CN104535769B - 经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高密度生物大分子单分子芯片的制作技术，该方法可将单个生物大分子固定于纳米阵列，从而制备成单分子芯片。首先制备能扦插入单个生物大分子的纳米坑阵列；并对纳米坑阵列底部进行选择性表面修饰而活化，以确保单个生物大分子能够固定到纳米坑阵列中；因基片表面的其他区域未被活化，不能绑定目标分子；最后清洗基片，获得高通量的单分子生物芯片。本发明获得的目的生物芯片主要特征是单分子、高通量、多功能，未来可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等领域。

Description

经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法

技术领域

本发明涉及一种生物芯片制作技术，具体是一种生物大分子(即DNA、RNA和蛋白质)高密度单分子芯片的制作方法。

背景技术

高密度生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)单分子芯片，即每一个样点只有一个生物大分子，样点间距达到光学分辨率极限，可以实现单位面积的数据量最大化；各样点上的单分子，可通过分子生物学手段修饰后用作“诱饵”，捕获靶分子，既可用于分子间如抗原与抗体间的相互作用、DNA杂交检测单核苷酸多态性、拷贝数变异和比较基因组杂交芯片等，也可用于DNA合成法测序、连接法测序等，将第二代测序技术转换为第三代测序技术。但是，生物大分子单分子芯片的制作难度大，传统的方法采用稀释的生物大分子溶液铺设，有很大的随机性，有许多分子因相互重叠而无法观察；此外，基片上部分区域样点极少或没有样品，检测效率降低。迄今，还没有比较有效的高密度生物大分子单分子芯片制作技术。

经对现有文献检索发现，2010年，CompleteGenomics(华大基因)公司在SCIENCE(第327卷，第78-81页)发表了题为“HumanGenomeSequencingUsingUnchainedBaseReadsonSelf-AssemblingDNANanoarrays”论文。该项技术将经滚环复制后形成的DNA纳米球样品固定到预先制备好的硅基阵列中，大大增加了芯片表面检测样点的密度，有效地提高了DNA测序通量和试剂的使用效率。但是，滚环复制后进入阵列的DNA并非来自天然基因组的单拷贝片段，而是短片段的多重拷贝，也即该芯片不是真正意义上的单分子DNA芯片。本发明要解决的技术问题是指提供单分子状态的高通量生物芯片。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的单分子芯片制作技术，即经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片，该方法可将单个生物大分子固定于纳米阵列，通过单分子样点的间距控制，建立高密度、多功能生物大分子的单分子芯片。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：制备能扦插入单个生物大分子的纳米坑阵列；并对纳米坑阵列底部进行选择性表面修饰而活化，以确保单个生物大分子能够固定到纳米坑阵列中；因基片表面的其他区域未被活化，不能绑定目标分子；最后清洗基片，获得高通量的单分子生物芯片。

所述方法具体按照如下步骤实施：

第一步，纳米阵列基底的制备：在洁净的基底上镀一层薄膜，薄膜的化学成分与基底不同，以备后续选择性修饰基底。

第二步，纳米坑阵列的制备：刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于2个生物大分子的纳米坑；如此反复，制作出纳米坑阵列；

第三步，纳米坑底部的选择性修饰：用化学方法，选择性修饰纳米坑底部，使之携带上活性基团A；因薄膜材料化学成分与基底不同，不能被修饰，因此，经清洗后，薄膜表面不含活性基团A；此后，直接进入下一步。

第四步，单分子生物芯片的制备：将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米坑的直径小于2个生物大分子，因此，内部只能连接1个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。

优选地，所述的基底，可以采用常用的基底材料，包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片等。

优选地，所述的薄膜，可以是金或铂等金属材料，也可以是PMMA等非金属材料。在选用有荧光淬灭效应的材料做薄膜时，上述第四步之后需要在薄膜上覆盖厚度≥5nm的保护层，屏蔽淬灭效应。

优选地，所述的在基底上镀一层薄膜，可以采用离子溅射、磁控溅射或者旋涂光刻胶等方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直径。

优选地，所述的刻蚀薄膜，可以用聚焦离子束(FIB)或聚焦电子束(FEB)辐照刻蚀薄膜。所述的刻蚀，是指控制基底暴露的加工技术，可以是FIB或FEB。

优选地，根据需要，纳米坑中心间距控制在≤1000纳米。所述的纳米坑中心间距≤1000纳米，是根据所采用的荧光分子的波长而定，两个相邻的荧光分子有分辨率极限，当前的高分辨率光学显微镜的分辨极限为200纳米，随着科学技术进步，有了突破当前分辨极限的显微镜，本发明的纳米孔中心间距，还可以随之降低；本发明也可以制备纳米坑中心间距超过1000纳米的阵列，但芯片上的样点量将大幅度下降，检测的信息量也会随之降低。

优选地，所述的生物大分子，可以是蛋白质的单体、二聚体和多聚体(包括抗体)，也可以是单个蛋白质携带单根核酸分子的复合物；所述核酸分子，可以是DNA，也可以是RNA。

优选地，所述的活性基团A与B，是指二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

与国内外同类芯片相比，本发明采用的制备工艺简单，适于大规模的单分子芯片制备，单分子样点间距可控，单分子连接效率接近100％。可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为规则纳米点阵列的制备流程示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。全部实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例及附图所采用的方法。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。

以下实施例中，对于制备得到的生物大分子单分子芯片的检测：用荧光分子标记生物大分子，清洗后，在高分辨荧光显微镜下检测。

所述的用荧光分子标记生物大分子后检测，也可以在固定生物大分子前，用荧光分子标记生物大分子后检测。

所述的单分子芯片的质量检测，可以采用荧光标记的方法在荧光显微镜下检测。也可以采用非荧光检测方法，如原子力显微镜检测。

实施例1

第一步，采用离子溅射，在现剥离的云母基片表面镀10nm厚的铂金薄膜。

第二步，采用FIB在镀膜基片上刻蚀出直径约30nm的纳米坑，使纳米坑底部暴露出云母表面，再在与该纳米坑相距500nm处重复该刻蚀过程，如此循环反复而制备出纳米坑阵列。

第三步，用乙醇和丙酮清洗纳米坑阵列，干燥后置于APTES(氨丙基三乙氧基硅烷)溶液处理，选择性使阵列中纳米坑的底部氨基化，清洗后用Biotin-NHS(生物素-N-琥珀酰亚胺基酯)处理，使坑底表面选择性生物素化。

第四步，用数量多于纳米坑数的单个四聚体状态的抗链酶生物素蛋白携带单个生物素标记的单根DNA分子复合物溶液处理纳米坑阵列，使复合物中抗链霉生物素上的自由活性绑定位点与纳米坑底部的生物素绑定。由于纳米坑底部只能容纳一个抗链霉生物素分子，又有足够量的复合物分子，因此，获得的DNA芯片为高密度单分子芯片。

第五步，用常规生物化学手段，将牛血清白蛋白(BSA)处理芯片，使铂金表面吸附一层BSA。

实施效果：本实施例可获得使阵列中纳米坑的单分子DNA装载效率接近100％的高密度单分子芯片，样点间距约500nm。经进一步分子生物学处理，该芯片可用于单分子水平的连接测序、合成测序、比较基因组杂交和单核苷酸多态性检测等，四色荧光检测时，样点间距与光学检测极限相匹配。

实施例2

第一步，采用磁控溅射，在经水虎鱼(Piranha)溶液和无离子水清洗的石英基片表面镀10nm厚的金薄膜。

第二步，采用聚焦电子束在金膜上刻蚀直径约20nm的纳米坑，使纳米坑底部暴露出石英表面，再在与该纳米坑相距200nm处重复该刻蚀过程，如此循环反复而制备出纳米坑阵列。

第三步，用乙醇和丙酮清洗纳米坑阵列，干燥后置于APTES溶液处理，选择性使阵列中纳米坑的底部氨基化，清洗后用Biotin-NHS处理，使坑底表面选择性生物素化。

第四步，用数量多于纳米坑数的单个四聚体状态的抗链酶生物素蛋白携带单个生物素标记的单根RNA分子复合物溶液处理纳米坑阵列，使复合物中抗链霉生物素上的自由活性绑定位点与纳米坑底部的生物素绑定。由于纳米坑底部只能容纳一个抗链霉生物素分子，又有足够量的复合物分子，因此，获得的RNA芯片为高密度单分子芯片。

第五步，用常规生物化学手段，将BSA处理芯片，使金表面覆盖一层BSA。

实施效果：本实施例可获得使阵列中纳米坑的单分子RNA装载效率接近100％的高密度单分子芯片。该芯片经进一步分子生物学处理，可用于单分子水平的RNA测序、单细胞RNA测序、RNA-DNA杂交等，最近样点间距为200nm，单波长紫色荧光检测时，样点间距与光学检测极限相匹配。

实施例3

第一步，采用磁控溅射，在经Piranha溶液和无离子水清洗的玻璃基片表面旋涂厚度约30nm的PMMA薄膜。

第二步，利用聚焦离子束在PMMA薄膜上刻蚀直径20nm的纳米坑阵列，使玻璃表面的羟基暴露；设定纳米坑相距500nm，制作成纳米坑阵列。

第三步，用乙醇和丙酮清洗纳米坑阵列，干燥后置于APTES溶液处理，选择性使阵列中纳米坑的底部氨基化，清洗后用Biotin-NHS处理，使坑底表面选择性生物素化。

第四步，用抗链霉生物素处理纳米坑阵列，通过免疫反应，将抗链霉生物素固定在纳米坑底部。

第五步，将与TNF-α(肿瘤坏死因子)绑定、标记有生物素的TNF-α单克隆抗体复合物固定到纳米坑底部，纳米坑的尺度只可容纳一个复合物分子，从而，获得高密度单分子芯片。

第六步，将荧光标记的TNF-α单克隆抗体与纳米坑内的TNF-α作用，通过免疫反应而得到固定。冲洗后荧光显微镜检测。

实施效果：本实施例可获得使阵列中纳米坑的单个蛋白质分子装载效率接近100％的高密度单分子芯片，用于高通量单分子抗体筛选。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到，上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，纳米阵列基底的制备：在洁净的基底上镀一层薄膜，薄膜的化学成分与基底不同，以备后续选择性修饰基底；

第二步，纳米坑阵列的制备：刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于2个生物大分子的纳米坑；如此反复，制作出纳米坑阵列；

第三步，纳米坑底部的选择性修饰：用化学方法，选择性修饰纳米坑底部，使之携带上活性基团A；因薄膜材料化学成分与基底不同，不能被修饰，因此，经清洗后，薄膜表面不含活性基团A；此后，直接进入下一步；

第四步，单分子生物芯片的制备：将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米坑的直径小于2个生物大分子，因此，内部只能连接1个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。

2.根据权利要求1所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的纳米坑中心间距≤1000纳米。

3.根据权利要求1所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的纳米坑，按照所制作的单分子生物芯片的要求，保证其直径不超过2个生物大分子的直径，即单个活性纳米坑中最多只能放置一个生物大分子。

4.根据权利要求1所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的生物大分子，是蛋白质的单体、二聚体或多聚体，或是单个蛋白质携带单根核酸分子的复合物；所述核酸分子是DNA或RNA。

5.根据权利要求1所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的活性基团A与B，是指二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可。

6.根据权利要求1所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的活性基团A与B包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基。

7.根据权利要求1-6任一项所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的基底，其材料包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片；所述的薄膜，是金或铂或PMMA。

8.根据权利要求1-6任一项所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的在洁净的基底上镀一层薄膜，采用离子溅射、磁控溅射或者旋涂光刻胶方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直径。

9.根据权利要求1-6任一项所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的刻蚀薄膜是用聚焦离子束或电子束曝光刻蚀薄膜。

10.根据权利要求1-6任一项所述的经高密度纳米坑制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：在选用有荧光淬灭效应的材料做薄膜时，在第四步之后需要在薄膜上覆盖厚度≥5nm的保护层，屏蔽淬灭效应。