.
게다가, 이 통신 능력은 시스템 제어, 데이터 저장, 및 무선 배터리 충전을 위한 확장된 사용자 인터페이스를 제공한다. 디바이스는 전류 측정들을 위한 정전위기들, 신호 프로세싱을 위한 마이크로컨트롤러 유닛(MCU), 미니 디스플레이 스크린, 재충전가능 배터리, 및 전극 보드를 삽입하기 위한 카드 에지 커넥터를 비롯한 다수의 컴포넌트를 하우징하고 있다. 이 소형화된 디바이스는, 전류들을 측정하고 미리 로드된 룩업 테이블들 따라 알레르겐 농도들을 디스플레이하는, 독립형 유닛이다.
도 34에 도시된 바와 같이, iEAT 판독기는 전위 제어를 위한 디지털-아날로그 변환기 및 신호 디지털화를 위한 아날로그-디지털 변환기에 연결하는 커스텀 설계된 정전위기들을 포함하였다. MCU는 작동 전극과 기준 전극(R) 사이에 정전위를 유지하면서 작동 전극(W)으로부터 카운터 전극(C)으로의 전류를 측정하도록 프로그램되었다. 이 회로는 단일 전극 또는 전극들의 어레이를 수용하도록 설계되었다. 단일 전극의 경우, 전기적 접촉이 카드 에지 커넥터의 상부 측면에서 일어났고; 다중 채널 어레이의 경우, 접촉이 카드 에지 커넥터의 하부 측면을 통해 일어났다. iEAT 판독기는 동작 모드(예컨대, 단일 또는 다중 채널)를 자동으로 감지하였다. 다중 채널 검출의 경우, MCU는 멀티플렉서를 통해 전극들을 순차적으로 폴링하였다.
우리는 페로시안화 칼륨[K4Fe(CN)6] 표준들을 사용하여 상용 벤치톱 정전위기(SP-200, Bio-Logic)에 대해 iEAT 성능을 벤치마킹하였다. 우리는 각각의 시스템에 대한 K4Fe(CN)6 교정 곡선(calibration curve)을 생성하였다. 다음에, 우리는 다양한 K4Fe(CN)6 농도들로 검사 샘플들을 측정하였고, 교정 곡선들로부터 그들의 농도들을 구하였다. 우리는 2개의 시스템 간의 우수한 매치를 관찰하였다(R2 = 0.995; 도 35를 참조). iEAT 판독기는 또한 양호한 정밀도를 보여주었다: 다섯 번의 반복 측정으로부터의 변동 계수(coefficient of variation: CV)는, 벤치톱 시스템으로 획득된 CV(4.9% 미만)와 비슷한, 4.1% 미만이었다. 그렇지만, iEAT 판독기는 벤치톱 시스템(38 x 21 x 17 cm3, 6 kg)보다 훨씬 더 작은 폼 팩터(5.5 x 2.5 x 2.4 cm3, 35 g)를 가졌으며, 8개의 병렬 측정을 할 수 있었다.
항원 추출
우리는 먼저 항원 추출 프로토콜을 최적화하였다. 우리의 목표는 회수 수율(recovery yield)을 최대화하면서 추출 시간 및 비용 둘 다를 최소화하는 것이었다. 우리는 5 가지 주요 단백질 항원을 추출 표적들로서 사용하였다: 글리아딘(gliadin)(밀), Ara h1(땅콩), Cor a1(헤이즐넛), 카세인(casein)(우유), 및 난알부민(ovalbumin)(달걀 흰자위). 기지의 양(10 ppm)의 단백질을 백미에 스파이크하는 것에 의해 모의 식사(mock meal)가 준비되었다. 우리는 3 개의 추출 완충액을 테스트하였다: 2-메르캅토에탄올(2-ME), 구아니딘으로 보강된 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀(TECP/GUA) 및 N-라우로일사르코신을 갖는 TECP(TECP/사르코실). 2-ME 환원 완충액은 고도로 가공된 식품으로부터 단백질을 추출하는 데 흔히 사용되지만 강한 냄새를 갖는다. 우리는 잠재적인 사용자 친화적 대안들로서 TECP 기반 환원제들을 준비하였다.
주어진 추출 완충액에 대해, 우리는 인큐베이션 시간 및 온도를 변경하였고, 우리는 회수 수율을 모니터링하였다. 도 36a는 2-ME 완충액을 이용한 예시적인 Ara h1 추출을 도시하고 있다. 추출은 실온에서도 효율적이었고; 2 분의 인큐베이션 이내에 60% 초과의 항원들이 회수되었다. 추출 수율들은 온도에 따라 증가하였다. 예를 들어, 전자레인지(1100W)에서 20 초의 가열 이후에, 추출 완충액에서의 1 분의 인큐베이션으로 수율들이 80%로 증가하였다. 3개의 추출 완충액 모두는 5개의 검사된 항원에 대해 유사한 성능을 나타냈다(도 36b 및 도 36c를 참조). 우리는 따라서 무취의 저렴한 TECP/사르코실 추출 완충액을 사용하기로 하였다(표 1을 참조).
* VITAL(Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling)에 의해 한 세트의 조치 레벨(action level)들이 생성되었다. 조치 레벨 1은 식품 제조업체들에 대한 라벨링(labeling) 또는 표시(declaration)를 필요로 하지 않는다.
우리는 또한 추출 프로세스를 가속화시키기 위해 소형 가열 디바이스(도 37을 참조)를 제작하였다. 추출 조건이 ~60 ℃에서 2 분 인큐베이션으로 설정되었다.
측정
미리 결정된 항원들을 포획하기 위해, 우리는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)들을 자성 비드들에 접합시키는 것에 의해 면역자성 비드들(직경이 2.8 μm임)을 준비하였다. 대조군 비드들은 아이소타입 매칭된 IgG 항체들에 접합되었다. 땅콩 알레르겐 적정을 사용하여 결정된, 최적의 비드 농도는 ~ 8 x 106 비드/mL였다(도 38a를 참조). 땅콩 알레르겐(Ara h1)에 특이적인 자성 비드들이 20 ppm Ara h1을 검출하는 데 사용되었다. 107 mL-1 초과의 비드 농도들은 신호 포화를 가져왔다. 최적의 비드 농도는 8 x 106 mL-1로 설정되었다. 다른 알레르겐들에 대해 유사한 실험들이 반복되었다. 데이터는 중복 측정들로부터의 평균 ± s.d.로서 보여진다.
식품 추출물들과 함께 실온(3 분)에서의 배양 이후에, 비드들이 피복된 자석을 이용해 수집되고 세척을 위해 새 완충액으로 이송되었다. 이어서, 비드들이 (실온에서 3 분) HRP-접합된 항체로 표지되고, 세척되며, 신호 발생을 위해 TMB와 혼합되었다. 환원 전위(-0.1 V)가 인가된 후 60 초 이내에 전류가 안정화되었다(도 38b의 동적 전류 응답들을 참조). 50 초와 60 초 사이의 측정된 신호가 평균화되었다. 배경과 표적 샘플(targeted sample) 사이의 순 전류 차이가 분석 척도(analytical measure)로서 사용되었다. 우리는 따라서 50 초와 60 초 사이의 전류 레벨을 평균화하도록 iEAT 판독기를 프로그램하였다. 대조군 비드들로부터의 전류 레벨들은 상이한 알레르겐들에 걸쳐 약 -110nA였고, 표적 샘플과 배경 간의 전류 차이는 순 신호로서 정의되었다. 알레르겐 추출을 포함한, 총 어세이 시간은 10 분 미만이었다.
시약 보관 및 수송을 용이하게 하기 위해, 우리는 면역자성 비드들 및 항체들을 추가로 동결건조시켰다. 우리는 상이한 동결건조 배지들(PBS, 수크로스(sucrose)) 및 보관 조건들(냉동, 실온)을 테스트하였다. 시약 활동들에는 유의한 차이들이 없었으며; 모든 동결건조된 시약들이 4 주의 보관 이후에 그들의 활성(> 96%)을 유지하였다(도 39a 및 도 39b를 참조). 도 39b와 관련하여, 면역자성 비드들 및 검출 항체들이 PBS 또는 수크로스 중에서 동결건조되었다. 동결건조된 제품들이 실온에서 또는 4 ℃에서 보관되었고 10 ppm의 땅콩 알레르겐을 검출하는 데 사용되었다. 시약들은 부형제 유형(excipient type) 및 보관 조건들에 관계없이 그들의 활성을 유지하였다. 모든 측정들이 두 번 이루어졌으며, 데이터는 평균 ± s.d.로서 디스플레이된다. 입수 용이성(ready availability)을 고려하여, 우리는 PBS를 부형제로서 선택하였고, 사용의 편의를 위해, 우리는 보관된 동결건조된 시약들의 주변 조건들을 선택하였다.
분석 성능
우리는 다음에, 표적 알레르겐 투여량(target allergen dose)을 변화시키면서, 반응 곡선들을 생성하였으며(Ara h1에 대해서는 도 40a를 그리고 다른 것들에 대해서는 도 40b를 참조); 이 곡선들은 iEAT 판독기에 룩업 테이블들로서 로드되었다. iEAT 어세이는 매우 민감하고, 정확하였으며 강건한 알레르겐 정량(allergen quantification)을 가능하게 해주었다. 
(여기서 σ와 m은, 제각기, 표준 편차와 교정 곡선의 기울기임)로서 정의된, 검출 한계(LOD)는 유발 투여량(eliciting dose: ED) 문턱값들보다 220배 초과 더 낮았다(표 1을 참조). 6개의 똑같은 것(duplicate)에 대해 3 가지 상이한 표준 농도(1, 5 및 10 ppm)를 측정하는 것에 의해 추정된, 어세이내 변동(intra-assay variation)들은 5% 미만이었고(도 40c를 참조), 어세이간 변동(inter-assay variation)들은 5% 미만이었다. 비교를 위해, 우리는 또한 동일한 샘플들을 ELISA에 의해 검사하였다. iEAT 결과들은 ELISA 측정들과 밀접한 상관관계를 보였다(도 40d를 참조, R2 = 0.995). 그렇지만, iEAT 어세이가 훨씬 더 빨랐다(ELISA에 대한 2 시간 대비 10 분). 어세이 특이도(assay specificity)를 검사하기 위해, 우리는 표적 프로브(target probe)들을 상이한 알레르겐 표준들(5 ppm)에 적용하였다. 도 43e에 도시된 바와 같이, 특이적 신호들이 비표적 샘플들보다 20배 초과 더 컸다.
현장 검사(Field Testing)
우리는 다음에 iEAT 플랫폼을 소비자 식품 제품들을 검사하는 데 적용하였다. 우리는 포장된 주요 식품들(빵, 우유, 시리얼)과 디저트들(쿠키, 아이스크림)의 패널을 먼저 검사하였다. 이전에 기술된 바와 같이, 식품의 작은 부분들(~1 g)이 2 분에 걸쳐 프로세싱되었고, 글리아딘, Ara h1(땅콩), Cor a1(헤이즐넛), 카세인(우유), 및 난알부민(달걀 흰자위)에 대한 추출물들이 어세이되었다. 프로파일링 결과들이 도 41a에 요약되어 있다. 예상대로, 특정의 라벨링(예컨대, "글루텐 프리", "너트 프리")을 갖는 제품들은 열거된 알레르겐이 대체로 없었다. 그렇지만, 대부분의 제품들에는 적어도 하나의 명시되지 않은 항원이 들어 있었으며; 예를 들어, 너트 프리 쿠키들의 브랜드들에는 글루텐이 들어 있었던 반면, 글루텐 프리 브랜드에는 땅콩 알레르겐이 들어 있었다.
우리는 다음에 식당들로부터 획득된 식품들(버거, 드레싱을 갖는 샐러드, 피자, 및 맥주)을 어세이하였다. 프로파일링 결과들(도 41b를 참조)은, 햄버거 및 피자 내의 글루텐과 같은, 예상된 알레르겐들을 나타내었지만, 우리는 식품 가공에 의해 기여된 예기치 않은 항원들도 검출하였다. 예를 들어, 샐러드에는, 아마도 샐러드 드레싱으로부터의, 글루텐이 들어 있었다. 우리는 또한 맥주에서 난알부민과 카세인을 확인하였는데, 이는 거품 특성들을 개선시키기 위해 달걀 흰자위가 사용되고 양조 과정에서 맥주를 안정화시키는 데 카세인이 사용되기 때문에 전혀 놀랄 일이 아니다.
스마트폰과 iEAT의 인터페이스를 이용하여, 우리는 개인 음식 섭취를 추적하여, 항원들 데이터를 시간 스탬프들과 함께 클라우드 서버에 기록하였다(도 41c를 참조). 일 예로서, 우리는 7개의 지역 식당으로부터의 글루텐 프리 메뉴 항목들을 조사하였고 결과들(예컨대, 식품 이름, 글루텐 함유량)을 로케일 정보와 함께 로깅하였다. "글루텐 프리" 항목들 중에서, 우리는 광범위한 항원 레벨들(1ppm 내지 100 ppm 초과)을 관찰하였고; 3개의 항목은 규제 한도를 훨씬 초과하는 글루텐을 가졌다(도 41d의 좌측을 참조). 이 결과들은 이어서 증거 기반 식당 지도를 만드는 데 사용되었다(도 41d의 우측을 참조). 이 지도들은 공유되고 개인화를 위해 다른 항원들을 포함하도록 확장될 수 있다.
재료들
하기의 화학적 및 생화학적 시약들이 받은 대로 사용되었다: 초상자성 비드들(6.7 x 107 비드/mg, Dynabeads® M-270 Epoxy, Invitrogen); 소혈청알부민(≥98%, BSA, Sigma); 난알부민(OVA, InvivoGen), 밀로부터의 글리아딘(Sigma); 소 우유로부터의 카세인(Sigma); 황산(IN, Fluka); Pierce® 고 민감도 스트렙타비딘-서양고추냉이 과산화효소(strep-HRP, Thermo Scientific); 모노클로날 쥐 IgGi (1.0 mg/mL, Ancell); 모노클로날 쥐 IgG2a (1.0 mg/mL, Ancell); 글리아딘 펩티드 항체(14D5, 1.0 mg/mL, 모노클로날 쥐 IgG2a, Enzo Life Sciences); 항-글리아딘 항체(15.5 mg/mL, HRP에 접합됨, 폴리클로날 토끼 IgG, abeam; MIoBS의 글리아딘 ELISA 키트로부터 HRP에 접합됨; 난알부민 항체(6C8, 0.98 mg/mL, 모노클로날 쥐 IgG1, Thermo Fisher); 항-OVA 폴리클로날 항체(MIoBS의 달걀 난알부민 ELISA 키트로부터 HRP에 접합됨; 자연적으로 정제된 Arachis hypogaea 알레르겐(땅콩 단백질 Ara h1, Indoor Biotechnologies); 항-Ara h1 항체(2C12, 2.7 mg/mL, 모노클로날 쥐 IgG1, Indoor Biotechnologies); 비오틴화된 항-Ara h1 항체(2F7, 모노클로날 쥐 IgG1, Indoor Biotechnologies); 땅콩 표준(Diagnostic Automation, Inc.), 토끼 항-소 카세인 폴리클로날 항체(2 mg/mL, AGRO-BIO); 항-카세인 폴리클로날 항체(MIoBS의 카세인 ELISA 키트로부터 HRP에 접합됨); 헤이즐넛 단백질 표준(RIDASCREEN® 헤이즐넛 ELISA 키트 및 Diagnostic Automation, Inc.); 헤이즐넛 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청(항-헤이즐넛 항체, Accurate Chemical & Scientific Corporation); HRP-접합된 항-헤이즐넛 항체(RIDASCREEN® 헤이즐넛 ELISA 키트); 수크로스(≥99.5%, Sigma); 1-Step ultra 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 기질 용액(Thermo Scientific); 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris-HCl, ≥99%, Sigma); 2-메르캅토에탄올(2-ME, ≥99%, Aldrich); 구아니딘 하이드로클로라이드(GUA, ≥99%, Sigma); 도데실 황산나트륨(SDS, ≥99%, Sigma- Aldrich); N-라우로일사르코신 (≥95%, Sigma); 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, ≥98%, Aldrich); Tween 20 (Sigma) 및 페로시안화칼륨(≥98.5%, Sigma- Aldrich). 달리 언급되지 않는 한, 모든 용액들은 25 ℃에서 준비되었고, 18.2 MΩ.cm의 전기 저항률을 갖는 초순수(ultrapure water)를 사용하였으며, 4 ℃에서 보관되었다.
iEAT 판독기의 제조
키체인 검출기(5.5 x 2.5 x 2.4 cm3)가 마이크로컨트롤러 유닛(MCU, ATSAMD21G18, Atmel Corporation) 주위에 제작되었다. 디지털-아날로그 변환기(DAC8552, Texas Instruments)가 기준 전극과 작동 전극 사이의 전위를 설정하는 데 사용되었다. 전류 측정들을 위해, 디지털-아날로그 변환기(ADS1115, Texas Instruments)와 정전위기가 MCU의 주변 인터페이스에 연결되었다. 정전위기는 2개의 연산 증폭기(AD8608, Analog Devices)를 포함하였다: 하나의 증폭기는 작동 전극과 기준 전극 사이의 전위차를 유지하고, 다른 하나는 전류를 전압 신호로 변환하기 위한 트랜스임피던스 증폭기로서 작동한다. 다른 주변기기들은 외부 디바이스들과의 블루투스 연결을 위한 통신 모듈(Bluefruit EZ-Link), 디스플레이 모듈, 및 재충전 배터리를 포함한다.
스마트폰 애플리케이션
MIT App Inventor 2를 사용하여, 우리는 시스템 동작 및 데이터 기록을 용이하게 하기 위한 Android 애플리케이션을 만들었다. 이 애플리케이션은 사용자들이 디바이스를 제어하고, 샘플 사진을 촬영하며, 측정 상세들(시간 스탬프들, 현재 값, 추정된 분석물 농도 및 GPS 위치)을 기록할 수 있게 해주었다. 데이터는 클라우드 스토리지(Google Drive)에 저장되었다.
항체-태깅된(Antibody-Tagged) 면역자성 비드들(Ab-MB들)의 준비
자성 비드들(~3.4 x 108)이 1 mL 인산나트륨 완충액에 재현탁되었다. 비드 용액이 잠시 동안 볼텍싱되었고, 비드들이 자석을 위치시키는 것에 의해 수집되었다. 상청액이 폐기되었다. 이 세척 단계는 2 회 반복되었다. 다음에, 비드들이 인산나트륨 완충액 중의 1 M 황산암모늄을 갖는 ~100 μg 포획 항체 또는 기준 IgG와 혼합되었다. 총 부피가 300 μL이어서, 비드 농도를 ~1.1 x 109 비드/mL가 되게 하였다. 비드 침전(bead settling)을 회피하기 위해 비드 용액이 4 ℃에서 16 시간 동안 저속 틸트 회전를 이용해 인큐베이트되었다. 자성 비드들의 표면 에폭시 기(surface epoxy group)들은 1차 아미노 기(primary amino group)들을 통해 항체들의 직접 공유 결합(direct covalent binding)을 가능하게 하였다. 그 후에, 코팅된 비드들이 수집되고 1 mL PBS로 3 회 세척되었다. 준비된 Ab-MB들은 이어서, 저장 용액(stock solution)으로서 사용된, 200 μL PBS, 1% BSA에 재현탁되었다.
면역자성 비드들 및 검출 항체의 동결건조
수크로스와 PBS는 Ab-MB들 및 항체들의 동결건조를 준비하는 데 사용되었다. 항체 농도에 대해 (PBS 중의) 일정 양의 300배 더 높은 몰 농도의 수크로스 또는 (수크로스를 제조할 때와) 동일한 부피의 PBS 용매가 Ab-MB 또는 항체 저장 용액에 첨가되었다. 혼합물이 액체 질소에서 동결되었고 이어서 VirTis Freezemobile 25EL Freeze Dryer(SP Scientific)에서 건조되었다. 동결건조된 시약들은 실온에서 또는 4 ℃에서 보관되었고, 사용 이전에 200 μL의 초순수 증류수(ultrapure distilled water)를 첨가하는 것에 의해 재구성되었다.
항원 표준들
우리는 백미 가루를 모델 식품 매트릭스(model food matrix)로서 사용하였다. 균일하게 혼합된 용액을 만들기 위해 1.0 g의 쌀가루가 10 mL의 PBS에서 제조되고 끓여졌다. 우리는 이어서 5 가지 알레르겐(글리아딘, Ara hi, Cor al, 카세인, 난알부민) 각각을 쌀 용액에 첨가하였다.
추출 완충액들:
3 가지 추출 완충액이 제조되었다: (1) 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween®20, 250 mM 2-ME, 2M GUA, 1% SDS, pH 7.4; (2) 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween®20, 20mM TCEP, 2M GUA, pH 7.4; (3) 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween®20, 5 mM TCEP, 2% N-라우로일사르코신, pH 7.4.
식품 샘플 준비
식품 샘플들이 지역 슈퍼마켓들 및 식당들로부터 획득되었다. 식품 샘플들(~ 1 g)이 작은 조각들로 절단되고 19 mL의 추출 완충액과 혼합되었다. 알레르겐 추출 이후에, 상청액이 후속 iEAT 검출을 위한 샘플 추출물로서 취해졌다. 샘플에서의 알레르겐의 양은 20 희석 배수(dilution fold)를 곱하는 것에 의해 복귀(revert)되었다.
iEAT 어세이
20 μL의 식품 추출물이 50 μL의 Ab-MB 용액과 혼합되고 실온에서 3 분 동안 인큐베이트되었다. 세척을 위해, 유리 피복된 자성 바를 사용하여 비드들이 수집되고 PBS(100 μL)에 방출되었다. 비드들이 이어서, 앞서 기술된 바와 같이, HRP-접합된 항체들(10 μL)과 함께 3 분 동안 인큐베이트되고 세척되었다. HRP-비드 복합체가 TMB 기질과 혼합되고 전극 상에 로드되었다. 1 분 후에, 크로노암페로메트리 측정이 시작되었다. 50 초와 60 초 사이의 전류 레벨들이 평균화되었다.
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
저장 포획 항체(stock capturing antibody) 및 기준 IgG 항체가 탄산염-중탄산염 완충액(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에서 ~3 μg/mL로 희석되고 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션을 위해 96-웰 폴리스티렌 멸균 평면 바닥 마이크로플레이트들(100 μL/웰)에 첨가되었다. 코팅된 플레이트들이 비결합 항체를 제거하기 위해 0.05% Tween 20 (PBST)을 갖는 PBS로 3 회 세척되었다. 이어서, 비점유 결합 사이트(unoccupied binding site)들을 블로킹하기 위해 1% BSA를 갖는 PBS가 첨가되었다(100 μL/웰). 플레이트들이 PBST로 3 회 헹구어졌다. 알레르겐 표준들 및 샘플 추출물들이 실온에서 1 시간 인큐베이션을 위해 두 번 플레이트 웰들에 분배되었다(100 ml/웰). 플레이트들이 PBST로 3 회 세척되었다. 이어서 100μL 분액의 비오틴화된 검출 항체가 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이트되었다. PBST로 3 회 세척한 후에, 100 배 희석된 strept-HRP 용액이 실온에서 30 분 동안 채워졌다(100 μL/웰). 플레이트들이 PBST로 3 회 헹구어졌다. 100 μL의 TMB 기질을 첨가하는 것에 의해 화학발광 신호가 나타났다. 실온에서 10 분의 인큐베이션 이후에, 효소 반응을 정지시키기 위해 100 μL의 황산(1N)이 각각의 웰에 첨가되었다. 각각의 웰의 광학 흡광도(optical absorbance)가 450 nm에서 플레이트 판독기(TECAN)를 사용하여 측정되었다.
통계 분석
획득된 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로서 제시되었다. 통계 분석들이 GraphPad Prism 6을 사용하여 수행되었다. 0.05 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주되었다.
고찰
우리는 다수의 식품 항원을 민감하게 검출하고, "안전한" 식품들을 인가(clear)하며, 불필요한 회피를 제거하고, 따라서 소비자들에게 권능을 부여하는 POC(point-of-care) 식품 검사 시스템(iEAT)을 개발하였다. 우리는 식품 산업, 식품 반응 클리닉들 및 규제 기관들에 의해 사용되는 시스템을 추가로 구상하고 있다. 전기화학 반응에 기초한, 신호 검출은 빠르고, 확장가능하며, 콤팩트한 전자 디바이스들에 아주 적합하고 멀티플렉싱이 가능하다. 우리는 키체인 판독기를 또한 무선으로 충전될 수 있고 클라우드와 블루투스 통신을 가능하게 해줄 수 있는 독립형(standalone)으로서 동작가능하도록 프로토타이핑하였다. 이 디바이스는 상대적으로 저렴하고, 어세이 비용은 현재의 디바이스에서 항원당 ~ 3 달러였다. 스케일-업(scale-up) 및 동결건조된 키트들을 생산할 수 있는 것에 의해, 우리는 이 비용들이 상당히 감소할 것으로 기대한다. 이 특징들에 의해, iEAT 시스템은, 저렴하고(affordable), 민감하며(sensitive), 특이적이고(specific), 사용자 친화적이며(user-friendly), 신속하고 강건하며(rapid and robust), 장비가 필요 없고(equipment free)(즉, 대형 전기 의존적 기기들이 없는) 인도가능한(deliverable) 것으로서 정의되는, 사용 시점(point-of-use) 디바이스들에 대한 WHO 가이드라인인 ASSURED와 밀접하게 부합한다.
우리는 소비자 식품들에서 흔히 발견되고 대부분의 식품 반응들의 원인이 되는 5 가지 대표적인 모델 항원을 정량화하기로 하였다. 이 항원들이 원리 증명(proof-of-principle)을 위해 선택되었지만, 그 중에서도 특히, 갑각류(새우, 바닷가재), 지느러미가 있는 어류(참치, 연어), 나무 견과류(호두, 피칸, 캐슈), 꽃가루 및 과일들과 같은 다른 많은 잠재적 항원들이 남아 있다. 이들 및 다른 알레르겐들을 검출 리스트에 추가하는 것은 상대적으로 간단할 것이다. iEAT 판독기는 단일 및 다중 채널 전극 둘 다를 특징으로 하며, 후자는 8 가지 알레르겐을 동시에 측정할 수 있다. 순차적 측정들 또는 채널 수를 확장하는 것 둘 다는 보다 광범위한 검사를 가능하게 하는 실시가능한 방법들이다.
우리가 특이적 단백질 항원들에 중점을 두었지만, 현재의 어세이 포맷이 또한 친화성 리간드들(예컨대, 앱타머들, 올리고뉴클레오티드들)을 변경하는 것; 식품 안전(예컨대, 살충제들)에 대한 그리고 식품 출처 식별(예컨대, DNA 기반 검사)에 대한 검출 패널들을 생성하는 것에 의해 저분자들, 독소들 또는 핵산들을 검출하도록 수정될 수 있다. 이 디바이스는, 식품 원산지들을 검증하거나, 오염 물질들의 부존재를 확인하는 것, 종교적 목적으로 음식 제한들을 지원하는 것과 같은, 많은 흥미로운 적용분야들을 가질 수 있다. 이들 및 다른 적용분야들은, 예를 들어, 샘플 프로세싱을 단순화하기 위해 일회용 유체 카트리지들을 개발함으로써 시스템 통합을 통해 더욱 향상될 수 있다. 특정 적용분야에 관계없이, 우리는 휴대용 iEAT 기술이 식품 제품들에 대한 보다 엄격하고 증거 기반의 분석을 가능하게 하고, 소비자 보호를 향상시키며, 우발적인 알레르기 노출을 감소시키고, 우리의 식품 공급망의 문제점들을 식별할 것으로 생각하고 있다.
다른 실시예들
본 명세서가 많은 상세들을 포함하고 있지만, 이들이 청구될 수 있는 것의 범주에 대한 제한으로서 해석되어서는 안되고 오히려 특정의 예들에 특정적인 특징들에 대한 설명으로서 해석되어야 한다. 개별적인 구현들과 관련하여 본 명세서에 기술되는 특정 특징들이 또한 조합될 수 있다. 이와 반대로, 단일의 구현과 관련하여 기술되는 다양한 특징들이 또한 다수의 실시예들에서 개별적으로 또는 임의의 적당한 부분조합(sub combination)으로 구현될 수 있다.
다수의 실시예들이 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어남이 없이 다양한 수정들이 행해질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 그에 따라, 다른 실시예들이 이하의 청구항들의 범주 내에 속한다.
Claims (37)
- 표적 분석물 검출 디바이스로서,
정전위기(potentiostat) 및 상기 정전위기에 커플링된 마이크로컨트롤러를 포함하는 하우징;
기판의 제1 표면 상에 복수의 전극을 포함하는 상기 기판 - 상기 복수의 전극의 제1 전극 세트는 제1 샘플 검출 영역을 정의하고, 상기 기판은, 상기 기판을 상기 하우징에 부착시킬 때 상기 제1 전극 세트가 상기 정전위기에 커플링되도록, 상기 하우징에 분리가능하게 부착가능함 -; 및
상기 기판의 제2 표면에 커플링가능한 자석 어셈블리 - 상기 자석 어셈블리는, 상기 자석 어셈블리를 상기 기판에 커플링시킬 때 자석으로부터의 자기장이 상기 기판 및 상기 제1 전극 세트를 통해 상기 제1 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록, 상기 자석 어셈블리에 배치된 상기 자석을 포함함 -
를 포함하는, 디바이스. - 제1항에 있어서, 상기 하우징은:
디지털-아날로그 변환기(DAC) 회로 - 상기 DAC의 출력은 상기 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링됨 -;
아날로그-디지털 변환기(ADC) 회로 - 상기 ADC 회로의 입력은 상기 정전위기의 출력에 커플링됨 -; 및
상기 DAC 회로에 그리고 상기 ADC 회로에 전기적으로 커플링된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 전압 신호를 상기 DAC 회로의 입력에 제공하도록 구성되고, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 ADC 회로의 출력으로부터 측정 신호를 수신하도록 구성됨 - 를 추가로 포함하는, 디바이스. - 제2항에 있어서, 복수의 정전위기를 추가로 포함하며,
상기 복수의 전극은 적어도 하나의 부가 전극 세트를 포함하고, 각각의 전극 세트는 상기 복수의 정전위기의 상이한 각자의 정전위기에 커플링가능하며, 각각의 전극 세트는 상이한 대응하는 샘플 검출 영역을 정의하는, 디바이스. - 제3항에 있어서, 상기 복수의 정전위기의 각각의 정전위기의 출력에 전기적으로 커플링된 멀티플렉서를 포함하고, 상기 멀티플렉서는 선택된 출력을 상기 ADC 회로의 상기 입력에 전기적으로 커플링시키도록 구성되는, 디바이스.
- 제3항에 있어서, 상기 기판의 표면 상에 배열된 웰 플레이트(well-plate) - 상기 웰 플레이트는 복수의 웰(well)을 포함함 - 를 포함하며, 상기 복수의 웰의 각각의 웰은 상이한 대응하는 샘플 검출 영역 바로 위에 배열되는, 디바이스.
- 제3항에 있어서, 상기 자석 어셈블리는 복수의 자석을 포함하고, 상기 복수의 자석의 각각의 자석은 상기 기판에 인접하여 배치되고, 상기 자석 어셈블리를 상기 기판에 커플링시킬 때 상기 대응하는 전극 세트와 정렬되어, 자기장이 상기 자석으로부터 상기 기판 및 대응하는 전극 세트를 통해 상기 대응하는 전극 세트에 의해 정의된 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록 하는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 기판은 카드 에지 커넥터(card-edge connector)를 포함하고, 상기 디바이스는 카드 에지 커넥터 리셉터클(card-edge connector receptacle)을 추가로 포함하는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 디바이스는 전자 통신 인터페이스를 추가로 포함하는, 디바이스.
- 제8항에 있어서, 상기 전자 통신 인터페이스는 적어도 하나의 유니버설 직렬 버스 커넥터(universal serial bus connector) 또는 무선 트랜시버(wireless transceiver)를 포함하는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 전극 세트는 3개의 개별 전극을 포함하는, 디바이스.
- 제10항에 있어서, 상기 3개의 개별 전극 중 제1 전극 및 제2 전극은 제1 금속이고, 상기 3개의 개별 전극 중 제3 전극은 제2 금속인, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 전극 세트는 2개의 개별 전극으로 이루어져 있는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 전극 세트는 서로 맞물린 전극(interdigitated electrode)들을 포함하는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 하우징은 상기 마이크로컨트롤러에 커플링된 전원(power supply) 및 트랜시버를 추가로 포함하는, 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 마이크로컨트롤러에 커플링된 디스플레이를 추가로 포함하는, 디바이스.
- 제1 유체 샘플에서의 표적 분석물의 존재를 검출하는 방법으로서,
복수의 자성 비드(magnetic bead)를 제1 유체 샘플에 제공하는 단계 - 상기 복수의 자성 비드는 상기 표적 분석물에 특이적으로 결합(specifically bind)하는 제1 결합 모이어티(binding moiety)들을 포함함 -;
상기 복수의 자성 비드가 상기 제1 유체 샘플 내의 상기 표적 분석물에 결합할 수 있게 해주는 단계;
상기 자성 비드들을 상기 제1 유체 샘플로부터 제2 유체 샘플로 이송(transfer)시키는 단계 - 상기 제2 유체 샘플은 상기 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 결합 모이어티들을 포함하고, 상기 제2 결합 모이어티들은 반응성 효소에 결합되며,
상기 자성 비드들을 이송시키는 단계는
시스(sheath)를 상기 제1 유체 샘플 내에 침지시키는 단계,
상기 자성 비드들이 상기 시스에 부착되도록, 상기 제1 유체 샘플 내에 침지된 상기 시스 내에 자석을 위치시키는 단계,
상기 자석을 포함하는 상기 시스를 상기 제1 유체 샘플로부터 제거하는 단계, 및
상기 자석을 포함하는 상기 시스를 상기 제2 유체 샘플에 침지시키는 단계를 포함함 -;
상기 제2 유체 샘플 내의 상기 제2 결합 모이어티들이 상기 자성 비드들의 상기 제1 결합 모이어티들에 결합된 상기 표적 분석물에 결합할 수 있게 해주는 단계;
제3 유체 샘플을 획득하기 위해 상기 복수의 자성 비드 및 상기 제2 결합 모이어티들을 포함하는 상기 제2 유체 샘플을 전자 매개체 용액(electron mediator solution)과 화합(combine)시키는 단계;
상기 제3 유체 샘플을 기판의 샘플 검출 영역에 제공하는 단계 - 상기 샘플 검출 영역은 제1 전극 상에 배열됨 -;
상기 제3 유체 샘플 내의 상기 복수의 자성 비드를 상기 제1 전극 옆에 유지하기 위해 상기 제3 유체 샘플을 자기장에 노출시키는 단계 - 상기 제1 전극은 정전위기에 전기적으로 커플링됨 -;
상기 제3 유체 샘플 내의 전자 매개체들과 상기 반응성 효소 간의 산화-환원 반응을 유도하는 단계; 및
상기 제3 유체 샘플에서의 상기 표적 분석물의 존재를 결정하기 위해 상기 정전위기의 출력을 모니터링하는 단계 - 상기 정전위기의 상기 출력이 상기 산화-환원 반응에 의해 수정됨 -
를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 산화-환원 반응을 유도하는 단계는 상기 산화-환원 반응이 일어나도록 전위(electrical potential)를 제2 전극에 인가하는 단계를 포함하며, 상기 제2 전극은 상기 정전위기에 전기적으로 커플링되는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 정전위기의 상기 출력을 모니터링하는 단계는 상기 제1 전극으로부터의 전압 또는 전류를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 전극으로부터의 상기 전압 또는 전류는 상기 산화-환원 반응의 결과로서 변하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 정전위기의 상기 출력을 모니터링하는 단계는:
복수의 상이한 정전위기의 출력들 중에서 상기 정전위기의 상기 출력을 선택하는 단계;
상기 선택된 출력을 마이크로컨트롤러 유닛에 제공하는 단계; 및
상기 선택된 출력을 디스플레이 상에 제시하는 단계를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 반응성 효소는 서양고추냉이 과산화효소(HRP)를 포함하고 상기 전자 매개체 용액은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분석물은 세포외 소포(extracellular vesicle)들을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 세포외 소포들은 엑소좀들을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분석물은 CD24, EpCAM, CA125, EGFR, HER2, MUC1, CD44, CD44v6, CEA, 메소텔린(Mesothelin), Trop2, GPC1, WNT2, Grp94, SSTR2, EGFRv3, IDH1-R132, GPA33, KRAS, CD166, CD133, MET, B7H3, CD63, CD9, 및 CD81 바이오마커(biomarker)들 중 임의의 것을 포함하는, 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정전위기의 상기 출력이 기준 레벨 초과 또는 미만인지를 결정하기 위해 상기 출력을 상기 기준 레벨과 비교하는 단계;
상기 비교에 기초하여 환자 내의 암의 존재 또는 부존재(presence or absence)를 진단하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 표적 분석물은 면역 세포 마커들을 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 면역 세포 마커들은 CD2, CD3, CD45, CD52, HLA-ABC, CD81, CXCL10, 또는 CXCL9 바이오마커들을 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서,
상기 정전위기의 상기 출력이 기준 레벨 초과 또는 미만인지를 결정하기 위해 상기 출력을 상기 기준 레벨과 비교하는 단계; 및
상기 비교에 기초하여 환자가 장기 이식에 대해 거부반응을 보였는지 여부를 진단하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 제1 유체 샘플은 혈액 또는 소변을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분석물은 단백질, 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 독소, 핵산들, 미생물들, 식품 항원들, 또는 대사물을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 제1 유체 샘플을 제공하기 위해 식품 샘플을 추출 완충액(extraction buffer)과 화합시키는 단계;
상기 식품 샘플로부터 상기 표적 분석물을 추출하기 위해 상기 식품 샘플을 상기 추출 완충액과 함께 인큐베이트(incubate)하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 키트로서,
샘플 튜브;
샘플 튜브 캡;
제1 자석을 포함하는 가늘고 긴 바(elongated bar); 및
표적 분석물 검출 디바이스
를 포함하며, 상기 표적 분석물 검출 디바이스는
하우징,
상기 하우징 내의 정전위기,
복수의 전극을 포함하는 제1 기판 - 상기 복수의 전극은 제1 샘플 검출 영역을 정의하는 제1 전극 세트를 포함하고, 상기 제1 기판이 상기 하우징에 부착될 때 상기 제1 전극 세트가 상기 정전위기에 커플링하도록 상기 제1 기판은 상기 하우징에 분리가능하게 부착되도록 구성됨 -, 및
제2 자석으로부터의 자기장이 상기 기판 및 상기 제1 전극 세트를 통해 상기 제1 샘플 검출 영역 위쪽의 구역에 미치도록 상기 제1 기판에 인접하게 배치되도록 구성된 상기 제2 자석을 포함하는, 키트. - 제26항에 있어서, 상기 샘플 튜브 캡은 가늘고 긴 시스(elongated sheath) 내로 연장되는 개구부(opening)를 포함하고, 상기 가늘고 긴 바는 상기 가늘고 긴 시스 내에 피팅(fit)되도록 사이징(size)되는, 키트.
- 제26항에 있어서,
복수의 자성 비드를 포함하는 추출 완충 용액;
세척 완충 용액;
표적 분석물 완충 용액; 및
산화 효소 완충 용액
을 추가로 포함하는, 키트. - 제26항에 있어서, 상기 표적 분석물 검출 디바이스는:
디지털-아날로그 변환기(DAC) 회로 - 상기 DAC의 출력은 상기 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링됨 -;
아날로그-디지털 변환기(ADC) 회로 - 상기 ADC 회로의 입력은 상기 정전위기의 출력에 커플링됨 -; 및
상기 DAC 회로에 그리고 상기 ADC 회로에 전기적으로 커플링된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 전압 신호를 상기 DAC 회로의 입력에 제공하도록 구성되고, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 ADC 회로의 출력으로부터 측정 신호를 수신하도록 구성됨 - 를 추가로 포함하는, 키트. - 제26항에 있어서, 상기 표적 분석물 검출 디바이스는 디스플레이를 포함하는, 키트.
- 제26항에 있어서, 제2 샘플 검출 영역을 정의하는 부가의 복수의 전극을 포함하는 제2 기판을 추가로 포함하며, 상기 제2 기판은 상기 하우징에 분리가능하게 부착되도록 구성되는, 키트.
- 제31항에 있어서, 제3 자석을 추가로 포함하며, 상기 제3 자석은 상기 제2 기판에 분리가능하게 부착되도록 구성되는, 키트.
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