JP4850061B2 - 抗原の分析装置の製造方法及び分析装置 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小断面の流路を有するマイクロチップと呼ばれる分析装置及びその製造方法に関し、特に、抗原を分析するための分析装置及びその製造方法に関する。
【０００２】
最も一般的に生体高分子を分析する方法は、臨床検査である。臨床検査において、通常５〜１０ｍＬ の採血管に血液を収集し、血漿や血清部分に含まれる抗原、抗体などを分析する。疾病の診断は、複数の検査項目の組み合わせと臨床症状によって為されるため、医師はその疾病の可能性によって検査項目の組み合わせを考察する。このような検査において、患者からの採血後、検査室に検体が搬送され、そこに設置された大型の検査装置で、複数の異なった項目が測定される。その後、測定結果が医師に通知され、数日後に来院した患者に検査結果を基にした疾病の結果が通知される。こうした分析装置としては、検査室などに備え付けられる大型のものが一般的であり、運転の際に予めウォーミングアップが必ず必要であるため、緊急を要する検査にはあまり適していない。このような分析装置を用いる検査においては、乳幼児、高齢者にとっては、採血量が多いため、非常に負担であり、また、検査にタイムラグが生じ、適切な治療が行えないという問題もあった。
【０００３】
こうした点を打開するために、種々の検査法を用いた試薬開発が行われてきている。例えば、特表平１−５０３１７４号公報（特許文献１）を用いた方法や、米国特許６，４４８，００１（特許文献２）に示すイムノクロマトグラフ法が挙げられる。これらの技術を用いた方法では、名刺の１／２程度の大きさの試薬を室温で保存でき、ベットサイドで極めて簡便に分析対象物の有無を判定することが可能となっている。しかしながら、これらの方法は判定を目視により行うため、感度が必ずしも高くなく、また、定量を行う事はできず、１回の分析に採血量１００μＬ程度を要することから、患者負担を軽減するに至っていない。
【０００４】
こうした点を打開するために、特開昭６３−２７３０４２号公報（特許文献３）に記載されているようなエバネッセント波を用いた分析装置も開発されている。この装置を用いると、定量を行う事は可能となるが、１回の分析に採血量２０〜５０μＬを要するために、先の分析技術よりも改善されているものの、解決には至っていない。
【０００５】
近年、MicroTAS（Micro Total Analysis System,マイクロ総合分析システム）といわれるマイクロ流体システム技術を用いた分析方法が考案され、生体高分子の分析、同定、精製等に用いられてきている。その背景には、ゲノム解析、プロテオミクスなどに代表されるバイオ技術分野において、極微量のサンプルから短時間で多くの情報を入手したいという要望が高まっていることがある。
【０００６】
マイクロ流体システムでは、流路を小型化、マイクロ化することにより、単位体積あたりの反応表面積が増大することがわかっているので、このことから反応時間が大幅に短縮でき、単位時間あたりに入手できる情報が多くなる。さらに、その容量が微量なので流体の温度均一性を保つのが容易になり、また、試薬使用量及び廃液を大幅に削減できるなど、多くの効果が得られる。
【０００７】
このように、マイクロ流体システムは、化学産業、製薬産業をはじめ、食品産業、農業技術など多くのバイオ関連産業を含む、非常に多くの産業に大きな影響を与えるものと考えられる。
【０００８】
こうしたマイクロ流体システムを用いた免疫測定は、Ｓａｔｏらによって実証されている（Analytical Chemistry 2001, 73, 1213-1218（非特許文献１）、特開昭２００１−４６２８号公報（特許文献４））。彼らの方法では、ガラス製のマイクロチップ中の幅２００μｍ、深さ１００μｍ、長さ５０．４ｍｍの流路の途中にダムのような構造を設け、このダムで堰き止められることが可能な粒径のポリスチレンビーズにマウス抗癌胎児性抗原抗体を結合させておく。流路入口から、このマウス抗癌胎児性抗原抗体結合ビーズを流し込みダム手前に該抗体結合ビーズを堰き止めることにより、抗体結合ビーズ領域を作る。ここに、種々の濃度の癌胎児性抗原を流し込み、マウス抗体結合ビーズ−抗原結合体を作る。洗浄後、ウサギ抗癌胎児性抗原抗体を反応させて、マウス抗体結合ビーズ−抗原−ウサギ抗癌胎児性抗原抗体結合体を作る。さらに洗浄後、金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させて、マウス抗癌胎児性抗原抗体結合ビーズ−抗原−ウサギ抗癌胎児性抗原抗体−金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体結合体を作る。この後、洗浄後、熱レンズ顕微鏡（Analytical Chemistry 2001, 73, 2112-2116（非特許文献２））で、結合した金コロイド量から結合した抗原である、癌胎児性抗原の濃度を定量するというものである。彼らは、従来の酵素免疫測定法（ELISA)で、４５時間要していた反応をマイクロ流体システムを用いることにより３０分にまで短縮することに成功しており、測定感度もELISA で１ｎｇ／ｍＬであったのに対して、マイクロ流体システムを用いることにより、０．０３ｎｇ／ｍＬの検出感度に達している。さらに、用いるサンプル容量も５μＬと微量になっている。
【０００９】
しかしながら、Ｓａｔｏら分析に用いるマイクロチップ作製の工程が非常に複雑で、コストダウンが図れないのが最大の欠点である。例えば、該マイクロチップの作成の具体的な工程には、次のものが挙げられる。始めに、パイレックス（登録商標：コーニング社製）製などのガラスの洗浄を行う。通常、数種類の薬液を用いて洗浄を行う。乾燥後、このガラスにフォトレジストを塗布する。この後、露光装置にマスク、ガラスをセットして露光する。この後、現像液に浸して現像を行い、所定時間経過後にリンス液中で洗浄する。洗浄後、フッ化水素でエッジングを行い、この時点で流路を作製する。この後、フォトレジストを除去して、流路が彫られた側は完成となる。流体を流せるようにするには、この流路が彫られたガラスに、流路入口及び流路出口をドリルなどで穴開け加工した対となるガラスを密着させ、６５０℃５時間程度融着させる。こうして、流体を流すことが可能なマイクロチップが完成する。しかし、抗原などの生体高分子の結合を分析するためにはこれだけでは不十分で、抗体を結合させたポリスチレンビーズを、流路入口から流し込み、反応領域となる箇所に堰き止め、これで始めて生体高分子の分析に用いることが可能になる。以上のように、ガラスを用いたチップは工程が非常に多く、大量生産に必ずしも向いておらず、コストダウンを図ることができない。
【００１０】
このように、Ｓａｔｏらの分析に用いるマイクロチップ作製においては、マイクロチャンネルを形成するための２枚の基板の融着に６５０℃程度の加熱を必要とする。このため、抗体等のタンパク質に対して加熱を避けるために、２枚の基板の融着することによりマイクロチャンネルを形成した後に、抗原抗体反応により試料中の免疫物質を捕獲させるための固相としてガラスビーズ又は高分子ビーズに結合させた抗体を、該マイクロチャンネル内に導入して、マイクロチャンネル内部に堰き止めた状態として使用しなければならない。
【００１１】
素材にプラスチックを用いたマイクロチップ製造技術も報告されている（Analytical
Chemistry;69(14);2626-2630（非特許文献３））。非特許文献３に示されているマイクロチップはＤＮＡを電気泳動で分離するための装置にすぎず、生物学的物質を特異的結合により捕獲し分析するものではない。非特許文献３に示されているマイクロチップの作製方法は、射出成型により微細流路に対応する鋳型に融解したプラスチックを流し込み、微細流路に対応する部材を成型し、これとは別に準備した部材を何らかの方法で接着することにより、微細流路を有するマイクロチップを作製するというものである。この方法は、ガラスチップなどに比べると、工程が少なく大量生産、コストの面で非常に有利である。しかしながら、この方法でＳａｔｏらの行った様な様式で生物学的物質を特異的結合により捕獲し分析するには、ダムのような形状を鋳型となる側に設けておき、上述のような方法でマイクロチップを作製し、抗体結合ビーズを導入することにより実施するしかない。そのため、マイクロチップ自体は安価にできるにもかかわらず、その後の工程のために、必ずしもコスト的にメリットがあるとは考えられない。
【００１２】
ＷＯ０１／０３４３０２（特許文献５）に、ミクロ流体デバイスを用いた生体材料とのハイブリダイゼーションのためのバイオチャンネルアッセイが報告されている。該文献にはマイクロチャンネル内に形成されたミクロ構造物、または充填されたビーズ上に、特異的結合対メンバー、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、核酸および抗体／抗原を固定した状態で、マイクロチャンネル内に試料を流して、結合対を生成し検出することが示されているが、生物学的物質が失活しないように、分析装置を製造することに関して具体的な提案はない。
【００１３】
ＷＯ０２／０６５１３８（特許文献６）に、生体高分子と試料との結合の検出をマイクロチップ上で行ったり、結合した化合物を回収しその同定を行うことが示されている。
【特許文献１】
特表平１−５０３１７４号公報
【特許文献２】
米国特許６，４４８，００１
【特許文献３】
特開昭６３−２７３０４２号公報
【特許文献４】
特開２００１−４６２８号公報
【特許文献５】
ＷＯ０１／０３４３０２
【特許文献６】
ＷＯ０２／０６５１３８
【特許文献７】
特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献８】
米国特許５，４４５，９３４
【特許文献９】
米国特許５，８０７，５２２
【特許文献１０】
特開２０００−３５６６１１号公報
【特許文献１１】
特表平９−５０３０６０号公報（ＷＯ９５／０８７７４）
【非特許文献１】
Analytical Chemistry 2001, 73, 1213-1218
【非特許文献２】
Analytical Chemistry 2001, 73, 2112-2116
【非特許文献３】
Analytical Chemistry;69(14);2626-2630
【非特許文献４】
FASEB J. 2000 Jun;14(9):1041-60.
【非特許文献５】
J.Biomol Struct Dyn. 1999 Oct;17(2):175-191
【非特許文献６】
Molecular cloning second edition, Sambrook、Fritsch 、Maniatis著、ColdSpring Harbor Lavoratory Press, 1989, 9.14-9.19
【非特許文献７】
Applied Biosystems DNA Synthesizer model 391 user manual“User Bulletin No.50 ”
【００１４】
抗体を、マイクロチップ内のチャンネルと呼ばれる流路内に固定化するのに、流路を形成するための２枚の部材の流路となる箇所に予め、抗体を固定化して、次いで２枚の部材を熱融着や接着剤により接合する方法が用いられる。この接合の際に必要とされる熱や、或いは接着剤の影響により、抗体の特異的結合性の失活が引き起こされるという問題があった。マイクロチップのような極めて微量な抗体を正確な量で固定化し、極めて微量な検体に含まれていると疑われる測定すべき抗原を精度よく分析するための分析装置を構築するには、接合時の熱の影響は無視できない。
【００１５】
そこで、分析装置の製造過程に熱の負荷の影響が存在しても、マイクロチャンネルの流路となる部分に固定されるべき抗体の失活等の影響が無く、しかも抗体を容易に固定化可能な分析装置の出現が望まれる。
【００１６】
従来のマイクロチャンネルを形成した生物学的物質の分析装置は、測定すべき特定の生物学的物質に特化したものであり、他の生物学的物質の分析に容易に転用できず、汎用性がないので、製造コストにおいて不利であった。
【００１７】
本発明はこれらの課題を解決するためになされるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の分析装置の製造方法は、以下の（１）−（４）の工程を含むことを特徴とする。
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有するプラスチック製の第１部材と、該溝を覆うことができるプラスチック製の第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、あるいは両方に流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）を各々独立させて、タンパク質を介さずに且つ直接共有結合により固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を融着により接合することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２ｈ：ｈは整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１ｉ：ｉは整数）とからなる結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を含む試薬Ａを流して、捕獲ゾーンの複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）に該結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を特異的結合により固定化させる。
【００３１】
分析装置
図１は本発明に用いられる分析装置の概略を示した平面図であり、図２はその断面図の１例である。１は分析装置であり、第１部材５と第２部材６が接合されて構成されている。第１部材５には、幅１μｍ−５ｍｍ、好ましくは５μｍ−２ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ−５００μｍ、深さ１μｍ−７５０μｍ、好ましくは５μｍ−５００μｍ、最も好ましくは１０μ−１００μｍの断面の溝が形成されており、第２部材６と接合されたときに、流路２を形成する。流路の一方の端には流路入口３と他方の端には流路出口４が設けられている。この流路入口、流路出口の間に試薬、試料を導入するするための導入口を１個以上設けることや、目的に応じてこうした流路につながる別の流路を設けることも可能である。流路２内には抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７が設けられている。
【００３２】
図３は、流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、流路出口が複数ある場合の分析装置の態様を示す。図３の分析装置１Ａでは、一つの流路２から分岐した複数の各流路内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、流路において一つの流路入口３と複数の流路出口４−１、４−２、４−３、４−４、４−５、４−６が設けられている。
【００３３】
図４は、流路入口が複数であり、各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す。図４の分析装置１Ｂでは、複数の各流路２内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、流路において複数の流路入口３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６と一つの流路出口４が設けられている。
【００３４】
図５は、流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、さらに各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す。図５の分析装置１Ｃでは、一つの流路２から分岐した複数の各流路内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、分岐する手前の流路において一つの流路入口３が設けられ、収束した後の流路において一つの流路出口４が設けられている。
【００３５】
図６は、１種類以上の抗原を分析するための分析装置であり、流路入口が一つであり流路出口が一つである場合の態様を示す。試料中に含まれる抗原を捕獲するための捕獲ゾーンにおいて、該抗原を含む複合体を捕獲するための第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化されている。
【００３６】
前記に説明した流路を複数有する図３、図４、図５のタイプの分析装置では、各流路内に捕獲ゾーンを設け、各捕獲ゾーン毎に種類の異なる抗原を含む複合体を捕獲させるための第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）を固定化してもよく、また、各捕獲ゾーンにおいて第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）を種類毎に各々独立して固定化してもよい。又、各捕獲ゾーンにおいて、複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g ）を混在させて固定化することもできる。勿論、複数の捕獲ゾーンにおいて全て同一種類の第１核酸（Ｎ１）を固定することもできる。これらの流路入口、流路出口の途中に試薬、試料を導入するための導入口をさらに１個以上設けることや、目的に応じてこうした流路につながる別の流路を設けることも可能である。
【００３７】
本発明における分析装置１内に形成される流路２の断面は、正方形、長方形、多角形、半円形、円弧形、Ｕ字形、Ｖ字形の何れであってもよい。
【００３８】
第１部材５及び第２部材６の材質としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.3451-3457,1997 ）、アクリル系樹脂(Anal.Chem.,Vol.69,pp.2626,1997)、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.4783,1997）、環状オレフィンコポリマー、あるいは、これらの部材の表面にポリ−Ｌ−リジン、カルボジイミド、アミノ基、アルデヒド基、マレイミド基、デキストランなどで表面が修飾された物質等が用いられる。
【００３９】
第１部材及び第２部材は、例えば、次の方法により製造することができる。まず鋳型をシリコンウエハーのエッチングにより作成しておく。これに融解したポリマーを流し込んで構造を転写し、ポリマーを固化させる。転写により、幅１μｍ−５ｍｍ、好ましくは５μｍ−２ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ−５００μｍ、深さ１μｍ−７５０μｍ、好ましくは５μｍ−５００μｍ、最も好ましくは１０μ−１００μｍの断面の溝の流路が形成され、分析有効長が数ｍｍ〜数１０ｃｍの分析装置の部材が形成される。ＰＤＭＳを素材とすればガラスやＰＤＭＳとの自然吸着により簡単に流路のシーリングが行える。プラスチックを用いたマイクロチャンネルは量産化が容易なので、コストの点で有利である。またガラスの場合は、フッ化水素の反応時間によって深さを調整しなければならないが、プラスチック製の場合は、一度鋳型を作製してしまえば射出成型の技術により再現性高く生産することが可能となる。
【００４０】
分析キット
前記した課題を解決するための本発明の分析キットには、次の一番目〜十番目の分析キットが挙げられる。
【００４１】
本発明の一番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａと試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂが同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。すなわち、本発明の一番目の分析キットに用いられる分析装置は、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置である。また、本発明の一番目の分析キットに用いられる試薬Ａは、該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬である。また、本発明の一番目の分析キットに用いられる試薬Ｂは、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）と標識物（Ｍ）が結合されてなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬である。
【００４２】
本明細書に記載の分析キットにおいて、「試薬Ａと試薬Ｂが同一の系に含まれている」とは、試薬Ａと試薬Ｂが均一に混ざり合った状態のことを意味し、「試薬Ａと試薬Ｂが独立して存在する」とは、試薬Ａと試薬Ｂが別体となって、分離した状態であることを意味する。
【００４３】
図７は、本発明の一番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、第１試薬、第２試薬が独立して存在する例を示す。枠で囲った意味は他とは独立して存在していること、すなわち、別体となって、分離した状態で使用可能なことを意味する。図７における１１は、分析装置の流路内の捕獲ゾーンのみを示しており、固相（Ｓ）上に第１核酸（Ｎ１）が固定されている状態の図である。図７における１２は、第２核酸に第１抗体（Ｌ１）が結合されてなる結合体（Ｎ１−Ｌ１）を含む試薬Ａを表す図である。図７における１３は、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂを表す図である。
【００４４】
標識（Ｍ）と第２抗体（Ｌ２）の結合様式は、本発明の一番目の分析キットに限られず、本発明の全ての分析キットに適用される。図７では試薬Ａ１２と試薬Ｂ１３は異なる枠の中に表され、即ち、互いに独立して存在することが示されているが、図７とは異なる形態として、試薬Ａ１２と試薬Ｂ１３が同一の枠に存在し、均一に混合された形態、即ち、同一の系でもよい。
【００４５】
本発明の二番目の分析キットは、前記第一番目の分析キットにおいて、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂに代えて、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃを使用するものである。即ち、本発明の二番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａ，試薬Ｂ’及び試薬Ｃの内２種以上は同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００４６】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置；
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａ；
iii) 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）を含む試薬Ｂ’；及び、 iv) 該第２抗体（Ｌ２）に特異的結合性を有する第３抗体（Ｌ３）と、標識物（Ｍ）とからなる結合体（Ｌ３−Ｍ）を含む試薬Ｃ。
【００４７】
本発明の三番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、以下の分析装置と試薬Ａからなり、標識物を含まないキットである。本発明の三番目の分析キットは、標識物を予め導入した抗原を分析対象物としているため、キットの構成要素として標識物を含ませる必要がない。
【００４８】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置；及び、
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａ。
本発明の四番目の分析キットは、試薬の一部、即ち、抗原に特異的結合性を有する抗体が、分析装置内に固定化されている場合のキットである。即ち、本発明の四番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００４９】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii) 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）と標識物（Ｍ）が結合されてなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂ。
【００５０】
図８は、前記本発明の四番目の分析キットの概念図である。図８において四角い枠で囲った意味は、分析装置、試薬が独立して存在していることを示す。図８における１４は、分析装置の流路内の捕獲ゾーンのみを示した分析装置であり、固相（Ｓ）上に第１核酸（Ｎ１）が固定され、第２核酸と第１抗体（Ｌ１）からなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）が相補的核酸塩基の特異的結合により該第１核酸（Ｎ１）に結合された状態を示す。図８における１５は、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂを表す。
【００５１】
本発明の五番目の分析キットは、前記四番目の分析キットにおいて、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂに代えて、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃを使用するものである。即ち、本発明の五番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００５２】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合により捕獲ゾーンに結合体（Ｎ１−Ｎ２−Ｌ１）の形態で形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii） 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）を含む試薬Ｂ’；及び、
iii) 該第２抗体（Ｌ２）に特異的結合性を有する第３抗体（Ｌ３）と、標識物（Ｍ）とからなる結合体（Ｌ３−Ｍ）を含む試薬Ｃ。
【００５３】
本発明の六番目の分析キットは、前記一番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原（Ｏ）の分析ができるように改造したものである。即ち、本発明の六番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００５４】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ；及び、
iii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）が結合されてなる結合体（Ｌ２j −Ｍl ：j と lは独立した整数）を含む試薬Ｂ。
【００５５】
本明細書において、複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）とは、Ｎ１1 、Ｎ１2 、…、Ｎ１g ( g は整数）からなる複数種類の第１核酸を意味する。同様に、複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）もＮ２1 、Ｎ２2 、…、Ｎ２h ( h は整数）からなる複数種類の第２核酸を意味する。複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）に付したi 、１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）に付したj 、１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）に付したk 、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）も、各々の物質の種類が１、２、…等の１種類以上又は複数種類存在することを意味する。
【００５６】
本発明の七番目の分析キットは、前記二番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものであり、かつ、前記六番目の分析キットにおいて、第２抗体−標識物（試薬Ｂ）に代えて、第２抗体（試薬Ｂ’）、第３抗体−標識物（試薬Ｃ）とした分析キットである。即ち、本発明の七番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａ，試薬Ｂ’及び試薬Ｃの内２種以上は同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００５７】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ；
iii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）を含む試薬Ｂ’；及び、
iv) 該１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）に種類毎に特異的結合性を有する１種類以上の第３抗体（Ｌ３m ：m は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：ｌは整数）とからなる結合体（Ｌ３m −Ｍl ：m とl は独立した整数）を含む試薬Ｃ。
【００５８】
本発明の八番目の分析キットは、前記三番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の八番目の分析キットは、標識物を導入した複数種類の分析対象物のための分析キットであり、分析キット自体は、標識物を含まない。即ち、本発明の八番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａと分析装置とからなる分析キットである。
【００５９】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに各々独立して固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の塩基配列に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ。
【００６０】
本発明の九番目の分析キットは、前記四番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の九番目の分析キットは、試薬の一部としての、抗原に特異的結合性を有する抗体が分析装置内に固定化されている場合のキットであり、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００６１】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数) を、第１核酸と第２核酸の特異的結合により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii) 測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）と１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）が結合されてなる結合体（Ｌ２j −Ｍl ：j と lは独立した整数）を含む試薬Ｂ。
【００６２】
本発明の十番目の分析キットは、前記五番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の十番目の分析キットは、試薬の一部としての、抗原に特異的結合性を有する抗体が分析装置内に固定化されている場合のキットであり、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００６３】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数) を、第１核酸と第２核酸の特異的結合性により形成して捕獲ゾーンに結合体（Ｎ１ｇ−Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｇ、ｈ及びｉは独立した整数）の形態で各々独立して固定化してなる分析装置；
ii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）を含む試薬Ｂ’；及び、
iii) 該１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第３抗体（Ｌ３m ：m は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）とからなる結合体（Ｌ３m −Ｍl ：m とl は独立した整数）を含む試薬Ｃ。
【００６４】
本発明の分析キットを構成するために使用することができる核酸には、５塩基以上の核酸塩基からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（FASEB J. 2000 Jun;14(9):1041-60.（非特許文献４））、あるいはＬＮＡ（Locked Nucleic Acid の略語：J Biomol Struct Dyn. 1999 Oct;17(2):175-191 （非特許文献５））が挙げられる。
【００６５】
本発明の分析キットに含まれる第１抗体（Ｌ１）及び第２抗体（Ｌ２）は、反応性が同一であっても、異なっていてもよい。例えば、各々第１抗体（Ｌ１）及び第２抗体（Ｌ２）は、同一の抗原に存在する異なるエピトープに反応性を有するものであってもよいし、同一のエピトープに反応性を有するものであってもよい。
【００６７】
本発明の分析キットに使用できる標識物（Ｍ）には、蛍光物質、金属コロイド、酵素、核酸、金属、糖、レクチン、ビオチン、ビオチンに結合性を有する物質（ストレプトアビジン、アビジン、ニュートリアビジン）が挙げられる。１種類以上の抗原の分析のための本発明の分析キットにおける第２抗体又は第３抗体に結合される１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）は、各々同一の物質であってもよく、異なる物質であってもよい。
【００６８】
標識を導入された分析対象物としての抗原を分析する装置として、試薬が分析装置の流路内の捕獲ゾーンに固定化されている分析装置であれば、該試薬を別体として用いることなく、分析装置を構築することができる。このような抗原の分析装置は、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合性により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置である。該分析装置では、標識が導入された抗原を分析対象物としているので、分析するのに標識物を含む試薬を用いる必要がなく、後記に詳述する分析方法で適用できる。
【００６９】
また、標識を導入された分析対象物としての１種類以上の抗原を分析する装置として、次の分析装置を構成することができる。即ち、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i :iとh は独立した整数）を、第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）と第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）との特異的結合性により結合して捕獲ゾーンに種類毎に独立して固定化してなる分析装置である。
【００７０】
上記の本発明の各分析キットに用いられる分析装置、あるいは本発明の各分析装置において、第１部材、或いは第２部材の流路となる箇所の捕獲ゾーンとなる部位に、ＤＮＡを結合させる方法としては、サーマルインクジェットヘッドにより核酸を含む液体を液滴として、固相に付着させて、核酸を固定化する方法（特開平１１−１８７９００（特許文献７））、シリコン等の支持体にフォトリソグラフ法で複数のオリゴヌクレオチドを並べて形成するアフィメトリクス方式（米国特許５，４４５，９３４（特許文献８）等）、またはスライドガラスに多種の核酸をスポッティングによって並べて固定化するスタンフォード式（米国特許５，８０７，５２２（特許文献９））などが本発明における分析装置の製造方法に適用可能である。
【００７１】
上記の本発明に用いられる各分析装置では、流路内に固定化された第１核酸（Ｎ１）に、さらに該第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的塩基配列の第２核酸（Ｎ２）と第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む溶液を流路内に送液して、結合体（Ｎ２−Ｌ１）を該第１核酸（Ｎ１）に特異的に結合させて固定化させているので、結合体（Ｎ２−Ｌ１）の固定化の作業は、第１部材と第２部材を接合した後に行うことができる。即ち、本発明では結合体（Ｎ２−Ｌ１）の固定化の作業は、第１部材と第２部材を接合の後に行われるので、第１部材と第２部材の接合時の熱や接着剤の影響が第１抗体（Ｌ１）に及ばないという利点がある。
【００７２】
また、本発明に用いられる分析装置では、固定化された第１核酸（Ｎ１）と、その後に固定化を行う第２核酸（Ｎ２）と第１抗体（Ｌ１）からなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）は、別体として作製されているので、固定化された第１核酸（Ｎ１）を有する分析装置を作製しておけば、第１抗体の種類を変えた種々の結合体（Ｎ２−Ｌ１i ：i は整数）を作製し、目的とする抗原の種類に応じて、特異的に結合できる結合体（Ｎ２−Ｌ１1 ）、（Ｎ２−Ｌ１2 ）、…（Ｎ２−Ｌ１n ）の内の一つを選択し、前記固定化した第１核酸（Ｎ１）に結合させて固定化できる。したがって、本発明に用いられる分析装置は、抗原の種類に特化した専用の分析装置を製造するための個々の多段の製造プロセスを行うことなく、抗原の種類に応じた、第２核酸と第１抗体からなる種々の結合体（Ｎ２−Ｌ１1 ）、（Ｎ２−Ｌ１2 ）、…（Ｎ２−Ｌ１i ：i は整数）を用意しておけば、固定化された第１核酸（Ｎ１）を有する一種類の分析装置で無限の種類の抗原に対応した分析や、或いは分析装置の調製が簡単なプロセスで行える。
【０１０９】
分析装置の製造方法
本発明の分析装置の製造方法は、２枚の部材を融着する前に２枚の部材の流路となることが予定されている箇所に、リガンドを結合するための核酸を固定化しておくことに特徴を有する。本発明の分析装置の製造方法には、次の方法が挙げられる。
【０１１０】
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、或いは両方に、流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の核酸（Ｎ１）を固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を熱融着により接合することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａを導入し、捕獲ゾーンの第１核酸（Ｎ１）に該結合体（Ｎ２−Ｌ１）を特異的結合により結合させて固定化することにより分析装置を得る。
【０１１１】
測定すべき抗原が複数種類の場合には次の分析装置の製造方法が好ましい。
【０１１２】
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、あるいは両方に流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）を各々独立させて固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を融着することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２ｈ：ｈは整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１ｉ：ｉは整数）とからなる結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を含む試薬Ａを流して、捕獲ゾーンの複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）に該結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を特異的結合により固定化することにより１種類以上の抗原の分析に適した分析装置を得る。
【０１１３】
本発明における分析装置の製造に用いる第１部材及び第２部材の材質は、ポリジメチルシロキサン、セラミックス、アクリロニトリル・ブタジエンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリル・エチレンプロピレンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリルスチレン樹脂、メタクリルスチレン樹脂、ポリアミド・ナイロン樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート・ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、メタクリル樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリフェニレンエーテル樹脂、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリスチレン樹脂、熱可塑性エラストマー樹脂、アロイ、液晶ポリマー樹脂、シクロオレフィン樹脂、熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ジアリルフタレート樹脂、環状オレフィンコポリマー、及び、これらの部材表面が修飾されたものから選ばれたものが挙げられる。第１部材と第２部材は、同じ材質であっても、異なる材質であってもよい。
【０１１４】
本発明の分析装置の製造において、上記の各材質の第１部材及び第２部材の融着温度は、７０℃−１４０℃であることが好ましい。７０℃未満であると融着が十分ではなく、また１４０℃を越えると、これらの部材に直接固定される第１核酸が熱により影響を受けるからである。また、核酸はタンパク質に比べて溶剤に対して失活しないことが知られていることから（Molecular cloning second edition, Sambrook、Fritsch 、Maniatis著、ColdSpring Harbor Lavoratory Press, 1989, 9.14-9.19 （非特許文献６）; Applied Biosystems DNA Synthesizer model 391 user manual "User Bulletin No.50"（非特許文献７））である。
前記に説明した、分析キット、分析装置、分析装置の製造方法において、使用される抗体は、測定されるべき抗原に対して特異的結合性を有する抗体である。
【０１１５】
本発明の分析装置の製造方法を用いると、抗原の分析を行うための、マイクロ流体システムによる抗原の分析装置を簡単な製造プロセスで、再現性高く製造することができるようになる。また、本発明の分析装置と試薬を組み合わせた分析キットを用いると、精度高く抗原を分析することができるようになり、臨床診断において有用である。
【０１１６】
本発明に使用する分析装置における第１核酸（Ｎ１）を結合した流路中に、該核酸に少なくとも相補的塩基配列を有する核酸に第１抗体（Ｌ１）を結合させることにより、直接、第１抗体（Ｌ１）を固相に結合させる場合に比べて、以下の１．〜３．の優位点が出現する。
【０１１７】
１．抗原を捕捉するためのリガンドとしての抗体はタンパク質であるが、タンパク質は、熱に不安定で、例えば、プラスチック素材のシーリングなどにおいて７５〜１１２℃５分以上の条件が必要となるが（L.E. Locascio ら、J. Chromatogr. A、８５７（１９９９）２７５−２８４）、タンパク質はこうした温度ではきわめて不安定である。そのため、抗体を直接プラスチックなどに固定化を行い、シーリングを行った場合、失活してしまう可能性が極めて高い。しかしながら、オリゴヌクレオチドなどの核酸は、タンパク質に比べて熱や種々の有機溶媒に対して安定であることがわかっているため、１００℃以上の温度でシーリングを行っても、相補的な核酸と結合能を保持していることが容易に予測される。実際、本明細書中、予備実験例で記載するが１１０℃で１時間加温してもハイブリダイゼーションの効率に影響が無いことが確認されている。そのため、本発明の様式により製造されたチップを用いると、固定化された核酸に対する相補的な核酸を抗体に結合させ、相補的核酸−抗体複合体を流路に流し、固相に結合された核酸と該相補的核酸−抗体複合体を結合させることにより、容易に抗体を結合させた微細流路を有するチップを作製することが可能となる。この一連の反応は、それぞれの試薬ごとに反応を行っても、反応の一部あるいは全てを同時に行うこともできる。例えば、Ｃａｉｎら（Ａｌｌｅｒｇｙ（１９９８）５３、１２１３−１２１５）は、ダニ由来のアレルゲンの一種であるＤｅｒ ｐ１、Ｄｅｒｆ１などを熱処理してその抗原性の失活の程度を確認している。この実験成績によると、Ｄｅｒ ｐ１は１００℃ ３０分の加熱によってもとの抗原性の８５％が、また、Ｄｅｒｆ１は、１００℃３０分の加熱によって９８％の抗原性が失活することが確認されている。アレルギー検査のためにプラスチック材料上にこうした抗原を塗布し、溝を有する部材との熱融着を行う工程により抗原性が失活してしまい、正しい測定を行うことができない可能性が非常に高い。しかしながら、本発明による方法を用いるとこうした熱による抗原性の失活を回避できるため、抗原性失活のない状態で測定を行うことが可能となる。
【０１２０】
２．抗体を安定に微細流路中に固定できても、分析項目が変わると それに対応した抗体を固定化したチップを作製する必要があった。そのため、固定化する抗体の物性に適切な固定化条件を実験的に求め、その条件で固定化する必要があった。しかしながら、本発明の方法によると、固定化するのは核酸であり、アミノ酸配列により物性が大きく異なる抗体に比べて、配列の違いで大きく物性が異なることはなく、ほとんど同条件で結合させることができることが知られている、核酸の固定化方法をそのまま流用することが可能である。
【０１２１】
また、安定に固定化できる条件を見いだすことができても、測定すべき抗原の種類に応じて異なるリガンドとしての抗体を固定化したチップを調製する必要があり、製造計画を綿密に立てる必要があった。そうしなければ、不良在庫を抱え込んでしまうことになりかねなかった。しかしながら、本発明の方法によれば、測定対象物が抗原であっても、測定対象物とは全く関係がない任意の配列の核酸を固定化することで、それぞれの測定項目と用いるチップは完全に独立に考えることができるようになる。例えば、塩基配列１を結合した微細流路中に結合させたチップがあれば、塩基配列１に相補的な塩基配列１’に抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体を結合させたものと組み合わせれば、そのチップはＢ型肝炎表面抗原用に用いることができるし、このチップと塩基配列１’にＣ型肝炎抗原を結合させたものを組み合わせれば、そのチップはＣ型肝炎抗体検出用に用いることができる。
【０１２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に用いられる分析装置の一例を示す概略的な平面図である。
【図２】 図１の断面図である。
【図３】 流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、流路出口が複数ある場合の分析装置の態様を示す図である。
【図４】 流路入口が複数であり、各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す図である。
【図５】 流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、さらに各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す図である。
【図６】 １種類以上の抗原を分析するための分析装置であり、流路入口が一つであり流路出口が一つである場合の態様を示す図である。
【図７】 本発明の一番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、第１試薬、第２試薬が独立して存在する場合の例を示す図である。
【図８】 本発明の四番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、試薬が独立して存在している場合の例を示す図である。
【図９】 一番目の分析キット及び二番目の分析キットを用いた適用後の捕獲ゾーンにおける状態を示す図である。
【図１０】 予備実験例１の分析の結果をグラフとして示す図である。
【図１１】 チップＡ、チップＢ、チップＣ−１、チップＣ−２を用いて、ＨＢｓ抗原を含む、或いは含まない試料と反応させた場合に、ＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Biodetect 645 Reader：商品名、GeneScan社製）で蛍光強度を検出した結果を表すグラフである。
【図１２】 基板にオリゴヌクレオチドを塗布した後に熱融着により調製したプラスチック製チップを用いた免疫測定の結果を表すグラフである。
【符号の説明】
【０１２３】
１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１１、１４ 分析装置
２ 流路
３、３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６ 流路入口
４、４−１、４−２、４−３、４−４、４−５、４−６ 流路出口
５ 第１部材
６ 第２部材
７、７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６ 捕獲ゾーン
１２ 試薬Ａ
１３，１５ 試薬Ｂ
【実施例１】
【０１２４】
［予備実験例１］
（１）ＤＮＡの固定化
５’末端にアミノ基を導入した配列番号１に示したAmino group-CGA CGG ATC CCC GGG AAT TC（配列番号１）なる配列を有するオリゴヌクレオチドＡを合成し、オリゴヌクレオチドＡ８．４５μＭとなるように、ＥＤＴＡ １ｍＭを含むＰＢＳ（−）で希釈した。この溶液を、ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に直径１ｍｍになるようにスポットした。この後、１００℃に加温したホットプレート上で１時間加温し、オリゴヌクレオチドＡを共有結合により固定化した。次いで、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで１５分洗浄し、９０℃の２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで５分洗浄後、滅菌水で洗浄して、乾燥させて、オリゴヌクレオチドＡ固定化スライドガラスを調製した。
【０１２５】
（２）流路の作製および反応１
前記工程（１）で調製したオリゴヌクレオチドＡを固定化したオリゴヌクレオチド固定化スライドガラスに、微細流路となる溝（幅：３００μｍ、高さ、１００μｍ）が形成されているポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳと呼ぶ）の平板を、スライドガラス上に固定化したオリゴヌクレオチドＡ上に流路が設置されるように圧着するように貼り合わせることにより接合して、チップを作製した。チップの内部に形成された流路（幅：３００μｍ、高さ、１００μｍ）に、２％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、次いで、固定化したオリゴヌクレオチドＡと相補的なオリゴヌクレオチドＢ結合抗ＨＢｓ抗体（Oku らの方法（J Immunol Methods. 2001 Dec 1;258(1-2):73-84. ）により調製）を５００μｇ／ｍＬの濃度になるように０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、０．１％ＰＢＳ）で希釈したものを１５分間送液した。次いで、０．１％ＰＢＳで５分間送液することにより洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬになるように０．１％ＰＢＳで調製したＨＢｓ抗原を１５分間送液した。この後、０．１％ＰＢＳで５分間送液して洗浄し、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬあるいは５０μｇ／ｍＬの濃度に０．１％ＰＢＳで調製したＣｙ５標識抗ＨＢｓ抗体を１５分間送液した。すべての反応は、３７℃、流速１μｌ／ｍｉｎで行った。
【０１２６】
（３）分析
スライドガラス部とＰＤＭＳ部を分離し、スライドガラス部について、Biodetect ６４５／４チップリーダー（商品名、ジーンスキャン社製）を用いてＣｙ５の蛍光強度を測定した。その結果を表１、図１０に示した。単位はシグナル強度ユニットである。この結果より、Ｃｙ５標識抗体の濃度としては、３０μｇ／ｍＬが適していると考えられた。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
（４）抗体の直接固定化
前記工程（２）のオリゴヌクレオチドＢ結合抗ＨＢｓ抗体に用いた同じ抗体を、１０００μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ（−）で希釈した。この溶液を、ジーンスライド （商品名、株式会社日本パーカーライジング製）に直径１ｍｍになるようにスポットした。この後、１１０℃に加温したホットプレート上の１時間加温下で、あるいは、室温で抗体を固定化した。次いで、ＰＢＳ（−）で５分洗浄後、滅菌水で洗浄して、乾燥させて、抗ＨＢｓ抗体固定化スライドガラスを調製した。
【０１２９】
（５）流路の作製および反応２
前記工程（４）で調製した抗ＨＢｓ抗体固定化スライドガラスに、微細流路となる溝（幅：３００μｍ、深さ、１００μｍ）が形成されているポリジメチルシロキサンを、常温で圧着するようにして貼り合わせチップを作製した。内部に形成された微細流路に、２％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、次いで、５０ｎｇ／ｍＬになるように０．１％ＰＢＳで調製したＨＢｓ抗原を１５分間送液した。この後、０．１％ＰＢＳで５分間送液して洗浄し、３０μｇ／ｍＬの濃度に０．１％ＰＢＳで調製したＣｙ５標識抗体を１５分間送液した。すべての反応は、３７℃、流速１μｌ／ｍｉｎで行った。この後、前記工程（３）と同様にチップ上の反応性をチップリーダーで確認した。この結果、室温で抗体を固定化した場合には、反応を確認することができたが、１１０℃で固定化した場合には、反応性を確認することができなかった。
【０１３０】
（予備実験例１の考察）
前記工程５と工程３の結果から、抗体を固定化する従来の方法では、射出成型によって調製した流路溝を有する部材とフィルムあるいは平板を熱融着などで接着させて、マイクロ流体チップを作製する際の熱で抗体が失活してしまう可能性が非常に高く、免疫学的な検出には用いるチップを調製することができない。しかしながら、本発明による方法を用いれば、核酸は、１１０℃１時間加熱しても安定に結合性を示していることから、射出成型によって調製した流路溝を有する部材と、フィルムあるいは平板を熱融着などで接着させて、マイクロ流体チップを作製し、チップ流路内に結合させたＤＮＡと少なくとも相補的塩基配列を有するＤＮＡ’を抗体に結合させたものを反応させ、（基板−ＤＮＡ）−（ＤＮＡ’−抗体）なる複合体を形成させ、この後、抗原を反応させた後、Ｃｙ５標識抗体を結合させて、（基板−ＤＮＡ）−（ＤＮＡ’−抗体）−（抗原）−（Ｃｙ５標識抗体）が形成されることによって免疫学的な検出が可能であることがわかった。
【０１３１】
［予備実験例２］
３種類の材料（Ｂ型肝炎表面抗原であるＨＢｓに対するモノクローナル抗体、マウス正常抗体、オリゴヌクレオチドＡ）を、材料毎に別々の各ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に、加熱して固定化させて（固定化処理ａ、固定化処理ｂ、固定化処理ｃ）３種類の固定化処理された固定化基板を得た。得られた３種類の固定化基板上に、微細流路となる溝を形成した平板部材を接着させて、接合体の内部に形成された微細流路内に固定化材料が固定化されている３種類の異なる接合体を得た。
【０１３２】
その後、オリゴヌクレオチドＡが固定されている固定化基板については当該オリゴヌクレオチドＡに相補的なオリゴヌクレオチドＢで標識した抗ＨＢｓ抗体、あるいは、相補的オリゴヌクレオチドＢで標識したマウス正常抗体を、オリゴヌクレオチドの相補的結合により、固定化し、免疫反応を実施した。一方、抗体（Ｂ型肝炎表面抗原であるＨＢｓに対するモノクローナル抗体、マウス正常抗体）を直接、基板に固定化した固定化基板においても同様に、免疫反応を行った。これらの処理の詳細及び結果を以下に具体的に記載する。
【０１３３】
（１）ＤＮＡ又は抗体の固定化
〈固定化処理ａ〉
ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上にマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗体５００μｇ／ｍＬを含むＰＢＳをマイクロピペットでスポットし、３７℃で１時間インキュベーションし固相化後、MilliQ水で洗浄し、乾燥させた。この後、固定化基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ａを得た。
【０１３４】
〈固定化処理ｂ〉
ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上にマウス正常抗体５００μｇ／ｍＬを含むＰＢＳをマイクロピペットでスポットし、３７℃で１時間インキュベーションして固相化した後、MilliQ水で洗浄し、乾燥させた。この後、固定化基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ｂを得た。
【０１３５】
〈固定化処理ｃ〉
前記予備実験例１で用いたオリゴヌクレオチドと同一の５’末端にアミノ基を導入した配列番号１で示すオリゴヌクレオチドＡ２５μＭを含むＰＢＳをジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に塗布して、８０℃で１時間インキュベーションして固相化した。９５℃水浴中で５分間ブロッキングを行い、MilliQ水で洗浄し乾燥させた。その後、基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ｃを得た。
【０１３６】
（２）チップの作製及びブロッキング
前記工程（１）で調製したガラス固定化基板Ａ、ガラス固定化基板Ｂ、ガラス固定化基板Ｃに、微細流路となる溝（幅３００ｍμｍ、深さ１００μｍ）が形成されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の平板（フルイドウェアテクノロジーズ社製、ストレート型）を、ＰＤＭＳの粘着性を利用してそれぞれ圧着して、各ガラス固定化基板と平板の間に微細流路（流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍ）を形成したチップＡ、チップＢ、チップＣを作製した（なお、Ａ、Ｂ、Ｃはガラス固定化基板のＡ、Ｂ、Ｃに対応する。）。得られた各チップは、全長が７５ｍｍで、幅が２５ｍｍの直方体であり、該チップには流路の入口及び出口が末端より５ｍｍの位置に口径１ｍｍφで形成され、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路が４本、各流路の間隔が７ｍｍで平行に形成されている。次いで、各チップの内部に形成された流路に、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを送液することによりブロッキングを行った。
【０１３７】
次いで、前記工程で得られたブロッキングされたチップＣの微細流路に、５０μｇ／ｍＬ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ（配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドＢ）標識抗ＨＢｓ抗体、および１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、チップＣ−１を得た。一方、前記工程で得られた別のブロッキングされたチップＣの微細流路に、５０μｇ／ｍＬ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ（配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドＢ）標識マウス正常抗体および１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、チップＣ−２を得た。
【０１３８】
（３）抗原結合量の検討
〈チップＡによる 抗原結合量の確認〉
前記工程（２）で得られた、ブロッキングされたチップＡの微細流路に、５０ｎｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、ＨＢｓ抗原を含むＰＢＳで処理したチップＡを得た。
【０１３９】
一方、ＨＢｓ抗原を含まず、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを送液した以外は、前記ＨＢｓ抗原で処理したチップＡを得る工程と同様にして、ＨＢｓ抗原を含まないＰＢＳで処理したチップＡを得た。
【０１４０】
次いで、前記工程で得られた各チップＡに対して、３０μｇ／ｍＬビオチン修飾抗ＨＢｓ抗体、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄した。前記工程で得られた各チップ（ＨＢｓ抗原を含むＰＢＳで処理したチップＡ、ＨＢｓ抗原を含まないＰＢＳで処理したチップＡ）に対して、最後に、１０μｇ／ｍＬ Ｃｙ５標識ストレプトアビジン、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄した。この後、ＰＤＭＳ部分を剥がし、基板をMilliQ水で洗浄後、チップリーダーで蛍光強度を検出して、抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４１】
〈チップＢによる抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＢを用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４２】
〈チップＣ−１による抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＣ−１を用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４３】
〈チップＣ−２による抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＣ−２を用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４４】
（４）結果
図１１のグラフによれば、ＨＢｓ抗原とは反応することの無いマウス正常抗体を基板に結合させ加熱処理した場合でも、ＨＢｓ抗原を流路内に送液した場合に、ＨＢｓ抗原を含まない溶液を送液した場合よりも高い値が得られている。この結果から、抗ＨＢｓ抗体を直接基板に結合させ、加熱処理を行った場合の反応は非特異的な結合によるものと考えられる。これは加熱処理により抗体が失活し、失活した抗体に非特異的に抗原が吸着した結果と考えられる。これに対して、オリゴヌクレオチドを介した結合の場合は、抗ＨＢｓ抗体を用いた場合と、正常抗体を用いた場合で明確な差が認められることがわかる。このことは、この反応が非特異的な反応ではなく、抗原抗体反応に由来する反応であることを示唆している。
【０１４５】
したがって、プラスチックの熱融着工程において、基板を約１３０℃程度で約２０分間程度加熱するような熱融着工程を含む、微細流路中に生体分子を結合させる方法として、オリゴヌクレオチドを介する方法は、マイクロ流路内に生体高分子を直接結合させるよりも優れていることが図１１の結果より強く示唆される。
【０１４６】
本実施例３は、基板にオリゴヌクレオチドを塗布した後に熱融着により調製したプラスチック製チップを用いた免疫測定に関する。
【０１４７】
（１）プラスチック製チップの製造
アルデヒド活性化処理されたシクロオレフィン基板（住友ベークライト社製）を用い、外形の全長が７５ｍｍで、幅が２５ｍｍの直方体の基板とし、該基板に口径１ｍｍφの流路入口及び流路出口を基板の末端から５ｍｍの位置に切削加工により形成し、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路を形成するための溝を４本、各流路が平行で間隔が７ｍｍとなるように、切削加工により形成して流路溝基板を得た。
【０１４８】
これとは別に、アルデヒド活性化処理シクロオレフィン基板に２５ｍＭ NH2- ATA GTG TTC TGG GTT AGC AA なる配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドＣ）を含む溶液をマイクロピペットを用いて、流路溝基板と貼り合わせた場合に流路溝上に並ぶように、直径約１ｍｍのスポットを１５カ所塗布して固相化処理を行った。このオリゴヌクレオチドＣを固定化した基板と前記工程で得られた流路溝基板を１１０〜１３５℃の間で熱融着処理により接合させ、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路を形成してなるプラスチック製チップを得た。
【０１４９】
（２）免疫測定
前記工程で得たプラスチック製チップの流路内に、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡ）を送液することによりブロッキングを行った。前記工程（１）で固相化したオリゴヌクレオチドＣと相補的な配列であるTTG CTA ACC CAG AAC ACT AT（配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドＤ）を結合させた抗ＨＢｓ抗体５０μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。次いで、ＨＢｓ１００ｎｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。この後、ビオチン標識抗ＨＢｓ抗体１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。続いて、ＨＲＰ（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン（ロシュ社製）５０ｍＵ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。続いてＨＲＰの基質であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所）を送液しながら、ＨＲＰの酵素活性により発色したＳＡＴＢｌｕｅをSELFOC型熱レンズ顕微鏡GRIN Spectra（マイクロ化学技研社製）により検出した。得られた熱レンズ信号強度（Voltage ）を縦軸に示したグラフとして図１２に示す。
【０１５０】
（３）結果
図１２のグラフによれば、ＨＢｓＡｇを反応させていないＢｌａｎｋに比べ、１００ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを反応させたときに高いシグナルが得られたことがわかる。このことはプラスチック製チップの作製に必要な熱融着処理によっても固定化したオリゴヌクレオチドは失活せず、オリゴヌクレオチドを固定化後に熱融着したチップを用いて生体高分子の検出が可能であることを示している。
【０１５１】
生体高分子等の生物学的物質の存在の確認、量の計測が、微量な試料で迅速に行えるため、試料採取における人体への苦痛が和らげ、臨床診断において有用である。本発明の生物学的物質の分析は、化学産業、製薬産業をはじめ、食品産業、農業技術など多くのバイオ関連産業において有用である。
【０００１】
本発明は、微小断面の流路を有するマイクロチップと呼ばれる分析装置及びその製造方法に関し、特に、抗原を分析するための分析装置及びその製造方法に関する。
【０００２】
最も一般的に生体高分子を分析する方法は、臨床検査である。臨床検査において、通常５〜１０ｍＬ の採血管に血液を収集し、血漿や血清部分に含まれる抗原、抗体などを分析する。疾病の診断は、複数の検査項目の組み合わせと臨床症状によって為されるため、医師はその疾病の可能性によって検査項目の組み合わせを考察する。このような検査において、患者からの採血後、検査室に検体が搬送され、そこに設置された大型の検査装置で、複数の異なった項目が測定される。その後、測定結果が医師に通知され、数日後に来院した患者に検査結果を基にした疾病の結果が通知される。こうした分析装置としては、検査室などに備え付けられる大型のものが一般的であり、運転の際に予めウォーミングアップが必ず必要であるため、緊急を要する検査にはあまり適していない。このような分析装置を用いる検査においては、乳幼児、高齢者にとっては、採血量が多いため、非常に負担であり、また、検査にタイムラグが生じ、適切な治療が行えないという問題もあった。
【０００３】
こうした点を打開するために、種々の検査法を用いた試薬開発が行われてきている。例えば、特表平１−５０３１７４号公報（特許文献１）を用いた方法や、米国特許６，４４８，００１（特許文献２）に示すイムノクロマトグラフ法が挙げられる。これらの技術を用いた方法では、名刺の１／２程度の大きさの試薬を室温で保存でき、ベットサイドで極めて簡便に分析対象物の有無を判定することが可能となっている。しかしながら、これらの方法は判定を目視により行うため、感度が必ずしも高くなく、また、定量を行う事はできず、１回の分析に採血量１００μＬ程度を要することから、患者負担を軽減するに至っていない。
【０００４】
こうした点を打開するために、特開昭６３−２７３０４２号公報（特許文献３）に記載されているようなエバネッセント波を用いた分析装置も開発されている。この装置を用いると、定量を行う事は可能となるが、１回の分析に採血量２０〜５０μＬを要するために、先の分析技術よりも改善されているものの、解決には至っていない。
【０００５】
近年、MicroTAS（Micro Total Analysis System,マイクロ総合分析システム）といわれるマイクロ流体システム技術を用いた分析方法が考案され、生体高分子の分析、同定、精製等に用いられてきている。その背景には、ゲノム解析、プロテオミクスなどに代表されるバイオ技術分野において、極微量のサンプルから短時間で多くの情報を入手したいという要望が高まっていることがある。
【０００６】
マイクロ流体システムでは、流路を小型化、マイクロ化することにより、単位体積あたりの反応表面積が増大することがわかっているので、このことから反応時間が大幅に短縮でき、単位時間あたりに入手できる情報が多くなる。さらに、その容量が微量なので流体の温度均一性を保つのが容易になり、また、試薬使用量及び廃液を大幅に削減できるなど、多くの効果が得られる。
【０００７】
このように、マイクロ流体システムは、化学産業、製薬産業をはじめ、食品産業、農業技術など多くのバイオ関連産業を含む、非常に多くの産業に大きな影響を与えるものと考えられる。
【０００８】
こうしたマイクロ流体システムを用いた免疫測定は、Ｓａｔｏらによって実証されている（Analytical Chemistry 2001, 73, 1213-1218（非特許文献１）、特開昭２００１−４６２８号公報（特許文献４））。彼らの方法では、ガラス製のマイクロチップ中の幅２００μｍ、深さ１００μｍ、長さ５０．４ｍｍの流路の途中にダムのような構造を設け、このダムで堰き止められることが可能な粒径のポリスチレンビーズにマウス抗癌胎児性抗原抗体を結合させておく。流路入口から、このマウス抗癌胎児性抗原抗体結合ビーズを流し込みダム手前に該抗体結合ビーズを堰き止めることにより、抗体結合ビーズ領域を作る。ここに、種々の濃度の癌胎児性抗原を流し込み、マウス抗体結合ビーズ−抗原結合体を作る。洗浄後、ウサギ抗癌胎児性抗原抗体を反応させて、マウス抗体結合ビーズ−抗原−ウサギ抗癌胎児性抗原抗体結合体を作る。さらに洗浄後、金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させて、マウス抗癌胎児性抗原抗体結合ビーズ−抗原−ウサギ抗癌胎児性抗原抗体−金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体結合体を作る。この後、洗浄後、熱レンズ顕微鏡（Analytical Chemistry 2001, 73, 2112-2116（非特許文献２））で、結合した金コロイド量から結合した抗原である、癌胎児性抗原の濃度を定量するというものである。彼らは、従来の酵素免疫測定法（ELISA)で、４５時間要していた反応をマイクロ流体システムを用いることにより３０分にまで短縮することに成功しており、測定感度もELISA で１ｎｇ／ｍＬであったのに対して、マイクロ流体システムを用いることにより、０．０３ｎｇ／ｍＬの検出感度に達している。さらに、用いるサンプル容量も５μＬと微量になっている。
【０００９】
しかしながら、Ｓａｔｏら分析に用いるマイクロチップ作製の工程が非常に複雑で、コストダウンが図れないのが最大の欠点である。例えば、該マイクロチップの作成の具体的な工程には、次のものが挙げられる。始めに、パイレックス（登録商標：コーニング社製）製などのガラスの洗浄を行う。通常、数種類の薬液を用いて洗浄を行う。乾燥後、このガラスにフォトレジストを塗布する。この後、露光装置にマスク、ガラスをセットして露光する。この後、現像液に浸して現像を行い、所定時間経過後にリンス液中で洗浄する。洗浄後、フッ化水素でエッジングを行い、この時点で流路を作製する。この後、フォトレジストを除去して、流路が彫られた側は完成となる。流体を流せるようにするには、この流路が彫られたガラスに、流路入口及び流路出口をドリルなどで穴開け加工した対となるガラスを密着させ、６５０℃５時間程度融着させる。こうして、流体を流すことが可能なマイクロチップが完成する。しかし、抗原などの生体高分子の結合を分析するためにはこれだけでは不十分で、抗体を結合させたポリスチレンビーズを、流路入口から流し込み、反応領域となる箇所に堰き止め、これで始めて生体高分子の分析に用いることが可能になる。以上のように、ガラスを用いたチップは工程が非常に多く、大量生産に必ずしも向いておらず、コストダウンを図ることができない。
【００１０】
このように、Ｓａｔｏらの分析に用いるマイクロチップ作製においては、マイクロチャンネルを形成するための２枚の基板の融着に６５０℃程度の加熱を必要とする。このため、抗体等のタンパク質に対して加熱を避けるために、２枚の基板の融着することによりマイクロチャンネルを形成した後に、抗原抗体反応により試料中の免疫物質を捕獲させるための固相としてガラスビーズ又は高分子ビーズに結合させた抗体を、該マイクロチャンネル内に導入して、マイクロチャンネル内部に堰き止めた状態として使用しなければならない。
【００１１】
素材にプラスチックを用いたマイクロチップ製造技術も報告されている（Analytical
Chemistry;69(14);2626-2630（非特許文献３））。非特許文献３に示されているマイクロチップはＤＮＡを電気泳動で分離するための装置にすぎず、生物学的物質を特異的結合により捕獲し分析するものではない。非特許文献３に示されているマイクロチップの作製方法は、射出成型により微細流路に対応する鋳型に融解したプラスチックを流し込み、微細流路に対応する部材を成型し、これとは別に準備した部材を何らかの方法で接着することにより、微細流路を有するマイクロチップを作製するというものである。この方法は、ガラスチップなどに比べると、工程が少なく大量生産、コストの面で非常に有利である。しかしながら、この方法でＳａｔｏらの行った様な様式で生物学的物質を特異的結合により捕獲し分析するには、ダムのような形状を鋳型となる側に設けておき、上述のような方法でマイクロチップを作製し、抗体結合ビーズを導入することにより実施するしかない。そのため、マイクロチップ自体は安価にできるにもかかわらず、その後の工程のために、必ずしもコスト的にメリットがあるとは考えられない。
【００１２】
ＷＯ０１／０３４３０２（特許文献５）に、ミクロ流体デバイスを用いた生体材料とのハイブリダイゼーションのためのバイオチャンネルアッセイが報告されている。該文献にはマイクロチャンネル内に形成されたミクロ構造物、または充填されたビーズ上に、特異的結合対メンバー、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、核酸および抗体／抗原を固定した状態で、マイクロチャンネル内に試料を流して、結合対を生成し検出することが示されているが、生物学的物質が失活しないように、分析装置を製造することに関して具体的な提案はない。
【００１３】
ＷＯ０２／０６５１３８（特許文献６）に、生体高分子と試料との結合の検出をマイクロチップ上で行ったり、結合した化合物を回収しその同定を行うことが示されている。
【特許文献１】
特表平１−５０３１７４号公報
【特許文献２】
米国特許６，４４８，００１
【特許文献３】
特開昭６３−２７３０４２号公報
【特許文献４】
特開２００１−４６２８号公報
【特許文献５】
ＷＯ０１／０３４３０２
【特許文献６】
ＷＯ０２／０６５１３８
【特許文献７】
特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献８】
米国特許５，４４５，９３４
【特許文献９】
米国特許５，８０７，５２２
【特許文献１０】
特開２０００−３５６６１１号公報
【特許文献１１】
特表平９−５０３０６０号公報（ＷＯ９５／０８７７４）
【非特許文献１】
Analytical Chemistry 2001, 73, 1213-1218
【非特許文献２】
Analytical Chemistry 2001, 73, 2112-2116
【非特許文献３】
Analytical Chemistry;69(14);2626-2630
【非特許文献４】
FASEB J. 2000 Jun;14(9):1041-60.
【非特許文献５】
J.Biomol Struct Dyn. 1999 Oct;17(2):175-191
【非特許文献６】
Molecular cloning second edition, Sambrook、Fritsch 、Maniatis著、ColdSpring Harbor Lavoratory Press, 1989, 9.14-9.19
【非特許文献７】
Applied Biosystems DNA Synthesizer model 391 user manual“User Bulletin No.50 ”
【００１４】
抗体を、マイクロチップ内のチャンネルと呼ばれる流路内に固定化するのに、流路を形成するための２枚の部材の流路となる箇所に予め、抗体を固定化して、次いで２枚の部材を熱融着や接着剤により接合する方法が用いられる。この接合の際に必要とされる熱や、或いは接着剤の影響により、抗体の特異的結合性の失活が引き起こされるという問題があった。マイクロチップのような極めて微量な抗体を正確な量で固定化し、極めて微量な検体に含まれていると疑われる測定すべき抗原を精度よく分析するための分析装置を構築するには、接合時の熱の影響は無視できない。
【００１５】
そこで、分析装置の製造過程に熱の負荷の影響が存在しても、マイクロチャンネルの流路となる部分に固定されるべき抗体の失活等の影響が無く、しかも抗体を容易に固定化可能な分析装置の出現が望まれる。
【００１６】
従来のマイクロチャンネルを形成した生物学的物質の分析装置は、測定すべき特定の生物学的物質に特化したものであり、他の生物学的物質の分析に容易に転用できず、汎用性がないので、製造コストにおいて不利であった。
【００１７】
本発明はこれらの課題を解決するためになされるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の分析装置の製造方法は、以下の（１）−（４）の工程を含むことを特徴とする。
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有するプラスチック製の第１部材と、該溝を覆うことができるプラスチック製の第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、あるいは両方に流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）を各々独立させて、タンパク質を介さずに且つ直接共有結合により固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を融着により接合することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２ｈ：ｈは整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１ｉ：ｉは整数）とからなる結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を含む試薬Ａを流して、捕獲ゾーンの複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）に該結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を特異的結合により固定化させる。
【００３１】
分析装置
図１は本発明に用いられる分析装置の概略を示した平面図であり、図２はその断面図の１例である。１は分析装置であり、第１部材５と第２部材６が接合されて構成されている。第１部材５には、幅１μｍ−５ｍｍ、好ましくは５μｍ−２ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ−５００μｍ、深さ１μｍ−７５０μｍ、好ましくは５μｍ−５００μｍ、最も好ましくは１０μ−１００μｍの断面の溝が形成されており、第２部材６と接合されたときに、流路２を形成する。流路の一方の端には流路入口３と他方の端には流路出口４が設けられている。この流路入口、流路出口の間に試薬、試料を導入するするための導入口を１個以上設けることや、目的に応じてこうした流路につながる別の流路を設けることも可能である。流路２内には抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７が設けられている。
【００３２】
図３は、流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、流路出口が複数ある場合の分析装置の態様を示す。図３の分析装置１Ａでは、一つの流路２から分岐した複数の各流路内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、流路において一つの流路入口３と複数の流路出口４−１、４−２、４−３、４−４、４−５、４−６が設けられている。
【００３３】
図４は、流路入口が複数であり、各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す。図４の分析装置１Ｂでは、複数の各流路２内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、流路において複数の流路入口３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６と一つの流路出口４が設けられている。
【００３４】
図５は、流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、さらに各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す。図５の分析装置１Ｃでは、一つの流路２から分岐した複数の各流路内に、抗原を捕獲し、分析するための捕獲ゾーン７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６が設けられ、分岐する手前の流路において一つの流路入口３が設けられ、収束した後の流路において一つの流路出口４が設けられている。
【００３５】
図６は、１種類以上の抗原を分析するための分析装置であり、流路入口が一つであり流路出口が一つである場合の態様を示す。試料中に含まれる抗原を捕獲するための捕獲ゾーンにおいて、該抗原を含む複合体を捕獲するための第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化されている。
【００３６】
前記に説明した流路を複数有する図３、図４、図５のタイプの分析装置では、各流路内に捕獲ゾーンを設け、各捕獲ゾーン毎に種類の異なる抗原を含む複合体を捕獲させるための第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）を固定化してもよく、また、各捕獲ゾーンにおいて第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）を種類毎に各々独立して固定化してもよい。又、各捕獲ゾーンにおいて、複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g ）を混在させて固定化することもできる。勿論、複数の捕獲ゾーンにおいて全て同一種類の第１核酸（Ｎ１）を固定することもできる。これらの流路入口、流路出口の途中に試薬、試料を導入するための導入口をさらに１個以上設けることや、目的に応じてこうした流路につながる別の流路を設けることも可能である。
【００３７】
本発明における分析装置１内に形成される流路２の断面は、正方形、長方形、多角形、半円形、円弧形、Ｕ字形、Ｖ字形の何れであってもよい。
【００３８】
第１部材５及び第２部材６の材質としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.3451-3457,1997 ）、アクリル系樹脂(Anal.Chem.,Vol.69,pp.2626,1997)、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.4783,1997）、環状オレフィンコポリマー、あるいは、これらの部材の表面にポリ−Ｌ−リジン、カルボジイミド、アミノ基、アルデヒド基、マレイミド基、デキストランなどで表面が修飾された物質等が用いられる。
【００３９】
第１部材及び第２部材は、例えば、次の方法により製造することができる。まず鋳型をシリコンウエハーのエッチングにより作成しておく。これに融解したポリマーを流し込んで構造を転写し、ポリマーを固化させる。転写により、幅１μｍ−５ｍｍ、好ましくは５μｍ−２ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ−５００μｍ、深さ１μｍ−７５０μｍ、好ましくは５μｍ−５００μｍ、最も好ましくは１０μ−１００μｍの断面の溝の流路が形成され、分析有効長が数ｍｍ〜数１０ｃｍの分析装置の部材が形成される。ＰＤＭＳを素材とすればガラスやＰＤＭＳとの自然吸着により簡単に流路のシーリングが行える。プラスチックを用いたマイクロチャンネルは量産化が容易なので、コストの点で有利である。またガラスの場合は、フッ化水素の反応時間によって深さを調整しなければならないが、プラスチック製の場合は、一度鋳型を作製してしまえば射出成型の技術により再現性高く生産することが可能となる。
【００４０】
分析キット
前記した課題を解決するための本発明の分析キットには、次の一番目〜十番目の分析キットが挙げられる。
【００４１】
本発明の一番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａと試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂが同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。すなわち、本発明の一番目の分析キットに用いられる分析装置は、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置である。また、本発明の一番目の分析キットに用いられる試薬Ａは、該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬である。また、本発明の一番目の分析キットに用いられる試薬Ｂは、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）と標識物（Ｍ）が結合されてなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬である。
【００４２】
本明細書に記載の分析キットにおいて、「試薬Ａと試薬Ｂが同一の系に含まれている」とは、試薬Ａと試薬Ｂが均一に混ざり合った状態のことを意味し、「試薬Ａと試薬Ｂが独立して存在する」とは、試薬Ａと試薬Ｂが別体となって、分離した状態であることを意味する。
【００４３】
図７は、本発明の一番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、第１試薬、第２試薬が独立して存在する例を示す。枠で囲った意味は他とは独立して存在していること、すなわち、別体となって、分離した状態で使用可能なことを意味する。図７における１１は、分析装置の流路内の捕獲ゾーンのみを示しており、固相（Ｓ）上に第１核酸（Ｎ１）が固定されている状態の図である。図７における１２は、第２核酸に第１抗体（Ｌ１）が結合されてなる結合体（Ｎ１−Ｌ１）を含む試薬Ａを表す図である。図７における１３は、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂを表す図である。
【００４４】
標識（Ｍ）と第２抗体（Ｌ２）の結合様式は、本発明の一番目の分析キットに限られず、本発明の全ての分析キットに適用される。図７では試薬Ａ１２と試薬Ｂ１３は異なる枠の中に表され、即ち、互いに独立して存在することが示されているが、図７とは異なる形態として、試薬Ａ１２と試薬Ｂ１３が同一の枠に存在し、均一に混合された形態、即ち、同一の系でもよい。
【００４５】
本発明の二番目の分析キットは、前記第一番目の分析キットにおいて、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂに代えて、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃを使用するものである。即ち、本発明の二番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａ，試薬Ｂ’及び試薬Ｃの内２種以上は同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００４６】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置；
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａ；
iii) 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）を含む試薬Ｂ’；及び、 iv) 該第２抗体（Ｌ２）に特異的結合性を有する第３抗体（Ｌ３）と、標識物（Ｍ）とからなる結合体（Ｌ３−Ｍ）を含む試薬Ｃ。
【００４７】
本発明の三番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、以下の分析装置と試薬Ａからなり、標識物を含まないキットである。本発明の三番目の分析キットは、標識物を予め導入した抗原を分析対象物としているため、キットの構成要素として標識物を含ませる必要がない。
【００４８】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置；及び、
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的な配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａ。
本発明の四番目の分析キットは、試薬の一部、即ち、抗原に特異的結合性を有する抗体が、分析装置内に固定化されている場合のキットである。即ち、本発明の四番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００４９】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii) 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）と標識物（Ｍ）が結合されてなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂ。
【００５０】
図８は、前記本発明の四番目の分析キットの概念図である。図８において四角い枠で囲った意味は、分析装置、試薬が独立して存在していることを示す。図８における１４は、分析装置の流路内の捕獲ゾーンのみを示した分析装置であり、固相（Ｓ）上に第１核酸（Ｎ１）が固定され、第２核酸と第１抗体（Ｌ１）からなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）が相補的核酸塩基の特異的結合により該第１核酸（Ｎ１）に結合された状態を示す。図８における１５は、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂを表す。
【００５１】
本発明の五番目の分析キットは、前記四番目の分析キットにおいて、第２抗体（Ｌ２）に標識（Ｍ）が結合してなる結合体（Ｌ２−Ｍ）を含む試薬Ｂに代えて、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃを使用するものである。即ち、本発明の五番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００５２】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合により捕獲ゾーンに結合体（Ｎ１−Ｎ２−Ｌ１）の形態で形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii） 測定されるべき抗原（Ｏ）に特異的結合性を有する第２抗体（Ｌ２）を含む試薬Ｂ’；及び、
iii) 該第２抗体（Ｌ２）に特異的結合性を有する第３抗体（Ｌ３）と、標識物（Ｍ）とからなる結合体（Ｌ３−Ｍ）を含む試薬Ｃ。
【００５３】
本発明の六番目の分析キットは、前記一番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原（Ｏ）の分析ができるように改造したものである。即ち、本発明の六番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００５４】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ；及び、
iii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）が結合されてなる結合体（Ｌ２j −Ｍl ：j と lは独立した整数）を含む試薬Ｂ。
【００５５】
本明細書において、複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）とは、Ｎ１1 、Ｎ１2 、…、Ｎ１g ( g は整数）からなる複数種類の第１核酸を意味する。同様に、複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）もＮ２1 、Ｎ２2 、…、Ｎ２h ( h は整数）からなる複数種類の第２核酸を意味する。複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）に付したi 、１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）に付したj 、１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）に付したk 、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）も、各々の物質の種類が１、２、…等の１種類以上又は複数種類存在することを意味する。
【００５６】
本発明の七番目の分析キットは、前記二番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものであり、かつ、前記六番目の分析キットにおいて、第２抗体−標識物（試薬Ｂ）に代えて、第２抗体（試薬Ｂ’）、第３抗体−標識物（試薬Ｃ）とした分析キットである。即ち、本発明の七番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ’、試薬Ｃ及び分析装置を組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａ，試薬Ｂ’及び試薬Ｃの内２種以上は同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キットである。
【００５７】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ；
iii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）を含む試薬Ｂ’；及び、
iv) 該１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）に種類毎に特異的結合性を有する１種類以上の第３抗体（Ｌ３m ：m は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：ｌは整数）とからなる結合体（Ｌ３m −Ｍl ：m とl は独立した整数）を含む試薬Ｃ。
【００５８】
本発明の八番目の分析キットは、前記三番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の八番目の分析キットは、標識物を導入した複数種類の分析対象物のための分析キットであり、分析キット自体は、標識物を含まない。即ち、本発明の八番目の分析キットは、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ａと分析装置とからなる分析キットである。
【００５９】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置；
ii) 該分析装置の捕獲ゾーンに各々独立して固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の塩基配列に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数）を含む試薬Ａ。
【００６０】
本発明の九番目の分析キットは、前記四番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の九番目の分析キットは、試薬の一部としての、抗原に特異的結合性を有する抗体が分析装置内に固定化されている場合のキットであり、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００６１】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数) を、第１核酸と第２核酸の特異的結合により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置；及び、
ii) 測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）と１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）が結合されてなる結合体（Ｌ２j −Ｍl ：j と lは独立した整数）を含む試薬Ｂ。
【００６２】
本発明の十番目の分析キットは、前記五番目の分析キットの構成を基にして、１種類以上の抗原の分析ができるように改造したものである。本発明の十番目の分析キットは、試薬の一部としての、抗原に特異的結合性を有する抗体が分析装置内に固定化されている場合のキットであり、試薬と分析装置が別体であり、次の試薬Ｂ’と試薬Ｃと分析装置を組み合わせてなる分析キットである。
【００６３】
ｉ） 幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i ：h とi は独立した整数) を、第１核酸と第２核酸の特異的結合性により形成して捕獲ゾーンに結合体（Ｎ１ｇ−Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｇ、ｈ及びｉは独立した整数）の形態で各々独立して固定化してなる分析装置；
ii) 測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）を含む試薬Ｂ’；及び、
iii) 該１種類以上の第２抗体（Ｌ２j ：j は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する１種類以上の第３抗体（Ｌ３m ：m は整数）と、１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）とからなる結合体（Ｌ３m −Ｍl ：m とl は独立した整数）を含む試薬Ｃ。
【００６４】
本発明の分析キットを構成するために使用することができる核酸には、５塩基以上の核酸塩基からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（FASEB J. 2000 Jun;14(9):1041-60.（非特許文献４））、あるいはＬＮＡ（Locked Nucleic Acid の略語：J Biomol Struct Dyn. 1999 Oct;17(2):175-191 （非特許文献５））が挙げられる。
【００６５】
本発明の分析キットに含まれる第１抗体（Ｌ１）及び第２抗体（Ｌ２）は、反応性が同一であっても、異なっていてもよい。例えば、各々第１抗体（Ｌ１）及び第２抗体（Ｌ２）は、同一の抗原に存在する異なるエピトープに反応性を有するものであってもよいし、同一のエピトープに反応性を有するものであってもよい。
【００６７】
本発明の分析キットに使用できる標識物（Ｍ）には、蛍光物質、金属コロイド、酵素、核酸、金属、糖、レクチン、ビオチン、ビオチンに結合性を有する物質（ストレプトアビジン、アビジン、ニュートリアビジン）が挙げられる。１種類以上の抗原の分析のための本発明の分析キットにおける第２抗体又は第３抗体に結合される１種類以上の標識物（Ｍl ：l は整数）は、各々同一の物質であってもよく、異なる物質であってもよい。
【００６８】
標識を導入された分析対象物としての抗原を分析する装置として、試薬が分析装置の流路内の捕獲ゾーンに固定化されている分析装置であれば、該試薬を別体として用いることなく、分析装置を構築することができる。このような抗原の分析装置は、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の第１核酸（Ｎ１）が固定化された分析装置であって、測定されるべき抗原（Ｏ）に対し特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）と、前記固定化第１核酸（Ｎ１）に対し少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を、第１核酸（Ｎ１）と第２核酸（Ｎ２）との特異的結合性により捕獲ゾーンに形成して固定化してなる分析装置である。該分析装置では、標識が導入された抗原を分析対象物としているので、分析するのに標識物を含む試薬を用いる必要がなく、後記に詳述する分析方法で適用できる。
【００６９】
また、標識を導入された分析対象物としての１種類以上の抗原を分析する装置として、次の分析装置を構成することができる。即ち、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内に設けた第１部材上及び／又は第２部材上の捕獲ゾーンにおいて、第１部材と第２部材の接合前に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）が種類毎に各々独立して固定化された分析装置であって、測定されるべき１種類以上の抗原（Ｏk ：k は整数）の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１i ：i は整数）と、前記複数種類の固定化第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）とからなる結合体（Ｎ２h −Ｌ１i :iとh は独立した整数）を、第１核酸（Ｎ１g ：g は整数）と第２核酸（Ｎ２h ：h は整数）との特異的結合性により結合して捕獲ゾーンに種類毎に独立して固定化してなる分析装置である。
【００７０】
上記の本発明の各分析キットに用いられる分析装置、あるいは本発明の各分析装置において、第１部材、或いは第２部材の流路となる箇所の捕獲ゾーンとなる部位に、ＤＮＡを結合させる方法としては、サーマルインクジェットヘッドにより核酸を含む液体を液滴として、固相に付着させて、核酸を固定化する方法（特開平１１−１８７９００（特許文献７））、シリコン等の支持体にフォトリソグラフ法で複数のオリゴヌクレオチドを並べて形成するアフィメトリクス方式（米国特許５，４４５，９３４（特許文献８）等）、またはスライドガラスに多種の核酸をスポッティングによって並べて固定化するスタンフォード式（米国特許５，８０７，５２２（特許文献９））などが本発明における分析装置の製造方法に適用可能である。
【００７１】
上記の本発明に用いられる各分析装置では、流路内に固定化された第１核酸（Ｎ１）に、さらに該第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的塩基配列の第２核酸（Ｎ２）と第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む溶液を流路内に送液して、結合体（Ｎ２−Ｌ１）を該第１核酸（Ｎ１）に特異的に結合させて固定化させているので、結合体（Ｎ２−Ｌ１）の固定化の作業は、第１部材と第２部材を接合した後に行うことができる。即ち、本発明では結合体（Ｎ２−Ｌ１）の固定化の作業は、第１部材と第２部材を接合の後に行われるので、第１部材と第２部材の接合時の熱や接着剤の影響が第１抗体（Ｌ１）に及ばないという利点がある。
【００７２】
また、本発明に用いられる分析装置では、固定化された第１核酸（Ｎ１）と、その後に固定化を行う第２核酸（Ｎ２）と第１抗体（Ｌ１）からなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）は、別体として作製されているので、固定化された第１核酸（Ｎ１）を有する分析装置を作製しておけば、第１抗体の種類を変えた種々の結合体（Ｎ２−Ｌ１i ：i は整数）を作製し、目的とする抗原の種類に応じて、特異的に結合できる結合体（Ｎ２−Ｌ１1 ）、（Ｎ２−Ｌ１2 ）、…（Ｎ２−Ｌ１n ）の内の一つを選択し、前記固定化した第１核酸（Ｎ１）に結合させて固定化できる。したがって、本発明に用いられる分析装置は、抗原の種類に特化した専用の分析装置を製造するための個々の多段の製造プロセスを行うことなく、抗原の種類に応じた、第２核酸と第１抗体からなる種々の結合体（Ｎ２−Ｌ１1 ）、（Ｎ２−Ｌ１2 ）、…（Ｎ２−Ｌ１i ：i は整数）を用意しておけば、固定化された第１核酸（Ｎ１）を有する一種類の分析装置で無限の種類の抗原に対応した分析や、或いは分析装置の調製が簡単なプロセスで行える。
【０１０９】
分析装置の製造方法
本発明の分析装置の製造方法は、２枚の部材を融着する前に２枚の部材の流路となることが予定されている箇所に、リガンドを結合するための核酸を固定化しておくことに特徴を有する。本発明の分析装置の製造方法には、次の方法が挙げられる。
【０１１０】
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、或いは両方に、流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の核酸（Ｎ１）を固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を熱融着により接合することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された第１核酸（Ｎ１）の塩基配列に少なくとも相補的塩基配列を有する第２核酸（Ｎ２）と、測定されるべき抗原に特異的結合性を有する第１抗体（Ｌ１）とからなる結合体（Ｎ２−Ｌ１）を含む試薬Ａを導入し、捕獲ゾーンの第１核酸（Ｎ１）に該結合体（Ｎ２−Ｌ１）を特異的結合により結合させて固定化することにより分析装置を得る。
【０１１１】
測定すべき抗原が複数種類の場合には次の分析装置の製造方法が好ましい。
【０１１２】
（１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、あるいは両方に流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）を各々独立させて固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を融着することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２ｈ：ｈは整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１ｉ：ｉは整数）とからなる結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を含む試薬Ａを流して、捕獲ゾーンの複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）に該結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を特異的結合により固定化することにより１種類以上の抗原の分析に適した分析装置を得る。
【０１１３】
本発明における分析装置の製造に用いる第１部材及び第２部材の材質は、ポリジメチルシロキサン、セラミックス、アクリロニトリル・ブタジエンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリル・エチレンプロピレンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリルスチレン樹脂、メタクリルスチレン樹脂、ポリアミド・ナイロン樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート・ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、メタクリル樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリフェニレンエーテル樹脂、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリスチレン樹脂、熱可塑性エラストマー樹脂、アロイ、液晶ポリマー樹脂、シクロオレフィン樹脂、熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ジアリルフタレート樹脂、環状オレフィンコポリマー、及び、これらの部材表面が修飾されたものから選ばれたものが挙げられる。第１部材と第２部材は、同じ材質であっても、異なる材質であってもよい。
【０１１４】
本発明の分析装置の製造において、上記の各材質の第１部材及び第２部材の融着温度は、７０℃−１４０℃であることが好ましい。７０℃未満であると融着が十分ではなく、また１４０℃を越えると、これらの部材に直接固定される第１核酸が熱により影響を受けるからである。また、核酸はタンパク質に比べて溶剤に対して失活しないことが知られていることから（Molecular cloning second edition, Sambrook、Fritsch 、Maniatis著、ColdSpring Harbor Lavoratory Press, 1989, 9.14-9.19 （非特許文献６）; Applied Biosystems DNA Synthesizer model 391 user manual "User Bulletin No.50"（非特許文献７））である。
前記に説明した、分析キット、分析装置、分析装置の製造方法において、使用される抗体は、測定されるべき抗原に対して特異的結合性を有する抗体である。
【０１１５】
本発明の分析装置の製造方法を用いると、抗原の分析を行うための、マイクロ流体システムによる抗原の分析装置を簡単な製造プロセスで、再現性高く製造することができるようになる。また、本発明の分析装置と試薬を組み合わせた分析キットを用いると、精度高く抗原を分析することができるようになり、臨床診断において有用である。
【０１１６】
本発明に使用する分析装置における第１核酸（Ｎ１）を結合した流路中に、該核酸に少なくとも相補的塩基配列を有する核酸に第１抗体（Ｌ１）を結合させることにより、直接、第１抗体（Ｌ１）を固相に結合させる場合に比べて、以下の１．〜３．の優位点が出現する。
【０１１７】
１．抗原を捕捉するためのリガンドとしての抗体はタンパク質であるが、タンパク質は、熱に不安定で、例えば、プラスチック素材のシーリングなどにおいて７５〜１１２℃５分以上の条件が必要となるが（L.E. Locascio ら、J. Chromatogr. A、８５７（１９９９）２７５−２８４）、タンパク質はこうした温度ではきわめて不安定である。そのため、抗体を直接プラスチックなどに固定化を行い、シーリングを行った場合、失活してしまう可能性が極めて高い。しかしながら、オリゴヌクレオチドなどの核酸は、タンパク質に比べて熱や種々の有機溶媒に対して安定であることがわかっているため、１００℃以上の温度でシーリングを行っても、相補的な核酸と結合能を保持していることが容易に予測される。実際、本明細書中、予備実験例で記載するが１１０℃で１時間加温してもハイブリダイゼーションの効率に影響が無いことが確認されている。そのため、本発明の様式により製造されたチップを用いると、固定化された核酸に対する相補的な核酸を抗体に結合させ、相補的核酸−抗体複合体を流路に流し、固相に結合された核酸と該相補的核酸−抗体複合体を結合させることにより、容易に抗体を結合させた微細流路を有するチップを作製することが可能となる。この一連の反応は、それぞれの試薬ごとに反応を行っても、反応の一部あるいは全てを同時に行うこともできる。例えば、Ｃａｉｎら（Ａｌｌｅｒｇｙ（１９９８）５３、１２１３−１２１５）は、ダニ由来のアレルゲンの一種であるＤｅｒ ｐ１、Ｄｅｒｆ１などを熱処理してその抗原性の失活の程度を確認している。この実験成績によると、Ｄｅｒ ｐ１は１００℃ ３０分の加熱によってもとの抗原性の８５％が、また、Ｄｅｒｆ１は、１００℃３０分の加熱によって９８％の抗原性が失活することが確認されている。アレルギー検査のためにプラスチック材料上にこうした抗原を塗布し、溝を有する部材との熱融着を行う工程により抗原性が失活してしまい、正しい測定を行うことができない可能性が非常に高い。しかしながら、本発明による方法を用いるとこうした熱による抗原性の失活を回避できるため、抗原性失活のない状態で測定を行うことが可能となる。
【０１２０】
２．抗体を安定に微細流路中に固定できても、分析項目が変わると それに対応した抗体を固定化したチップを作製する必要があった。そのため、固定化する抗体の物性に適切な固定化条件を実験的に求め、その条件で固定化する必要があった。しかしながら、本発明の方法によると、固定化するのは核酸であり、アミノ酸配列により物性が大きく異なる抗体に比べて、配列の違いで大きく物性が異なることはなく、ほとんど同条件で結合させることができることが知られている、核酸の固定化方法をそのまま流用することが可能である。
【０１２１】
また、安定に固定化できる条件を見いだすことができても、測定すべき抗原の種類に応じて異なるリガンドとしての抗体を固定化したチップを調製する必要があり、製造計画を綿密に立てる必要があった。そうしなければ、不良在庫を抱え込んでしまうことになりかねなかった。しかしながら、本発明の方法によれば、測定対象物が抗原であっても、測定対象物とは全く関係がない任意の配列の核酸を固定化することで、それぞれの測定項目と用いるチップは完全に独立に考えることができるようになる。例えば、塩基配列１を結合した微細流路中に結合させたチップがあれば、塩基配列１に相補的な塩基配列１’に抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体を結合させたものと組み合わせれば、そのチップはＢ型肝炎表面抗原用に用いることができるし、このチップと塩基配列１’にＣ型肝炎抗原を結合させたものを組み合わせれば、そのチップはＣ型肝炎抗体検出用に用いることができる。
【０１２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に用いられる分析装置の一例を示す概略的な平面図である。
【図２】 図１の断面図である。
【図３】 流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、流路出口が複数ある場合の分析装置の態様を示す図である。
【図４】 流路入口が複数であり、各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す図である。
【図５】 流路入口が一つであり、流路の途中で複数の流路に分岐し、さらに各流路の途中で１本の流路に収束し、流路出口が一つの場合の分析装置の態様を示す図である。
【図６】 １種類以上の抗原を分析するための分析装置であり、流路入口が一つであり流路出口が一つである場合の態様を示す図である。
【図７】 本発明の一番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、第１試薬、第２試薬が独立して存在する場合の例を示す図である。
【図８】 本発明の四番目の分析キットの概念図を示し、分析装置、試薬が独立して存在している場合の例を示す図である。
【図９】 一番目の分析キット及び二番目の分析キットを用いた適用後の捕獲ゾーンにおける状態を示す図である。
【図１０】 予備実験例１の分析の結果をグラフとして示す図である。
【図１１】 チップＡ、チップＢ、チップＣ−１、チップＣ−２を用いて、ＨＢｓ抗原を含む、或いは含まない試料と反応させた場合に、ＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Biodetect 645 Reader：商品名、GeneScan社製）で蛍光強度を検出した結果を表すグラフである。
【図１２】 基板にオリゴヌクレオチドを塗布した後に熱融着により調製したプラスチック製チップを用いた免疫測定の結果を表すグラフである。
【符号の説明】
【０１２３】
１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１１、１４ 分析装置
２ 流路
３、３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６ 流路入口
４、４−１、４−２、４−３、４−４、４−５、４−６ 流路出口
５ 第１部材
６ 第２部材
７、７−１、７−２、７−３、７−４、７−５、７−６ 捕獲ゾーン
１２ 試薬Ａ
１３，１５ 試薬Ｂ
【実施例１】
【０１２４】
［予備実験例１］
（１）ＤＮＡの固定化
５’末端にアミノ基を導入した配列番号１に示したAmino group-CGA CGG ATC CCC GGG AAT TC（配列番号１）なる配列を有するオリゴヌクレオチドＡを合成し、オリゴヌクレオチドＡ８．４５μＭとなるように、ＥＤＴＡ １ｍＭを含むＰＢＳ（−）で希釈した。この溶液を、ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に直径１ｍｍになるようにスポットした。この後、１００℃に加温したホットプレート上で１時間加温し、オリゴヌクレオチドＡを共有結合により固定化した。次いで、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで１５分洗浄し、９０℃の２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで５分洗浄後、滅菌水で洗浄して、乾燥させて、オリゴヌクレオチドＡ固定化スライドガラスを調製した。
【０１２５】
（２）流路の作製および反応１
前記工程（１）で調製したオリゴヌクレオチドＡを固定化したオリゴヌクレオチド固定化スライドガラスに、微細流路となる溝（幅：３００μｍ、高さ、１００μｍ）が形成されているポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳと呼ぶ）の平板を、スライドガラス上に固定化したオリゴヌクレオチドＡ上に流路が設置されるように圧着するように貼り合わせることにより接合して、チップを作製した。チップの内部に形成された流路（幅：３００μｍ、高さ、１００μｍ）に、２％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、次いで、固定化したオリゴヌクレオチドＡと相補的なオリゴヌクレオチドＢ結合抗ＨＢｓ抗体（Oku らの方法（J Immunol Methods. 2001 Dec 1;258(1-2):73-84. ）により調製）を５００μｇ／ｍＬの濃度になるように０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、０．１％ＰＢＳ）で希釈したものを１５分間送液した。次いで、０．１％ＰＢＳで５分間送液することにより洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬになるように０．１％ＰＢＳで調製したＨＢｓ抗原を１５分間送液した。この後、０．１％ＰＢＳで５分間送液して洗浄し、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬあるいは５０μｇ／ｍＬの濃度に０．１％ＰＢＳで調製したＣｙ５標識抗ＨＢｓ抗体を１５分間送液した。すべての反応は、３７℃、流速１μｌ／ｍｉｎで行った。
【０１２６】
（３）分析
スライドガラス部とＰＤＭＳ部を分離し、スライドガラス部について、Biodetect ６４５／４チップリーダー（商品名、ジーンスキャン社製）を用いてＣｙ５の蛍光強度を測定した。その結果を表１、図１０に示した。単位はシグナル強度ユニットである。この結果より、Ｃｙ５標識抗体の濃度としては、３０μｇ／ｍＬが適していると考えられた。
【０１２７】
【表１】
（４）抗体の直接固定化
前記工程（２）のオリゴヌクレオチドＢ結合抗ＨＢｓ抗体に用いた同じ抗体を、１０００μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ（−）で希釈した。この溶液を、ジーンスライド （商品名、株式会社日本パーカーライジング製）に直径１ｍｍになるようにスポットした。この後、１１０℃に加温したホットプレート上の１時間加温下で、あるいは、室温で抗体を固定化した。次いで、ＰＢＳ（−）で５分洗浄後、滅菌水で洗浄して、乾燥させて、抗ＨＢｓ抗体固定化スライドガラスを調製した。
【０１２９】
（５）流路の作製および反応２
前記工程（４）で調製した抗ＨＢｓ抗体固定化スライドガラスに、微細流路となる溝（幅：３００μｍ、深さ、１００μｍ）が形成されているポリジメチルシロキサンを、常温で圧着するようにして貼り合わせチップを作製した。内部に形成された微細流路に、２％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、次いで、５０ｎｇ／ｍＬになるように０．１％ＰＢＳで調製したＨＢｓ抗原を１５分間送液した。この後、０．１％ＰＢＳで５分間送液して洗浄し、３０μｇ／ｍＬの濃度に０．１％ＰＢＳで調製したＣｙ５標識抗体を１５分間送液した。すべての反応は、３７℃、流速１μｌ／ｍｉｎで行った。この後、前記工程（３）と同様にチップ上の反応性をチップリーダーで確認した。この結果、室温で抗体を固定化した場合には、反応を確認することができたが、１１０℃で固定化した場合には、反応性を確認することができなかった。
【０１３０】
（予備実験例１の考察）
前記工程５と工程３の結果から、抗体を固定化する従来の方法では、射出成型によって調製した流路溝を有する部材とフィルムあるいは平板を熱融着などで接着させて、マイクロ流体チップを作製する際の熱で抗体が失活してしまう可能性が非常に高く、免疫学的な検出には用いるチップを調製することができない。しかしながら、本発明による方法を用いれば、核酸は、１１０℃１時間加熱しても安定に結合性を示していることから、射出成型によって調製した流路溝を有する部材と、フィルムあるいは平板を熱融着などで接着させて、マイクロ流体チップを作製し、チップ流路内に結合させたＤＮＡと少なくとも相補的塩基配列を有するＤＮＡ’を抗体に結合させたものを反応させ、（基板−ＤＮＡ）−（ＤＮＡ’−抗体）なる複合体を形成させ、この後、抗原を反応させた後、Ｃｙ５標識抗体を結合させて、（基板−ＤＮＡ）−（ＤＮＡ’−抗体）−（抗原）−（Ｃｙ５標識抗体）が形成されることによって免疫学的な検出が可能であることがわかった。
【０１３１】
［予備実験例２］
３種類の材料（Ｂ型肝炎表面抗原であるＨＢｓに対するモノクローナル抗体、マウス正常抗体、オリゴヌクレオチドＡ）を、材料毎に別々の各ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に、加熱して固定化させて（固定化処理ａ、固定化処理ｂ、固定化処理ｃ）３種類の固定化処理された固定化基板を得た。得られた３種類の固定化基板上に、微細流路となる溝を形成した平板部材を接着させて、接合体の内部に形成された微細流路内に固定化材料が固定化されている３種類の異なる接合体を得た。
【０１３２】
その後、オリゴヌクレオチドＡが固定されている固定化基板については当該オリゴヌクレオチドＡに相補的なオリゴヌクレオチドＢで標識した抗ＨＢｓ抗体、あるいは、相補的オリゴヌクレオチドＢで標識したマウス正常抗体を、オリゴヌクレオチドの相補的結合により、固定化し、免疫反応を実施した。一方、抗体（Ｂ型肝炎表面抗原であるＨＢｓに対するモノクローナル抗体、マウス正常抗体）を直接、基板に固定化した固定化基板においても同様に、免疫反応を行った。これらの処理の詳細及び結果を以下に具体的に記載する。
【０１３３】
（１）ＤＮＡ又は抗体の固定化
〈固定化処理ａ〉
ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上にマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗体５００μｇ／ｍＬを含むＰＢＳをマイクロピペットでスポットし、３７℃で１時間インキュベーションし固相化後、MilliQ水で洗浄し、乾燥させた。この後、固定化基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ａを得た。
【０１３４】
〈固定化処理ｂ〉
ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上にマウス正常抗体５００μｇ／ｍＬを含むＰＢＳをマイクロピペットでスポットし、３７℃で１時間インキュベーションして固相化した後、MilliQ水で洗浄し、乾燥させた。この後、固定化基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ｂを得た。
【０１３５】
〈固定化処理ｃ〉
前記予備実験例１で用いたオリゴヌクレオチドと同一の５’末端にアミノ基を導入した配列番号１で示すオリゴヌクレオチドＡ２５μＭを含むＰＢＳをジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に塗布して、８０℃で１時間インキュベーションして固相化した。９５℃水浴中で５分間ブロッキングを行い、MilliQ水で洗浄し乾燥させた。その後、基板を１３０℃で２０分間加熱することによりガラス固定化基板Ｃを得た。
【０１３６】
（２）チップの作製及びブロッキング
前記工程（１）で調製したガラス固定化基板Ａ、ガラス固定化基板Ｂ、ガラス固定化基板Ｃに、微細流路となる溝（幅３００ｍμｍ、深さ１００μｍ）が形成されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の平板（フルイドウェアテクノロジーズ社製、ストレート型）を、ＰＤＭＳの粘着性を利用してそれぞれ圧着して、各ガラス固定化基板と平板の間に微細流路（流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍ）を形成したチップＡ、チップＢ、チップＣを作製した（なお、Ａ、Ｂ、Ｃはガラス固定化基板のＡ、Ｂ、Ｃに対応する。）。得られた各チップは、全長が７５ｍｍで、幅が２５ｍｍの直方体であり、該チップには流路の入口及び出口が末端より５ｍｍの位置に口径１ｍｍφで形成され、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路が４本、各流路の間隔が７ｍｍで平行に形成されている。次いで、各チップの内部に形成された流路に、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを送液することによりブロッキングを行った。
【０１３７】
次いで、前記工程で得られたブロッキングされたチップＣの微細流路に、５０μｇ／ｍＬ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ（配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドＢ）標識抗ＨＢｓ抗体、および１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、チップＣ−１を得た。一方、前記工程で得られた別のブロッキングされたチップＣの微細流路に、５０μｇ／ｍＬ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ（配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドＢ）標識マウス正常抗体および１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、チップＣ−２を得た。
【０１３８】
（３）抗原結合量の検討
〈チップＡによる 抗原結合量の確認〉
前記工程（２）で得られた、ブロッキングされたチップＡの微細流路に、５０ｎｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄して、ＨＢｓ抗原を含むＰＢＳで処理したチップＡを得た。
【０１３９】
一方、ＨＢｓ抗原を含まず、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを送液した以外は、前記ＨＢｓ抗原で処理したチップＡを得る工程と同様にして、ＨＢｓ抗原を含まないＰＢＳで処理したチップＡを得た。
【０１４０】
次いで、前記工程で得られた各チップＡに対して、３０μｇ／ｍＬビオチン修飾抗ＨＢｓ抗体、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄した。前記工程で得られた各チップ（ＨＢｓ抗原を含むＰＢＳで処理したチップＡ、ＨＢｓ抗原を含まないＰＢＳで処理したチップＡ）に対して、最後に、１０μｇ／ｍＬ Ｃｙ５標識ストレプトアビジン、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１５分間送液し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを３分間送液し洗浄した。この後、ＰＤＭＳ部分を剥がし、基板をMilliQ水で洗浄後、チップリーダーで蛍光強度を検出して、抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４１】
〈チップＢによる抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＢを用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４２】
〈チップＣ−１による抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＣ−１を用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４３】
〈チップＣ−２による抗原結合量の確認〉
前記「チップＡによる抗原結合量の確認」の欄に示した抗原結合量を確認する処理において、チップＡの代わりにチップＣ−２を用いた以外は、同様にして抗原結合量を確認した。その結果を縦軸に蛍光強度を表すグラフとして図１１に示す。
【０１４４】
（４）結果
図１１のグラフによれば、ＨＢｓ抗原とは反応することの無いマウス正常抗体を基板に結合させ加熱処理した場合でも、ＨＢｓ抗原を流路内に送液した場合に、ＨＢｓ抗原を含まない溶液を送液した場合よりも高い値が得られている。この結果から、抗ＨＢｓ抗体を直接基板に結合させ、加熱処理を行った場合の反応は非特異的な結合によるものと考えられる。これは加熱処理により抗体が失活し、失活した抗体に非特異的に抗原が吸着した結果と考えられる。これに対して、オリゴヌクレオチドを介した結合の場合は、抗ＨＢｓ抗体を用いた場合と、正常抗体を用いた場合で明確な差が認められることがわかる。このことは、この反応が非特異的な反応ではなく、抗原抗体反応に由来する反応であることを示唆している。
【０１４５】
したがって、プラスチックの熱融着工程において、基板を約１３０℃程度で約２０分間程度加熱するような熱融着工程を含む、微細流路中に生体分子を結合させる方法として、オリゴヌクレオチドを介する方法は、マイクロ流路内に生体高分子を直接結合させるよりも優れていることが図１１の結果より強く示唆される。
【０１４６】
本実施例３は、基板にオリゴヌクレオチドを塗布した後に熱融着により調製したプラスチック製チップを用いた免疫測定に関する。
【０１４７】
（１）プラスチック製チップの製造
アルデヒド活性化処理されたシクロオレフィン基板（住友ベークライト社製）を用い、外形の全長が７５ｍｍで、幅が２５ｍｍの直方体の基板とし、該基板に口径１ｍｍφの流路入口及び流路出口を基板の末端から５ｍｍの位置に切削加工により形成し、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路を形成するための溝を４本、各流路が平行で間隔が７ｍｍとなるように、切削加工により形成して流路溝基板を得た。
【０１４８】
これとは別に、アルデヒド活性化処理シクロオレフィン基板に２５ｍＭ NH2- ATA GTG TTC TGG GTT AGC AA なる配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドＣ）を含む溶液をマイクロピペットを用いて、流路溝基板と貼り合わせた場合に流路溝上に並ぶように、直径約１ｍｍのスポットを１５カ所塗布して固相化処理を行った。このオリゴヌクレオチドＣを固定化した基板と前記工程で得られた流路溝基板を１１０〜１３５℃の間で熱融着処理により接合させ、流路幅３００μｍ、流路深さ１００μｍの流路を形成してなるプラスチック製チップを得た。
【０１４９】
（２）免疫測定
前記工程で得たプラスチック製チップの流路内に、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡ）を送液することによりブロッキングを行った。前記工程（１）で固相化したオリゴヌクレオチドＣと相補的な配列であるTTG CTA ACC CAG AAC ACT AT（配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドＤ）を結合させた抗ＨＢｓ抗体５０μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。次いで、ＨＢｓ１００ｎｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。この後、ビオチン標識抗ＨＢｓ抗体１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。続いて、ＨＲＰ（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン（ロシュ社製）５０ｍＵ／ｍＬを含むＰＢＳ−ＢＳＡを１０分間送液し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡのみを３分間送液することにより洗浄した。続いてＨＲＰの基質であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所）を送液しながら、ＨＲＰの酵素活性により発色したＳＡＴＢｌｕｅをSELFOC型熱レンズ顕微鏡GRIN Spectra（マイクロ化学技研社製）により検出した。得られた熱レンズ信号強度（Voltage ）を縦軸に示したグラフとして図１２に示す。
【０１５０】
（３）結果
図１２のグラフによれば、ＨＢｓＡｇを反応させていないＢｌａｎｋに比べ、１００ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを反応させたときに高いシグナルが得られたことがわかる。このことはプラスチック製チップの作製に必要な熱融着処理によっても固定化したオリゴヌクレオチドは失活せず、オリゴヌクレオチドを固定化後に熱融着したチップを用いて生体高分子の検出が可能であることを示している。
【０１５１】
生体高分子等の生物学的物質の存在の確認、量の計測が、微量な試料で迅速に行えるため、試料採取における人体への苦痛が和らげ、臨床診断において有用である。本発明の生物学的物質の分析は、化学産業、製薬産業をはじめ、食品産業、農業技術など多くのバイオ関連産業において有用である。
Claims (6)
- （１）幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−７５０μｍの断面の溝を有するプラスチック製の第１部材と、該溝を覆うことができるプラスチック製の第２部材を用意し、
該溝は第１部材と第２部材を接合したときに流路となる部分であり、該第１部材又は第２部材の何れかに、あるいは両方に流路入口及び流路出口を有し、
（２）第１部材及び／又は第２部材における流路となることが予定されている部分であって、測定されるべき抗原を捕獲するためのゾーンとなる部分に、任意の塩基配列の複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）を各々独立させて、タンパク質を介さずに且つ直接共有結合により固定化し、
（３）次いで、第１部材及び第２部材を融着により接合することにより流路を形成した接合体とし、
（４）該接合体の流路に、捕獲ゾーンに固定化された複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）の種類毎に対応した少なくとも相補的塩基配列を有する複数種類の第２核酸（Ｎ２ｈ：ｈは整数）と、測定されるべき１種類以上の抗原の種類毎に対応した特異的結合性を有する複数種類の第１抗体（Ｌ１ｉ：ｉは整数）とからなる結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を含む試薬Ａを流して、捕獲ゾーンの複数種類の第１核酸（Ｎ１ｇ：ｇは整数）に該結合体（Ｎ２ｈ−Ｌ１ｉ：ｈとｉは独立した整数）を特異的結合により固定化させることを特徴とする分析装置の製造方法。 - 融着温度が７０℃−１４０℃である請求項１記載の分析装置の製造方法。
- 前記第１部材又は第２部材が、ポリジメチルシロキサン、アクリロニトリル・ブタジエンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリル・エチレンプロピレンゴム・スチレン樹脂、アクリロニトリルスチレン樹脂、メタクリルスチレン樹脂、ポリアミド・ナイロン樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート・ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、メタクリル樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリフェニレンエーテル樹脂、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリスチレン樹脂、熱可塑性エラストマー樹脂、液晶ポリマー樹脂、シクロオレフィン樹脂、熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ジアリルフタレート樹脂、環状オレフィンコポリマー、及び、これらの部材表面が修飾されたものから選ばれたものである請求項１記載の分析装置の製造方法。
- 前記第１部材又は第２部材の材質は同一である請求項１記載の分析装置の製造方法。
- 前記第１部材又は第２部材の材質は異なる請求項１記載の分析装置の製造方法。
- 請求項１乃至５の何れか１項に記載の分析装置の製造方法により得られた分析装置。
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