JP2019500580A - デジタル計数のためのフローシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第1態様において、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体(support)を備えた、サンプル中の1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムがここでは開示され、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
実施形態において、ここで説明するシステムおよび方法は、マイクロ液滴のための改善したシールを提供し、そのため気相シールを提供する。一実施形態において、ここで説明するシステムおよび方法は、複数のマイクロ液滴を支持するための表面を有するチャネル形状のフロー区画を含む。実施形態において、ここで開示するように、チャネル形状のフロー区画はまた、マイクロ液滴を支持する表面の上に延びる表面を有し、チャネル形状のフロー区画が2つの開口を有し、1つがフロー区画の各側にあるようにした壁を含む。一実施形態において、チャネルは、四角形(square)断面を備えた矩形状であり、各開口が四角形である。他の実施形態において、フロー区画は、円柱形状であり、各開口は円形である。これらの実施形態の両方において、マイクロ液滴は、例えば、アレイ状に互いに離隔しており、フロー区画内の中央に配置される。実施形態において、中央に配置されたマイクロ液滴は、開口の各々から長さ(LE)だけ離隔している。一実施形態において、フロー区画の高さ(h)は、マイクロ液滴に含まれる流体の凝集体積に部分的に基づいて選択され、周囲環境の温度および圧力は、フロー区画および長さLEに接触する。一実施形態において、高さhは、マイクロ液滴が蒸発するレートを低減するフロー区画内の蒸気圧を生成するように選択される。理論によって縛られないが、マイクロ液滴が蒸発すると、蒸発からの蒸気が、周囲環境に全体的に露出した場合にマイクロ液滴が経験するレートと比較して、蒸発が生ずるレートを低減する気相シールを生成する。一実践では、水溶液では、特定の割合の水が気相に蒸発することが理解される。しかしながら、蒸発の程度は、(i)正しいフローチャネル深さおよび幾何形状、(ii)正しい液滴体積、(iii)正しい液滴アレイ幾何形状を選択することによって予測でき、合理的に制御できる。パラメータを適正に選択することによって、マイクロ液滴は、蒸気圧に起因して蒸発しなくなり、こうしてフローチャネルでの湿度が増加する。これは、化学的シールに類似した気相シールを提供するが、フロー区画を液相で覆う代わりに、マイクロ液滴が気相、例えば、空気の中に維持される。気相の利点は、液相と比較して、多くの大きな生体分子(タンパク質、DNA、脂質など)は、その沸点が水より著しく高いため、空気中に分配しないことである。化学的シールとは異なり、気相シールは、油相を除去する必要なしで、試薬をアレイ上に容易に導入できる。
本文脈において、用語「デジタル計数(counting)」は、サンプルの特異成分が区画の中に限界濃度で分配される任意の検体を参照し、区画の数は特異サンプル成分の数より大きい。こうして2値/デジタル値が、それが空(値0)または装填(値1)であるかに応じて各区画に割当てできる。本文脈において、装填とは、特異サンプル成分の少なくとも1つを含む区画を参照し、一方、空とは、特異サンプル成分を含まない区画を参照する。デジタル計数は、装填および空の区画の数が、特異サンプル成分から、または特異サンプル成分の存在に結合した付属検出試薬から由来する特異信号に基づいて評価される場合に行う。
疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備えた、サンプル中の1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムがここでは開示され、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。実施形態において、フロー区画は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。実施形態において、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の50%未満に低減する。
・疎水性基板によって包囲された親水性機構のパターンを提示する液滴領域であり、蒸発耐性気相封止のナノリットルからアトリットルの液滴の形成を可能にする。
・液滴領域を覆う1つ以上のフロー区画であり、親水性/疎水性パターンとの液体接触を可能にする。
・フロー区画に液体および試薬を供給するための液体装填パッド。
・フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口。
・吸引を提供し、そしてフロー区画を介して液体駆動に介在する圧力源にフロー区画を接続する液体出口。
1.コンピュータ数値制御(CNC)フライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または3次元印刷を用いて、固体基板にフロー区画を製造する。
2.CNCフライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または3次元印刷に適合した任意の固体基板を適用する。
3.1つ以上のコンポーネントからフローシステムを作成し、続いてコンポーネントを共に接合して、所望の幾何形状または機能性を達成する。接合する手法は、感圧接着フィルム、液体接着剤のスプレーコーティング、熱接合、超音波溶接またはレーザ溶接を含む。接合する代わりに、個々のコンポーネントは、例えば、最終アセンブリを生産するために、機械的、電気機械的または磁気的にクランプしてもよい。マイクロ流体用途のために利用される接合および製造プロセスの概要は、文献(Temiz, Y., Lovchik, R., Kaigala, G. V. and Delamarche, E. in "Lab-on-a-chip devices: How to close and plug the lab" published in Microelectronics Engineering, vol. 132, pp. 156-175 (2015) (DOI: 10.1016/j.mee.2014.10.013))を参照。
・親水性機構を構成する材料の親水性
・疎水性基板を構成する材料の疎水性
・機構のエリア
・機構の厚さ
1.最初に、目前の応用のために適切な液滴体積を選択する。液滴体積についての前述した議論を参照。
2.次に、この応用で適用される液体について固体/液体接触角γを取得する。
3.親水性機構の所望の幾何形状、即ち、円形、四角、六角形などについて決定する。形状は、パターンを生成するために適用される製造手順に依拠することになる。
4.ステップ3からの特定形状の外周長と対応する最大液滴体積との間の関係を計算する。円形形状の場合、関係は式(1)で提供される。他の幾何形状については、関係は、式(1)の誘導について記述したのと同様な方法で誘導する必要があるであろう。
5.ステップ4での関係から、選択した液滴体積に対応する外周長を取得する。円形形状の場合、それはRDについて式(1)を解くのに充分である。
1)用途に必要とされる液滴の合計数を決定する。上述したように、液滴の合計数は、測定のダイナミックレンジを決定し、検体の予想される濃度範囲に整合させる必要がある。
2)パターンについてのVDA値は、ここでは式(2)から計算でき、フロー区画体積、即ち、VC値について下限を提供する。
3)適用される液体の公称モル重量(MW)および体積密度(ρL)、そして測定が行われる温度(T)およびRHI値を決定する。基準温度、圧力、蒸気のエンタルピーについて適切な値セットを適用して、式(9)を用いてフロー区画体積についてVMAXを計算する。例えば、水についてはP0=1.0atm、T0=373Kであり、40.7kJ/molのΔHVAP値を示す。
4)親水性機構のパターンの特定配置、例えば、正方形格子アレイ、六角形格子アレイ、矩形格子アレイ、菱形格子アレイなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。液滴の合計数を収容するために、アレイの長さおよび幅を決定する。
5)フロー区画幾何形状、例えば、矩形チャネル、円形チャネル、半円形チャネルなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。
6)合計体積がVMAXより小さくなるように、フロー区画幾何形状を拡大縮小する。この例が例2において提供される。簡潔には、矩形チャネルの場合、合計体積は、チャネルの幅×長さ×高さとして与えられる。チャネルの幅および長さは、例えば、アレイと整合でき、高さを可変にする。こうして高さは、VMAXより小さい合計体積を提供するように選択できる。
ここで説明する本発明は、多くの可能性ある用途を有し、これは当業者に知られており、例えば、文献(Witters et al. in Digital Biology and Chemistry (DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232))を参照。これらは、アッセイのクラスを含み、我々は単一酵素結合分子分析(SELMA)と称している。SELMA式アッセイは、単一のペプチド、タンパク質及び/又はオリゴヌクレオチド分子の操作および検出に依拠している。
体積がピコリットル以下のマイクロ液滴を基板上の所定場所に液相で保持するプロセスが、マイクロ液滴を、少なくとも1つの開口を有するチャネル内に配置することと、チャネルの空間を、マイクロ液滴の蒸発を低減できるチャネル内蒸気圧を確立する値に設定することとを含む。
サンプル中の1つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、フロー区画は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。
実施形態1に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、体積(VC)を有し、体積(VC)は、全てのナノリットルからアトリットルの液滴の凝集最大液滴体積(VDA)より大きく、下記式によって計算されるVMAXより小さい。
実施形態1〜2のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構が(RD)の半径を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積(VD)は、下記式である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発は、最大液滴体積の50%未満、各ナノリットルからアトリットルの液滴の最大液滴体積の、40%未満、好ましくは30%未満、好ましくは20%未満、好ましくは10%未満、好ましくは5%未満、好ましくは1%未満である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び/又はヘリウムによって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
サンプル中の1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、親水性/疎水性パターンとの液体接触を可能にするために、液滴領域を覆う1つ以上のフロー区画を備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローシステムに液体および試薬を供給するための1つ以上の液体装填パッドを備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口を備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローチャネルを圧力源に接続する液体出口を備え、吸引を提供し、よってフローチャネルを介して液体駆動に介在する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び/又はヘリウムによって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブを備え、捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、支持体は平面的である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は平面的である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、親水性機構がアレイ状に配置された少なくとも1つの領域を含む。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、正方形平面アレイ状に編成され、機構は、半径(RD)を有する円として形状をなし、アレイは、隣接する機構の間のピッチ(δ)を有し、δは少なくとも3RDであり、アレイは、フロー方向に沿って長さ(LAX)に延びており、アレイは、フロー方向に対して垂直な長さ(LAY)に延びており、チャネルは、フロー方向に沿って長さ(LCX)を有し、LCXはLAXより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、フロー方向に対して垂直な長さ(LCY)を有し、LCYはLAYより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、高さ(h)を有し、これは少なくとも2RDで、多くてもhMAXであり、hMAXは下記の式から計算される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、少なくとも2つの領域を備え、一方の領域のアレイは、他方の領域のアレイと相違する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構を支持する領域は、フロー区画内に中央に設置される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構の数は、少なくとも1000個、好ましくは少なくとも10000個、好ましくは少なくとも100000個、好ましくは少なくとも1000000個、好ましくは少なくとも10000000個である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、フロー区画は、チャネル形状であり、区画の対向端部での2つの開口の間でフロー方向を形成する。
実施形態13に係るフローシステムにおいて、フロー区画および開口は、フロー方向に対して垂直な断面で矩形形状を有する。
実施形態13に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、矩形形状を有し、開口は、フロー方向に対して垂直な断面で円形形状を有する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、ナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、液滴は、少なくとも90度、多くても150度の、疎水性基板での接触角を示す。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、少なくとも0.1μm、多くても100μmの半径を有するナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性基板は、ガラス、親水性ポリマーまたは金属酸化物化合物である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、基板に共有結合的に接合した分子単層である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、金属基板上に化学吸着した分子単層である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、1つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)である。
前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを調製する方法。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを使用する方法。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法であり、該方法は、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む。
実施形態39に係る方法において、気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フローシステム内の蒸気圧を確立する。
実施形態39〜40のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、フローシステムにおいて実施され、該フローシステムは、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
実施形態39〜41のいずれかに係る方法において、親水性機構は、半径(RD)を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積(VD)は、下記の式である。
実施形態39〜42のいずれかに係る方法において、気相シールは、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の50%未満に低減する。
実施形態39〜43のいずれかに係る方法において、フローシステムは、実施形態1〜36のいずれかにおいて定義される。
実施形態39〜44のいずれかに係る方法はさらに、(i)疎水性基板の中または上にある親水性機構のパターンを、1つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む。
実施形態39〜45のいずれかに係る方法は、(ii)親水性機構の上で少なくとも1つの検体タイプを捕獲するステップを含む。
実施形態39〜46のいずれかに係る方法は、(iii)少なくとも1つの捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む。
実施形態39〜47のいずれかに係る方法は、(iv)検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップを含む。
実施形態39〜48のいずれかに係る方法は、(v)標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む。
実施形態39〜49のいずれかに係る方法は、ステップ(iii)、(iv)および(v)を1回以上繰り返すことを含む。
実施形態39〜50のいずれかに係る方法は、第1標識剤の代わりに、検出される第2検体タイプに特異的な第2標識剤を使用することによって、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返すことを含む。
実施形態39〜51のいずれかに係る方法は、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む。
実施形態39〜52のいずれかに係る方法において、標識剤は、表面結合した検体からの脱離によって不活性化され、フローシステムの洗浄(flushing)によって除去される。
実施形態39〜53のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素的切断によって脱離される。
実施形態39〜54のいずれかに係る方法において、標識剤は、pHを調整し、イオン強度を調整し、変性塩を追加し、または洗浄剤を追加することによって、化学的切断または脱着によって脱離される。
実施形態39〜55のいずれかに係る方法において、標識剤は、フローシステムの温度を上昇させることによって脱離される。
実施形態39〜56のいずれかに係る方法において、標識剤は、その化学的または物理的な状態を変化させることによって不活性化される。
実施形態39〜57のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的または生化学的修飾によって変化する。
実施形態39〜58のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的または物理的分断によって変化する。
実施形態39〜59のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素および特異検体認識部位を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その複合体またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜60のいずれかに係る方法において、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
実施形態39〜61のいずれかに係る方法において、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブは、リンカー(linker)部位によって親水性機構に付着され、リンカー部位は、下記の分子グループ、即ち、ポリ(エチレングリコール)、直鎖または分岐アルカン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜62のいずれかに係る方法は、親水性機構に付着された2つ以上のタイプの捕獲プローブを備え、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
実施形態39〜63のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜64のいずれかに係る方法において、液体中に1つ以上の検体タイプを含むサンプルは、完全浸漬によって親水性機構を含む基板と接触する。
実施形態39〜65のいずれかに係る方法は、液体を除去し、基板を洗浄することを含む。
実施形態39〜66のいずれかに係る方法において、標識化は、完全浸漬によって、検体用の標識剤を含む溶液を、捕獲した検体と接触させることによって実施される。
実施形態39〜67のいずれかに係る方法は、残りのプローブを含む溶液を除去し、基板を洗浄することを含む。
実施形態39〜68のいずれかに係る方法において、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
実施形態39〜69のいずれかに係る方法において、検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質/オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質/脂質複合体、ペプチド、エキソソーム(exosome)、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される。
実施形態39〜70のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される。
実施形態39〜71のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または、処理した血液サンプルなどの組織、の研究室処理サンプルから選択される。
実施形態39〜72のいずれかに係る方法において、1つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
実施形態39〜73のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合されたオリゴヌクレオチドであり、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
実施形態39〜74のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
実施形態39〜75のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
実施形態39〜76のいずれかに係る方法において、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)である。
実施形態1〜38のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相は、大気によって提供され、及び/又は、捕獲プローブは、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び/又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のDNAであり、及び/又は、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、及び/又は、検出様式は酵素であり、及び/又は、認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
実施形態39〜77のいずれかに係る方法において、気相は、大気によって提供され、及び/又は、捕獲プローブは、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブは複数領域に配置され、及び/又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のDNAであり、及び/又は、標識剤は、検出様式および認識部位を備え、及び/又は、検出様式は酵素であり、及び/又は、認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴の使用。
実施形態80に係る使用は、実施形態39〜77、79のいずれかに係る方法によって実行される。
実施形態80〜81のいずれかに係る使用は、実施形態1〜38、78のいずれかに係るフローシステムにおいて実行される。
安定したマイクロ液滴を形成するために、平面的な疎水性領域の上に組み込まれた親水性円形機構の正方形アレイをリン酸緩衝水溶液と接触させた。溶液の10μlプラグをアレイの表面を横断するように駆動して、図4の顕微鏡写真に示すように、親水性機構の上にマイクロ液滴を残した。
化学的にパターン化された固体基板が組み込まれたフローチャネルについて検討する。化学パターンは、アレイに編成された円形の親水性領域からなる。親水性アレイは、連続的な疎水性領域によって包囲される。こうして、例1に示すように、いったん水溶液が注入され、続いてフローチャネルから引き出されると、マイクロ液滴のアレイが親水性機構の上部に形成される。
フローシステムの製造は、2つの主要ステップで行った。1つのステップは、UVフォトリソグラフィおよびマイクロ加工(microfabrication)処理を利用して、パターン化した親水性機構を製造するものであり、一方、第2ステップは、親水性パターンを、直角(right)の幾何形状を示すフロー区画に集積化することに取り組むものである。以下、両方のステップについてより詳細に説明する。
本発明の実施形態において、親水性機構は、石英(quartz)(SiO2)で構成し、疎水性領域は、ペルフルオロデシルトリクロロシラン(FDTS)で構成した。製造プロセスの第1ステップにおいて、FDTSの分子単層を、MVD100分子気相成膜システム(アプライド・マイクロストラクチャ社)を用いて分子気相成膜によって石英ウエハの上に堆積した。FDTSは、石英の表面でのシラノール基との共有結合を受け、ウエハ表面での疎水性単分子層を生成した。
集積化の前に、フロー区画に嵌め込むために、マイクロ加工ウエハを矩形ピース(25mm×12mm)に切断した。アレイが更なる表面機能化を必要とする場合、下記の例4〜5で説明するように、区画集積化の前に機能化プロトコルを行った。
本例では、集積化液滴アレイチップを備えたフローシステムを用いて単一の生体分子(本ケースでは、一本鎖DNA)がどのように検出され、デジタル計数できるかを示す。フローシステムアセンブリは、例1〜3で説明した手順に従って製造し動作させたが、液滴アレイチップのPMMAフロー構造への集積化の前に、チップは、一本鎖ターゲットDNAの特異的捕獲を可能にするために、更なる表面機能化を施した。マイクロ加工チップは、4μmの直径を有し、8μmの機構間間隔で正方アレイ状に配置された93750個の円形親水性機構で構成した。
液滴アレイチップは、アセトン中で10分間の超音波処理によって全面的に洗浄し、続いてイソプロパノール中で10分間の超音波処理を行い、続いてエタノール中で10分間の超音波処理を行った。チップは、窒素フロー下で乾燥し、95%(v/v)エタノール中の1%(v/v)エポキシシラン(Dynasylan GLYEO、エボニック インダストリーズ社)液の溶液に浸漬した。チップは、30分間、エポキシシラン溶液中で培養し、続いて95%エタノールを用いて3回洗浄し、窒素フロー下で乾燥し、110℃で30分間、硬化させた。
検出のターゲットは、50−bpのDNAオリゴ(5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT−3’(SEQ ID NO:2))であった。DNAオリゴの最後の14個の塩基対は、PNA捕獲プローブに対して相補的であり、一方、DNAオリゴの最初の12個の塩基対は、DNA系標識剤に対して相補的であった。標識剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に共役した1つ以上の12−bpのDNAオリゴによって構成した。標識DNAオリゴの配列は、5’−GCC TAC GAC AGA−3’−TEG−ビオチン(TEG−ビオチンに結合したSEQ ID NO:3)であって、TEGは、テトラエチレングリコールリンカーを表す。
標識緩衝液:5×SSC緩衝液、0.5%(v/v)トリトンX−100、10g/lのBSA、pH7.0。
洗浄緩衝液1:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.1%(v/v)トリトンX−100、50g/lの20kDaモル重量のポリ(エチレングリコール)(PEG20000)、pH7.4。
洗浄緩衝液2:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、50g/lのPEG20000、pH7.4。
検出緩衝液:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、10g/lのPEG20000、1.0mMのH2O2、pH7.4。
ステップ1:25μlのDNAターゲット溶液を0.2μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ2:フローチャネルを10μlのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ3:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ4:フローチャネルを、標識緩衝液中の50pMのNAv−HRP−LO3の10μlで注入する。
ステップ5:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ6:100μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ7:100μlの洗浄緩衝液2を10μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ8:検出緩衝液中の200μMのampliflu red(シグマアルドリッチ社、90101−5MG−F)溶液の3μlを5μl/分のフローレートで作動させる。
本例において、捕獲されたDNAターゲットが、標識剤の不活性化によってどのようにして繰り返し検出できるかを示す。本例で使用したフローシステムは、例1〜3に従って製造し動作し、そして例4で提供された表面機能化プロトコルに従って機能化した。
ステップ1:25μlのDNAターゲット溶液を0.2μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ2:フローチャネルを10μlのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ3:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ4:フローチャネルを、標識緩衝液中の50pMのNAv−HRP−LO3の10μlで注入する。
ステップ5:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ6:100μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ7:100μlの洗浄緩衝液2を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ8:検出緩衝液中の200μMのampliflu red(シグマアルドリッチ社、90101−5MG−F)溶液の3μlを5μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ9:液滴アレイの蛍光および明視野顕微鏡写真を記録する。
ステップ10:フローチャネルを10μlの消化緩衝液で注入する。
ステップ11:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ12:20μlの不活性化緩衝液を5μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ13:50μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ14:ステップ4〜13を繰り返す。
ステップ15:ステップ4〜9を繰り返す。
本例において、100μlのサンプル溶液中に存在するDNA検体のデジタル検出を実施できるフローシステムが、後述するステップを続けることによって得られる。検体(ターゲットDNA)は、サンプル中に約10aMの濃度で存在すると予想され、下記の配列セグメント:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT−3’(SEQ ID NO:4)を含む。検体に加えて、サンプルは、約10000倍以上の濃度、即ち、100fMの他の非ターゲットDNA分子(野生型DNA)を含むと予想され、下記の配列セグメント:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC CAC TAT−3’(SEQ ID NO:5)を含む。ターゲットおよび野生型DNAは、ボールド体の下線付き位置だけ配列が相違する。
SEQ ID NO:1:ACA TAG TTG ACA CG
SEQ ID NO:2:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT−3’
SEQ ID NO.3:5’−GCC TAC GAC AGA−3’
SEQ ID NO:4:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT−3’
SEQ ID NO:5:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC CAC TAT−3’
SEQ ID NO:6:5’−GTG CCT ACG ACA GA−3’
SEQ ID NO:7:5’−ATA GTT GAC AC−3’
Claims (43)
- サンプル中の1つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステム(10)であって、
疎水性基板(16)の中または上に親水性機構(14)のパターンを有する支持体(12)を備え、
疎水性基板(16)は、少なくとも1つの開口(20)を含むフロー区画(18)の中に組み込まれ、
親水性機構(14)は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、
フロー区画(18)は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成され、
フロー区画(18)は、体積(VC)を有し、体積(VC)は、全てのナノリットルからアトリットルの液滴の凝集最大液滴体積(VDA)より大きく、下記式によって計算されるVMAXより小さい、フローシステム(10)。
- 1つ以上の区別できる検体タイプのための少なくとも1つの捕獲プローブ(22)を備え、捕獲プローブ(22)は、親水性機構(14)に付着される、請求項1記載のフローシステム(10)。
- 平面的な疎水性基板(16)の中または上に平面的な親水性機構(14)のパターンを有する支持体(12)を備えた、サンプル中の1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステム(10)であって、
疎水性基板(16)は、少なくとも1つの開口(20)を含むフロー区画(18)の中に組み込まれ、
親水性機構(14)は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、
フローシステム(10)は、1つ以上の区別できる検体タイプのための少なくとも1つの捕獲プローブ(22)を備え、捕獲プローブ(22)は、親水性機構(14)に付着される、フローシステム(10)。 - 気相は、大気によって提供される、請求項1〜5のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- 異なるタイプの捕獲プローブ(22)が複数領域(24)に配置される、請求項1〜6のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- 親水性機構(14)は、正方形平面アレイ状に編成され、
機構は、半径(RD)を有する円として形状をなし、
アレイは、隣接する機構の間のピッチ(δ)を有し、δは少なくとも3RDであり、
アレイは、フロー方向に沿って長さ(LAX)に延びており、
アレイは、フロー方向に対して垂直な長さ(LAY)に延びており、
チャネルは、フロー方向に沿って長さ(LCX)を有し、LCXはLAXより大きいか、またはこれに等しく、
チャネルは、フロー方向に対して垂直な長さ(LCY)を有し、LCYはLAYより大きいか、またはこれに等しく、
チャネルは、高さ(h)を有し、これは少なくとも2RDで、多くてもhMAXであり、hMAXは下記の式から計算される、請求項1〜7のいずれかに記載のフローシステム(10)。
ここで、γは疎水性材料についての液体接触角であり、θMAXは液滴の最大許容蒸発体積割合であり、ρLは液体の体積密度であり、Rはモル気体定数であり、Tは温度であり、RHIは液体の気体成分の初期相対蒸気飽和であり、P0は対応する基準温度T0での液体の基準蒸気圧であり、MWは液体のモル重量であり、ΔHVAPは液体の蒸発のエンタルピーである。 - 親水性機構(14)のための支持体(12)は、フロー区画(18)内に中央に設置される、請求項1〜8のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- 親水性機構(14)の数は、少なくとも1000個、好ましくは少なくとも10000個、好ましくは少なくとも100000個、好ましくは少なくとも1000000個、好ましくは少なくとも10000000個である、請求項1〜9のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- 捕獲プローブ(22)は、1つ以上の捕獲した検体との共有結合を可能にする、請求項1〜10のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- デジタル計数は、デジタル計数測定である、請求項1〜11のいずれかに記載のフローシステム(10)。
- 請求項1〜12のいずれかに定義されるフローシステムを調製する方法。
- 少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、請求項1〜13のいずれかに定義されるフローシステムを使用する方法。
- 少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法であって、
気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む、方法。 - 気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フローシステム内の蒸気圧を確立する、請求項15記載の方法。
- 気相シールは、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の50%未満に低減する、請求項15〜16のいずれかに記載の方法。
- フローシステムは、請求項1〜12のいずれかに定義される、請求項15〜17のいずれかに記載の方法。
- (i)疎水性基板(16)の中または上にある親水性機構(14)のパターンを、1つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む、請求項15〜18のいずれかに記載の方法。
- (ii)親水性機構(14)の上で1つ以上の検体タイプを捕獲するステップを含む、請求項15〜19のいずれかに記載の方法。
- (iii)捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む、請求項15〜20のいずれかに記載の方法。
- (iv)検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップを含む、請求項15〜21のいずれかに記載の方法。
- (v)標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む、請求項15〜22のいずれかに記載の方法。
- ステップ(iii)、(iv)および(v)を1回以上繰り返すことを含む、請求項15〜23のいずれかに記載の方法。
- 第1標識剤の代わりに、検出される第2検体タイプに特異的な第2標識剤を使用することによって、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返すことを含む、請求項15〜24のいずれかに記載の方法。
- ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む、請求項15〜25のいずれかに記載の方法。
- 標識剤は、表面結合した検体からの脱離によって不活性化され、フローシステムの洗浄によって除去される、請求項15〜26のいずれかに記載の方法。
- 標識剤は、酵素および特異検体認識部位を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その複合体またはその合成変異体から選択される、請求項15〜27のいずれかに記載の方法。
- 1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブ(22)は、親水性機構(14)に付着される、請求項15〜28のいずれかに記載の方法。
- 親水性機構(14)に付着された2つ以上のタイプの捕獲プローブ(22)を備え、異なるタイプの捕獲プローブ(22)が複数領域(24)に配置される、請求項15〜29のいずれかに記載の方法。
- 捕獲プローブ(22)は、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはその合成変異体から選択される、請求項15〜30のいずれかに記載の方法。
- 液体中に1つ以上の検体タイプを含むサンプルは、完全浸漬によって親水性機構(14)を含む基板と接触する、請求項15〜31のいずれかに記載の方法。
- 標識化は、完全浸漬によって、検体用の標識剤を含む溶液を、捕獲した検体と接触させることによって実施される、請求項15〜32のいずれかに記載の方法。
- 検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質/オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質/脂質複合体、ペプチド、エキソソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される、請求項15〜33のいずれかに記載の方法。
- サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される、請求項15〜34のいずれかに記載の方法。
- サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織の研究室処理サンプルから選択される、請求項15〜35のいずれかに記載の方法。
- 1つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブ(22)と共有結合できる、請求項15〜36のいずれかに記載の方法。
- デジタル計数は、デジタル計数測定である、請求項15〜37のいずれかに記載の方法。
- デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)である、請求項15〜38のいずれかに記載の方法。
- 気相は、大気によって提供され、
捕獲プローブは、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、
異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、
検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖DNAであり、
標識剤は、検出様式および認識部位を備え、
検出様式は、酵素であり、
認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される、請求項15〜39のいずれかに記載の方法。 - 少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴の使用。
- 請求項15〜40のいずれかに記載の方法によって実行される、請求項41記載の使用。
- 請求項1〜12のいずれかに記載のフローシステムにおいて実行される、請求項41〜42のいずれかに記載の使用。
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