CN102095848A

CN102095848A - 一种免疫检测方法和装置

Info

Publication number: CN102095848A
Application number: CN2010105498975A
Authority: CN
Inventors: 吴坚
Original assignee: HANGZHOU ANYUAN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU ANYUAN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明涉及一种免疫检测方法，包括以下步骤：提供阵列，该阵列包括至少两对微电极；在所述阵列表面具有与被测成分对应的一抗抗体；将被测物和微磁球加至所述阵列的表面，所述微磁球上具有与一抗抗体对应的二抗抗体；对所述阵列表面进行洗板处理；向所述阵列表面加缓冲液，测量所述微电极之间的参数，通过分析所述参数，从而得到被测物中被测成分的含量。本发明还公开了一种实现上述方法的装置。本发明具有同时测量多成分、测量灵敏度高、测量装置简单等优点。

Description

一种免疫检测方法和装置

技术领域

本发明涉及一种免疫检测技术，尤其是采用阻抗阵列芯片同时进行多组分检测，并利用微磁球进行信号放大，利用外磁场的作用清除吸附磁球以降低背景信号。

背景技术

酶联免疫分析(ELISA)是一种常见的免疫方法，其利用一抗来实现被测目标的捕捉，同时利用偶联有酶标的二抗来实现信号检测。由于酶的催化放大作用，酶联免疫可以实现较为灵敏的检测，但是，酶是一生物物质，性能受很多因素影响，稳定性不是很好。同时，目前人们还主要通过一些光学的手段，如比色法、荧光法等对酶的催化底物或产物进行检测。光学检测虽然比较稳定，但是往往需要较为复杂的光学系统，从而使得检测一般只能在实验室中进行，限制了应用范围。

电化学检测通过电极在溶液中进行，其放大电路和信号调理也十分简单，因此在简化酶联免疫检测系统的研究中，是一种很有前途的技术。目前已经有很多利用电化学手段来进行免疫检测的报道。例如，在最常见的辣根过氧化物酶(HRP)标记体系中，就有报道利用底物TMB在酶催化反应后的电化学活性的变化通过电化学方波法来进行检测。也有些报道是利用铁氰化钾等电子传递剂来进行电化学酶联免疫检测。电化学检测有很多种模式，在这之中，特别是溶液阻抗测量，不受电极表面各种情况的影响，十分稳定。

在免疫反应中，利用溶液阻抗进行测量，其主要缺点是检测灵敏度较差。免疫反应只是在电极表面发生，也只能引起这附近溶液阻抗的变化，而实际所测试的是两电极间所有溶液的阻抗。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明提供了一种可测量多种成分、测量灵敏度高的免疫检测方法和装置。

一种免疫检测方法，包括以下步骤：

提供阵列，该阵列包括至少两对微电极；

在所述阵列表面具有与被测成分对应的一抗抗体；

将被测物和微磁球加至所述阵列的表面并进行反应，所述微磁球上具有与一抗抗体对应的二抗抗体；

对所述阵列表面进行洗板处理；

向所述阵列表面加缓冲液，测量所述微电极之间的参数，通过分析所述参数，从而得到被测物中被测成分的含量。

作为优选，相邻微电极的间距为1-1000微米。

作为优选，所述微磁球的直径为微米或纳米量级。

进一步，在所述微磁球加至阵列表面后，利用微磁球与其它元件间的力而使微磁球富集在阵列表面。

进一步，在洗板后，利用微磁球与其它元件间的力而吸走未反应的磁球。

作为优选，所述元件为磁铁。

进一步，所述阵列固定相同或不同的一抗抗体。

进一步，所述被测物和磁球是同时加至阵列的表面。

进一步，先将被测物加至阵列的表面，再将磁球加至阵列的表面。

作为优选，采用磷酸缓冲液。

作为优选，所述参数为阻抗。

为了实现上述方法，本发明还提出了这样一种免疫检测装置，所述检测装置包括：

阵列，该阵列包括至少两对微电极；

与被测成分对应的一抗抗体；

微磁球，所述微磁球上具有与一抗抗体对应的二抗抗体；

用于对所述阵列表面进行洗板处理的模块；

缓冲液；

用于测量所述微电极之间的参数的测量模块；

分析模块，用于分析所述参数而得到被测物中被测成分的含量。

作为优选，相邻微电极的间距为1-1000微米。

作为优选，所述微磁球的大小为微米或纳米量级。

进一步，所述免疫检测装置还包括磁铁。

更进一步，所述微电极设置在阵列的正面，磁铁设置在阵列的背面。

所述抗体是一种或多种。

作为优选，所述缓冲液采用磷酸。

作为优选，所述参数为阻抗。

本发明所采用的阵列由多个呈方形或矩形排列的电极组成，其相邻电极的间距在1微米至1000微米。通过外接的信号检测电路，每个电极可以和相邻的电极配合组成一个电化学电池，也可以和其他电极配合组成一个电化学电池，从而可以根据实际需要进行灵活配置，达到最大的检测灵敏度。

本发明总的技术构思为：在进行免疫测量前，首先需要根据实际测量的要求，在各个阵列表面固定上一抗抗体。针对被测溶液中的具体情况，电极阵列的不同区域可以固定上相同的抗体，也可以固定上不同的抗体。同时，将和所使用一抗抗体相对应的二抗抗体固定在微磁球上，所用微磁球的直径根据实际需要，可以在纳米直至微米量级。

在进行酶联免疫检测时，可以采用一步法或两步法，也就是可以同时将被测物和带二抗微磁球加至阵列表面；也可以先将被测物加至阵列表面，使其反应一定时间，然后再加入带二抗微磁球至阵列表面。在一步法和二步法中，当磁球加入后，在阵列的背面都放置一磁铁或电磁铁，从而富集磁球到阵列表面，加快反应速度。

在免疫反应结束后，首先按常规酶联免疫反应进行洗板，然后在阵列表面非常靠近处放置一磁铁或电磁铁，在磁场作用下吸走未反应磁球，从而降低背景信号。

最后，向阵列表面滴加低离子强度的磷酸缓冲液(＜0.1M)，并进行测量，得到结果。

采用本发明的方法，具有以下技术优势：

1)利用磁球的体积效应，增大了免疫阻抗检测中由于免疫反应所带来的阻抗变化，从而提高了检测灵敏度。

2)在免疫反应过程中，通过外加磁场的作用将带行二抗的磁球富集到阵列表面，从而加快可免疫反应速度。在免疫反应完成之后，通过外加磁场的作用清除吸附的磁球，降低了背景信号。

3)能够在电极阵列上固定与不同被测成分对应的一抗抗体，以及在磁球上固定与一抗抗体对应的二抗抗体，从而实现多种被测成分的检测。

附图说明

图1是本发明的免疫反应及阻抗检测示意图，1：电极，2：被测物质，3：带磁球二抗，4：固定在基板上的一抗。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

一种免疫检测装置，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，所述装置包括：

提供50x50的微电极阵列，相邻两电极的间距为5微米；

与沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7对应的一抗抗体；施加到微电极阵列的正面；

1微米的微磁球，所述微磁球上具有与上述一抗抗体对应的二抗抗体；

磁铁，当磁铁处于微电极阵列的背面时，有助于微磁球吸附在微电极阵列表面；当磁铁处于微电极阵列的正面时，有助于吸走没有反应的微磁球。

用于对所述阵列表面进行洗板处理的模块；

缓冲液；本实施例采用低离子强度的磷酸缓冲液。

用于测量所述微电极之间的参数的测量模块。本实施例中，测量的参数为阻抗。

分析模块，用于分析所述参数而得到被测物中沙门氏菌和大肠杆菌EcoliO157的含量。

一种免疫检测方法，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，所述检测方法包括以下步骤：

提供微电极阵列：在普通硅片上首先通过热氧化生成一氧化硅绝缘层，然后，通过真空蒸涂及光刻工艺形成50x50的微电极陈列，相邻两电极的间距为5微米；利用SU-8等类似材料再形成一绝缘层，并通过光刻将电极表面裸露；

将50x50电极阵列分成两个区域，在一个区域使用时，将另一个区域用光刻胶等手段保护，再分别利用生物素/亲和素法以及戊二醛等常见抗体固定方法，在芯片的两个区域分别固定沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7的一抗抗体；

在1微米的磁球上同定与上述一抗抗体对应的二抗抗体；将被测物和所述磁球同时施加到微电极阵列表面，在微电极阵列的背面放置磁铁，从而使微磁球富集在电极阵列表面，提高反应速度；如图1所示，当被测物中含有和抗体相对应的抗原物质时，磁球也被捕捉在芯片表面；

在免疫反应结束后，首先按常规酶联免疫反应进行洗板，然后在芯片表面非常靠近处放置磁铁或电磁铁，在磁场作用下吸走未反应的磁球，从而有效地降低了背景信号；

向微电极阵列表面滴加低离子强度的磷酸缓冲液(＜0.1M)，使用测量模块分别统计每个区域中各个相邻电极间的阻抗，并根据所滴加的磷酸缓冲液电阻值设定阈值，将高阻抗设为1，低阻抗归为0，每个区域中高阻抗的数目和沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7的浓度相关，利用这种关系得到沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7的浓度。

在上述测量中，虽然磁球中的氧化铁，特别是四氧化三铁是导体，但由于在二抗固定等阶段磁球表面已经包裹一层绝缘物质，所以，当磁球取代磷酸缓冲液出现在芯片表面，将增大所测得的溶液阻抗，从而实现测量。

实施例2：

一种免疫检测装置，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，与实施例1不同的是：

1、每对电极的间距在1微米。

一种免疫检测方法，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，与实施例1不同的是：

1、每对电极的间距在1微米。

实施例3：

1、每对电极的间距在1微米。

2、使用1纳米的磁球。

1、每对电极的间距在1微米。

2、使用1纳米的磁球。

实施例4：

1、在氧化铝基片上采用厚膜电极制作三对电极，每对电极的间距在800微米。

2、使用2微米的磁球。

2、其中两对电极上分别固定沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7的一抗抗体，另外第三对电极作为参照。

3、在2微米的磁球上固定对应二抗抗体。

4、根据所得阻抗值大于参照值的情况，及预先标定情况，确定沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7的浓度。

实施例5：

一种免疫检测装置，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，与实施例4不同的是：

1、每对电极的间距在400微米。

2、使用20微米的磁球。

一种免疫检测方法，用于检测沙门氏菌和大肠杆菌E coliO157：H7，与实施例4不同的是：

1、每对电极的间距在400微米。

2、在20微米的磁球上固定对应二抗抗体。

实施例6：

一种免疫检测装置，用于检测转基因杀虫晶体蛋白BT-Cry1Ab/1Ac，与实施例1不同的是：

1、在氧化铝基片上采用厚膜电极制作两对电极，每对电极的间距在800微米。

2、使用BT-Cry1Ab/1Ac的一抗抗体，该一抗抗体用于施加到其中一对电极上。

3、在磁球上固定与所述一抗抗体对应的二抗抗体。

一种免疫检测方法，用于检测转基因杀虫晶体蛋白BT-Cry1Ab/1Ac，与实施例1不同的是：

3、在磁球上固定与所述一抗抗体对应的二抗抗体。

4、根据所得阻抗值大于参照值的情况，及预先标定情况，确定BT-CrylAb/1Ac的浓度。

上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是，在免疫反应的原理上，利用阻抗测量对被测物进行检测，通过偶联在二抗上的微磁球对阻抗信号进行放大，通过外加磁场的作用来减少磁球吸附，降低背景信号。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明做出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种免疫检测方法，其特征在于：

提供阵列，该阵列包括至少两对微电极；

在所述阵列表面具有与被测成分对应的一抗抗体；

将被测物和微磁球加至所述阵列的表面，所述微磁球上具有与一抗抗体对应的二抗抗体；

对所述阵列表面进行洗板处理；

2.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：相邻微电极的间距为1-1000微米。

3.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：在所述微磁球加至阵列表面后，利用微磁球与其它元件间的力而使微磁球富集在阵列表面。

4.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：在洗板后，利用微磁球与其它元件间的力而吸走未反应的磁球。

5.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：所述阵列固定相同或不同的一抗抗体。

6.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：所述被测物和磁球是同时加至阵列的表面。

7.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于：所述参数为阻抗。

8.一种免疫检测装置，其特征在于：所述检测装置包括：

阵列，该阵列包括至少两个微电极；

与被测成分对应的一抗抗体；

微磁球，所述微磁球上具有与一抗抗体对应的二抗抗体；

用于对所述阵列表面进行洗板处理的模块；

缓冲液；

用于测量所述微电极之间的参数的测量模块；

9.根据权利要求8所述的免疫检测装置，其特征在于：所述微电极设置在阵列的正面，磁铁设置在阵列的背面。

10.根据权利要求8所述的免疫检测装置，其特征在于：所述参数为阻抗。