CN101317086A - 分析物的微观流体检测 - Google Patents

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Abstract

揭示了对用于微观流体器件的样品进行浓缩的装置和方法。所述方法涉及对带电分子电泳，使其从大体积样品转变成较小体积。所关心的分析物可以是带电分子，或者可以使用例如一种或多种离子性部分对所关心的分析物进行改性使其带电。

Description

分析物的微观流体检测
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请第60/723715号(于2005年10月4日提交)和第60/820566号(于2006年7月27日提交)的优先权，这两份申请的全部内容都通过参考结合于本文。
发明领域
本发明涉及微观流体技术以及对样品中低浓度分析物的检测。
发明背景
微观流体系统在临床实验室设备中具有极大的应用潜力。但是，由于这些设备的容量仅能容极小的样品体积，通常为等于或小于几个微升的量级，所以这些器件具有局限性。如果待分析的物质在样品中的浓度非常低，则灵敏度就受到限制。克服这种限制的一种方法是，在将样品引入微观流体设备之前或之后使用分析物放大步骤，从而提高分析物的浓度。例如，可以使用PCR之类的方法对非常少量的核酸进行放大。但是，并非所有分析物都能进行放大，而且，即使可以进行放大，放大步骤也需要额外的试剂并且增加了分析的复杂程度。对于临床和其他实验室分析，那些能够以微观流体方式对大体积样品中的分析物进行分析、和/或不需要放大步骤就能进行分析的新方法将是有价值的。本发明满足了这些需要以及许多其他的需要。
发明概述
在一方面，本发明提供了通过以下步骤将样品中所关心的分析物引入或应用于微观流体器件的方法：在一个或多个大容量储存器中提供一种或多种含水样品，所述样品包含所述分析物并且样品体积大于10微升，使所关心的分析物带电或者使所关心的分析物与带电的分子缔合，所述带电的分子例如是离子性分子或是带电的载体分子；下一个步骤涉及提供一种包括分析区的微观流体器件，提供一种或多种连接器，其中大容量储存器和微观流体器件通过连接器流通连通，对从大容量储存器到微观流体器件的分析物进行电泳处理，并且以足够长的时间通过分析区，从而在分析区获得比大容量储存器中和/或样品中浓度更高的分析物浓度。所述大容量储存器可以是微型孔板、艾本德(eppendorf)管或试管。所述大容量储存器可以是与微观流体器件整合的孔。所述连接器可以是毛细管。在本发明的一个方面中，所关心的分析物是生物分子，例如肽、蛋白、核酸、类脂或糖。与得电的分子缔合的分析物可以是，例如，附着在离子性部分上的分析物，或附着在带离子性电荷的抗体上的分析物。
在本发明另一个方面中，首先将样品与抗体混合，所述抗体专一地与所关心的分析物结合。可以用至少一个离子性部分对抗体进行改性。或者，可以对所关心的分析物进行改性使其带电，例如用抗体或离子性部分对其进行改性。
在又一个方面中，所述分析区是俘获位置，所述方法涉及使带电的分子在俘获位置上移动，所述俘获位置包括至少一种能俘获所关心的分析物的俘获剂。在俘获区上的移动可以通过电泳进行。所述方法可以进一步包括对被俘获剂结合的分析物进行检测。所述俘获剂可以结合分析物或离子性部分。所述俘获剂可以是抗体或核酸。所述检测可以涉及对抗体上的标记物、对分析物、或对离子性部分进行检测。
在又一个方面中，所述方法涉及提供分段式储存器，使得大容量储存器和分段式储存器通过连接器连体连通。
在本发明的一个方面中，样品体积约为20微升至50毫升，优选50微升至20毫升。或者，样品体积大于约20微升，优选大于约50微升。
在本发明的一个方面中，所关心的分析物在电泳之前附着在微粒上。所述微粒可以是磁性微粒。优选所述微粒涂覆有对所关心的分析物为特异性的至少一种受体、抗体或反配体(anti-ligant)。所述方法可以包括在电泳之前从微粒上清除分析物的步骤。所述抗体可以识别分析物。可以提供第二抗体，所述第二抗体可以结合在分析物的不同位置上。所述检测可以涉及对第二抗体上的标记进行检测。
在又一个方面中，所述离子性部分可以在电泳之前的任何步骤中通过间接附着物实现附着。所述间接附着物可以是抗生物素蛋白/生物素附着物。
又一个方面是用于将样品中的带电分析物引入或应用于具有分析区的微观流体器件的系统，所述系统包括以可操作的方式与第一电极连接的至少一个大容量储存器、以可操作的方式与第二电极连接的至少一个分析区、以及用于将带电分子移出大容量储存器的至少一个连接器，其中所述大容量储存器和所述分析区的流体连通的。所述至少一个连接器可以是毛细管。所述微观流体器件可以包括分段式储存器，大容量储存器，大容量储存器通过连接器与分段式储存器流体连通。所述分析区可以包括俘获位置。所述系统可以包括多个与独立的分段式储存器流体连通的大容量储存器。
附图简要说明
图1示出对引入微观流体器件的样品进行浓缩的系统。
图2A-C示出用于浓缩分析物的系统的三种实施方式。图2A示出的实施方式中分析物蓄积于分段式储存器中。图2B示出的实施方式中分析物没有蓄积，但是存在从微观流体器件上流过并且通过分析区的连续流。图2C示出的实施方式中大容量储存器与微观流体器件整合。
图3示出能够检测各样品中的多种分析物的微观流体器件。
图4是说明本发明实施方式中，以离子性部分进行标记的抗体与所关心的分析物在大容量储存器(LVR)中结合并且形成络合物，该络合物通过电泳至微观流体器件的图。所述微观流体器件中附着有俘获剂(对所关心的分析物具有特异性但是能识别不同表位(epitope)的第二抗体)。
图5是说明的本发明实施方式中，使用结合有第一抗体(primary antibody)的微粒作为固定相来结合大容量储存器中的分析物的图。添加以离子性部分进行标记的第二抗体，该第二抗体也与所述分析物结合。使第一抗体裂解，从微粒上释放出分析物络合物，该络合物被电泳至分段式储存器中。使用对所述离子性部分具有特异性的俘获剂将络合物俘获至微观流体器件上。
图6示出与图5所示类似的实施方式，该实施方式中，所关心的分析物最初与微粒结合。使用生物素/抗生物素蛋白型键合使离子性部分附着于结合了微粒的抗体。使所述抗体裂解，从微粒上释放出分析物，通过电泳引入到微观流体器件。使用对所述分析物具有特异性的第二抗体将所述络合物俘获在所述微观流体器件上。
图7所示为检测血样中病毒核酸或蛋白的示范性测试的图表。将多个样品中的分析物传送(例如通过电泳)经过分析区中的多个检测位置。
发明详细说明
I.引入
微观流体学是设计、制造和使用能处理纳升或皮升量级体积的流体的器件和方法的科学。一般来说，微观流体器件具有至少一个维度的尺寸小于1毫米的至少一个通道或容器。所述器件可以具有至少一个维度的尺寸小于0.5毫米、0.2毫米或0.1毫米的至少一个通道或容器。微观流体器件还可以具有微型泵、阀、温度调节器等。
制造微观流体器件的一些方法和途径是已知的，包括微型装配、整体微型机械加工法、表面微型机械加工法、标准平版印刷法、湿法蚀刻、反应性离子蚀刻、等离子体蚀刻、立体光刻(sterolithography)和激光化学三维纪录法、软性平版印刷法、模块组装法、复制模塑法、注塑法、热模塑法、激光烧蚀法、它们的组合方法、以及本领域中已知的其他方法。可以对一些这样的途径进行调整用于本发明中，这是本领域技术人员显而易见的。对于微观流体器件的全面综述可参见例如，Chovan等，“Microfabricated devices in biotechnologyand biochemical processing”，Trends Biotechnol.，2002 20：116-22；Anthony等，“DNA array technology and diagnostic microbiology”，ExpertRev.Mol.Diagn.，2001 1：30-8；Windman等，“Microfluidics forultrasmall-volume biological analysis”，Adv.Chromatogr.，2003，42：241-67；Ng等，“Biochips beyond DNA：technologies and applications”，Biotechnol Annu Rev.，2003，9：1-149；Fiorini和Chiu，2005，“Disposablemicrofluidic devices：fabrication，function，and application”，Biotechniques，38：429-46；Beebe等，2000，“Microfluidic tectonics：a comprehensive construction platform for microfluidic systems”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：13488-13493；Rossier等，2002，“Plasma etchedpolymer microelectrochemical systems”，Lab Chip，2：145-150；Becker等，2002，“Polymer microfluidic devices”，Talanta，56：267-287；Becker等，2000，“Polymer microfabrication methods for microfluidic analyticalapplications”，Electrophoresis，21：12-26；US 6767706B2，例如6.8节，“Microfabrication of a Silicon Device”；Terry等，1979，A GasChromatography Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer，IEEE会刊，关于电子器件，ED-26版，第1880-1886页；Berg等，1994，Micro Total AnalysisSystems，New York，Kluwer；Webster等，1996，Monolithic Capillary GelElectrophoresis Stage with On-Chip Detector in International ConferenceOn Micro Electromechanical Systems，MEMS 96，第491496页；Unger等，2000，Science 288：113-16；美国专利6960437(Nucleic acid amplificationutilizing microfluidic devices)；Quake & Scherer，2000，“From microto nanofabrication with soft materials”，Science，290：1536-40；Becker等，2000，“Polymer microfabrication methods for microfluidic analyticalapplications”，Electrophoresis，21：12-26。本领域中还描述了适用于微观流体器件中的微电极。本领域中还描述了使蛋白、核酸或其他分子固定到器件表面上(例如在微观流体通道内)的方法。
微观流体器件(有时称为“芯片”)可以用于各种生物医学和制药应用中，包括分析、制备和合成化学化合物并且分析和操纵细胞、蛋白与核酸。小型化的优点包括显著降低试剂消耗、缩短反应时间、并且具有在大规模平行检测中获得很高检测量的潜力。但是，这种能够小型化的一个方面也成为限制这些方法的灵敏度的明显障碍。微观流体芯片只能处理微小体积的样品溶液，在应用于芯片的非常小体积中的分析物分子可能不足以进行检测。因此，经常在将样品引入器件之前或之后使用放大步骤(如PCR)来处理用于微观流体器件的样品。但是这种放大步骤的缺点是增加成本和复杂程度，并且可能由于PCR的错误而获得异常结果。将一些微观流体器件设计成通过将芯片的整个表面接触引入的样品溶液而接受体积略大的样品。由于使用整个芯片表面来接收样品，因此可以应用较大的样品体积，但是这仍然限制了可以处理的样品体积。而且，这导致一次检测一个样品的限制，需要对不同样品溶液进行依次测试。对于测试多个样品，这不仅是耗费时间的，还有造成样品间交叉污染风险的缺点。
本文揭示的方法和装置通过使用电泳来浓缩和/或控制分析物材料的传送，从而克服了微观流体器件体积容量小的限制，因此，可以使用这些方法和装置来促进反应或分析，并且用于典型的芯片格式中。对分析物进行电泳，无需使用尺寸排阻凝胶、粘性介质、过滤器、生物筛等就能使分析物通过缓冲水溶液。这些方法能够将多个样品应用于芯片上的多个特定区。由于各样品独立地进行电泳移动到芯片的不同部分中进行分析，所以各样品不会与相同表面发生接触。这具有减少交叉污染的优点。
本发明提供了用于对大体积样品中的一种或多种分析物进行微观流体分析的方法和器件。由于本文揭示的方法增大了器件的样品体积容量，所以降低了使用所述器件进行测试的最低可检测浓度(该测试能可靠测定的最低分析物浓度)。
本文描述的方法和装置使得研究者或医生能够从大体积样品中提取分析物，对分析物进行检测和鉴定。所述方法适用于多种分析物，包括特定蛋白和多聚核苷酸序列。除了能够在单个芯片上同时分析多种样品之外，所述方法的实施方式还能将大体积样品浓缩在芯片上，而不需要使样品连续流入浓缩储存器中或芯片上。
通过图1能帮助理解本发明。能够理解，图1是用于说明而非意图以任何方式对本发明进行限制。图1中所示的系统包括：大容量储存器(LVR)100，可以将包含低浓度的分析物的样品引入其中；分段式储存器300，其与微观流体器件600(有时称为“芯片”)整合；连接器200，大容量储存器中的分析物通过所述连接器，电泳传送至分段式储存器；以及分析区700，可以在其中对分析物进行检测。一般来说，分析区是微观流体通道，所述通道包含分析物的流体可以从中流过和/或所述通道中包含可以传递分析物的缓冲水溶液。或者，所述分析区可以是包含固定的俘获剂的孔或室。在一些实施方式中，包围分析区的至少一部分外壳或材料是透明的，从而便于对来自分析区的信号(例如荧光发射)进行检测。通过连接器，将分析物传递至分析区中的水溶液一般不包含用于分离分析物的排阻凝胶、粘性介质、过滤器、筛等。电极400和500的设置使得对电极施加电势(即对一个电极施加正电荷，对另一个电极施加负电荷)时，带电分析物能够传递通过溶液到达所述器件的合适区域(例如分段式储存器)。可以任选地设置附加电极800从而将分析物传递到分析区700中。在一些实施方式中不包括分段式储存器电极500。可以将电极整合在LVR或分段式储存器中，或者电极可以是位于储存器室中与样品或其他溶液接触的外部电极。电池组900是适用于电泳的任何电源或电流源(为了简化，在图1中只示出一个与电池组连接的LVR)。
分析区通常包括与器件分析区中的底物缔合的“俘获剂”。俘获剂(以下将详细讨论)是能够特异性地结合分析物、载体分子、离子性部分、或与分析物缔合的其他分子的试剂。俘获剂的例子包括抗体和多聚核苷酸。一般情况下俘获剂固定在分析区(微观流体器件的某个物理表面，其能够通过结合至少一种俘获剂、优选至少两种俘获剂、更优选是俘获剂分子的阵列而发生改性)中的“俘获位置”上。或者，在其他实施方式中，分析区不包括俘获剂，在样品流过检测器时对其进行分析(检测)。
在所述系统工作时，将样品溶液(例如包含或可能包含分析物的水性液体)引入大容量储存器100中。所述一个或多个大容量储存器可以与微观流体器件600整合，或者不与微观流体器件整合而是物理连接，或者不与微观流体器件整合也不相连而是靠近放置。例如，所述一个或多个大容量储存器可以是一个或多个独立的容器，例如用于盛放液体的各种容器中的任何一种，包括但不限于：试管、微量离心管(microfuge)、微型孔板的孔、组织培养皿等。大容量储存器的液体容量可以约为10微升至100毫升，可以至少为10微升、至少25微升、至少50微升、至少100微升、至少200微升、至少500微升、至少1000微升或至少5000微升。最常见的LVR液体容量约为100微升至2毫升。单个芯片可以连接一个或多个大容量储存器。在一些实施方式中，有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、175、200、250或更多个大容量储存器与单个器件相连。例如，如果使用具有100个孔的微型滴定板，则大容量储存器的数量可以为100。
根据本发明，分析物通过电泳经由连接器200传递至分段式储存器300。电泳是指溶液中带电分子或颗粒对电场作出响应而发生移动。如下所述，分析物的迁移率取决于(1)分析物分析本身的净电荷和/或(2)与分析物缔合的离子性部分的净电荷。净电荷是分子具有的合并离子电荷，可以为正、负或中性。如上所述，分析物可以电泳通过缓冲水溶液，而不需要使用尺寸排阻凝胶、粘性介质、过滤器、生物筛等。本文使用短语“电泳通过水溶液”表示不使用尺寸排阻介质或过滤器。
有分析物通过的连接器200可以具有任意各种形式，可以由任何能与分析物相容并且不干扰带电分析物的移动和/或电泳的材料制成。将外部源或管道连接至微观流体器件的方法是已知的，可以在本发明中用于连接。在一些实施方式中，连接器具有尺寸不同的多个区域。要在大容量储存器和分段式储存器或分析区之间进行连接，连接器200可以具有直径缩小的各个区段。可以通过连接直径缩小且不同材料的直形或锥形的管或通道而实现。在LVR不与芯片整合的一些实施方式中，连接器的一部分可以包括将分析物从大容量储存器传送至微观流体器件中的通道的管道部分，并且，连接器的一部分可以包括位于芯片上的微观流体通道(“连接器的微观流体通道部分”)，然后分析物可以经由该通道传送至分段式储存器300。可以例如使用充分发展的弹性体模塑法、光刻法或微型机械加工法将通道制造成具有不同的形状和尺寸。在一些实施方式中，连接器整个位于芯片之外。在一种实施方式中，大容量储存器与器件整合，连接器200是与微观流体器件整合的微观流体通道。
对于管道，有各种尺寸和材料可供选择。用于形成这些种类的连接器的方法的例子例如参见：Douglas Smith，Engineering and Science，CaliforniaInstitute of Technology出版，2003，第LXVI卷，第2期，第8-18页；SkelleyAM等，Proc Natl Acad Sci USA，2005年1月25日，102(4)，1041-6；Manz，A.和Becker，H.，“Microsystem Technology in Chemistry and LifeSciences”，Springer-Verlag出版，1999。示范性的管道包括不锈钢管道，针管，由如聚丙烯、聚四氟乙烯、特氟隆、聚氯乙烯、PEEKTM或PEEKsilTM的塑性材料、熔凝石英或玻璃之类制造的管道。合适管道的内径一般为几毫米至几微米，包括但不限于约10毫米、9毫米、8毫米、7毫米、6毫米、5毫米、4毫米、3毫米、2毫米、1毫米、0.5毫米、0.1毫米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米、20微米、10微米、9微米、8微米、7微米、6微米、5微米、4微米、3微米、2微米、1微米。连接器的内部尺寸通常在5毫米至50微米范围。
分段式储存器300(如果存在的话)与微观流体器件整合，分段式储存器300的容量通常约为0.1皮升至2微升，包括但不限于1皮升至1微升，以及10皮升至0.5微升。分段式储存器与器件的分析区流体连通，使得在打开合适的门或阀时，分析物可以从分段式储存器传送至分析区。大容量储存器和分段式储存器的容量比可以在很大范围内变化，但是在一些实施方式中，该容量比约为100∶1至1000∶1，包括但不限于100∶1以上、200∶1以上、300∶1以上、500∶1以上、800∶1以上、以及1000∶1以上。
要产生将分析物从大容量储存器传送至分段式储存器所需要的电场，需要设置电极以产生这种电场。电极一般设置在各储存器(即LVR和分段式储存器)内。电极在LVR中的位置可以变化，但是优选与连接器200的开口有一定距离，优选设置在相对于所述开口为最远端的位置或者距离处。可以以任何方式固定或定位电极，使得当电流接通并且存在溶液从而完成电路时产生进行电泳的电场。举例来说(并非限制)，电极可以插入储存器内的液体中。或者，电极可以与室或微观流体器件整合(例如结合在储存器或室的壁中)。微电极是本领域中众所周知的(参见例如：国际专利公开WO04044575A2；Rongsheng等，2005，Anal.Chem 77，4338-47；Abad-Villar等，2005，Electrophoresis 26，3602-3608)。
另外，可以在器件工作过程中改变器件或系统中电极的极性(例如从负电荷变化成正电荷)。带电分析物离开相同电荷的电极向相反电荷的电极移动。因此，例如，通过电泳可以将带负电荷的分析物从具有带正电荷的电极(阳极)的LVR传送至具有带负电荷的电极(阴极)的分段式储存器。然后通过切断流至LVR电极的电流、将分段区电极的极性变化为正性、并且接通设置在分析区中或分析区后的电极，将分析物从分段式储存器传送至分析区，以使分析物传送通过或越过分析区，将分析物从分段式储存器传送至分析区。迁移率取决于电场强度、净电荷、分子的尺寸和形状，还取决于其中有分子移动的介质的离子强度、粘度和温度。
图2A-C说明系统的其他实施方式。图2A说明的实施方式中，分析物蓄积于分段式储存器300中。在该实施方式中，可以根据需要将微观流体器件600上的电极从正性切换至负性。例如，当带负电荷的分析物浓缩或蓄积在分段式储存器300中时，电极500是带正电荷的。然后为了通过电泳使分析物移动至分析区700，使电极500带负电荷，并且使分析区旁边的电极800带正电荷。图2B说明的实施方式中，分析物并没有蓄积在分段式储存器300中，而是连续流过微观射流器件600，通过或流至分析区700。图2C说明的实施方式中，大容量储存器100与微观流体器件600整合，通过连接器200连接至分段式储存器。
可以将用于俘获和分析分析物的试剂预先设置在微观流体器件的通道中(例如将俘获剂固定在分析区底物上)，可以从大容量储存器引入所述试剂以及分析物，或者可以将其引至芯片上。例如，可以通过本领域已知的方法在化验的任意恰当时刻将试剂引入分段式储存器、分析区或通道中。引入方法根据器件的各种设计而变化。例如，可以通过打开分隔输入通道和分析区的阀，经由与分析区流体连通的输入通道将试剂引入分析区中。
II.分析物
分析物(或“所关心的分析物”)是使用本发明的方法或器件测量或检测的分子、分子络合物或颗粒。如上所述，分析物具有净电荷和/或分析物可以与带电分子缔合，使得可以如上所述通过电泳对分析物进行浓缩。在一种实施方式中，分析物与带电的一种或多种离子性部分缔合。或者，分析物可以通过与带电载体分子结合而与带电分子缔合，所述载体分子例如是抗体、受体、配体、底物或抗原。所述载体分子可以本身带电，或者可以通过附着离子性部分发生改性而荷电。
分析物的例子包括但不限于蛋白、蛋白络合物、病毒、核酸、重金属、药物、类固醇、杀虫剂和碳水化合物。分析物优选为生物分子(在细胞中产生或由细胞产生的一类分子)，例如蛋白、肽、多聚核苷酸(例如RNA或DNA)、糖、类脂、糖脂、糖蛋白等。分析物的具体例子包括：来自病毒或细菌之类的病原生物的生物分子，与疾病、毒素、药物相关的生物分子，包含变异、抗体和抗原的小分子、蛋白感染素和核酸。可以使用本发明的方法分析的分析物在测试条件(例如pH值)下可以具有净电荷或者没有净电荷。本身带电的分析物的一个例子是多聚核苷酸。分析物(不论是否带电)可以通过附着至少一种离子性部分发生改性而增加其电荷。例如，可以通过附着带有离子性部分的载体分子而使分析物改性(例如，带有核酸离子性部分的抗体)。以下描述离子性部分的例子。
III.样品溶液和样品前体
本文使用“样品溶液”表示在电泳开始时位于大容量储存器中的包含分析物的水性液体(即“起始材料”)。一般来说，通过对包含分析物的“样品前体(pre-sample)”进行处理而产生样品溶液。所述处理例如是：部分纯化或浓缩分析物，清除会干扰电泳或测试的杂质等。所述处理的具体步骤的例子包括：离心(清除碎屑、或分馏样品前体)、沉淀、过滤、色层析、超声处理、或导致溶液中没有分析物的任何其他方法。在一种实施方式中，所述处理包括使用珠粒(例如磁性珠粒，经过处理以结合分析物)浓缩分析物。另外，可以通过例如向样品溶液中添加缓冲剂、酸、碱或盐之类的试剂以调节溶液的pH值、离子强度和/或组成从而促进电泳。所述添加试剂的步骤导致例如：用水或缓冲剂之类的合适溶液(例如缓冲的盐溶液)稀释包含分析物的液体，使分析物重新悬浮于合适溶液中，使固体(例如盐)溶解在溶液中，等等。另外，可以通过与一种或多种离子性部分以及任选的一种或多种载体分子缔合而使样品溶液中的分析物发生改性。
分析物的来源可以是任何多种的材料，包括例如：生物流体、细胞、组织、环境样品(例如土壤或水)或合成产物。生物样品前体的例子包括例如：血液、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、细胞提取物、组织提取物、组织培养提取物、细胞提取物、颊面擦取物、细菌或病毒培养物。样品前体的其他例子包括：湖水或河水、食品加工流体、工厂制造的食品、水果和蔬菜提取物、化妆品。样品前体可以是液体或固体。如果是固体，则将样品前体分解、溶解或悬浮在液体(例如水性液体)中，并且可以清除不溶性材料。表1示出(说明性而非限制性)示范性的样品和样品前体。
表1：示范性的样品和样品前体
  样品前体   样品   分析物
  血液   血清*   抗HIV抗体**
  尿液   经过过滤的尿液*   hCG**
  河水   经过过滤的水*   霍乱菌抗原**
  PBMC   基因组DNA   DNA片断**
*在各情况中经过改性以调节离子强度/pH值
**在各情况中任选经过改性以缔合离子性部分
IV.分析物与离子性部分缔合
离子性部分是带有电荷的分子结构。所述离子性部分可以是阴离子(例如聚阴离子)或阳离子(例如聚阳离子)的。可以理解，带电分子的净电荷是部分取决于环境条件，具体是指样品溶液的pH值和盐的组成。但是，离子性部分的净电荷优选至少为+5或至少为-5。虽然离子性部分可以具有低或中等的电荷密度，但是优选离子性部分具有高电荷密度。电荷密度是单位体积溶液、材料等由于其中存在带电本体而具有的电荷量。具有高电荷密度的材料的单位体积具有较多的电荷，更容易吸引具有相反电荷的本体，并且排斥具有相同电荷的本体。一般来说，具有较高电荷密度容易导致荷电本体在电泳时具有较短的迁移时间。
离子性部分的例子包括(用于说明而非限制)：核酸及其天然和合成的类似物(例如RNA、DNA、PNA)，多胺，例如聚赖氨酸、聚谷氨酸盐、聚天冬酰胺，硫酸化的聚糖，经过化学改性的蛋白例如琥珀酰化的牛血清蛋白。其他离子性部分包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙基丙烯酸、聚丙基丙烯酸、聚丁基丙烯酸、聚马来酸、硫酸葡聚糖、肝素、透明质酸、多硫酸盐、多磺酸盐、聚乙烯基磷酸、聚乙烯基膦酸、聚马来酸的共聚物、聚羟基丁酸、以及混合的聚合物。
V.分析物与离子性部分缔合
在电泳之前，可以对分析物进行改性以与离子性部分缔合。分析物和离子性部分的组合通常具有大于单独的分析物的净电荷。可以用离子性部分直接对分析物进行改性，或者使用带离子性部分的载体分子间接地对分析物进行改性。载体分子包括如下所述的结合分析物的抗体、多聚核苷酸和其他分子。
A.离子性部分与分析物的直接缔合
在一些实施方式中，离子性部分与分析物以共价方式或非共价方式直接缔合。例如，可以根据序列互补性(部分或完全的)将核酸离子性部分与核酸分析物以非共价方式缔合。也可以通过化学或酶的方式对分析物进行共价改性以增加其离子电荷。化学改性的例子包括使用酐(例如琥珀酐或四氢邻苯二甲酸酐)之类的试剂将蛋白中的氨基转化为羧基以增加蛋白的净负电荷。也可以使用碘醋酸盐之类的试剂将蛋白中硫醇基或组氨酰基之类的其他基团转化为如羧基之类的带负电荷的基团。另外，可以将这些官能团转化为一些其他活性基团以促进离子性部分的缔合。这些改性试剂和其他改性试剂以及改性方法是本领域中已知的(参见例如：“Chemical Modification of Proteins”，Gary E.Means和Robert E.Feeney；“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson；和“Chemical Reagents for Protein Modification”，Roger L.Lundblad)。
如核酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐和硫酸化的聚糖之类的离子性部分具有能够促进与分析物共价缔合的官能团(例如氨基或羧基)。而且，可以通过设计衍生离子性部分，使其具有用于与分析物共轭的有利的官能团。
另外，已知可以使用一些市售交联剂来附着载体分子和离子性部分(例如：使氨基与氨基或巯基与巯基交联的同双官能(homo-bifunctional)试剂，使氨基与巯基交联的杂双官能试剂等)。这些和其他交联方法是本领域技术人员众所周知的，可以根据测试的具体要求进行选择。
B.经由载体分子或载体络合物使离子性部分与分析物间接缔合
还可以通过载体分子或载体络合物，使分析物与离子性部分间接缔合。载体分子是专一地结合分析物的分子。因此，分析物和载体分子一起构成“特异性结合对(bonding pair)”或载体络合物。在该实施方式中，离子性部分与载体分子而非分析物键合或共轭，或者，离子性部分与载体分子以及分析物键合或共轭。结合对的例子包括但不限于抗体-抗原对、受体-配体对、以及其他配体：反配体络合物。一般来说载体分子是特异性地结合分析物的抗体。
表2：示范性的特异性结合对
  分析物   载体分子
  抗原(例如蛋白)   抗体
  抗体   抗原
  多聚核苷酸链   互补多聚核苷酸链
  配体(例如激素)   受体(例如激素受体)
  免疫球蛋白   蛋白A
  酶   酶辅助因子或底物
  碳水化合物   凝集素
可以使用任意各种缔合分子的方法(一些方法如上所述)，将载体分子与离子性部分缔合。选择的方法部分取决于分析物、离子性部分和载体分子的性质。例如，可以使用标准化学方法将一种或多种离子性部分附着于载体分子。例如，如核酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐和硫酸化的聚糖之类的离子性部分具有能促进其与抗体或其他载体分子交联的官能团(例如氨基或羧基)，或者这些离子性部分能够衍生从而带有这些官能团。一些潜在的载体分子(例如核酸和蛋白)具有能促进其与离子性部分交联的官能团(例如氨基[如赖氨酸、精氨酸]、羧基[如天冬氨酸、谷氨酸]或巯基[如半胱氨酸])，或者这些载体分子能够衍生从而带有这些官能团。可以使用各种双官能键合剂(linker)将载体分子与一种或多种离子性部分缔合。可以对载体分子进行化学改性，从而具有用于交联的特异性官能团。例如，可以对硫酸化的聚糖进行氧化，从而具有醛官能团，可以用来与氨基反应。合成的低聚核苷酸在一端具有巯基或伯胺基。低聚核苷酸可以使用现有的交联剂通过氨基或巯基官能团与抗体分子上的氨基或巯基交联。
还可以经由一种或多种中间分子将离子性部分与载体分子(以及与分析物)间接缔合。例如，如果分析物为抗原(“抗原A”)，则可以通过例如用抗-抗原A单克隆抗体(AAA-mAb)(“载体分子”)结合抗原A和用带离子性标签的第二抗体(抗-AAA-mAb)结合AAA-mAb使所述抗原与离子性部分间接缔合。可以认识到，这种第二抗体类别标记在免疫化验中是常规的。可以将包含分析物和离子性部分(在该实施例中为抗原A+AAA-mAb+抗-AAA-mAb-离子性部分)的分子络合物称为“载体络合物”。虽然在该实施例中描述了抗体-抗原缔合方式，但是本方法并不限于抗体。可以使用其中一个成员为分析物的任何特异性结合对。
还可以经由特异性结合对将载体分子与离子性部分缔合，所述特异性缔合对中的一个或两个成员与标记物共轭。例如，可以对载体分子进行生物素化，并且使用与抗生物素蛋白共轭的离子性部分进行标记。该标记是抗生物素蛋白或生物素，能够在处理的任何步骤中经由该标记与离子性部分结合。在另一种实施方式中，按照以下方法将抗体载体分子与离子性部分(核酸)缔合：在生物素的四个结合位置上添加1、2或3个生物素化低聚核苷酸，留下至少一个位置未被占据的生物素，制备带电的抗生物素蛋白分子。将生物素化的载体分子(例如抗分析物的抗体)与抗生物素蛋白-生物素-低聚核苷酸络合物结合。标记的其他例子包括(并非限制)聚组氨酸标记、谷胱甘肽标记、地高辛和荧光素。对标记具有专一亲合性的抗体市场上有售，或者可以按照需要生产。
可以使用以上对载体分子进行离子性标记的段落中所述的任何方法对蛋白、核酸、或载体络合物的其他组分进行离子性标记。
可以将与离子性部分直接(例如共价)结合的分子称为“经离子标记的”。可以将分析物络合物、缔合的离子性部分、载体分子(如果存在的话)以及用于缔合离子性部分和分析物的任何其他分子称为“分析物-离子性部分(IM)络合物”。
能够理解，在浓缩电泳以及任选的随后浓缩分析步骤的条件下，分析物和离子性部分的缔合是足够稳定的，使得分析物和离子性部分在进行测试时保持缔合在一起。
VI.离子性部分与固定的分析物的缔合
在本发明的一个方面中提供了部分地利用上述浓缩电泳技术的本发明方法。根据所述方法，分析物进行以下步骤：
a)与固相或固定相结合
b)与离子性部分缔合
c)从固相或固定相释放
d)电泳至微观流体器件
e)使用能特异性地识别i)或ii)的俘获剂在分析区实现结合或检测
i)分析物，或
ii)离子性部分。
步骤(a)和(b)可以按照任意顺序进行，步骤(b)和(c)可以按照任意顺序进行，前提是(c)在(a)之后发生。例如，顺序可以为a→b→c；b→a→c；或a→c→b。以下描述步骤(a)-(c)，用于说明而非限制。本方法的具体实施方式如图5中所示，将在相应段落中讨论。本方法包括两个独立的特异性分析物浓缩步骤，为高灵敏度的测试方法。
a.分析物与固相或固定相结合
可以通过用固定在固相上的分析物特异性结合成员(SBP)处理样品溶液，以任意常规的方式将分析物结合至固相或固定相(本文中可以互换使用)。固相可以是(说明性而非限制性)大容量储存器的表面、微量滴定板孔的表面、或微粒的表面。在一种优选的实施方式中，使用微粒。在一个实施方式中，使用磁性微粒。
适用于纯化的微粒在本领域中是众所周知的。微粒一般是球形颗粒，直径通常约为0.05-1000微米，可以在微粒上结合或涂布SBP(例如抗体、多聚核苷酸)。可以使用如玻璃、硅酸锆、氧化硅、金、聚苯乙烯、胶乳和PMMA之类的材料制造微粒，微粒可以具有如磁性或可磁化、经过染色、可生物降解和发荧光之类的物理性质。可以用结合剂涂布微粒，或者微粒具有能够与结合成员(例如抗体、多聚核苷酸、抗生物素蛋白)共价附着的反应性基团(例如氨基、羧基、氰尿酸)。另外，可以购得结合有SBP的微粒(例如涂布有链霉抗生物素蛋白、人IgG和IgM的抗体、来自例如法国澳林的茵蒂卡生物技术公司(Indicia Biotechnology，Oullins France)的抗生物素的抗体的微粒)；具有以下结合基团的微粒：抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白A、白蛋白、生物素、PEG、以及来自例如德国斯蒂芬特的开斯克生物技术公司(KiskerBiotechnology，Steinfurt Germany)的胶原。还可以购得其他固相(例如微量滴定板)，或者对固相进行衍生使其具有共价结合的结合成员(例如结合有链霉抗生物素蛋白或来自BD生物科学(Biosciences)(Bedford MD)的抗IgG抗体的微量滴定板)。
可以在将分析物结合至SBP的条件下，通过使包含分析物的溶液与固定的SBP接触而将分析物结合至固定的结合剂。例如，可以向样品前体溶液中添加微粒。将分析物附着于微粒之后，可以通过使用离心、磁力分离或过滤方法，以及适当的洗涤步骤分离微粒，从而制备富含分析物的馏分。通过清除未结合的上清液，以及其他众所周知的方法，可以使用其他固相(例如微型孔板)实现对未结合的污染物的清除。
b.分析物与离子性部分缔合
使用例如以上段落中描述的任意合适方法可以将分析物与离子性部分缔合。如上所述，可以在与固定相结合之前或之后将分析物与离子性部分缔合，而且可以经由结合剂缔合或者直接缔合。因此，本文使用的结合剂将分析物结合至微粒或底物之类的固定相。可以首先将离子性部分与固相缔合。在这种情况中，通过结合至固相可以促进离子性部分与分析物的缔合。
c.从固相或固定相释放分析物
可以使用各种策略从微粒(或其他固相)释放结合的分析物。例如，可以使用特异性试剂替代分析物从而与结合至固定的SBP的分析物进行竞争。或者，可以用变性剂(例如脲)之类的非特异性试剂、极端pH、温度、高离子强度缓冲剂等来洗提分析物从而使结合中断。这可以通过改变缓冲剂、改变电场、pH条件、添加洗提缓冲剂、或本领域中已知的任意方法来实现。
或者，可以通过在结合剂和固相(例如微粒或底物)之间的键合中引入可裂解或可断裂的键，从而以络合物的形式释放结合有分析物的结合剂。在微观流体芯片上进行分析的过程中，除了使用俘获剂来俘获分析物之外，还可以在俘获剂和微观流体芯片的俘获表面之间结合可裂解或可断裂的键。虽然结合剂和俘获剂可以是相同类型的分子，但是它们的作用不同。在分析过程中要俘获分析物(即固定在分析区中)时使用俘获剂。在任意情况中，所述键包括二硫键、二醇、限制酶序列、以及能够通过化学方法或酶解离的键。例如，可以使用蛋白酶或核酸酶(例如序列特异性的蛋白酶或核酸酶)裂解结合剂。如果使用包含二硫键的交联剂将抗体定位于固相上，则可以通过使用如巯基乙醇或二硫苏糖醇之类的还原剂释放结合络合物。可以使用核酸酶裂解核酸结合分子。
提供以下实施例的目的是为了说明而非意图限制本发明。
1.核酸分析物
在一种实施方式中，分析物是核酸。核酸分析物本身是聚离子性的，因此，虽然可能存在其中附着附加的离子性部分是有利的情况，但是可能并不需要附着离子性部分来通过电场移动这些分子。但是，在电泳之前浓缩分析物和/或清除污染物可能是有利的。这可以通过例如使用具有与磁性微粒共轭的互补序列的核酸结合剂实现。可以将磁性微粒添加在大容量储存器内包含核酸分析物的样品中。将分析物分子结合至微粒之后，施加电场，将微粒聚集至大容量储存器内的特定点。然后清除污染物和干扰物质。通过如低离子强度、脲、甜菜碱、高pH或温度、或者这些因素的组合之类的变性条件使杂合中断，从而分开核酸链并且从微粒释放结合的分析物。电泳驱使分析物核酸移动至第二储存器中。在第二储存器中浓缩之后，立刻在微观流体器件上对核酸分析物进行电泳，使其至具有与核酸分析物的5′端互补的俘获剂的特定俘获位置。核酸分析物结合，并可以使用与核酸分析物的3′端互补的带标记的核酸检测剂进行检测。
2.抗原分析物
在另一个例子中，使用抗体作为结合剂，可以将用作为抗原的分析物与固体底物缔合。使对例如蛋白分析物具有亲合性的抗体与微粒共轭。通过磁力方式将微粒聚集(如果它们是磁性微粒)或者通过离心场使微粒聚集至大容量储存器内的特定点，并且清除包含任意未结合的分子、污染物或干扰物质的上清液。蛋白分析物作为络合物从微粒释放。这可以通过使用可裂解的交联剂(例如本文所述的)实现。还可以使用适当的蛋白酶，在优化的反应条件下实现所需要的释放，而不会使分析物发生不利的降解。另外，对于具有严格裂解位置要求的蛋白酶，可以想到对定位组分(交联剂或抗体)中的特异性蛋白水解位置进行设计。然后，使用这些蛋白酶来裂解结合的络合物。在一种实施方式中，根据本发明的方法，使用预先浓缩步骤对血样中的分析物进行检测，预先浓缩步骤中将涂布有对分析物具有亲合性的结合剂的磁性微粒添加于大容量储存器内的血样中。
VII.分析物的浓缩电泳
将分析物与离子性部分缔合的一些步骤或全部步骤(以及之前的样品处理步骤)可以在大容量储存器内进行。或者，一些步骤或全部步骤可以在一个或多个不同的容器中进行，可以将分析物(以及任意缔合的分子)传送至大容量储存器(例如通过移液操作)。结果是，分析物-IM络合物将位于大容量储存器内。
大容量储存器的液体容量可以在很大范围内变化。容量通常约为1微升至100毫升。LVR容量(以及样品体积)优选大于约5微升、更优选大于约10微升，例如大于50微升、大于100微升、大于1毫升。在一些实施方式中，LVR容量或样品体积约为1微升至20毫升。(能够理解，样品体积小于LVR容量，一般至少为LVR容量的25％、更常见为至少50％、通常为至少75％。)在一些实施方式中，样品体积约为10微升至100毫升，较常见为25微升至5毫升，更常见为50微升至5毫升或100微升至25毫升。LVR容量可以约为50微升、100微升、200微升、300微升、500微升、800微升、1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、10毫升、20毫升、30毫升、40毫升、50毫升、60毫升、70毫升、80毫升和90毫升。一般来说，可以使用预期能够在合理时间内通过电泳进行浓缩的合理体积。这可以通过使带电分析物在样品体积内移动最长距离需要的时间来确定。
通过产生从大容量储存器经由连接器延伸至微观流体器件(例如分段式储存器或分析区)的电场，能够实现带电分析物或分析物-IM络合物的电泳传送。系统的一种示范性布置如图1-3中所示。图1和3中所示的器件显示了将自多种大容量储存器的多个样品连接至微观流体器件和/或多种分段式储存器的各种连接器。
有至少一个电极位于或整合于各大容量储存器内，并且有至少一个电极位于微观流体器件上或者整合于微观流体器件内。施加的电场强度使得分析物从大容量储存器以选定的速率移动至微观流体器件。可以通过确定电极位置以及对储存器施加的电场以促使微观流体器件作出最佳表现，例如在短时间内实现灵敏检测。举例来说，设置在大容量储存器内的电极的位置可以是相对于通向微观流体器件的连接器开口提供最大对称性和距离的点。这种电极位置可能提供较均匀的电场从而驱动储存器内的全部分析物。微观流体器件内一个或多个电极的位置取决于器件的预期操作。如果需要分段式储存器，则可以将电极靠近分段式储存器放置。如果需要在不使用分段式储存器下驱使分析物直接移动至分析区，则可以将电极靠近分析区放置。还可以将电极靠近这两个位置放置，使得能够施加电场，按照顺序驱使分析物首先移动至分段式储存器然后移动至分析区。
在微观流体器件中使用分段式储存器使得能够对分析物向分析区的移动进行同步和更好地控制。分段式储存器与芯片整合。分段式储存器的构造使其与分析区流体连通(当器件中阻断流动的任意阀打开时)。分段式储存器的体积小于大容量储存器的体积，一般小于约1微升，包括但不限于约0.1皮升至2微升、1皮升至1微升、10皮升至0.5微升，优选小于1微升，有时小于0.1微升，有时小于1皮升。
所示连接器可以为毛细管。为了便于电泳的进行，连接器中充有如低盐缓冲剂之类的传导介质，从而可以建立电场。施加电场时，带电分析物(或络合物)被传送并驱使其直接通过分析区进入微观流体器件中；或者进入微观流体器件上的分段式储存器，从而在进一步分析之前对分析物进行浓缩。对与大容量储存器和分段式储存器连接的电极的电势进行选择，从而实现传送分析物需要的速率。
电泳的持续时间取决于以下因素，例如样品中所关心的分析物的浓度和量、电泳条件(电流、电压、缓冲剂的离子强度等)、起始样品的体积、分析物电荷、检测方法的灵敏度、以及使用的缓冲剂。进行电泳的时间足以传送一定量的所关心的分析物。传送了足够量的分析物时，可以停止电泳，需要时可以移开大容量储存器和连接器。
在一种实施方式中，电泳一直进行到分段式储存器内分析物的浓度至少为大容量储存器内分析物浓度的两倍时才停止。有时浓度差异至少为3倍，有时至少为5倍、10倍、25倍、100倍或以上。
可以连接一个以上的大容量储存器和一个以上的分段式储存器，从而实现进行测试的最佳配置，方便而高效地传送分析物。对于非常大的样品，使用串联的多个大容量储存器是更有效的。在这种实施方式中，通过连接器依次连接体积缩小的多个LVR并且设置电极，从而将分析物连续地从一个LVR传送到下一个LVR并最终到达芯片。通过这种配置可以按照某种方式施加电压，从而快速传送分析物并且使传送分析物至微观流体芯片中所需要的电压最小。较小的电压是有利的，因为可以减少微观流体器件中任何涉及电泳、加热和/或气体处理的问题。
在一些实施方式中，在将分析物传送至分析区之前，将分析物从分段式储存器传送至一个或多个中间储存器，从而能够轻易地进行多重测试(例如在不同溶液中或者使用不相容的试剂进行测试)。例如，可以将分段式储存器的内腔分隔，一部分用于核酸检测，另一部分用于蛋白检测。使用中间储存器还可以处理较大体积的样品。
VIII.将分析物、带电分析物、或分析物-IM络合物传送至分析区
对分析物进行检测和分析时，从大容量储存器或分段式储存器将分析物(可以与离子性部分和/或分析物络合物的一部分缔合)传送至器件的分析区。在优选的实施方式中，分析区包括多种俘获剂(可以是相同或不同的，可以排列成有序阵列或者不排列成有序阵列)，所述俘获剂结合分析物或分析物-IM络合物(而且可以结合载体分子、离子性部分或络合物的其他组分)。
通过电泳使分析物和/或包含分析物的络合物从LVR移动至微观流体芯片之后，可以使用本领域中已知的任何方法(例如微型泵、毛细管作用和/或电泳)立刻将分析物/络合物传送至俘获位置。在一种优选的实施方式中，使用电泳。可以理解，要离开分段式储存器电泳越过所述阵列，则需要在分段式储存器内的电极与分析区内或分析区附近的电极之间形成电场。或者，如果不使用分段式储存器，则要在LVR内的电极与分析区内或分析区附近的电极之间形成电场。
IX.分析区和分析物检测
可以在芯片的分析区中对分析物进行检测、定量或分析。在一种实施方式中，分析时不需要将分析物固定在分析区中(例如使用在溶液中进行的光散射、流式细胞仪、荧光检测或其他检测方法)。例如，分析物可以用荧光团作标记，并通过以下进行分析，即，用适当波长的激光激发荧光团，在分析区中用常用于流式细胞仪中的装置分析荧光本体，并且测量发射的荧光。能够理解，与大多数微观流体器件的设计一致，分析区通常为芯片的通道或室。
或者，检测包括通过分析区中固定的俘获剂来结合分析物。俘获剂是能够通过特异性地结合分析物或络合物的成员从而俘获分析物或分析物络合物的分子。能够被俘获剂结合的络合物的成员包括分析物、载体分子、载体分子/分析物络合物、离子性部分、第二抗体(如果使用的话)和标记。因此，俘获剂可以是例如一种或多种抗体、核酸、受体和/或配体。
可以使用本领域中已知的任何方法，将俘获剂固定在微观流体器件的俘获位置上。例如，可以经由抗体的Fc部分附着一种或多种抗体俘获剂。可以将俘获剂共价附着或非共价附着在俘获位置上，但是优选这种附着足够强，使得液体在俘获位置上的移动不会分开俘获剂。使用的各种试剂和反应条件是本领域中已知的(参见例如：“Chemical Modification of Proteins”，Gary E.Means和Robert E.Feeney；“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson；“Chemical Reagents for Protein Modification”，Roger L.Lundblad)。将俘获剂附着至固相底物上的俘获位置的示范性方法可以参见例如：美国专利5629213、5688642、5585275，以及国际专利申请WO9745730。
在俘获位置附着之后，当分析物或分析物络合物的成员移动经过俘获位置时，俘获剂能够俘获分析物或分析物络合物的成员。俘获剂和分析物或分析物络合物一般通过非共价相互作用结合，但是可以使用共价结合。对于核酸分析物或核酸离子性部分，俘获剂可以是例如互补核酸。对于蛋白分析物，俘获剂可以包括对蛋白分析物具有特异性的抗体、配体、凝集素和受体。可以使用抗体俘获剂俘获碳水化合物和类脂分析物。可以使用抗体、抗原或其他特异性地结合抗体的分子俘获抗体载体分子。例如，如果载体分子是人抗体，则俘获剂可以是山羊抗人抗体。
可以操控俘获条件从而对分析物络合物的带标记的成员进行特异性俘获。可以对如缓冲剂、移动经过俘获位置的速率、温度和俘获时间进行选择，从而只结合特定的分析物，或者也结合具有单个碱基变化或不同蛋白的核酸之类的变种。或者，可以对俘获剂进行选择从而只结合特定的分析物或结合变种。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将俘获剂引导至微观流体器件上的特定位置或俘获位置。例如，可以使用泵送器件或者光刻和光致反应性试剂将俘获剂引导并缔合在特异性的俘获位置处。
一般根据来自可检测标记物的信号对分析物进行检测。标记物是指作为或者能够用于检测(例如利用物理或化学性质)、指示分子的存在或者能够与另一种分子共价结合或缔合的原子(例如放射性核)、分子(例如荧光素)或络合物。术语“标记物”也表示作用于底物从而产生可检测的物理信号、分子或络合物的共价结合或缔合的分子(例如酶之类的生物分子)。适用于本发明的可检测的标记物包括可以通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或物理手段等进行检测的任何组合物。使用可检测标记物时，将其增加至可以与俘获剂结合的最终络合物的任意组分。例如，可以使标记物与载体分子、分析物、离子性部分或结合剂结合。用于微观流体环境中的检测器(例如荧光读数计、分光光度计等)在本领域中是众所周知的。
能够理解，可以在相同样品中检测多种分析物。例如，如图3和7中所示，可以使分析区的特定区域与对具体分析物具有特异性的俘获部分缔合。
X.测试的特异性
本文所述方法的任何一个或多个步骤可以提供测试的特异性。例如，一个或多个步骤可能涉及结合一般种类的分子，一个或多个步骤可能要求只特异性地结合所关心的分析物。对特异性有要求时，可以使用经过特异性离子改性的抗体，可以使用特异性的载体分子，可以使用特异性的结合剂，可以使用特异性的检测分子和/或可以在微观流体器件上使用特异性的俘获剂。因此，例如，开始时可以使用涂布有特异性结合分子的微粒对样品中的分析物进行浓缩。或者，可以用结合包括分析物的一般种类分子的结合分子涂布微粒。一般种类分子包括：磷酰化蛋白、糖蛋白、核酸、抗体、类脂、糖、共享受体域、共享图(shared motif)、保留性核酸或氨基酸图、共享载体和共享表位。
XI.测试中使用的抗体
读者能够理解，抗体可以在本发明方法中扮演多种角色。例如，抗体也可以是分析物，如以下实施例中所述。术语“抗体”是指包含两个重链和两个轻链、以及抗原结合片断(包括Fab，Fab′F(ab′)2，Fabc和Fv)的免疫球蛋白。通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶或化学分离，可以产生片断。术语“抗体”也包括化学共轭于或表达为具有其他蛋白、单链抗体和双特异性抗体的融合蛋白的一种或多种免疫球蛋白链或片断。参见例如：Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，New York(1988)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1999，包括2005年增刊)；Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79，315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。抗体可以是单克隆或多克隆的。但是，在一些实施方式中，使用单克隆抗体以保证结合至蛋白上的特异性表位。
在一些实施方式中，在测试的某些时刻将两种或更多种抗体同时结合于分析物(或其他分析物-IM络合物组分)。在这些情况下，抗体或者结合分析物上的不同表位、第二抗体结合于第一抗体，或者第二抗体结合于抗体/分析物络合物。在其他实施方式中，可以在添加第二抗体之前移开第一抗体。
根据抗体发挥的功能，可以对抗体进行离子标记和/或对其改性从而包括可检测的标记物以便后续检测。本文使用的“可检测的标记物”具有本领域中的普通含义，是指作为或能够用于检测(例如利用物理或化学性质)、指示分子的存在、或者能够共价结合或缔合另一种分子的原子(例如放射性核素)、分子(例如荧光素)或络合物。术语“标记物”也值作用于底物从而产生可检测的原子、分子或络合物的共价结合或缔合的分子(例如酶之类的生物分子)。适用于本发明的可检测的标记物包括能够通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或物理手段等进行检测的任何组合物。
XII.装置和系统
本发明提供了用于进行本文所述方法的装置和系统。在一种实施方式中，微观流体器件具有与分析区流体连通的分段式储存器，分析区包含结合以下物质的俘获剂：(i)分析物，(ii)抗体或(iii)核酸(即，载体分子或分析物-IM络合物的元素(elment))。如上所述，分析区一般是微观流体通道的一个区域，俘获剂至少固定在通道表面上。样品储存器的流体容量如上所述(例如0.1皮升至约2微升)。所述器件还包括与分段式储存器连接的第一微电极和与分析区连接的第二微电极。对电极进行设置，在对一个电极施加正电荷并且对另一个电极施加负电荷时，能够产生足以将带电分子从分段式储存器电泳移动至分析区的电场。因此，一个电极可以位于分段式储存器内，第二电极位于固定的俘获剂远端(相对于分段式储存器而言)的分析区内。
在一种实施方式中，所述器件包括如上所述的分段式储存器和分析区的多个单元。分段式储存器和分析区的每个组合可以称为“工作单元”。
在一种实施方式中，所述器件的至少一个分析区包含结合来自一种以上病原生物的分子的俘获剂。在一种实施方式中，至少一种，并任选所有的病原生物是病毒。在一种实施方式中，至少一种，并任选所有的病原生物是细菌。在一种实施方式中，来自病原生物的分子是核酸、蛋白或毒素。
在相关实施方式中，本发明提供的系统包括本发明的微观流体器件，还包括大容量储存器和/或连接器和/或电源和/或计算机辅助控制系统，可以使用所述系统根据浓缩、传送和/或分析的需要启动电极(400、500)或者切换这些电极的极性。所述系统使用电泳来浓缩带电分析物，并且将样品引入或应用于微观流体器件。通过电泳将带电分析物从大容量储存器移动和浓缩至分段式储存器或微观流体器件中。所述系统的一般方案如图1和2中所示。所述系统一般包括微观流体器件600、至少一个大容量储存器100、至少一个分段式储存器300、连接器200、用于进行电泳的至少两个电极400和500(或800)。在一种实施方式中，微观流体器件还包括对样品分析剩余的任何流出物进行收集的流出物阱(well)(例如参见图3)。
图1中显示在大容量储存器100和分段式储存器300之间的多个连接器200，这些连接器使用毛细管。毛细管200中充满如低盐缓冲剂之类的流体，用来连接电极(400和500)，形成电场。该电场能够使带电分析物进行电泳从大容量储存器100传送至分段式储存器300(参见图3)。
可以使用本领域中已知的任何手段将电极400和500连接至储存器(100、300)和/或微观流体器件600，从而产生合适的电场。能够理解，材料、样品、缓冲剂、以及所有组件的制造都要与对材料进行的电泳相适应。电极(400、500)以可操作的方式连接至储存器(100、300)。以可操作的方式连接表示电极位于储存器内或靠近储存器，因此，施加电压或电势时能产生传送带电分子的电场。在一种实施方式中，将电极嵌入储存器或器件的材料(例如包含在底座)中。而且，使用两个以上的电极(400、500)时，可以按照浓缩、传送和/或分析的需要使用计算机辅助控制系统来切换电极(400、500)的极性。可以对控制系统进行配置，使其能响应测量分析区中分析物的存在和/或位置的检测器。
在一种实施方式中，所述系统包括各自与不同的大容量储存器流体连通的多个工作单元。在一种实施方式中，所述系统包括各自具有分段式储存器和相连电极的多个工作单元和控制系统，所述控制系统对各电极施加相同大小和持续时间的电荷。
可以使用本领域中已知的仪器施加电压、对流体传送、器件内的流速和方向、用于检测或感知所关心的分析物的检测仪器、处理器(例如发出指令从而控制仪器、从检测器接受数据、分析储存和解读数据、并且以可读的报告形式提供数据和进行阐释的计算机)进行控制。
XIII.示范性实施方式
以下参考图4-6描述方法的示范性实施方式。
在图4中所示的实施方式中，使用带离子标签的抗体载体分子在分析物上产生离子性质。附着有离子性部分2的第一抗体1特异性地结合在大容量储存器内的样品中的分析物3，产生抗体/分析物络合物4。通过电泳将带离子标记的抗体和络合物传送至分段式储存器。然后将络合物传送至结合有带俘获剂6的底物5的分析区。俘获剂6是对分析物3具有特异性的第二抗体。俘获剂抗体6结合了不同于第一抗体1的分析物3的表位，或者，俘获剂抗体6可以特异性地结合至抗体/分析物络合物4，但是没有结合至任何游离的第一抗体1。可以在俘获分析物3之前或之后的任意时刻将可检测的标记物直接附着至任何分子(潜在位置7)。在其他实施方式中，使用带标记的第三抗体检测结合至俘获剂的分析物/IM络合物，所述第三抗体结合至分析物3上的不同位置、或者结合至抗体/分析物(4)络合物。
通过第一抗体1和/或俘获剂6的特异性可以获得该测试的特异性。其他实施方式可以包括组合使用分析物专一的可检测标记物以及结合至第一抗体1或离子性部分2的俘获剂6。
在图5所示的实施方式中，分析物3通过结合至大容量储存器内的磁性微粒8从而与电荷缔合。在该实施方式中，微粒8涂布有抗体结合剂11。在适当缓冲剂中将这些微粒加入样品，使分析物3结合至抗体结合剂11。如果需要，可以在将微粒8磁性集中至储存器的特定区域之后清除干扰、污染和/或不需要的物质。可以进行附加步骤从而进一步减少不需要的物质。将附着有离子性部分2的第二抗体1添加至大容量储存器内的抗体/分析物络合物中。第二抗体1可以经由不同表位结合在分析物3上。可以任选颠倒添加抗体1和添加涂布有抗体结合剂11的微粒的顺序。形成结合的分析物/抗体络合物(3/11/1/2)之后，在将微粒8磁性集中至储存器特定区域之后清除过量的抗体1、干扰、污染和/或不需要的物质。可以进行附加的洗涤步骤从而进一步减少不需要的物质。然后使用适当的裂解剂从微粒8除去结合的分析物/抗体络合物(3/11/1/2)。然后对络合物(3/11/1/2)进行电泳，将分析物3浓缩至分段式储存器中。浓缩之后，络合物在微观流体器件的俘获位置5上进行电泳。在该实施方式中，附着于俘获位置5的俘获剂6特异性地结合至离子性部分2(例如，如果离子性部分2为核酸分子，则俘获剂6为互补核酸分子)。可以在涉及的任何分子上附着可检测的标记物7，所述分子包括分析物3、微粒8上的抗体结合分子11、第二抗体1、或离子性部分2。这种反应的特异性可以在任何步骤提供，包括结合至微粒8上的结合剂11的步骤和/或结合第二抗体1的步骤。在一种实施方式中，俘获剂6可以是结合至分析物3上的不同表位的第三抗体，或者是特异性地结合至抗体/分析物(1/3或11/3)络合物并且没有结合至游离抗体(1或11)的第三抗体。
图6中说明的实施方式与图5说明的类似，图6中说明的实施方式涉及在过程的后期附着离子性部分2，该实施方式可以用于离子性部分2可能干扰先前的结合或纯化步骤的情况中。在该实施方式中，使用抗生物素蛋白/生物素对(13/14)或类似的特异性结合对，将离子性部分2附着至抗体11作为标记/结合剂对。首先将分析物3固定在涂布有特异性结合剂11的磁性微粒8上。在图6的说明中，结合剂是特异性地结合至分析物3、用生物素标记13改性的抗体11。将与抗生物素蛋白共轭的离子性部分2(或指向该标记的结合剂)和微粒8混合，并经由抗生物素蛋白/生物素(13/14)结合至抗体结合剂11。在过程的任意时刻，可以通过施加磁场将磁性微粒8浓缩至大容量储存器内的特定区域，以便进行洗涤、改变缓冲剂和/或从微粒处移出分析物3。
在通过电泳将分析物3浓缩至分段式储存器内之前，通过例如添加特异性蛋白酶，从微粒8裂解抗体结合剂11。然后通过电泳将分析物3/抗体11络合物以及样品中的任何其他带电分子浓缩至分段式储存器内。浓缩之后，使络合物在俘获位置5上移动。俘获位置5上的特异性俘获剂6俘获分析物3。在该实施方式中，俘获位置4上涂布有抗体俘获剂6，该俘获剂在不同于第一抗体11所识别的表位处特异性地结合至分析物3。可检测的标记物7可以结合至任何组分，包括抗体结合剂11、分析物3或离子性部分2。
表3提供了本发明方法中可以使用的分析物、离子性部分、载体分子和俘获剂的组合(用于说明而非限制)。
表3：分析物/离子性部分/载体分子/俘获剂组合的例子
  分析物   离子性部分   载体分子   结合剂   俘获剂
  多肽   核酸   抗体   抗体   抗体
  参见核酸实施方式   核酸   (分析物)   无或核酸   互补核酸   互补核酸
  抗体   聚赖氨酸   无或第二抗体   抗原   抗原
  碳水化合物   核酸   抗体   凝集素   抗体
实施例
此为对用于检测传染病的生物芯片的一般描述。芯片包括电极、样品孔、特异性检测区、通道和阀。可以装载多个样品，并可以通过电泳驱使样品经过用于鉴别和定量的检测区。可以同时或依次装载不同的样品，而且可以用微观流体阀控制装载。用于检测的常用试剂(common reagents)可以通过器件中的通道引入。
实施例1：HIV/HBV/HCV测试
图3说明用于检测样品中是否存在HIV、HBV和/或HCV抗原(蛋白分析物)的微观流体器件600。该微观流体器件具有在电泳中使用的电极500和800以及LVR电极400。将怀疑包含HIV、HBV或HCV的生物样品引入大容量储存器(未显示)内，与对HIV、HCV和HBV蛋白分析物具有特异性的抗体混合。抗体附着有离子性部分。形成抗体/分析物络合物，该络合物在分析区700中的俘获位置(700a、700b和700c)上进行电泳(任选在分段式储存器300中进行浓缩之后)。试剂和未结合的分子流入流出物室(chamger)1000中，并可以将其移出。HIV俘获位置700a具有对HIV蛋白分析物具有特异性的抗体俘获剂。HBV俘获位置700b具有对HBV蛋白分析物具有特异性的抗体俘获剂，HCV俘获位置700c具有对HCV蛋白分析物具有特异性的抗体俘获剂。通过来自用于该病毒分析物的特异性俘获位置(700a、700b或700c)处的可检测标记物的信号，可以鉴别HIV、HBV和/或HCV的存在。图3说明的实施方式中，通过电泳经由分段式储存器(顶部)或不经由分端区(底部)将分析物从大容量储存器传送至分析区。
图7是芯片的示意图，说明了对血样是否感染HIV、HBV和HCV之类病毒的测试的实施方式。目前FDA批准的对HIV临床试验的灵敏度限度约为50个病毒拷贝/毫升(对Roche的UltraSensitive AMPLICOR HIV-1MONITOR
Figure A20068004105500331
试验而言)、1.5个病毒拷贝/毫升(对PCR技术或Bayer的Versant HIV而言)、3.0个病毒拷贝/毫升(对b-DNA技术而言)。这意味着，对于一般样品，需要完全的1毫升样品来提供用于检测的足够病毒RNA。将全部1毫升样品溶液装载于芯片中或装载于芯片上是不符合实际的。即使使用如离心、乙醇沉淀、或者先用微粒再通过洗提来俘获目标RNA的预备步骤来浓缩样品，最终样品的体积也为几十或几百微升。由于微观流体芯片中的测试区一般为几个至几百微米，所以即使是大型芯片能够操作的体积也仅为几个纳升。使制备的全部样品溶液移动至芯片中经过检测区并且留出足够的时间使分析物接触特异性分析区中的检测剂从而实现结合需要大量的时间。从而导致获得测试数据需要长得令人无法接受的周转时间。因此，目前使用检测芯片的操作方法一般使用PCR反应的产物，PCR反应对应用于芯片的分析物进行了高度浓缩。
但是，使用本文揭示的方法和装置能够通过电泳将病毒RNA或DNA从大样品传送至芯片的分析区，其间可以选择传递经过分段式储存器从而将样品浓缩至能够在芯片上进行检测的浓度。图7显示了检测血样中病毒核酸或蛋白的示范性测试的表格。图7示出芯片600能够通过在电极(400、800)之间以箭头所示方向施加的电场下电泳，将多个样品(位于分段式储存器300内)中的分析物传送经过分析区中的多个检测位置700。检测位置700被标记为“HIV”、“HBV”和“HCV”，用以表示存在对来自这些病毒的蛋白或核酸具有特异性的俘获剂，或者用以结合与一种病毒特异性地缔合的结合部分等。在该实施例中，同时测试四个样品。在另一种实施方式中，采用除了电泳之外的技术(例如使用蠕动泵)从分段式储存器传送分析物。
实施例2：病毒核酸分析物的HIV/HBV/HCV试验
要检测病患样品中的病毒核酸分析物，在大容量储存器内的病患样品中添加离子性或非离子性去污剂以破坏病毒膜并且暴露出核酸。如果使用非离子性去污剂并且样品具有低离子含量，则可以通过电泳直接驱使病毒核酸进入分析区700。或者，通过电泳先驱使病毒核酸至分段式储存器300。随后通过电泳或微型泵之类的其他手段将这些病毒核酸从分段式储存器传递至分析区700。
如果使用离子性去污剂，则进一步的样品制备如下所述。向包含病毒RNA或DNA分析物的样品中添加与互补核酸或类似物(结合剂)共轭的磁性微粒。病毒RNA或DNA结合至微粒上的结合剂。进行洗涤步骤以去除过量去污剂之后，使用脲之类的变性剂或进行加热使病毒核酸从微粒上解离。然后通过电泳将病毒核酸传递至分析区700或者将病毒核酸浓缩在分段式储存器300中。
浓缩在分段式储存器300中之后，通过电泳传递核酸分析物经过在特定位置的微观流体器件600上的特异性俘获位置(700a、700b和700c)。俘获剂是具有与特定病毒核酸分析物互补的序列的核酸或它们的类似物。核酸分析物结合在对病毒为特异性的检测区处，通过应用标记物进行检测，制备所述标签的核酸或它们的类似物具有的序列与用于俘获的病毒序列之外的病毒序列片段互补。核酸检测剂与荧光染料或酶之类可检测的本体共轭，这些荧光染料或酶可以由荧光或化学发光底物检测。在微观流体器件的特异性区(700a、700b或700c)中检测到标签时，鉴别该样品为包含特定病毒。
实施例3：用于抗体分析物的HIV/HBV/HCV试验
检测病患样品中HIV、HBV或HCV病毒抗原的抗体的例子如下文所述进行：
将作为各抗体的结合剂的特异性病毒抗原经由具有限定位置的双链DNA之类的可裂解键共轭于磁性微粒。或者可以使用经过离子性部分改性的抗人Fc抗体。将微粒与来自病人的血样在大容量储存器内混合从而俘获特异性病毒抗原的抗体。进行洗涤步骤从而减少不需要的杂质之后，通过用限制酶进行裂解从微粒上释放络合物。然后通过电泳驱使络合物进入分段式储存器中。浓缩在分段式储存器中之后，将络合物驱使至分析位置(700a、700b、700c)。举例来说，要检测络合物，使对络合物中的本体之一具有专一亲合性的俘获剂共轭于各特异性位置(700a、700b和700c)处的芯片表面上，从而再次俘获络合物，由此确定样品中是否存在特定病毒抗原的抗体。例如，如果在样品制备步骤中使用病毒抗原作为磁性珠粒上的结合剂，则俘获剂可以是特异性的抗人抗体。相反，如果首先使用特异性的抗人抗体作为结合剂，则可以使用病毒抗原来再次俘获病人抗体络合物和抗人抗体。通过对络合物具有亲合性的标记剂检测再次俘获的络合物。对络合物具有亲合性的试剂可以是人抗体或合适病毒抗原的不同抗体。可以用荧光染料或者辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶之类的酶对它们作标记。或者，可以对第一结合剂进行改性，使其同时带有离子性部分和标记或用于检测的特异性互补序列。例如，可以将低聚核苷酸离子性部分共轭至第一结合剂从而提供离子电荷以及用于结合带标签的互补低聚核苷酸的序列。或者，可以对第一结合剂进行生物素化或用聚组氨酸之类的本体作标记，通过抗生物素蛋白或通过标记物共轭的抗聚组氨酸抗体进行检测。
实施例4：用于混合分析物的HIV/HBV/HCV试验
本方法可用于检测来自多种来源的混合分析物，例如来自一个来源的蛋白以及来自另一不同来源的核酸。本试验检测在相同微观流体器件上或甚至相同病患样品中的编码HIV tat的核酸、HBV衣壳蛋白、以及特异性HCV抗原的抗体。俘获位置处提供的俘获剂包括：在第一俘获位置700a中的与HIV核酸互补的核酸、在第二俘获位置700b中的特异性地结合HBV衣壳蛋白的抗体、在第三俘获位置700c中作为俘获剂特异性地结合该抗原的抗体的HCV抗原。或者，可以使用本方法检测来自病患样品的相同来源的多种分析物(例如病原特异性抗原、病原特异性DNA和病原特异性抗体)。
虽然已经参考具体实施方式详细描述了本发明，但是本领域技术人员能够认识到，修改和改进包括在以下权利要求确定的本发明范围和原理之内。本文引用的所有出版物和专利文献(专利、公开的专利申请、以及未公开的专利申请)都通过参考结合于此，各份出版物或文献都具体而个别地指出通过参考结合。引用出版物和专利文献并不意味着承认任何这些文献是相关的现有技术，也不意味着承认这些文献的内容或出版日期。已经通过书面说明和实施例描述了本发明，本领域技术人员能够认识到，本发明可以通过多种实施方式进行，以上说明书和实施例的目的是用于说明而非限制以下权利要求。

Claims (55)

1.一种将样品中所关心的分析物引至微观流体器件的方法，其包括：
在大容量储存器中提供水性样品，所述样品包含分析物并且体积大于10微升，其中所关心的分析物带电或者缔合有带电分子；
提供包括分析区的微观流体器件；
提供连接器，其中大容量储存器和微观流体器件经由连接器流体连接；
对分析物电泳，使其从大容量储存器经由连接器至微观流体器件；并且将分析物进一步传送至分析区，传送时间足以使分析区中的分析物浓度高于样品中的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在与微观流体器件流体连接的大容量储存器中提供至少一种其他水性样品，以及进一步包括用于所述其他水性样品的至少一个其他分析区。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，微观流体器件包括分段式储存器，其中大容量储存器和分段式储存器通过连接器流体连接。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，大容量储存器是不与所述微观流体器件整合的室。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大容量储存器是微型孔板的孔、艾本德管或试管。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述连接器是毛细管。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在电泳之前将抗体混入所述样品中，其中所述抗体特异性地结合所关心的分析物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，用至少一种离子性部分对所述抗体进行改性。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，离子性部分选自以下：核酸、多胺、硫酸化的聚糖和琥珀酰化蛋白、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙基丙烯酸、聚丙基丙烯酸、聚丁基丙烯酸、聚马来酸、硫酸葡聚糖、肝素、透明质酸、多硫酸盐、多磺酸盐、聚乙烯基磷酸、聚乙烯基膦酸、聚羟基丁酸、聚马来酸的共聚物、和混合的聚合物。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在电泳之前将抗体混入所述样品中，其中所述抗体特异性地结合所关心的分析物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在将所关心的分析物传送至所述分段式储存器之前去除所述抗体。
12.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物与离子性部分共价结合。
13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物通过结合至带离子性电荷的载体分子或者被改性为带有离子性电荷的载体分子而与带电分子缔合。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述载体分子选自抗体、受体、配体和抗原。
15.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所关心的分析物是生物分子。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物分子选自肽、蛋白、核酸、脂类和糖。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所关心的分析物是核酸。
18.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，分析区包括含有俘获剂的俘获位置，所述方法进一步包括在由俘获剂俘获所关心的分析物的条件下将分析物传送经过俘获位置。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将分析物传送至分析区时，分析物与抗体结合。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，抗体与带电分子共价结合或非共价结合。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，从大容量储存器电泳至微观流体器件时的分析物与所述与带电分子共价结合或非共价结合的抗体结合。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，分析物经过电泳从大容量储存器至分段式储存器。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析物被传送至分析区时与核酸结合。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，分析物被传送至分析区时与所述核酸结合。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，从大容量储存器电泳至微观流体器件时的分析物与所述核酸结合。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，分析物经过电泳从大容量储存器至分段式储存器。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析物被传送至分析区时与选自以下的离子性部分结合：核酸、多胺、硫酸化的聚糖和琥珀酰化的蛋白、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙基丙烯酸、聚丙基丙烯酸、聚丁基丙烯酸、聚马来酸、硫酸葡聚糖、肝素、透明质酸、多硫酸盐、多磺酸盐、聚乙烯基磷酸、聚乙烯基膦酸、聚羟基丁酸、聚马来酸的共聚物、和混合的聚合物。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，从大容量储存器电泳至微观流体器件时的分析物与所述离子性部分结合。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，分析物经过电泳从大容量储存器至分段式储存器。
30.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述传送通过电泳进行。
31.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括检测被俘获剂结合的分析物。
32.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述俘获剂结合分析物或离子性部分。
33.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述俘获剂是抗体或核酸。
34.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品的体积约为20微升至50毫升。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述样品的体积约为50微升至20毫升。
36.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品的体积大于约20微升。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述样品的体积大于约50微升。
38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括检测分析物、离子性部分或抗体上的标记物。
39.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在电泳之前将所关心的分析物固定在微粒上。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述微粒是磁性微粒。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述微粒涂布有至少一种受体、抗体或抗配体，所述受体、抗体或抗配体特异性地结合所关心的分析物。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括在电泳之前从微粒上分离出分析物的步骤。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述微粒涂布有至少一种抗体，所述至少一种抗体结合所述分析物或者结合包括所述分析物的一组分子。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，第二抗体结合至所述分析物的不同位置。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，检测包括检测所述第二抗体上的标记物。
46.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗体经过改性而与离子性部分缔合。
47.一种用于检测分析物的微观流体器件，其包括：
a)与分析区流体连通的分段式储存器，所述分析区包含用以俘获以下物质的俘获剂：(i)分析物、(ii)抗体或(iii)核酸；
b)位于分段式储存器中的第一微电极，远离分析区至少一个部分的第二微电极，所述微电极的设置使得能够在电极之间产生电场，并且，带电分析物得以在电极之间发生电泳。
48.一种将样品中的带电分析物引至微观流体器件的系统，其包括：
至少一个大容量储存器，以可操作的方式连接第一电极；
具有至少一个分析区的微观流体器件，其中所述微观流体器件以可操作的方式连接第二电极；
用于将带电分析物从所述大容量储存器移动至所述微观流体器件的至少一个连接器。
49.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述至少一个连接器是毛细管。
50.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述微观流体器件包括分段式储存器，所述大容量储存器通过连接器与所述分段式储存器流体连接。
51.如权利要求48所述的系统，其特征在于，分析区包括俘获位置。
52.如权利要求51所述的系统，其特征在于，该系统包括多个大容量储存器，各大容量储存器与独立的分段式储存器流体连接。
53.如权利要求48所述的系统，其特征在于，该系统包括多个大容量储存器和多个连接器，用以将带电分析物移动至微观流体器件和多个分析区。
54.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述第二电极以可操作的方式连接分析区。
55.如权利要求50所述的系统，其特征在于，所述第二电极以可操作的方式连接所述分段式储存器。
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