ES2558797T3 - Detección microfluídica de analitos - Google Patents

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ES2558797T3 ES06825530.6T ES06825530T ES2558797T3 ES 2558797 T3 ES2558797 T3 ES 2558797T3 ES 06825530 T ES06825530 T ES 06825530T ES 2558797 T3 ES2558797 T3 ES 2558797T3
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Abstract

Un método para introducir un analito de interés de una muestra en un dispositivo microfluídico, que comprende: proporcionar una muestra acuosa en un depósito de gran volumen, conteniendo dicha muestra el analito y teniendo un volumen mayor de 1 microlitro, en donde el analito de interés está cargado o se ha asociado a una molécula cargada; someter el analito a electroforesis por medio de un conector desde el depósito de gran volumen a un depósito de agrupamiento colocado en el dispositivo microfluídico durante el tiempo suficiente para que dé como resultado una concentración más alta del analito en el depósito de agrupamiento que la concentración en la muestra, en donde el depósito de agrupamiento comprende un microelectrodo localizado en él; y transportar el analito desde el depósito de agrupamiento a un área de análisis situada en el dispositivo microfluídico durante un tiempo suficiente para que dé como resultado una concentración de analito mayor en el área de análisis que la concentración en la muestra, en donde el área de análisis comprende un sitio de captura que comprende un agente de captura, comprendiendo además dicho método el transporte del analito a través del sitio de captura en condiciones en las que el analito de interés es capturado por el agente de captura; en donde dicho analito está unido covalentemente a un resto iónico o está asociado a una molécula marcada estando unido a una molécula portadora seleccionada de entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un receptor, un ligando y un antígeno, y dicha molécula portadora está cargada iónicamente o está modificada para ser cargada iónicamente.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion microfluidica de analitos Campo de la invencion
La invencion se refiere a la microfluidica y la deteccion de analitos presentes en bajas concentraciones en una muestra.
Antecedentes de la invencion
Los sistemas microfluidicos tienen un gran potencial para su uso en una instalacion de laboratorio clinico. Sin embargo, estos dispositivos estan limitados por el hecho de que solo tienen capacidad para volumenes de muestra muy pequenos, normalmente en el orden de pocos microlitros o menos. Cuando las sustancias que se van a analizar se encuentran con una concentracion muy baja en una muestra, la sensibilidad puede estar limitada. Una manera de superar esta limitacion es utilizando una etapa de amplificacion del analito para aumentar la concentracion de analito, antes o despues de la introduccion de la muestra en un dispositivo microfluidico. Por ejemplo, se pueden amplificar cantidades muy pequenas de acidos nucleicos utilizando metodos tales como la PCR. Sin embargo, no todos los analitos se pueden amplificar e incluso cuando es posible, la amplificacion puede necesitar reactivos adicionales y aumentar la complejidad de los analisis. Serian de mucho valor nuevos metodos que permitieran el ensayo de analitos con un formato microfluidicos en muestras de gran volumen y/o que permitieran los analisis sin una etapa de amplificacion para ensayos en laboratorios clinicos y otros. La presente invencion cumple con estas y otras muchas necesidades.
El documento WO 01/69230 describe un metodo para efectuar la concentracion de un analito polar en un campo electrico alterno. La solicitud japonesa S57-53419 describe un dispositivo de electroforesis capaz de concentrar un componente determinado en una muestra antes del analisis por electroforesis convencional.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para introducir el analito de interes de una muestra en un dispositivo microfluidico, de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Tambien se describe en el presente documento un metodo para introducir o aplicar un analito de interes de una muestra en un dispositivo microfluidico proporcionando una o mas muestras acuosas en uno o mas depositos de gran volumen, conteniendo las muestras el analito y teniendo un volumen mayor de 10 microlitros, y el analito de interes esta cargado o asociado con una molecula cargada, tal como una molecula ionica o una molecula portadora que esta cargada. Las siguientes etapas implican que se proporcione un dispositivo microfluidico que comprende un area de analisis, que proporciona uno o mas conectores, en el que el deposito(s) de gran volumen y el dispositivo microfluidico estan conectados fluidicamente por medio del conector, y realizar la electroforesis del analito desde el deposito de gran volumen al dispositivo microfluidico y a traves del area de analisis durante un tiempo suficiente para que de como resultado una concentracion de analito en el area de analisis mayor que la concentracion en el deposito de gran volumen y/o en la muestra. El deposito de gran volumen puede ser una placa con micropocillos, un tubo de Eppendorf®, o un tubo de ensayo. El deposito de gran volumen puede ser un pocillo que es parte integral del dispositivo microfluidico. El conector puede ser un tubo capilar. En un aspecto de la invencion, el analito de interes es una biomolecula, tal como un peptido, una proteina, un acido nucleico, un lipido o un azucar. El analito asociado con una molecula cargada puede ser, por ejemplo, un analito unido a un resto ionico o un analito unido a un anticuerpo que esta cargado ionicamente.
Como se describe en el presente documento, la muestra se puede mezclar primero con un anticuerpo, y el anticuerpo se une al analito de interes. El anticuerpo se puede modificar con al menos un resto ionico. De manera alternativa, el analito de interes se puede modificar para que tenga carga, por ejemplo con un anticuerpo o un resto ionico.
Como se describe en el presente documento, el area de analisis es un sitio de captura y el metodo implica el movimiento de la(s) molecula(s) cargada(s) a traves del sitio de captura, el sitio de captura incluye al menos un agente de captura y esto permite que se capture el analito de interes. El movimiento sobre el area de captura puede ser por electroforesis. El metodo puede incluir ademas la deteccion del analito unido al agente de captura. El agente de captura se puede unir al analito o al resto ionico. El agente de captura puede ser un anticuerpo o un acido nucleico. La deteccion puede implicar la deteccion de un marcador en el anticuerpo, el analito o el resto ionico.
Como se describe en el presente documento, el metodo implica proporcionar un deposito de agrupamiento, tal que el deposito de gran volumen y el deposito de agrupamiento estan unidos fluidicamente por medio del conector.
En un aspecto de la invencion, la muestra tiene un volumen de desde aproximadamente 20 pl a 50 ml, preferentemente desde 50 pl a 20 ml. De manera alternativa, la muestra tiene un volumen mayor de
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aproximadamente 20 pi, preferentemente mayor de aproximadamente 50 pi.
En un aspecto de ia invencion, ei anaiito de interes esta unido a una microparticuia antes de ia eiectroforesis. La microparticuia puede ser una microparticuia magnetica. Preferentemente ia microparticuia esta revestida con ai menos un receptor, anticuerpo o anti-iigando especifico para ei anaiito de interes. Ei metodo puede inciuir ia etapa de separacion dei anaiito de ia microparticuia antes de eiectroforesis. Ei anticuerpo puede reconocer ei anaiito. Puede proporcionarse un segundo anticuerpo y se puede unir a un sitio diferente dei anaiito. La deteccion puede impiicar ia deteccion de un marcador en ei segundo anticuerpo.
En un aspecto mas, ei resto ionico se puede unir en cuaiquier etapa antes de ia eiectroforesis por medio de una union indirecta. La union indirecta puede ser por medio de una union a avidina/biotina.
Se describe en ei presente documento un sistema para introducir o apiicar un anaiito cargado de una muestra en un dispositivo microfiuidico que tiene un area de anaiisis, en ei que ei sistema inciuye ai menos un deposito de gran voiumen, unido operativamente a un primer eiectrodo, ai menos un area de anaiisis, unida operativamente a un segundo eiectrodo, y ai menos un conector para mover ias moiecuias cargadas desde ei deposito de gran voiumen, en que ei deposito de gran voiumen y ei area de anaiisis estan en comunicacion fiuidica. Ei ai menos un conector puede ser un tubo capiiar. Ei dispositivo microfiuidico puede inciuir un deposito de agrupamiento, con ei deposito de gran voiumen conectado fiuidicamente ai deposito de agrupamiento por medio dei conector. Ei area de anaiisis puede inciuir un sitio de captura. Ei sistema puede inciuir muitipies depositos de gran voiumen conectados fiuidicamente con depositos de agrupamiento separados.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 iiustra un sistema para concentrar ias muestras para ia introduccion en un dispositivo microfiuidico.
Las Figuras 2A-C iiustran tres reaiizaciones dei sistema para concentrar anaiitos. La Figura 2A iiustra una reaiizacion en ia que ios anaiitos se acumuian en ei deposito de agrupamiento. La Figura 2B iiustra una reaiizacion en ia que ios anaiitos no se acumuian, sino que hay un fiujo continuo sobre ei dispositivo microfiuidico y a traves dei area de anaiisis. La Figura 2C iiustra una reaiizacion en ia que ei deposito de gran voiumen esta integrado en ei dispositivo microfiuidico.
La Figura 3 iiustra un dispositivo microfiuidico que es capaz de detectar muitipies anaiitos de una o varias muestras.
La Figura 4 es un diagrama que iiustra una reaiizacion de ia invencion en ia que un anticuerpo marcado con un resto ionico se une a un anaiito de interes en un deposito de gran voiumen (LVR) y forma un compiejo, y ei compiejo se somete a eiectroforesis en un dispositivo microfiuidico. Ei dispositivo microfiuidico tiene un agente de captura (un segundo anticuerpo especifico para ei anaiito de interes pero que reconoce un epitopo diferente) unido ai mismo.
La Figura 5 es un diagrama que iiustra una reaiizacion de ia invencion en ia que ias microparticuias a ias que se unen ios anticuerpos primarios se utiiizan como una fase soiida a ia que se une ei anaiito en un deposito de gran voiumen. Se anade un segundo anticuerpo, marcado con un resto ionico, y tambien se une ai anaiito. Los anticuerpos primarios se escinden para iiberar ei compiejo de anaiito de ias microparticuias, y ei compiejo se somete a eiectroforesis en un deposito de agrupamiento. Ei compiejo se captura en ei dispositivo microfiuidico utiiizando un agente de captura especifico para ei resto ionico.
La Figura 6 iiustra una reaiizacion simiiar a ia que se iiustra en ia Figura 5, en ia que ei anaiito de interes iniciaimente se une a microparticuias. Se une un resto ionico ai anticuerpo unido a ia microparticuia utiiizando una union de tipo biotina/avidina. Ei anticuerpo se escinde para iiberar ei anaiito de ia microparticuia y se introduce en ei dispositivo microfiuidico por eiectroforesis. Ei compiejo se captura en ei dispositivo microfiuidico utiiizando un segundo anticuerpo especifico dei anaiito.
La Figura 7 muestra un diagrama de un formato de ensayo a modo de ejempio para ia deteccion de acidos nucieicos o proteinas viricos en una muestra de sangre. Los anaiitos de muitipies muestras se transportan (por ejempio, por eiectroforesis) sobre muitipies sitios de deteccion en ias areas de anaiisis.
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Descripcion detallada de la invencion
I. introduction
La microfluidica es la ciencia que disena, fabrica y utiliza dispositivos y procesos que tratan con volumenes de fluido del orden de nanolitros o picolitros. Normalmente, un dispositivo microfluidico tiene al menos un canal o recipiente con un tamano menor de 1 mm, en al menos una dimension. El dispositivo puede tener al menos un canal o recipiente con un tamano menor de 0,5, 0,2 mm, o 0,1 mm en al menos una dimension. Los dispositivos microfluidicos pueden tener adicionalmente microbombas, valvulas, reguladores de temperatura, etc.
Se conocen varios metodos y estrategias para fabricar dispositivos microfluidicos, incluyendo el microensamblaje, metodos de microfabricacion a maquina en masa, metodos de micro- fabricacion a maquina en superficie, metodos litograficos de referencia, grabado humedo, grabado ionico reactivo, grabado con plasma, estereolitografia y metodos de escritura tridimensional quimica por laser, metodos de litografia suave, metodos de ensamblaje modular, metodos de moldeado de replicas, metodos de moldeado por inyeccion, metodos de moldeado en caliente, metodos de ablacion por laser, combinaciones de metodos, y otros metodos que se conocen en la tecnica. Sera evidente para los expertos en la tecnica que varias de estas estrategias se pueden adaptar para su uso de acuerdo con la presente invencion. Para un revision general de los dispositivos microfluidicos vease, por ejemplo, Chovan, et al. "Microfabricated devices in biotechnology and biochemical processing" Trends Biotechnol. 2002 20:116-22; Anthony et al. "DNA array technology and diagnostic microbiology" Expert Rev. Mol. Diagn. 2001 1:30-8; Windman et al. "Microfluidics for ultrasmall-volume biological analysis" Adv. Chromatogr. 2003, 42:241-67; y Ng et al. "Biochips beyond DNA: technologies and applications" Biotechnol Annu Rev. 2003, 9:1-149; Fiorini y Chiu, 2005, "Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application" Biotechniques 38:429-46; Beebe et al., 2000, "Microfluidic tectonics: a comprehensive construction platform for microfluidic systems." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1348813493; Rossier et al., 2002, "Plasma etched polymer microelectrochemical systems" Lab Chip 2:145-150; Becker et al., 2002, "Polymer microfluidic devices" Talanta 56:267-287; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21 :12-26; documento US 6.767.706 B2, por ejemplo, la Seccion 6.8 "Microfabrication of a Silicon Device"; Terry et al., 1979, A Gas Chromatography Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer, IEEE Trans, en Electron Devices, v. Ed-26, pp. 1880-1886; Berg et al., 1994, Micro Total Analysis Systems, Nueva York, Kluwer; Webster et al., 1996, Monolithic Capillary Gel Electrophoresis Stage with On- Chip Detector in International Conference On Micro Electromechanical Systems, MEMS 96, pp. 491496; Unger et al., 2000, Science 288:113-16; Pat. de EE. UU N° US 6.960.437 (Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices); Quake y Scherer, 2000, "From micro to nanofabrication with soft materials" Science 290:1536-40; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21:12-26. Tambien se describen en la tecnica microelectrodos adecuados para su uso en los dispositivos microfluidicos. Tambien se describen en la tecnica metodos para inmovilizar proteinas, acidos nucleicos u otras moleculas en una superficie del dispositivo (por ejemplo, en un canal microfluidico).
Los dispositivos microfluidicos (a veces denominados “chips”) se pueden utilizar en diversas aplicaciones biomedicas y farmaceuticas, que incluyen analisis, preparacion y sintesis de compuestos quimicos y analisis y manipulacion de celulas, proteinas y acidos nucleicos. Las ventajas de la miniaturizacion incluyen el consumo muy reducido de reactivos, tiempos de reaccion mas cortos, y el potencial de un rendimiento muy alto utilizando el ensayo paralelo masivamente. Sin embargo, un aspecto de esta miniaturizacion se convierte en un obstaculo significativo que limita la sensibilidad de estos procedimientos. Los chips microfluidicos manejan solo volumenes minimos de soluciones de muestra, y puede haber insuficientes moleculas de analito en el volumen muy pequeno que se aplica al chip para que se detecten facilmente. Por lo tanto, a menudo se utiliza una etapa de amplificacion, tal como la PCR, para tratar la muestra para su uso con un dispositivo microfluidico, sea antes o despues de la introduccion de la muestra en el dispositivo. Sin embargo, esto tiene la desventaja de aumentar el coste y la complejidad, y que permite posibles resultados aberrantes debido a errores de la PCR. Algunos dispositivos microfluidicos se disenan para recibir un volumen de muestra algo mas grande exponiendo la superficie entera del chip a la solucion de muestra entrante. Esto permite un volumen de muestra relativamente grande que se va a aplicar ya que se utiliza toda la superficie del chip para recibir la muestra, pero aun asi el volumen de la muestra que se puede procesar es limitado. Ademas, esto limita la deteccion a una muestra cada vez y se necesita que se ensayen secuencialmente diferentes soluciones de muestra. Para ensayar multiples muestras, no solo se consume mucho tiempo, sino que tiene la desventaja adicional del riesgo de contaminacion cruzada entre las muestras.
Los metodos y aparatos que se desvelan en el presente documento superan la limitacion de baja capacidad de volumen en los dispositivos microfluidicos utilizando una electroforesis para concentrar y/o controlar el transporte del material analito, de forma que se pueden aplicar para facilitar las reacciones o analisis y se utilizan en un formato de chip tipico. El analito se somete a electroforesis por medio de una solucion acuosa de tampon sin el uso de geles de exclusion por tamano, un medio viscoso, filtros, tamices biologicos o similares. El metodo permite que se apliquen multiples muestras en multiples areas especificas del chip. Debido a que cada muestra se somete a electroforesis por separado hacia una parte diferente del chip para el analisis, las muestras separadas no entran en contacto con la misma superficie. Esto tiene la ventaja de la reduccion de la contaminacion cruzada.
Se describen en el presente documento metodos y dispositivos para analisis microfluidico de uno o mas analitos a
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partir de una muestra de gran volumen. Debido a que se aumenta la capacidad de volumen de muestra de un dispositivo por los metodos desvelados en el presente documento, se reduce la concentracion detectable minima (la concentracion de analito mas baja que el ensayo puede medir fiablemente) de un ensayo utilizando el dispositivo.
Los metodos y dispositivos que se describen en el presente documento permiten al investigador o clinico extraer el analito de un gran volumen de muestra, detectar e identificar el analito. Este metodo es adecuado para su uso con una amplia diversidad de analitos, incluyendo proteinas especificas y secuencias de polinucleotidos. Ademas de la capacidad para analizar multiples muestras en un unico chip simultaneamente, las realizaciones del metodo permiten concentrar una muestra grande en el chip sin un flujo continuo de la muestra al deposito de concentracion o el chip.
La Figura 1 se proporciona para ayudar a comprender la invencion. Se apreciara que la Figura 1 es para ilustrar y no se pretende que limite la invencion de ninguna manera. El sistema que se muestra en la Figura 1 incluye un deposito de gran volumen (LVR) 100 en el que se puede introducir una muestra que contiene un analito, un deposito de agrupamiento 300 integrado en el dispositivo microfluidico 600 (a veces denominado “chip”), un conector 200 a traves del cual se transporta electroforeticamente un analito del deposito de gran volumen al deposito de agrupamiento, y un area de analisis 700 en el que se puede detectar un analito. En general, el area de analisis es un canal microfluidico por el que puede fluir el fluido que contiene el analito y/o que puede contener una solucion acuosa de tampon por medio del cual se puede transportar el analito. De manera alternativa, el area de analisis puede ser un pocillo o una camara que comprende agentes de captura inmovilizados. En algunas realizaciones al menos una parte de la carcasa o el material que rodea el area de analisis es transparente, para facilitar la deteccion de la senal del area de analisis (por ejemplo, las emisiones fluorescentes). Como con el conector, la solucion acuosa por la cual se transporta el analito en el area de analisis no contiene generalmente geles de exclusion, un medio viscoso, filtros, tamices, etc. para la separacion del analito. Los electrodos 400 y 500 se colocan de forma que cuando se aplica un potencial electrico a los electrodos (es decir, una carga positiva se aplica a un electrodo y una carga negativa se aplica al otro) el analito cargado se transporta por medio de la solucion a la region apropiada del dispositivo (por ejemplo, el deposito de agrupamiento). Se pueden colocar opcionalmente electrodos adicionales 800 para transportar el analito por el area de analisis 700. En algunas realizaciones, no se incluyen electrodos del deposito de agrupamiento 500. Los electrodos se pueden integrar en el LVR o el deposito de agrupamiento o pueden ser electrodos externos situados en la camara del deposito en contacto con la muestra u otra solucion. La bateria 900 es cualquier suministro electrico o fuente de corriente electrica adecuada para electroforesis (por simplicidad, en la Figura 1 solamente se muestra un LVR conectado a la bateria).
El area de captura normalmente incluye “agentes de captura” asociados con el sustrato en el area de analisis del dispositivo. Los agentes de captura (que se tratan en detalle posteriormente) son agentes que se unen especificamente al analito, una molecula portadora, un resto ionico, u otra molecula asociada con el analito). Los ejemplos de agentes de captura incluyen anticuerpos y polinucleotidos. Normalmente los agentes de captura se inmovilizan en un “sitio de captura” del area de analisis (una superficie fisica del dispositivo microfluidico que puede modificarse por la union de al menos un agente de captura, preferentemente al menos dos y mas preferentemente una matriz de moleculas de agentes de captura). De manera alternativa, en otras realizaciones, el area de analisis no incluye un agente de captura y la muestra se analiza (detecta) segun fluye a traves de un detector.
En la operacion del sistema, una solucion de muestra (por ejemplo, un liquido acuoso que contiene, o se sospecha que contiene el analito) se introduce en un deposito de gran volumen 100. El deposito o depositos de gran volumen pueden estar integrados en el dispositivo microfluidico 600, no integrados sino conectados fisicamente con el dispositivo microfluidico, o no integrados ni conectados sino situados cerca del dispositivo. Por ejemplo, el deposito o depositos de gran volumen pueden ser uno o mas recipientes separados, tales como cualquiera de diversos recipientes para albergar liquidos, incluyendo pero sin limitarse a: un tubo de ensayo, un tubo de microcentrifuga, un pocillo de una placa de micropocillos, una placa de cultivo tisular, y similares. La capacidad de liquido del deposito de gran volumen puede variar desde aproximadamente 10 pl a aproximadamente 100 ml, y puede ser de al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1000 o al menos 5000 microlitros. La capacidad de liquidos del LVR esta mas a menudo en un intervalo de aproximadamente 100 pl a aproximadamente 2 ml. Se pueden asociar uno o mas depositos de gran volumen con un unico chip. En algunas realizaciones se asocian 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175, 200, 250 o mas depositos de gran volumen con un unico dispositivo. Por ejemplo, si se utiliza una placa de microtitulacion que tiene 100 pocillos, el numero de depositos de gran volumen puede ser 100.
De acuerdo con la invencion, el analito se transporta electroforeticamente por medio del conector 200 al deposito de agrupamiento 300. Electroforesis se refiere al movimiento de moleculas o particulas en solucion cargadas en respuesta a un campo electrico. La movilidad del analito se basa en (1) una carga neta de la molecula de analito por si misma y/o (2) una carga neta de un resto ionico asociado con el analito, como se describe posteriormente. Una carga neta es la carga ionica de combinacion que tiene una molecula, esta puede ser positiva, negativa o neutra. Como se senalo anteriormente, el analito se puede someter a electroforesis por medio de una solucion acuosa de tampon sin el uso de geles de exclusion por tamano, un medio viscoso, filtros, tamices biologicos o similares. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “electroforesis por medio de una solucion acuosa” se utiliza para
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significar que no se utiliza ningun medio de exclusion por tamano o filtros.
El conector 200 a traves del cual viaja el analito puede tener cualquiera de diversas formas y se puede hacer de cualquier material compatible con el analito y que no interfiera con el movimiento del analito cargado y/o la electroforesis. Los metodos para conectar las fuentes externas o los tubos para los dispositivos microfluidicos se conocen y se pueden utilizar para conectar en la presente invencion. En algunas realizaciones, el conector tiene multiples regiones con diferentes dimensiones. Para la conexion entre el deposito de gran volumen y el deposito de agrupamiento o el area de analisis, el conector 200 puede tener secciones de diametro decreciente. Esto se puede formar conectando tubos o canales rectos o ahusados de diametros en disminucion y de diferentes materiales. En algunas realizaciones en las que el LVR no esta integrado en el chip, una parte del conector puede comprender una porcion de tubo en el que se transporta el analito desde el deposito de gran volumen a un canal en el dispositivo microfluidico, y una parte del conector puede comprender un canal microfluidico en el chip (“parte de canal microfluidico del conector”) transportandose entonces el analito a traves del canal al deposito de agrupamiento 300. Los canales se pueden fabricar para que tengan varias formas y dimensiones utilizando, por ejemplo, el moldeado de elastomeros bien desarrollado, fotolitografia o metodos de micro-fabricacion. En algunas realizaciones el conector esta completamente fuera del chip. En una realizacion, el deposito de gran volumen esta integrado en el dispositivo y el conector 200 es un canal microfluidico integrado en el dispositivo microfluidico.
Para los tubos, hay tambien una amplia diversidad de tamanos y materiales que se pueden seleccionar. Se pueden encontrar ejemplos de metodos para formar estos tipos de conectores, por ejemplo, en Douglas Smith, Engineering and Science, publicado por California Institute of Technology, 2003 volumen LXVl, Numero 2, paginas 8-18; Skelley AM et al., Proc Natl Acad Sci USA. 25 de Ene de 2005; 102(4):1041 -6; Manz, A. y Becker, H., "Microsystem Technology in Chemistry and Life Sciences" publicado por Springer-Verlag, 1999. Los tubos a modo de ejemplo incluyen tubos de acero inoxidable, agujas, tubos hechos de material plastico tal como polipropileno, politetrafluoroetileno, Teflon, polivinilcloruro, PEEK™ o PEEKsil™, silicio o vidrio fundido. Los tubos adecuados tienen habitualmente un diametro interno de varios milimetros a micrometros, que incluyen pero sin limitacion aproximadamente 10 mm, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm, 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm, 0,5 mm, 0,1 mm, 90 pm, 80 pm, 70 pm, 60 pm, 50 pm, 40 pm, 30 pm, 20 pm, 10 pm, 9 pm, 8 pm, 7 pm, 6 pm, 5 pm, 4 pm, 3 pm, 2 pm, 1 pm. A menudo las dimensiones internas de un conector estan en el intervalo de 5 mm a 50 pm.
El deposito de agrupamiento 300, si esta presente, esta integrado en el dispositivo microfluidico y normalmente tiene una capacidad desde aproximadamente 0,1 pl a aproximadamente 2 pl, incluyendo, pero sin limitacion a 1 pl a 1 pl, y 10 pl a 0,5 pl. El deposito de agrupamiento esta en comunicacion fluidica con el area de analisis del dispositivo, de modo que se puede transportar un analito desde el deposito de agrupamiento al area de analisis cuando las compuertas o valvulas adecuadas estan abiertas. La relacion de volumenes en el deposito de gran volumen y el deposito de agrupamiento puede variar considerablemente, pero en algunas realizaciones, las relaciones son desde aproximadamente 100:1 a 1000:1, incluyendo pero sin limitacion, mas de 100:1, mas de 200:1, mas de 300:1, mas de 500:1, mas de 800:1, y mas de 1000:1.
Para generar el campo electrico necesario para transportar el analito desde el deposito de gran volumen al deposito de agrupamiento, se situan electrodos para generar tal campo. Normalmente los electrodos se situan en cada uno de los depositos (es decir el LVR y el deposito de agrupamiento). La localizacion del electrodo en el LVR puede variar, pero preferentemente esta a alguna distancia de la apertura del conector 200, y preferiblemente en el sitio o distancia mas lejana de la apertura. Los electrodos se pueden unir o colocar de cualquier manera que permita que se genere un campo electrico para electroforesis cuando la corriente se conecta y este presente una solucion para completar un circuito. Por ejemplo y sin limitacion, los electrodos se pueden insertar en el liquido de un deposito. De manera alternativa, el electrodo puede estar integrado en la camara o dispositivo microfluidico (por ejemplo, incorporado en la pared de un deposito o camara). Los microelectrodos se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, la Publicacion de Patente internacional WO 04044575A2; Rongsheng et al., 2005, Anal. Chem 77:4338-47; Abad-Villar et al, 2005, Electrophoresis 26:3602-3608).
Ademas, la polaridad de los electrodos en el dispositivo o sistema pueden cambiarse (por ejemplo, de una carga negativa a una positiva) durante el funcionamiento del dispositivo. Un analito cargado migra desde un electrodo(s) de carga similar hacia un electrodo(s) de carga opuesta. Por lo tato, por ejemplo, un analito cargado negativamente se puede transportar por electroforesis desde un LVR que tiene un electrodo cargado positivamente (anodo) a un deposito de agrupamiento que tiene un electrodo cargado negativamente (catodo). El analito se puede transportar entonces desde el deposito de agrupamiento a un area de analisis desconectando la corriente del electrodo del LVR, cambiando la polaridad del electrodo del area de agrupamiento a positiva, y conectando un electrodo colocado en o mas alla del area de analisis, de modo que el analito se transporta por o a traves del area de analisis. La velocidad de migracion depende de la fuerza del campo, la carga neta, el tamano y forma de las moleculas y tambien la fuerza ionica, viscosidad y temperatura del medio en el que se mueven las moleculas.
Las Figuras 2A-C ilustran otras realizaciones del sistema. La Figura 2A ilustra una realizacion en la que el analito se acumula en un deposito de agrupamiento 300. En esta realizacion, el electrodo 500 del dispositivo microfluidico 600 puede cambiar de positivo a negativo segun se necesite. Por ejemplo, cuando un analito cargado negativamente se
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concentra o acumula en el deposito de agrupamiento 300, el electrodo 500 esta cargado positivamente. Luego con el fin de realizar la electroforesis del analito hacia el area de analisis 700, el electrodo 500 esta cargado negativamente y el electrodo 800 en el area de analisis esta cargado positivamente. La Figura 2B ilustra una realizacion en la que los analitos no se acumulan en un deposito de agrupamiento 300, sino que fluyen continuamente sobre el dispositivo microfluidico 600 y a traves o hacia el area de analisis 700. La Figura 2C ilustra una realizacion en la que el deposito de gran volumen 100 esta integrado en el dispositivo microfluidico 600, y esta conectado con el deposito de agrupamiento por el conector 200.
Los reactivos que se utilizan para la captura y analisis del analito se pueden pre-colocar en los canales del dispositivo microfluidico (por ejemplo, agentes de captura inmovilizados en el sustrato del area de analisis), se pueden introducir desde el deposito de gran volumen junto con el analito, o se pueden introducir en el chip. Por ejemplo, los reactivos se pueden introducir en el deposito de agrupamiento, area o canales de analisis, por metodos conocidos en la tecnica en cualquier punto apropiado para el ensayo. Los metodos de introduccion variaran con el diseno especifico del dispositivo. Como ilustracion, los reactivos se pueden introducir en el area de analisis por medio de un canal de entrada en comunicacion fluida con el area de analisis abriendo una valvula que separa el canal de entrada y el area de analisis.
II. El analito
El analito (o “analito de interes”) es una molecula, un complejo de moleculas o particula que se mide o detecta utilizando los metodos de la invencion. Como se ha senalado anteriormente, un analito tiene una carga neta y/o se puede asociar con una molecula cargada, de modo que el analito se puede concentrar electroforeticamente como se describe en el presente documento. En una realizacion, el analito se asocia con uno o mas restos ionicos, que portan una carga. De manera alternativa, el analito se puede asociar con una molecula cargada uniendose a una molecula portadora cargada, tal como un anticuerpo, un receptor, un ligando, un sustrato, o un antigeno. La molecula portadora puede estar cargada intrinsecamente o se puede modificar para que este cargada uniendola a un resto ionico.
Ejemplos de analitos incluyen, pero sin limitacion, proteinas, complejos de proteinas, virus, acidos nucleicos, metales pesados, farmacos, esteroides, y pesticidas, y carbohidratos. Preferentemente, los analitos son biomoleculas (una clase de molecula que se produce en o por una celula) tales como proteinas, peptidos, polinucleotidos (por ejemplo, ARN o ADN), azucares, lipidos, glucolipidos, glucoproteinas, y similares. Ejemplos particulares de analitos incluyen biomoleculas de organismos patogenos tales como virus o bacterias, biomoleculas asociadas con enfermedad, toxinas, farmacos, moleculas pequenas, priones, acidos nucleicos que contienen mutaciones, anticuerpos y antigenos. Los analitos que se pueden analizar utilizando el metodo de la invencion pueden tener o no una carga neta en las condiciones (por ejemplo, el pH) del ensayo. Un polinucleotido es un ejemplo de un analito que esta cargado por si mismo. Un analito cargado o no, se puede modificar por union con al menos un resto ionico, para aumentar su carga. Por ejemplo, un analito se puede modificar por union a una molecula portadora que porta un resto ionico (por ejemplo un anticuerpo que porta un resto ionico de acido nucleico). Se describen posteriormente ejemplos de restos ionicos.
III. La solucion de muestra y pre-muestra
Como se utiliza en el presente documento, la “solucion de muestra” es el liquido acuoso que contiene el analito que esta presente en el deposito de gran volumen al principio de la electroforesis (es decir, el “material de partida”). En general, la solucion de muestra se genera por el procesamiento de una “pre-muestra” que contiene el analito. Tal procesamiento se lleva a cabo, por ejemplo, para purificar parcialmente o concentrar el analito, eliminar impurezas que interferirian en la electroforesis o el ensayo, y similares. Los ejemplos de las etapas de procesamiento especificas incluyen centrifugacion (para eliminar los residuos, o para fraccionar la pre-muestra), precipitacion, filtracion, cromatografia, sonicacion, o cualquier otro proceso que de como resultado un analito libre en la solucion. En una realizacion, el proceso incluye la concentracion del analito utilizando perlas, tal como perlas magneticas, que se tratan para unirse al analito. Ademas, se pueden anadir reactivos a la solucion de muestra para ajustar el pH, la fuerza ionica y/o la composicion de la solucion para facilitar la electroforesis, por ejemplo, anadiendo agentes tamponantes, acidos, bases o sales. La adicion puede implicar, por ejemplo, diluir el liquido que contiene el analito con una solucion apropiada tal como el agua o un tampon (por ejemplo, una solucion salina tamponada), resuspender el analito en una solucion apropiada, disolver solidos (por ejemplo, sales) en la solucion, y similares. Ademas, se puede modificar el analito de la solucion de muestra asociandolo con uno o mas restos ionicos, y opcionalmente con una o mas moleculas portadoras.
La fuente del analito puede ser cualquiera de una amplia diversidad de materiales, incluyendo por ejemplo, un fluido biologico, celula, o tejido, muestra ambiental (por ejemplo, suelo o agua) o un producto sintetico. Los ejemplos de pre-muestras biologicas incluyen, por ejemplo, sangre, plasma, liquido cefalorraquideo, orina, saliva, extractos celulares, extractos tisulares, extractos de cultivos tisulares, extractos de cultivos celulares, raspados bucales, y cultivos bacterianos o viricos. Otros ejemplos de pre-muestra incluyen agua de lago o de rio, fluidos del proceso alimentario, preparaciones de alimentos fabricados, extractos de frutas y verduras, y cosmeticos. La pre-muestra puede ser un liquido o un solido. Si es un solido, la pre-muestra se disuelve, solubiliza o suspende en un liquido (por
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ejemplo, un liquido acuoso) y se pueden eliminar los materiales insolubles. La Tabla 1 muestra, como ilustracion y sin limitacion, muestras y pre-muestras a modo de ejemplo.
Tabla 1: Muestras y pre-muestras a modo de ejemplo
Pre-muestra
Muestra Analito
Sangre
suero* anticuerpo anti-VIH**
orina
orina filtrada* hCG**
agua de rio
agua filtrada* antigenos de bacteria del colera **
PBMC
ADN genomico fragmento de ADN**
* En cada caso, se modifica para ajustar la fuerza ionica/pH ** En cada caso opcionalmente se modifica para asociarlo con un resto ionico.
IV. Asociacion del analito con un resto ionico
Un resto ionico es una estructura molecular que porta una carga. El resto ionico puede ser anionico (por ejemplo, polianionico) o cationico (por ejemplo, policationico). Se apreciara que la carga neta de una molecula cargada dependera en parte del entorno, particularmente del pH y la composicion en sales de la solucion de muestra. Sin embargo, el resto ionico preferentemente tiene una carga neta de al menos +5 o al menos -5. Aunque el resto ionico puede tener una densidad de carga baja o media, preferentemente el resto ionico tiene una densidad de carga alta. La densidad de carga es la cantidad de carga/por unidad de volumen de una solucion, material, etc. debida a la presencia de entidades con carga en el material. Un material que tiene una densidad de carga alta tiene mas carga por unidad de volumen, y es mas probable que atraiga entidades que tienen una carga opuesta, y repela entidades que tienen la misma carga. Normalmente, tener una densidad de carga mayor resultara probablemente en tiempos de migracion mas rapidos de una entidad cargada durante la electroforesis.
Los ejemplos de restos ionicos incluyen, como ilustracion y sin limitacion, acidos nucleicos y sus analogos naturales y sinteticos (por ejemplo, ARN, ADN, PNA), poli-aminas tales como polilisina, poli-glutamato, poli-aspartato, glucanos sulfatados y proteinas modificadas quimicamente tales como la albumina serica bovina succinilada. Otros restos ionicos incluyen el acido poliacrilico, acido polimetacrilico, acido polietilacrilico, acido polipropilacrilico, acido polibutilacrilico, acido polimaleico, sulfato de dextrano, heparina, acido hialuronico, polisulfatos, polisulfonatos, acido polivinil fosforico, acido polivinil fosfonico, copolimeros de acido polimaleico, acido polihidroxibutirico y mezclas de polimeros.
V. Asociacion del analito con un resto ionico
Antes de la electroforesis, el analito puede modificarse para asociarse con un resto ionico. La combinacion del analito y el resto ionico normalmente tiene una carga neta mayor que la del analito solo. El analito se puede modificar directamente con el resto ionico o indirectamente utilizando una molecula portadora que porta un resto ionico. Las moleculas portadoras incluyen anticuerpos que se unen al analito, polinucleotidos y otras moleculas como se analiza posteriormente.
A. Asociacion directa de un resto ionico y el analito
En algunos casos, un resto ionico se asocia directamente, sea covalente o no covalentemente, con el analito. Por ejemplo, un resto ionico de acido nucleico puede asociarse no covalentemente con un analito de acido nucleico basandose en una complementariedad de secuencia (parcial o completa). El analito se puede modificar tambien covalentemente para aumentar su carga ionica sea quimica o enzimaticamente. Los ejemplos de modificaciones quimicas incluyen la conversion de grupos amino de una proteina en grupos carboxilo para aumentar la carga neta negativa de la proteina utilizando reactivos tales como anhidridos (por ejemplo, anhidrido succinico o anhidrido tetrahidroftalico). Tambien se pueden convertir otros grupos de una proteina tales como grupos tiol o histidilo, en grupos cargados negativamente tales como grupos carboxilo, utilizando reactivos tales como el yodoacetato. Ademas, estos grupos funcionales se pueden convertir en varios grupos activos distintos para facilitar la asociacion de restos ionicos. Estos y otros reactivos de modificacion y metodos de modificacion se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, "Chemical Modification of Proteins" por Gary E. Means y Robert E. Feeney; "Bioconjugate Techniques" por Greg T. Hermanson; y "Chemical Reagents for Protein Modification" por Roger L. Lundblad).
Ciertos restos ionicos, tales como acidos nucleicos, poli-lisina, poli-arginina, poli-glutamato, poli-aspartato y glucanos sulfatados, tienen grupos funcionales (tales como grupos amino o carboxilo) que pueden facilitar la asociacion covalente con el analito. Ademas, los restos ionicos se pueden derivar por diseno para que tengan grupos funcionales convenientes para la conjugacion con los analitos.
Ademas, se conocen varios agentes de reticulacion disponibles en el mercado que se pueden utilizar para unir moleculas portadoras y restos ionicos (por ejemplo, reactivos homo-bifuncionales que unen de manera cruzada grupos amino-amino o sulfhidrilo-sulfhidrilo, y similares). Estos y otros metodos de reticulacion son bien conocidos por los facultativos en el campo y la seleccion se puede basar en las necesidades especificas del ensayo.
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B. Asociacion de un resto ionico y el analito indirectamente por medio de una molecula portadora o complejo portador
Un analito tambien se puede asociar con un resto ionico indirectamente, por medio de una molecula portadora o complejo portador. Una molecula portadora es una molecula que se une especificamente al analito. Por lo tanto, el analito y la molecula portadora juntos constituyen una “pareja de union especifica” o complejo portador. En esta realizacion, el resto ionico se une o conjuga con la molecula portadora en vez de, o ademas de, el analito. Los ejemplos de parejas de union incluyen pero sin limitacion, parejas de anticuerpo-antigeno, parejas de ligando- receptor, y otros complejos ligando: anti-ligando. Normalmente la molecula portadora es un anticuerpo que se une especificamente al analito.
Tabla 2: Parejas de union especifica a modo de ejemplo
Analito
Molecula Portadora
antigeno (por ejemplo, una proteina)
anticuerpo
anticuerpo
antigeno
cadena de
cadena de polinucleotido
polinucleotido
complementaria
ligando (por ejemplo,
receptor (por ejemplo, receptor
hormona)
hormonal)
inmunoglobulina
Proteina A
enzima
cofactor enzimatico o sustrato
carbohidrato
lectina
La molecula portadora se puede asociar con un resto ionico utilizando cualquiera de diversos metodos para asociar moleculas algunos de los cuales se han tratado anteriormente. Los metodos seleccionados dependeran en parte de la naturaleza del analito, resto ionico y molecula portadora. Por ejemplo, se pueden unir uno o mas restos ionicos a moleculas portadoras utilizando procesos quimicos convencionales. Por ejemplo, los restos ionicos tales como acidos nucleicos, poli-lisina, poli-arginina, poli-glutamato, poli-aspartato y glucanos sulfatados tienen grupos funcionales (tales como amino o carboxilo) que facilitan la reticulacion con anticuerpos u otras moleculas portadoras, o se pueden derivar para que porten tales grupos funcionales. Algunas moleculas portadoras potenciales, tales como los acidos nucleicos y las proteinas tienen grupos funcionales (tales como amino [por ejemplo, lisina, arginina], carboxilo [por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico] o sulfhidrilo [por ejemplo, cisteina]) que facilitan la reticulacion con restos ionicos, o se pueden derivar para que porten tales grupos funcionales. Las moleculas portadoras se pueden asociar con el resto o restos ionicos utilizando diversos enlazadores bifuncionales. Las moleculas portadoras pueden modificarse quimicamente para tener grupos funcionales especificos para la reticulacion. Por ejemplo, los glucanos sulfatados se pueden oxidar para tener grupos funcionales aldehido, que se pueden utilizar para que reaccionen con grupos amino. Los oligonucleotidos se sintetizan con un grupo sulfhidrilo o amino primario en un extremo. En los grupos funcionales amino o sulfhidrilo, el oligonucleotido se puede reticular con los grupos amino o sulfhidrilo de las moleculas del anticuerpo utilizando reactivos de reticulacion que estan disponibles.
El resto ionico tambien se puede asociar con la molecula portadora (y por tanto con el analito) indirectamente, por medio de una o mas moleculas intermedias. Por ejemplo, si el analito es un antigeno, “AntigenoA”, se puede asociar indirectamente con un resto ionico, por ejemplo, uniendo el AntigenoA a un anticuerpo monoclonal anti-AntigenoA (AAA-mAb) (“molecula portadora”) y uniendo el AAA-mAb con un segundo anticuerpo marcado ionicamente (anti- AAA-mAb). Se reconocera que este tipo de marcaje de tipo anticuerpo secundario es rutinario en los inmunoensayos. El complejo de moleculas que comprenden el analito y el resto ionico (en este ejemplo, AntigenoA + AAA-mAb + resto ionico anti-AAA-mAb) se puede denominar un “complejo portador”. Aunque se describen asociaciones antigeno-anticuerpo en este ejemplo, el metodo no esta limitado a anticuerpos. Se puede utilizar cualquier pareja de union especifica en la que una de las partes sea el analito.
Tambien se pueden asociar una molecula portadora y un resto ionico por medio de una pareja de union especifica cuando uno o ambos miembros de la pareja de union especifica se conjugan con un marcador. Por ejemplo, una molecula portadora puede estar biotinilada y marcada utilizando un resto ionico conjugado con avidina. El marcador es avidina o biotina y permite la union del resto ionico por medio del marcador en cualquier etapa del proceso. En otra realizacion, una molecula de anticuerpo portadora se asocia con un resto ionico (acido nucleico) de la siguiente manera: Una molecula de avidina cargada se prepara anadiendo 1, 2 o 3 oligonucleotidos biotinilados en sus cuatro sitios de union a biotina, dejando al menos un sitio de biotina que permanece sin ocupar. Una molecula portadora biotinilada (por ejemplo, anticuerpo anti-analito) se une en el complejo oligonucleotido-avidina-biotina. Otros ejemplos de marcadores incluyen sin limitacion un marcador de poli-histidina, marcador de glutation y fluoresceina. Los anticuerpos con afinidad especifica para los marcadores estan disponibles para su adquisicion o se pueden producir si se necesita.
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Cualquiera de los metodos descritos anteriormente en el contexto de marcaje ionico de una molecula portadora, se pueden utilizar para marcar ionicamente una protefna, acido nucleico, u otro componente del complejo portador.
Una molecula que se une directamente (por ejemplo, covalentemente) a un resto ionico se puede denominar “marcada ionicamente”. El complejo del analito, asociado con resto(s) ionico(s), molecula(s) portadora(s), si esta presente, y cualquiera de otras moleculas que se utilizan para asociar el resto(s) ionico(s) y el analito se puede denominar “complejo Analito-Resto ionico (IM)”.
Se apreciara que la asociacion del analito y restos ionicos es suficientemente estable en las condiciones de electroforesis de concentracion y, opcionalmente, las etapas analfticas de concentracion posteriores, para que los dos permanezcan asociados segun se lleva a cabo el ensayo.
VI. Asociacion de un resto ionico con un analito inmovilizado
En un aspecto, la invencion proporciona un metodo de la invencion que utiliza, en parte, la tecnologfa de electroforesis de concentracion descrita anteriormente. De acuerdo con el metodo, el analito:
a) se une a una fase solida o inmovilizada
b) se asocia con un resto ionico
c) se libera de la fase solida o inmovilizada
d) se somete a electroforesis en el dispositivo microflufdico
e) se une o detecta en un area de analisis utilizando un agente de captura que reconoce especfficamente
i) el analito o
ii) el resto ionico.
Las etapas (a) y (b) pueden tener lugar en cualquier orden y las etapas (b) y (c) pueden tener lugar en cualquier orden, siempre que (c) se produzca despues de (a). Por ejemplo, el orden pude ser a^b^c; b^a^c; o a^c^b. Las etapas (a) - (c) se describen posteriormente, como ilustracion y no como limitacion. Las realizaciones particulares de este metodo se muestran en la Figura 5, y se tratan en el texto correspondiente. Este metodo incluye dos etapas de concentracion especfficas del analito independientes y proporciona un metodo de ensayo altamente sensible.
a. El analito se une a una fase solida o inmovilizada
El analito se puede unir a una fase solida o inmovilizada (lo que se usa de manera intercambiable en el presente documento) de cualquier manera convencional, tratando la solucion de muestra con un companero de union especffico (SBP) del analito inmovilizado en una fase solida. La fase solida puede ser, como ilustracion y no como limitacion, una superficie del deposito de gran volumen, una superficie de un pocillo de una placa de microtitulacion, o la superficie de una micropartfcula. En una realizacion preferida, se utilizan micropartfculas. En una realizacion, se utilizan micropartfculas magneticas.
Las micropartfculas utiles para la purificacion se conocen bien en la tecnica. Las micropartfculas son en general partfculas esfericas que tienen normalmente un diametro desde aproximadamente 0,05 pm a aproximadamente 1000 pm, sobre las que se puede unir, o que pueden revestirse con, una SBP (por ejemplo, anticuerpo, polinucleotido). Las micropartfculas se pueden fabricar utilizando materiales tales como cristal, silicato de zirconio, silicio, oro, poliestireno, latex, y PMMA, y pueden tener caracterfsticas ffsicas como que sean magneticas o magnetizables, coloreadas, biodegradables y fluorescentes. Las micropartfculas se pueden revestir con un agente de union, o pueden incluir grupos reactivos (por ejemplo, amino, carboxilo, cianurico) que permitan la union covalente con un companero de union (por ejemplo, anticuerpo, polinucleotido, avidina). Ademas, las micropartfculas se pueden adquirir con SBP unidas (por ejemplo, micropartfculas revestidas con estreptavidina, anticuerpos contra IgG e IgM humanas, y anticuerpos anti-biotina, en por ejemplo, Indicia Biotechnology (Oullins Francia); micropartfculas con grupos de union: avidina, estreptavidina, protefna A, albumina, biotina, PEG, y colageno en, por ejemplo, Kisker Biotechnology (Steinfurt Alemania). Otras fases solidas, tales como placas de microtitulacion tambien se pueden adquirir con, o derivarse para que tengan, companeros de union unidos covalentemente (por ejemplo, placas de microtitulacion con estreptavidina o anticuerpos anti-IgG unidos en BD Biosciences (Bedford MD)).
El analito se puede unir al agente de union inmovilizado poniendo en contacto la solucion que contiene el analito con la SBP inmovilizada en condiciones en las que el analito se une a la SBP. Por ejemplo, las micropartfculas se pueden anadir a una solucion de pre-muestra. Tras la union del analito a las micropartfculas se puede preparar una fraccion rica en analito segregando las micropartfculas utilizando la centrifugacion, separacion magnetica, o filtracion con sus etapas de lavado apropiadas. La eliminacion de contaminantes no unidos utilizando otras fases solidas (por ejemplo, pocillos de microplaca) se pueden conseguir eliminando el sobrenadante no unido, y otros metodos bien conocidos.
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b. El analito se asocia con un resto ionico
El analito se puede asociar con un resto ionico utilizando cualquier metodo adecuado, tal como los que se han descrito en las secciones previas. Como se ha indicado anteriormente, el analito se puede asociar con el resto ionico antes o despues de la union a la fase inmovilizada, y se puede asociar por medio del agente de union o directamente. Por lo tanto, los agentes de union que se utilizan en el presente documento unen el analito a una fase inmovilizada tal como una microparticula o un sustrato. El resto ionico se puede asociar con la fase solida antes. En este caso, la asociacion del resto ionico y el analito se facilita uniendose a la fase solida.
c. El analito se libera de la fase solida o inmovilizada
Los analitos unidos se pueden liberar de las microparticulas (u otra fase solida) utilizando diversas estrategias. Por ejemplo, un analito se puede desplazar utilizando agentes especificos que compiten con el analito por la union con la SBP inmovilizada. De manera alternativa, el analito se puede eluir con reactivos no especificos tales como los agentes desnaturalizantes (por ejemplo, la urea), pH extremo, temperatura, tampones de alta fuerza ionica y similares para destruir la union. Esto se puede hacer utilizando cambios de tampon, cambios en el campo electrico, pH, adicion de un tampon de elucion, o cualquier metodo conocido en la tecnica.
De manera alternativa, los agentes de union que tienen el analito unido a los mismos se pueden liberar como un complejo incorporando un enlace que se pueda escindir o romper en la union entre los agentes de union y la fase solida (tal como la microparticula o el sustrato). Ademas, los agentes de captura que se utilizan para capturar el analito durante el analisis en el chip microfluidico pueden incorporar un enlace que se pueda escindir o romper entre los agentes de captura y la superficie de captura del chip microfluidico. Aunque los agentes de union y agentes de captura pueden ser el mismo tipo de moleculas, sus papeles son diferentes. El agente de captura se utiliza cuando se captura el analito durante el analisis (es decir, se inmoviliza en el area de analisis). En cualquier caso, los enlaces incluyen puentes disulfuro, dioles, secuencias de enzimas de restriccion, y enlaces que se pueden disociar por productos quimicos o enzimas. Por ejemplo, el agente de union se puede escindir utilizando proteasas o nucleasas (por ejemplo, proteasas o nucleasas especificas de la secuencia). Si se utiliza un enlazador que contiene un puente disulfuro para anclar los anticuerpos a la fase solida, el complejo de union se puede liberar utilizando agentes reductores tales como el mercaptoetanol o el ditiotreitol. Una molecula de union de acido nucleico se puede escindir con nucleasas.
Se proporcionan los siguientes ejemplos como ilustracion y no se pretende que limiten la invencion.
1. Analito acido nucleico
En una realizacion, el analito es un acido nucleico. Los analitos de acido nucleico son poli-ionicos por si mismos, por tanto, aunque puede haber circunstancias en las que su union con un resto ionico adicional puede ser ventajosa, puede no ser necesario unir un resto ionico para movilizar estas moleculas con un campo electrico. Sin embargo, puede ser ventajoso concentrar inicialmente los analitos y/o eliminar los contaminantes antes de la electroforesis. Esto se puede hacer, por ejemplo, utilizando agentes de union al acido nucleico con secuencias complementarias que se conjugan a microparticulas magneticas. Las microparticulas magneticas se pueden anadir a una muestra que contiene el analito de acido nucleico en el deposito de gran volumen. Despues de que las moleculas de analito se unen a las microparticulas, se aplica un campo magnetico para agrupar las microparticulas en un punto especifico en el deposito de gran volumen. Entonces se eliminan los contaminantes y sustancias de interferencia. Se utilizan condiciones de desnaturalizacion tales como baja fuerza ionica, urea, betaina, pH o temperatura altos, o una combinacion de estos factores, para destruir la hibridacion separando de esta manera las cadenas de acido nucleico y liberando los analitos unidos de las microparticulas. La electroforesis conduce los acidos nucleicos analitos al segundo deposito. Una vez que se concentran en el segundo deposito, los analitos de acido nucleico se someten a electroforesis en el dispositivo microfluidico hacia los sitios de captura especifica que tienen agentes de captura que son complementarios al extremo 5’ de los analitos de acido nucleico. Los analitos de acido nucleico se unen y se pueden detectar utilizando un agente de deteccion de acidos nucleicos marcado que es complementario del extremo 3’ de los analitos de acido nucleico.
2. Analito antfgeno
En otro ejemplo, se pueden asociar analitos que pueden actuar como antigenos con un sustrato solido utilizando anticuerpos como agentes de union. Los anticuerpos con afinidad para, por ejemplo, un analito proteico se conjugan con microparticulas. Las microparticulas se agrupan tal como por medios magneticos (si son microparticulas magneticas) o por campo de centrifuga en un punto especifico del deposito de gran volumen y se elimina el sobrenadante que contiene cualquier molecula que no este unida, contaminante o sustancia de interferencia. Los analitos proteicos se liberan de la microparticula como un complejo. Esto se puede conseguir utilizando enlazadores escindibles (por ejemplo como se describe en el presente documento). Tambien se pueden utilizar las proteasas apropiadas con condiciones de reaccion optimizadas para conseguir la liberacion deseada sin la degradacion no deseable del analito. Ademas, se puede concebir modificar tecnicamente sitios proteoliticos especificos en los componentes de anclaje, sea el enlazador o el anticuerpo, para proteasas con necesidades de sitio de escision
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rigurosas. Estas proteasas se pueden utilizar entonces para escindir el complejo de union. En una realizacion, un analito de una muestra de sangre se detecta de acuerdo con los metodos de la invencion utilizando una etapa de pre-concentracion en la que se anaden microparticulas magneticas revestidas con agentes de union con afinidad para el analito a la muestra de sangre en un deposito de gran volumen.
VII. Electroforesis de concentracion del analito
Algunas o todas las etapas de asociacion del analito con un resto ionico (asi como las etapas anteriores de procesamiento de la muestra) se pueden llevar a cabo en el deposito de gran volumen. De manera alternativa, alguna o todas las etapas se pueden llevar a cabo en uno o mas recipientes diferentes y el analito (y cualquier molecula asociada) se puede transferir al deposito de gran volumen (por ejemplo, por pipeteo). Como resultado, el complejo Analito-IM se puede localizar en el deposito de gran volumen.
La capacidad de liquido del deposito de gran volumen puede variar ampliamente. Los volumenes tipicos son desde aproximadamente 1 microlitro a aproximadamente 100 mililitros. Preferentemente, la capacidad del LVR (y el volumen de muestra) es mayor de aproximadamente 5 microlitros, incluso mas preferentemente, mayor de aproximadamente 10 microlitros, tal como mayor de 50 microlitros, mayor de 100 microlitros y mayor de 1 mililitro. En algunas realizaciones, la capacidad del LVR o el volumen de muestra, esta entre aproximadamente 1 microlitro y 20 mililitros. (Se apreciara que el volumen de muestra sera menor que la capacidad del LVR, aunque sera habitualmente al menos un 25 %, mas a menudo al menos un 50 %, y a menudo al menos un 75 % del volumen del LVR). En algunas realizaciones, la muestra tiene un volumen de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 100 mililitros, mas a menudo de 25 microlitros a 5 ml, incluso mas a menudo de 50 microlitros a 5 ml o 100 microlitros a 25 ml. La capacidad del LVR puede ser aproximadamente 50 microlitros, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 500 pl, 800 pl, 1 mililitro, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml y 90 ml. En general, se puede utilizar un volumen que se espera que se pueda concentrar razonablemente por electroforesis en una cantidad razonable de tiempo. Esto se puede determinar por la cantidad de tiempo que tarda el analito cargado en moverse en el volumen de muestra la distancia mas larga.
La transferencia electroforetica del analito cargado o el complejo de analito-IM se consigue generando un campo electrico que se extiende desde el deposito de gran volumen por medio del conector al dispositivo microfluidico (por ejemplo, un deposito de agrupamiento o un area de analisis). Una disposicion a modo de ejemplo del sistema se ilustra en las Figuras 1-3. El dispositivo que se muestra en las Figuras 1 y 3 muestra una multiplicidad de conectores para conectar multiples muestras de una multiplicidad de depositos de gran volumen con el dispositivo microfluidico y/o una multiplicidad de depositos de agrupamiento.
Se coloca al menos un electrodo en, o esta integrado en, cada deposito de gran volumen y se coloca al menos un electrodo en, o se integra en, el dispositivo microfluidico. Se aplica el campo electrico con una fuerza tal que el analito se dirija desde los depositos de gran volumen al dispositivo microfluidico a una velocidad seleccionada. La posicion de los electrodos y el campo electrico aplicado en el deposito se puede determinar para facilitar el mejor rendimiento del dispositivo microfluidico, por ejemplo, para alcanzar una deteccion sensible en poco tiempo. Como ejemplo, los electrodos de los depositos de gran volumen se pueden colocar en un punto que ofrezca la mayor simetria y distancia en relacion a la apertura de los conectores que conducen al dispositivo microfluidico. Esta colocacion de electrodos probablemente ofrece un campo electrico relativamente uniforme para conducir todos los analitos del deposito. La colocacion de uno o mas electrodos en el dispositivo microfluidico dependera de la operacion que se pretenda en el dispositivo. El electrodo(s) se puede colocar cerca de los depositos de agrupamiento si se desean depositos de agrupamiento. Se puede colocar cerca del area de analisis si se desea conducir los analitos al area de analisis directamente sin utilizar depositos de agrupamiento. Los electrodos se pueden colocar tambien en ambos lugares de modo que los campos electricos se pueden aplicar para conducir los analitos secuencialmente, primero a los depositos de agrupamiento y luego al area de analisis.
El uso de un deposito de agrupamiento en el dispositivo microfluidico permite la sincronizacion y un mejor control de los movimientos de los analitos hacia el area de analisis. El deposito de agrupamiento esta integrado en el chip. El deposito de agrupamiento se construye de tal manera que este en comunicacion fluida con el area de analisis (cuando cualquiera de las valvulas que interrumpen el flujo de fluido en el dispositivo esta abierta). El volumen del deposito de agrupamiento es menor que el volumen del deposito de gran volumen, y es normalmente menor de aproximadamente 1 microlitro, incluyendo pero sin limitacion, desde aproximadamente 0,1 pl a aproximadamente 2 pl, 1 pl a 1 pl, y 10 pl a 0,5 pl, preferentemente menor de 1 microlitro, a veces menor de 0,1 microlitros, y a veces menor de 1 picolitro.
Los conectores que se muestran pueden ser tubos capilares. Para facilitar la electroforesis, se llena un conector con medio de conduccion tal como un tampon bajo en sales de forma que se pueda establecer un campo electrico. Cuando se aplica el campo electrico, el analito (o complejo) cargado se transporta y se dirige al dispositivo microfluidico sea directamente a traves del area de analisis o hacia un deposito de agrupamiento en el dispositivo microfluidico para concentrar el analito antes de su analisis posterior. El potencial electrico del electrodo que se asocia con el deposito de gran volumen y el deposito de agrupamiento se selecciona para conseguir la velocidad de transporte del analito deseada.
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La duracion de la electroforesis depende de factores tales como la concentracion y cantidad de analito de interes en la muestra, las condiciones electroforeticas (corriente, tension, fuerza ionica de los tampones, etc.), el volumen de la muestra inicial, la carga del analito, la sensibilidad del metodo de deteccion, y el tampon que se utilice. La electroforesis se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para transportar una cantidad del analito de interes. Cuando se transfiere el suficiente analito, se puede interrumpir la electroforesis, y si se desea, el deposito de gran volumen y el conector se pueden retirar.
En una realizacion, la electroforesis se lleva a cabo hasta que la concentracion de analito en el deposito de agrupamiento es de al menos 2 veces la concentracion del deposito de gran volumen. A veces la diferencia de concentracion es al menos de 3 veces, y a veces al menos de 5 veces, 10 veces, 25 veces o 100 veces o mayor.
Se pueden conectar mas de un deposito de gran volumen y mas de un deposito de agrupamiento para conseguir la mejor configuracion para el ensayo con el fin de transportar el analito con facilidad y eficacia. Con muestras muy grandes, puede ser mas eficaz utilizar multiples depositos de gran volumen en serie. En esta realizacion se conectan por conectores LVR de volumenes decrecientes en secuencia, con los electrodos configurados de forma que un analito se transporte en serie de un LVR al proximo y finalmente al chip. Esto permite que se apliquen tensiones de tal manera que los analitos se transfieran con velocidad y minimizando la tension necesaria para transportar analitos en el chip microfluidico. Una tension menor es ventajosa porque reduce cualquier problema con la electrolisis, calentamiento y/o gases en el dispositivo microfluidico.
En algunas realizaciones el analito se transporta de los depositos de agrupamiento a uno o mas depositos intermedios antes de transportarlo al area de analisis. Esto permite multiples ensayos (por ejemplo, ensayos que se llevan a cabo en diferentes soluciones o con reactivos incompatibles) para llevarse a cabo facilmente. Por ejemplo, los contenidos de un deposito de agrupamiento se pueden dividir y una porcion se utiliza para la deteccion de un acido nucleico y el otro para la deteccion de una proteina. Utilizando depositos intermedios tambien se puede permitir el uso de un mayor volumen de muestra.
VIII. Transporte del analito, analito cargado, o complejo analito-IM al area de analisis
Para la deteccion y analisis del analito, el analito (que puede estar asociado con un resto ionico y/o parte de un complejo de analito) se transporta desde el deposito de gran volumen o el deposito de agrupamiento al area de analisis del dispositivo. En realizaciones preferidas el area de analisis comprende multiples agentes de captura (que pueden ser el mismo o diferentes, y que pueden estar dispuestos o no en una matriz ordenada) que se unen al analito o el complejo analito-IM (y que pueden unirse a la molecula portadora, resto ionico, u otro componente del complejo).
Una vez que el analito y/o el complejo que comprende el analito se ha sometido a electroforesis desde el LVR al chip microfluidico, el analito/complejo se puede transportar al sitio de captura utilizando cualquier medio conocido en la tecnica, por ejemplo, microbombas, accion de capilaridad, y/o electroforesis. En una realizacion preferida, se utiliza la electroforesis. Se apreciara que la electroforesis que sale del deposito de agrupamiento a traves de la matriz necesitara que se forme un campo electrico entre el electrodo del deposito de agrupamiento y el electrodo del o cerca del area de analisis. De manera alternativa, si no se utiliza un deposito de agrupamiento, el campo electrico se forma entre el electrodo del LVR y el electrodo del o cerca del area de analisis.
IX. Area de analisis y deteccion del analito
El analito se puede detectar, cuantificar o analizar en el area de analisis del chip. En una realizacion, el analisis se hace sin inmovilizar el analito en el area de analisis (por ejemplo, utilizando dispersion de luz, citometria de flujo, o deteccion fluorescente u otros metodos de deteccion que se llevan a cabo en solucion). Por ejemplo, los analitos se pueden marcar con fluoroforos y analizarse en el area de analisis con aparatos que se utilizan habitualmente en los citometros de flujo para analizar entidades fluorescentes excitando los fluoroforos con laser de longitud de onda adecuada y medir la luz fluorescente emitida. Se apreciara que, de acuerdo con el diseno de la mayoria de los dispositivos microfluidicos, el area de analisis habitualmente es un canal o una camara del chip.
De manera alternativa, la deteccion implica la union del analito con un agente de captura inmovilizado en el area de analisis. Un agente de captura es una molecula que puede capturar un analito o complejo de analito uniendose especificamente al analito o un miembro del complejo. Los miembros del complejo que se pueden unir al agente de captura incluyen el analito, la molecula portadora, el complejo molecula portadora/analito, un resto ionico, un segundo anticuerpo (si se utiliza) y un marcador. Por lo tanto, el agente de captura puede ser, por ejemplo, uno o mas anticuerpos, acidos nucleicos, receptores y/o ligandos.
El agente de captura se puede inmovilizar en el dispositivo microfluidico en un sitio de captura utilizando cualquiera de los metodos que se conocen en la tecnica. Por ejemplo, se puede unir uno o mas agentes de captura de anticuerpos por medio de la parte Fc del anticuerpo. El agente de captura se puede unir al sitio de captura por una union covalente o no covalente, pero, preferentemente, la union sera los suficientemente fuerte para que el movimiento de liquido por encima del sitio de captura no despegue los agentes de captura. Los diversos reactivos y
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condiciones de la reaccion que se utilizan se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, "Chemical Modification of Proteins" por Gary E. Means y Robert E. Feeney, "Bioconjugate Techniques" por Greg T. Hermanson y "Chemical Reagents for Protein Modification" por Roger L. Lundblad). Se pueden encontrar metodos ilustrativos de union de agentes de captura a los sitios de captura en los sustratos de la fase solida por ejemplo en las Patentes de EE. UU. 5.629.213, 5.688.642, 5.585.275, y la Solicitud de Patente Internacional WO 9745730.
Una vez unidos al sitio de captura, los agentes de captura pueden capturar el analito o un miembro del complejo de analito segun se mueve sobre el sitio de captura. El agente de captura y el analito o complejo de analito se unen normalmente por una interaccion no covalente, pero se puede utilizar una union covalente. Para los analitos de acido nucleico o restos ionicos de acido nucleico, los agentes de captura pueden ser, por ejemplo, acidos nucleicos complementarios. Para los analitos proteicos, los agentes de captura pueden incluir anticuerpos, ligandos, lectinas y receptores especificos para el analito proteico. Los analitos de carbohidratos y lipidos se pueden capturar utilizando anticuerpos como agentes de captura. Las moleculas de anticuerpo portadoras se pueden capturar utilizando anticuerpos, antigenos u otras moleculas que se unen especificamente a los anticuerpos. Por ejemplo, si la molecula portadora es un anticuerpo humano, el agente de captura puede ser un anticuerpo anti-humano de cabra.
Las condiciones para la captura se pueden manipular para permitir la captura especifica de un miembro diana del complejo de analito. Las condiciones tales como el tampon, la velocidad de movimiento sobre el sitio de captura, la temperatura y el tiempo de captura se pueden escoger para permitir la union de solamente un analito especifico o para unir tambien variantes tales como acidos nucleicos con cambios de bases unicos o variantes de proteinas. De manera alternativa, el agente de captura se puede escoger para que solamente se una a un analito especifico o a las variantes.
Los agentes de captura se pueden dirigir a una localizacion especifica o sitio de captura de un dispositivo microfluidico por cualquier metodo conocido por un experto en la tecnica. Por ejemplo, los agentes de captura se pueden dirigir y asociarse a un sitio de captura especifico utilizando dispositivos de bombeo, o reactivos de fotolitografia y fotorreactivos.
A menudo el analito se detecta basandose en una senal de un marcador detectable. Un marcador se refiere a un atomo (por ejemplo, un radionuclido), molecula (por ejemplo, fluoresceina), o complejo, que se usa o se puede utilizar para detectar (por ejemplo, debido a una propiedad fisica o quimica), que indica la presencia de una molecula o que es capaz de unirse a otra molecula a la que esta unida covalentemente o asociada de otra manera. El termino “marcador” tambien se refiere a moleculas unidas covalentemente o asociadas de otra manera (por ejemplo, una biomolecula tal como una enzima) que actua sobre un sustrato para producir una senal fisica, molecula o complejo detectable. Los marcadores detectables adecuados para su uso en la presente invencion incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos, electricos, opticos, quimicos o fisicos y similares. Un marcador detectable, cuando se utiliza, se puede anadir a cualquier componente del complejo final que se pueda unir al agente de captura. Por ejemplo, el marcador puede unirse a una molecula portadora, un analito, un resto ionico, o un agente de union. Los detectores (por ejemplo, lectores de fluorescencia, espectrofotometros, etc.) para su uso en un entorno microfluidico se conocen bien en la tecnica.
Se apreciara que se pueden detectar multiples analitos en la misma muestra. Por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 3 y 7, se pueden asociar regiones especificas del area de analisis con restos de captura especificos para analitos particulares.
X. Especificidad del ensayo
La especificidad del ensayo se puede proporcionar en una cualquiera o mas de las etapas de los metodos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, una o mas etapas pueden implicar la union a clases generales de moleculas y una o mas etapas pueden requerir la union especifica solo al analito de interes. Cuando se desea especificidad, se puede utilizar un anticuerpo especifico modificado ionicamente, se puede utilizar una molecula portadora especifica, se puede utilizar un agente de union especifico, se puede utilizar una molecula de deteccion especifica, y/o se puede utilizar un agente de captura especifico en el dispositivo microfluidico. Por lo tanto, por ejemplo, inicialmente el analito de la muestra se puede concentrar utilizando microparticulas revestidas con moleculas de union especifica. De manera alternativa, las microparticulas se pueden revestir con moleculas de union que se unen a una clase general de moleculas que incluye el analito. Las clases de moleculas generales incluyen: proteinas fosforiladas, glucoproteinas, acidos nucleicos, anticuerpos, lipidos, azucares, dominios de receptor compartidos, motivos compartidos, motivos de acidos nucleicos o aminoacidos conservados, portadores compartidos, y epitopos compartidos.
XI. Anticuerpos que se utilizan en el ensayo
El lector apreciara que los anticuerpos pueden desempenar varios papeles en el metodo de la invencion. Por ejemplo, un anticuerpo tambien puede ser el analito, como se describe en el Ejemplo posterior. El termino “anticuerpo” se refiere a inmunoglobulinas que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y los fragmentos de union a antigeno de los mismos (que incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc y Fv). Los fragmentos se
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pueden producir por tecnicas de ADN recombinante, o por separacion enzimatica o quimica de inmunoglobulinas intactas. El termino “anticuerpo” tambien incluye una o mas cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos que estan conjugados quimicamente con, o se expresan como, proteinas de fusion con otras proteinas, anticuerpos de cadena sencilla, y anticuerpos biespecificos. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1988); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1999, que incluyen los suplementos hasta 2005); Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Los anticuerpos pueden ser mono o policlonales. Sin embargo, en algunas realizaciones se utilizan anticuerpos monoclonales para asegurar la union a un epitopo especifico de la proteina.
En algunas realizaciones, se unen dos o mas anticuerpos al analito (u otro componente del complejo analito-IM) simultaneamente en algun punto del ensayo. En tales condiciones, los anticuerpos bien se unen a diferentes epitopos del analito, un segundo anticuerpo se une al primer anticuerpo, o un segundo anticuerpo se une al complejo de anticuerpo/analito. En otras realizaciones, un primer anticuerpo se puede retirar antes de la adicion de un segundo anticuerpo.
Dependiendo de la funcion que cumplan, los anticuerpos pueden estar marcados ionicamente y/o se pueden modificar para incluir un marcador detectable para la deteccion posterior. Como se utiliza en el presente documento, un “marcador detectable” tiene el significado habitual en la tecnica y se refiere a un atomo (por ejemplo, radionuclido), una molecula (por ejemplo, fluoresceina), o complejo, que se usa o se puede utilizar para detectar (por ejemplo, debido a una propiedad fisica o quimica), indicar la presencia de una molecula o para hacer posible la union de otra molecula a la que esta unida covalentemente o asociada de otra manera. El termino “marcador” tambien se refiere a moleculas unidas covalentemente o asociadas de otra manera (por ejemplo, una biomolecula tal como una enzima) que actuan sobre un sustrato para producir un atomo, molecula o complejo detectable. Los marcadores detectables adecuados para su uso en la presente invencion incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos, electricos, opticos, quimicos o fisicos y similares.
XII. Aparatos y sistemas
Se describen en el presente documento un aparato y sistema para llevar a cabo los metodos que se describen en el presente documento. En una realizacion el dispositivo microfluidico tiene un deposito de agrupamiento en comunicacion fluida con un area de analisis que comprende agentes de captura que se unen a (i) el analito, (ii) un anticuerpo, (iii) un acido nucleico (es decir, moleculas portadoras o elementos del complejo analito-IM). Como se ha senalado anteriormente, el area de analisis es normalmente una region de un canal microfluidico y los agentes de captura se inmovilizan en al menos la superficie del canal. El deposito de la muestra tiene una capacidad de fluido como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, de 0,1 pl a aproximadamente 2 pl). El dispositivo comprende ademas un primer microelectrodo asociado con el deposito de agrupamiento y un segundo microelectrodo asociado con el area de analisis. Los electrodos se colocan tal que la aplicacion de una carga positiva a un electrodo y una carga negativa en el otro electrodo da como resultado un campo electrico suficiente para la electroforesis de una molecula cargada desde el deposito de agrupamiento hacia el area de analisis. Por lo tanto, un electrodo se puede situar en el deposito de agrupamiento y el segundo se situa en el area de analisis distal a (con respecto al deposito de agrupamiento) los agentes de captura inmovilizados.
En una realizacion, el dispositivo comprende multiples unidades de deposito de agrupamiento y area de analisis, como se ha descrito anteriormente. Cada combinacion de deposito de agrupamiento y area de analisis se denomina “unidad operativa”.
En una realizacion, al menos un area de analisis del dispositivo comprende agentes de captura que se unen a las moleculas de uno o mas organismos patogenos. En una realizacion, al menos uno, y opcionalmente todos los organismos patogenos, son virus. En una realizacion, al menos uno, y opcionalmente todos los organismos patogenos, son bacterias. En una realizacion, las moleculas de los organismos patogenos son acidos nucleicos, proteinas, o toxinas.
En una realizacion relacionada, la presente divulgacion proporciona un sistema que comprende un dispositivo microfluidico de la presente divulgacion y comprende ademas un deposito de gran volumen y/o un conector y/o una fuente de corriente electrica y/o se puede utilizar un sistema de control implementado por ordenador para activar o cambiar la polaridad de los electrodos (400, 500) segun se necesite para la concentracion, el transporte y/o el analisis. El sistema utiliza la electroforesis para concentrar un analito cargado y para introducir o aplicar la muestra en un dispositivo microfluidico. La electroforesis se utiliza para mover y concentrar un analito cargado desde un deposito de gran volumen en un deposito de agrupamiento o en un dispositivo microfluidico. Una disposicion general para el sistema o aparato se ilustra en las Figuras 1 y 2. El sistema incluye en general un dispositivo microfluidico 600, al menos un deposito de gran volumen 100, al menos un deposito de agrupamiento 300, un conector 200, y al menos dos electrodos 400 y 500 (u 800) para la electroforesis. En una realizacion, el dispositivo microfluidico tambien incluye un pocillo de efluente para la recoleccion de cualquier efluente sobrante del analisis de la muestra (por ejemplo, vease la Figura 3).
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Los multiples conectores 200 entre los depositos de gran volumen 100 y los depositos de agrupamiento 300 que utilizan tubos capilares se muestran en la Figura 1. Los capilares 200 estan llenos de fluido, tal como tampones de baja salinidad que tienen el fin de conectar los electrodos (400 y 500) para formar un campo electrico. Esto permite que un analito cargado se someta a electroforesis desde un deposito de gran volumen 100 a un deposito de agrupamiento 300 (vease la Figura 3).
Los electrodos 400 y 500 se pueden conectar a los depositos (100, 300) y/o el dispositivo microfluidico 600 utilizando cualquier medio conocido en la tecnica para producir un campo electrico adecuado. Se entiende que los materiales, muestras, tampones y fabricacion de todos los componentes se proporcionan de forma que sean compatibles para la electroforesis de materiales. Los electrodos (400, 500) estan unidos operativamente a los depositos (100, 300). Unidos operativamente significa que el electrodo se coloca en o cerca del deposito de forma que la aplicacion de una tension o un potencial genera un campo electrico a traves del cual se transportan moleculas cargadas. En una realizacion, el electrodo esta insertado en el material del deposito o el dispositivo (por ejemplo, contenido en el sustrato). Ademas, cuando estan presentes mas de dos electrodos (400, 500), se puede utilizar un sistema de control implementado por ordenador para cambiar la polaridad de los electrodos (400, 500) segun se necesite para la concentracion, el transporte y/o el analisis. El sistema de control se puede configurar para responder a un detector que mide la presencia y/o posicion del analito en el area de analisis.
En una realizacion, el sistema comprende una multiplicidad de unidades operativas en comunicacion fluida con un deposito de gran volumen diferente. En una realizacion, el sistema comprende una multiplicidad de unidades operativas, cada una con un deposito de agrupamiento y un electrodo asociado, y un sistema de control que aplica una carga de la misma magnitud y duracion a cada uno de los electrodos.
Se puede utilizar una instrumentacion conocida en la tecnica para aplicar el voltaje, controlar el transporte, caudal y direccion del liquido en el dispositivo, instrumentos de deteccion para detectar o notar el analito de interes, procesadores, por ejemplo, ordenadores para la instruccion de los instrumentos de control, recepcion de datos de los detectores, y para analizar el almacenamiento e interpretacion de los datos, y proporcionar los datos e interpretaciones en un formato de informe facilmente accesible.
XIII. Realizaciones ilustrativas
Las realizaciones de los metodos se describiran ahora en referencia a las Figuras 4-6.
En la realizacion que se ilustra en la Figura 4, se utiliza una molecula de anticuerpo portadora marcada ionicamente para dar propiedades ionicas al analito. Un anticuerpo 1 con un resto ionico 2 fijado a el, se une especificamente al analito 3 de la muestra en un deposito de gran volumen produciendose un complejo anticuerpo/analito 4. Los anticuerpos marcados ionicamente y los complejos se transportan electroforeticamente hacia un deposito de agrupamiento. Los complejos se transportan entonces a un area de analisis que tiene un sustrato 5 que tiene unidos los agentes de captura 6. Los agentes de captura 6 son segundos anticuerpos especificos para el analito 3. Los anticuerpos agentes de captura 6 se unen a un epitopo del analito 3 diferente del que se unfa al primer anticuerpo 1, o puede unirse especificamente al complejo anticuerpo/analito 4, pero no se une a ninguno de los primeros anticuerpos 1 libres. Se puede unir un marcador detectable directamente a cualquiera de las moleculas (sitios potenciales 7) en cualquier punto antes o despues de la captura del analito 3. En otras realizaciones, el complejo analito/IM unido a un agente de captura se detecta utilizando un tercer anticuerpo marcado que se une a un sitio diferente del analito 3 o al complejo anticuerpo/analito (4).
La especificidad del ensayo se puede dar por la especificidad del primer anticuerpo 1, la especificidad del agente de captura 6, o ambos. Otras realizaciones pueden incluir un marcador de deteccion especifica del analito que se utiliza en combinacion con un agente de captura 6 que se une al primer anticuerpo 1 o al resto ionico 2.
En la realizacion que se ilustra en la Figura 5, el analito 3 se asocia con una carga uniendolo a microparticulas magneticas 8 en el deposito de gran volumen. En esta realizacion, las microparticulas 8 estan revestidas con un anticuerpo agente de union 11. Estos se anaden a la muestra en un tampon apropiado para permitir que los analitos 3 se unan a los anticuerpos agentes de union 11. Si se desea, las sustancias de interferencia, contaminantes y/o no deseadas se eliminan tras la concentracion magnetica de las microparticulas 8 en un area especifica del deposito. Se pueden llevar a cabo etapas adicionales para reducir mas las sustancias no deseadas. Un segundo anticuerpo 1 que tiene un resto ionico 2 unido, se anade al complejo anticuerpo/analito en el deposito de gran volumen. El segundo anticuerpo 1 se une posiblemente por medio de un epitopo diferente del analito 3. De manera opcional el orden de adicion del anticuerpo 1 frente a las microparticulas revestidas con un anticuerpo agente de union 11 puede invertirse. Tras formarse la union del complejo analito/anticuerpo (3/11/1/2), se retira cualquier anticuerpo 1 en exceso, sustancias de interferencia, contaminantes y/o no deseadas tras la concentracion magnetica de las microparticulas 8 en un area especifica del deposito. Se pueden llevar a cabo etapas adicionales de lavado para reducir mas las sustancias no deseadas. El complejo analito/anticuerpo (3/11/1/2) se separa de la microparticula 8 utilizando un agente de escision adecuado. Este complejo (3/11/1/2) se somete entonces a electroforesis para concentrar el analito 3 en un deposito de agrupamiento. Tras la concentracion, el complejo se somete a electroforesis sobre el sitio de captura 5 del dispositivo microfluidico. En esta realizacion, los agentes de captura 6
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unidos al sitio de captura 5 se unen especificamente al resto ionico 2 (por ejemplo, si el resto ionico 2 es una molecula de acido nucleico, el agente de captura 6 es una molecula de acido nucleico complementaria). Se puede unir un marcador 7 detectable a cualquiera de las moleculas implicadas, incluyendo el analito 3, la molecula de anticuerpo de union 11 de la particula 8, el segundo anticuerpo 1, o el resto ionico 2. La especifidad en esta reaccion se puede proporcionar en cualquier etapa, incluyendo la union al agente de union 11 en la microparticula 8, la union del segundo anticuerpo 1 o ambos. En una realizacion, el agente de captura 6 puede ser un tercer anticuerpo que se une a un epitopo diferente del analito 3 o que se une especificamente al complejo anticuerpo/analito (1/3 u 11/3) y no se une con anticuerpos libres (1 u 11).
La realizacion que se ilustra en la Figura 6 es similar a la de la Figura 5, e implica la union de un resto ionico 2 mas tarde en el proceso y se puede utilizar en los casos en los que el resto ionico 2 puede interferir con una etapa de union o purificacion anterior. En esta realizacion, una pareja avidina/biotina (13/14), o una pareja de union especifica similar, se utiliza para unir el resto ionico 2 al anticuerpo 11 como una pareja marcador/agente de union. El analito 3 se inmoviliza primero en microparticulas magneticas 8 revestidas con los agentes de union 11 especificos. En la ilustracion de la Figura 6, los agentes de union son anticuerpos 11 que se unen especificamente al analito 3, modificados con un marcador biotina 13. El resto ionico 2 conjugado con avidina (o agente de union al marcador) se mezcla con las microparticulas 8 que se unen al anticuerpo agente de union 11 por medio de un enlace avidina/biotina 13/14. En cualquier punto del proceso, las microparticulas magneticas 8 se pueden concentrar en un area especifica del deposito de gran volumen aplicando un campo magnetico para permitir lavados, cambios de tampon, y/o separacion del analito 3 de las microparticulas.
Antes de la electroforesis para concentrar el analito 3 en el deposito de agrupamiento, los anticuerpos agentes de union 11 se escinden de las microparticulas 8, por ejemplo por adicion de una proteasa especifica. El complejo analito 3/ anticuerpo 11 y cualquier otra molecula cargada de la muestra se concentran entonces en el deposito de agrupamiento utilizando electroforesis. Tras la concentracion, el complejo se mueve sobre un sitio de captura 5. El analito 3 se captura por los agentes de captura 6 especificos en el sitio de captura 5. En esta realizacion, el sitio de captura 4 se reviste con anticuerpos agentes de captura 6 que se unen especificamente al analito 3 en un epitopo diferente del que reconoce el primer anticuerpo 11. Se puede unir un marcador de deteccion 7 a cualquiera de los componentes, incluyendo el anticuerpo agente de union 11, el analito 3, o el resto ionico 2.
La Tabla 3 proporciona ejemplos, como ilustracion y sin limitacion, de combinaciones de analitos, restos ionicos, moleculas portadoras, y agentes de captura que se pueden utilizar en los metodos de la invencion.
Tabla 3: Ejemplos de combinaciones de analito/resto ionico/molecula portadora/agente de captura
Analito Resto ionico molecula portadora agente de union agente de captura
polipeptido acido nucleico anticuerpo anticuerpo anticuerpo
Vease la realizacion con acido nucleico
acido nucleico (analito) ninguno o acido nucleico acido nucleico comp. acido nucleico comp.
anticuerpo poli-lisina ninguno o segundo anticuerpo antigeno antigeno
carbohidrato acido nucleico anticuerpo lectina anticuerpo
Ejemplos
Esta es una descripcion generica de un biochip que se utiliza para la deteccion de una enfermedad infecciosa. El chip contiene electrodos, pocillos de muestra, areas de deteccion especifica, canales y valvulas. Se pueden cargar multiples muestras y llevarlas a traves de areas de deteccion para la identificacion y cuantificacion utilizando electroforesis. Las diferentes muestras se pueden cargar simultaneamente o secuencialmente y la carga se puede controlar por valvulas microfluidicas. Los reactivos habituales que se utilizan en la deteccion pueden introducirse a traves de los canales del dispositivo.
Ejemplo 1: ensayo VIH/VHB/VHC
La Figura 3 ilustra un dispositivo microfluidico 600 para detectar la presencia de antigenos de VIH, VHB y/o VHC (analitos proteicos) en una muestra. El dispositivo microfluidico tiene los electrodos 500 y 800 para su uso, junto con el electrodo del LVR 400, en la electroforesis. Se introduce una muestra biologica sospechosa de contener VlH, VHB o VHC en el deposito de gran volumen (no mostrado) y se mezcla con anticuerpos especificos para los analitos proteicos de VIH, VHB o VHC. Los anticuerpos tienen unido un resto ionico. Se permite que se formen los complejos anticuerpo/analito y, se someten los complejos a electroforesis sobre los sitios de captura (700a, 700b y 700c) en el area de analisis 700 (opcionalmente tras la concentracion en el deposito de agrupamiento 300). Los reactivos y las moleculas que no se unen fluyen hacia la camara de eluyente 1000, y se pueden eliminar. El sitio de captura de VIH 700a tiene anticuerpos agentes de captura especificos para un analito proteico de VIH. El sitio de captura VHB 700b
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tiene anticuerpos agentes de captura especificos para un analito proteico de VHB y el sitio de captura VHC 700c tiene anticuerpos agentes de captura especificos para un analito proteico de VHC. La presencia de VIH, VHB y/o VHC se puede identificar por una senal de un marcador detectable en los sitios especificos de captura (700a, 700b o 700c) para el analito virico. La Figura 3 ilustra realizaciones en las que el analito se transporta electroforeticamente desde el deposito de gran volumen hacia el area de analisis a traves de un deposito de agrupamiento (arriba) o sin area de agrupamiento (abajo).
La Figura 7 es una representacion esquematica de un chip que ilustra una realizacion del ensayo en referencia a un ensayo de sangre para virus infecciosos tales como el VlH, VHB y VHC. El limite actual de sensibilidad para los ensayos clinicos aprobados por la FDA para el VIH es aproximadamente de 50 copias viricas por ml para el ensayo de Roche Ultrasensitive AmPlICOR VlH-1 MONITOR®, v1.5 que utiliza tecnologia PCR o Versant VIH 3.0 de Bayer que utiliza tecnologia de ADN-b. Esto significa que para una muestra tipica, se necesita 1 ml completo de muestra para proporcionar suficiente ARN virico para la deteccion. Es impractico cargar el 1 ml completo se solucion de muestra en o sobre el chip. Incluso utilizando etapas preparatorias para la concentracion de la muestra, tales como centrifugacion, precipitacion en etanol o la captura del ARN diana con microparticulas seguido por elucion, el volumen final de muestra estara en el intervalo de decenas o cientos de microlitros (pl). Aunque las areas de ensayo en los chips microfluidicos habitualmente varian desde unos pocos a varios cientos de micrometros, el volumen que se puede manejar incluso en un gran chip estara en el intervalo de unos cuantos nanolitros (nl). Seria necesario un tiempo significativo para que la solucion de muestra entera que se ha preparado, se mueva por el chip a traves del area de deteccion y permitir el tiempo suficiente para que se unan los analitos que se ponen en contacto con los agentes de deteccion en un area de analisis especifica. Esto da como resultado entonces un tiempo de cambio inaceptablemente alto para obtener los datos del ensayo. Por esta razon, en la practica actual que utiliza un chip para la deteccion normalmente se utilizan los productos de reacciones PCR que tienen altas concentraciones de analitos para su aplicacion en un chip.
Sin embargo, utilizando los metodos y aparatos que se desvelan en el presente documento, la electroforesis puede transportar un ARN o ADN virico a partir de una gran muestra en el area de analisis de un chip con la opcion de pasar a traves de un deposito de agrupamiento que de como resultado la concentracion de la muestra a un nivel que se pueda utilizar para su deteccion en el chip. La Figura 7 muestra un diagrama de un formato de ensayo a modo de ejemplo para la deteccion de acidos nucleicos o proteinas viricas en una muestra de sangre. La Figura 7 presenta un chip 600 que permite el transporte de analitos en multiples muestras (que se localizan en los depositos de agrupamiento 300) por electroforesis con un campo electrico que se aplica en la direccion de las flechas entre los electrodos (400, 800) por encima de multiples sitios de deteccion 700 en las areas de analisis. Los sitios de deteccion 700 estan marcados con “VIH”, “VHB” y “VHC” para indicar la presencia de agentes de captura especificos para las proteinas o acidos nucleicos de estos virus, o a restos de union, etc. que se asocian especificamente con uno de los virus. En este ejemplo, se van a ensayar cuatro muestras de manera simultanea. En una realizacion alternativa, el analito se transporta desde el deposito de agrupamiento de manera distinta que electroforeticamente (por ejemplo, utilizando bombas peristalticas).
Ejemplo 2: Ensayo de VIH/VHB/VHC para analitos de acido nucleico virico
Para detectar los analitos de acido nucleico virico en muestras de pacientes, se anade un detergente ionico o no ionico a la muestra del paciente para destruir la envoltura virica y exponer los acidos nucleicos en el deposito de gran volumen. Si se utiliza un detergente no ionico y las muestras tienen un contenido ionico bajo, se puede utilizar la electroforesis para conducir los acidos nucleicos viricos directamente al area de analisis 700. De manera alternativa, los acidos nucleicos viricos se dirigen por electroforesis al deposito de agrupamiento 300 en primer lugar. Posteriormente, estos acidos nucleicos viricos se suministran desde el deposito de agrupamiento al area de analisis 700 por electroforesis u otros medios tales como las microbombas.
Si se utilizan detergentes ionicos, se utiliza una preparacion adicional de la muestra de la siguiente manera. Se anaden microparticulas magneticas conjugadas con acidos nucleicos o analogos complementarios (agentes de union) a la muestra que contiene el analito de ADN o ARN virico. El ARN o ADN virico se une a los agentes de union de las microparticulas. Tras las etapas de lavado para retirar el exceso de detergentes, se disocian los acidos nucleicos viricos de las microparticulas utilizando un agente desnaturalizante tal como la urea o calor. Luego se suministran los acidos nucleicos viricos al area de analisis 700 o se concentran en el deposito de agrupamiento 300 utilizando electroforesis.
Tras la concentracion en el deposito de agrupamiento 300, se utiliza entonces la electroforesis para pasar los analitos de acido nucleico sobre los sitios de captura especificos (700a, 700b y 700c) del dispositivo microfluidico 600 en una localizacion especifica. Los agentes de captura son acidos nucleicos o sus analogos con secuencias complementarias a los analitos de acido nucleico virico especifico. Los analitos de acido nucleico se unen en un area de deteccion especifica para el virus y se detectan aplicando marcadores fabricados de acidos nucleicos o sus analogos con secuencias complementarias a una seccion de las secuencias viricas distintas de las que se usan para la captura. Los agentes de deteccion del acido nucleico se conjugan con entidades detectables tales como colorantes fluorescentes o enzimas, que se pueden detectar por sustratos de fluorescencia o quimioluminiscencia. Una muestra se identifica como que contiene el virus especifico cuando se detecta un marcador en el area
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especifica del dispositivo microfluidico (700a, 700b o 700c).
Ejemplo 3: ensayo VIH/VHB/VHC para analitos de anticuerpo
Se llevo a cabo un ejemplo para detectar anticuerpos contra VIH, VHB o VHC de la siguiente manera:
Se conjugo un antigeno virico especifico como agente de union para cada anticuerpo con microparticulas magneticas por medio de un enlace escindible tal como un ADN bicatenario con un sitio de restriccion. De manera alternativa, se pueden utilizar anticuerpos anti-Fc humanos modificados con restos ionicos. Las microparticulas se mezclaron con las muestras de sangre de pacientes humanos en un deposito de gran volumen para capturar cualquier anticuerpo contra los antigenos viricos especificos. Tras las etapas de lavado para reducir impurezas no deseadas, el complejo se libera de las microparticulas por escision con una enzima de restriccion. El complejo se conduce entonces por electroforesis a un deposito de agrupamiento. Tras la concentracion en el deposito de agrupamiento, el complejo se conduce a los sitios de analisis (700a, 700b, 700c). Como ejemplo, para detectar los complejos, los agentes de captura con afinidad especifica para una de las entidades del complejo se conjugan en la superficie del chip en cada sitio especifico (700a, 700b y 700c) para recapturar los complejos y, por lo tanto, identificar la presencia de anticuerpos contra los antigenos viricos especificos de la muestra. Por ejemplo, si se utilizan antigenos viricos como agente de union sobre las perlas magneticas en la etapa de preparacion de la muestra, el agente de captura puede ser un anticuerpo anti humano especifico. Por el contrario, si se utiliza primero el anticuerpo anti-humano especifico como agente de union, el antigeno virico se puede utilizar para recapturar el complejo del anticuerpo del paciente y el anticuerpo anti-humano. Los complejos recapturados se detectan por agentes marcadores que tienen afinidad por el complejo. Los agentes con afinidades por el complejo pueden ser anticuerpos diferentes contra los anticuerpos humanos o el antigeno virico segun sea apropiado. Se pueden marcar con colorantes fluorescentes o enzimas tal como la peroxidasa de rabano rusticano o fosfatasa alcalina. De manera alternativa, el primer agente de union puede modificarse para portar tanto los restos ionicos como los marcadores o secuencias complementarias especificas para la deteccion. Por ejemplo, los restos ionicos de oligonucleotidos se pueden conjugar con el primer agente de union para proporcionar cargas ionicas y una secuencia que se una a un oligonucleotido marcado complementario de este. De manera alternativa, el primer agente de union puede estar biotinilado o marcado con entidades tales como poli-histidina y detectarse por la avidina o un anticuerpo anti-poli histidina conjugado con marcadores.
Ejemplo 4: ensayo VIH/VHB/VHC para analitos mixtos
Los metodos se pueden utilizar para detectar analitos mixtos a partir de varias fuentes, por ejemplo proteinas de una fuente y acidos nucleicos de una fuente diferente. Este ensayo detecta un acido nucleico que codifica tat de VIH, una proteina de la capsida de VHB, y un anticuerpo contra un antigeno especifico de VHC en el mismo dispositivo microfluidico o incluso en la misma muestra de paciente. Los agentes de captura que se proporcionan en el sitio de captura incluyen un acido nucleico complementario del acido nucleico de VIH en un sitio de captura 700a, un anticuerpo que se une especificamente a la proteina de la capsida del VHB en un segundo sitio de captura 700b, y un antigeno VHC como agente de captura que se une especificamente a un anticuerpo contra este antigeno en un tercer sitio de captura 700c. De manera alternativa, los metodos se pueden utilizar para detectar multiples analitos de la misma fuente (por ejemplo, un antigeno especifico del agente patogeno, un ADN especifico del agente patogeno y anticuerpos especificos del agente patogeno) en una muestra de un paciente.
Aunque la presente invencion se ha descrito en detalle en referencia a realizaciones especificas, los expertos en la tecnica reconoceran que hay modificaciones o mejoras que estan dentro del ambito y espiritu de la invencion, como se expone en las reivindicaciones siguientes. La cita de publicaciones y documentos de patente no se conciben como una admision de que ninguno de estos documentos sea una tecnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admision de los contenidos o la fecha de publicacion de los mismos. La invencion que se ha descrito ahora por medio de la descripcion escrita y los ejemplos, los expertos en la tecnica reconoceran que la invencion se puede practicar en diversas realizaciones y que la descripcion y ejemplos anteriores tienen fines de ilustracion y no limitacion de las reivindicaciones siguientes.

Claims (20)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para introducir un analito de interes de una muestra en un dispositivo microfluidico, que comprende:
    proporcionar una muestra acuosa en un deposito de gran volumen, conteniendo dicha muestra el analito y teniendo un volumen mayor de 1 microlitro, en donde el analito de interes esta cargado o se ha asociado a una molecula cargada;
    someter el analito a electroforesis por medio de un conector desde el deposito de gran volumen a un deposito de agrupamiento colocado en el dispositivo microfluidico durante el tiempo suficiente para que de como resultado una concentracion mas alta del analito en el deposito de agrupamiento que la concentracion en la muestra, en donde el deposito de agrupamiento comprende un microelectrodo localizado en el; y
    transportar el analito desde el deposito de agrupamiento a un area de analisis situada en el dispositivo microfluidico durante un tiempo suficiente para que de como resultado una concentracion de analito mayor en el area de analisis que la concentracion en la muestra, en donde el area de analisis comprende un sitio de captura que comprende un agente de captura, comprendiendo ademas dicho metodo el transporte del analito a traves del sitio de captura en condiciones en las que el analito de interes es capturado por el agente de captura; en donde dicho analito esta unido covalentemente a un resto ionico o esta asociado a una molecula marcada estando unido a una molecula portadora seleccionada de entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un receptor, un ligando y un antigeno, y dicha molecula portadora esta cargada ionicamente o esta modificada para ser cargada ionicamente.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas proporcionar al menos otra muestra acuosa en un deposito de gran volumen fluidicamente conectado al dispositivo microfluidico y que comprende ademas al menos otra area de analisis para dicha otra muestra.
  3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el deposito de gran volumen es una camara que no esta integrada en dicho dispositivo microfluidico.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que dicho deposito de gran volumen es un pocillo de una placa de micropocillos o un tubo de ensayo.
  5. 5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho conector es un tubo capilar.
  6. 6. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha molecula portadora es un anticuerpo que se une especificamente a dicho analito de interes, en donde dicho anticuerpo esta modificado con al menos un resto ionico o esta modificado para asociarse a al menos un resto ionico.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6 en el que el resto ionico se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    acidos nucleicos, poli-aminas, glucanos sulfatados y proteinas succiniladas, acido poliacrilico, acido polimetacrilico, acido polietilacrilico, acido polipropilacrilico, acido polibutilacrilico, acido polimaleico, sulfato de dextrano, heparina, acido hialuronico, polisulfatos, polisulfonatos, acido polivinil fosforico, acido polivinil fosfonico, copolimeros de acido polimaleico, acido polihidroxibutirico y mezclas de polimeros.
  8. 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho analito de interes es una biomolecula.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicha biomolecula se selecciona de entre el grupo que consiste en un peptido, una proteina, un acido nucleico, un lipido y un azucar.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicho analito de interes es un acido nucleico.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho transporte es por electroforesis.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la deteccion del analito unido al agente de captura.
  13. 13. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra tiene un
    volumen de entre 1 microlitro y 20 mililitros.
  14. 14. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra tiene un volumen mayor de aproximadamente 20 pl.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicha muestra tiene un volumen mayor de aproximadamente 50 pl.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dicha deteccion comprende la deteccion de un marcador en el
    anticuerpo, el analito o el resto ionico.
  17. 17. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la inmovilizacion de dicho analito de interes en una microparticula antes de la electroforesis.
    5
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 17, en el que dicha microparticula es una microparticula magnetica.
  19. 19. El metodo de la reivindicacion 17, en el que dicha microparticula esta revestida con al menos un receptor, un anticuerpo o un anti-ligando que se unen especificamente a dicho analito de interes o a un grupo de moleculas que
    10 incluyen dicho analito de interes.
  20. 20. El metodo de la reivindicacion 17, que comprende ademas la etapa de separar el analito de la microparticula antes de la electroforesis.
    15 21. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion de volumenes
    entre el deposito de gran volumen y el deposito de agrupamiento es desde 100:1 a 1000:1.
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