CN114561455A - 一种芯片表面化学修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种芯片表面化学修饰方法，包括：提供包括表面的第一固体支撑物，所述表面之上包括连续的涂层；穿过涂层形成表面之下的微米尺度或纳米尺度的轮廓；提供表面材料与所述涂层相同的第二固体支撑物，将其与第一固体支撑物封装成芯片；对所述涂层轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内部不反应；对微米尺度或纳米尺度的轮廓内部进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应。本发明提供的方法为先将芯片封装成流动池，再完成芯片表面化学修饰，能够避免表面修饰对粘贴、键合等封装工艺的限制。
Description
技术领域
本发明涉及一种芯片表面化学修饰方法，属于生物化学领域。
背景技术
基因测序是当今科技发展的代表性技术之一。二代测序(NGS)是当前非常成熟的测序技术。在二代基因测序技术中，芯片是决定测序质量的关键因素之一，很多时候芯片上需要具备刻蚀的微坑，这些微坑的主要作用是为反应提供反应室以及分隔。特别的，利用荧光发生技术实现高通量测序时，是通过读取释放在溶液中的荧光分子的信号强度来获知待测核酸序列信息的，由于荧光分子会发生扩散，因此要求测序芯片必须利用微坑将荧光分子限制在原位，并将不同的微坑隔离开。由于微坑内的化学反应体系为水相，因此可以利用油相隔离(油封)。这就对芯片的微加工和表面修饰提出了高难度的要求，即需要每个微坑满足微坑内表面亲水、微坑外表面疏水。此外，高通量测序芯片中的微坑尺寸很小，通常只有微纳米级别大小，对如此微小的微坑内外进行区分性修饰的难度非常大。因此，需要一种可以严格区分修饰芯片微坑内外表面的化学修饰方法。
发明内容
基于荧光发生技术的高通量测序芯片必须在芯片表面同时具备疏水和亲水的修饰层。疏水部分是实现油封的必要条件，亲水部分则可以显著降低蛋白、DNA等生物大分子在表面的非特异性吸附。已有的技术路线利用化学气相沉积(CVD)的方式引入了含有碳氟链官能团的硅烷实现疏水修饰，也同样利用CVD的方式引入如氨基、巯基、羧基、降冰片烯、炔基等官能团的硅烷，并通过进一步偶联反应连接聚乙二醇、聚乙烯醇、水凝胶、聚乳酸等亲水大分子，从而实现亲水修饰。这样的技术路线有以下几个缺点：
1.修饰工艺并不会对微阵列的微坑内部(侧壁、底面)，和微坑外部(微坑之间的连接区域)等结构进行区分，不同结构区域的各官能团的修饰密度没有显著区别。微坑间的连接区域是实现油封的关键，理论上讲需要尽量疏水，而不加区分的修饰方法会在该区域引入亲水大分子，降低在测序过程油封的成功率。微坑内部构成了测序反应的微反应器，同时也是待测序列被固定的区域，理论上需要尽可能亲水，且对待测序列的固载要尽可能稳定，而在这些区域引入疏水官能团，会增加测序反应中的蛋白、DNA等大分子的非特异性吸附。
2.芯片需要先完成CVD等几步表面修饰，然后封装成流动池，再在流动池内完成后续一系列表面连接反应。因此在CVD的时候必须考虑对芯片用来封装的区域进行区分，以防止表面改性影响了粘贴、键合等封装工艺的效果，还要避免粘贴、键合等工艺的操作条件不能破坏已经引入的各类硅烷及其官能团。这些限制条件都制约了工艺手段和工艺条件的可选范围。
3.为了在足够洁净、硅羟基活性足够高的芯片上完成修饰，疏水硅烷的CVD步骤一定要在进行连接亲水分子和生物大分子的化学反应之前完成，因此不可避免地使得这些大分子在后续反应过程中吸附在疏水层上，进一步削弱该区域的疏水性质。同时，由于疏水的流动池内气泡更不容易被水溶液推走，后续这些反应的流体进样环节还需要非常谨慎的操作，防止带入气泡。
为了克服上述缺点，本发明公开一种芯片表面化学修饰方法，其特征在于，包括：
提供包括表面的第一固体支撑物，所述表面之上包括连续的涂层；
穿过所述涂层形成表面之下的微米尺度或纳米尺度的轮廓；
提供表面材料与所述涂层相同的第二固体支撑物，将其与第一固体支撑物封装成芯片；
对所述涂层轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内部不反应；
对微米尺度或纳米尺度的轮廓内部进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
其中，所述第一固体支撑物包括玻璃；所述轮廓包括微坑。
本发明还公开了一种基因测序芯片的使用方法，所述基因测序芯片的特征在于：包括第一固体支撑物和第二固体支撑物，其中第一固体支撑物包括表面，所述表面之上包括连续的涂层；所述表面之下具有微米尺度或纳米尺度的轮廓；所述第二固体支撑物表面材料与所述涂层相同；所述基因测序芯片的使用方法包括以下步骤：
1)对所述轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内不反应；
2)对微米尺度或纳米尺度的轮廓内进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
3)将核酸引物或连接有核酸分子的微球固载至轮廓内；
进行扩增和/或测序反应。
根据优选的实施方式，所述第一固体支撑物为石英玻璃、蓝宝石玻璃、普通玻璃中的一种。
根据优选的实施方式，所述涂层材料选自金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种。
根据优选的实施方式，所述涂层厚度为10nm-150nm，优选20nm-100nm。
根据优选的实施方式，所述轮廓为第一固体支撑物中的离散的微坑，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米。
根据优选的实施方式，所述微米尺度或纳米尺度的轮廓由疏水性间隙区相互分隔。
根据优选的实施方式，所述涂层材料为金，则所述疏水修饰物可来自以下物质：癸硫醇、辛硫醇等含有脂肪链的硫醇，或全氟癸硫醇、全氟辛硫醇等含有碳氟链的硫醇；所述涂层材料为氧化铝、氧化锌等金属氧化物或氮化镓等物质，则所述疏水修饰物为带有脂肪链或碳氟链的膦酸。
根据优选的实施方式，所述第二固体支撑物邻近所述涂层的表面也发生所述疏水修饰反应。
根据优选的实施方式，所述亲水修饰包括：先修饰带巯基、氨基、羧基、降冰片烯、炔基等官能团的硅烷，再利用与之对应的如马来酰亚胺、琥珀酸异丙酯、EDC化学、点击化学等反应，再连接如聚乙二醇、聚乙烯醇、水凝胶、聚乳酸等亲水高分子。
根据优选的实施方式，所述亲水修饰后的轮廓内包括固载点，可将特定的核酸引物或者将已连接核酸分子的微球固载到轮廓内。
本发明提供一种基因测序芯片，其特征在于，所述芯片的流动池表面包括重复特征图案，其中第一特征图案为微米或纳米尺度的轮廓，所述轮廓包括离散的微坑，其内为亲水修饰物；第二特征图案为轮廓间隔区，其包括涂层以及涂层上的疏水修饰物；所述涂层为金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米；所述轮廓内有固载点，可以将核酸引物或连接核酸分子的微球固载至轮廓内，进行扩增和/或测序反应。
本发明的有益效果
本发明提供一种区分修饰基因测序芯片内外表面的方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.本发明提供的方法为先将芯片封装成流动池，再完成芯片表面化学修饰，此顺序与传统方法中先修饰后封装的顺序相反，能够避免表面修饰对粘贴、键合等封装工艺的限制，扩大了工艺手段和工艺条件的可选范围。
2.由于涂层的存在引入了一种和玻璃表面截然不同的材料，可以选择特异性足够好的修饰化学对微坑内外两种材料分别修饰，微坑外的疏水修饰保证测序过程油封的成功率，微坑内的亲水修饰使得核酸的固载更加稳定。
3.在实际使用时，可以根据所选涂层的材料和对应的化学修饰方式，灵活调整各步反应的先后顺序，规避吸附、气泡等干扰因素。
附图说明
附图中的尺寸和比例仅用于示意本发明的方法，并不一定按照比例尺绘制。
图1.利用涂层的芯片表面区分性修饰的效果示意图。图中101表示第一固体支撑物表面的涂层，102表示第二固体支撑物邻近涂层的表面，该表面材料与所述涂层相同，103表示疏水修饰物，104表示轮廓内的亲水修饰物。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的实施例作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。
本发明实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。附图中各部分的尺寸和形状不代表真实比例，只用以示意本发明内容。
除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”的使用不是限制性的，应被解释为具有开放式含义，也就是说，其应与短语“至少包括”同义地解释。
具体的，本发明的第一方面提供一种利用涂层的芯片表面化学修饰方法，其特征在于，包括：
提供包括表面的第一固体支撑物，所述表面之上包括连续的涂层；
穿过所述涂层形成表面之下的微米尺度或纳米尺度的轮廓；
提供表面材料与所述涂层相同的第二固体支撑物，将其与第一固体支撑物封装成芯片；
对所述涂层轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内部不反应；
对微米尺度或纳米尺度的轮廓内部进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
其中，所述第一固体支撑物包括玻璃；所述轮廓包括微坑。
本发明中，“轮廓”指的是固体支撑物表面形状的局部变化形成的结构，示例性的轮廓包括孔、微坑等凹陷结构，是测序生物化学反应发生的场所。轮廓可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合，本发明对轮廓的形状并没有特定的要求。在优选的实施方式中，轮廓(或称微坑)以规则的或重复的图案提供在固体支撑物表面上。
本发明中，“固体支撑物”指的是刚性材料，其不与水溶液互溶。固体支撑物具有基本平坦的或平坦的表面，是形成芯片流动池的组件。
本发明中，所述固体支撑物的“表面”指的是其外部，表面可以与另一种材料诸如涂层、气体、液体、聚合物等接触。表面可以是平面的或基本平坦的，表面还可以具有微坑等轮廓。轮廓的形成方式一般是在一块平面的板材上，利用刻蚀或者其他方式，制备凹陷的结构，从而形成阵列的轮廓。特殊的，阵列的轮廓的部分区域有可区分的标志，比如微坑缺失的区域，比如特殊形状的微坑等等。
本发明中，所涉及的位置相关的词语，例如“上”“下”“左”“右”“垂直”“水平”“X方向”“Y方向”“Z方向”“前”“后”“高”“低”“内”“外”表述的是相对的位置关系，并不代表具体的位置。本发明中所称的内部或者外部属于一般性的意义，属于常见的描述方式。其中，所述轮廓“内”指的是，位于轮廓的空间中。例如，对于轮廓是微坑的情况，“轮廓内部进行亲水修饰”意为，亲水修饰物在微坑的底面及侧壁上。如图1所示，对轮廓内部进行了亲水修饰104，轮廓外部即为轮廓之间的间隔区域，表面为疏水修饰103，其中疏水修饰发生在101所示的涂层以及102所示的第二支撑物邻近涂层的表面上。
本发明中所述的亲水、疏水也是常规意义上的亲水、疏水。一般性的，材料表面对于水的接触角大于90度则为疏水，材料表面对于水的接触角小于90度则为亲水。
根据优选的实施方式，所述第一固体支撑物为石英玻璃、蓝宝石玻璃、普通玻璃中的一种。
根据优选的实施方式，所述涂层材料选自金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种。
根据优选的实施方式，所述涂层厚度为10nm-150nm，优选20nm-100nm。
根据优选的实施方式，可以用电镀等方式在第一固体支撑物表面加上所述涂层。
根据优选的实施方式，在第一固体支撑物表面之上的涂层上涂覆光刻胶，进行曝光、显影、刻蚀，形成表面之下的轮廓。之后，将第一固体支撑物与第二固体支撑物封装，再进行化学修饰。其中，第二固体支撑物表面的材料与所述涂层相同。
根据优选的实施方式，所述轮廓为第一固体支撑物中的离散的微坑，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米。
根据优选的实施方式，所述微米尺度或纳米尺度的轮廓由疏水性间隙区相互分隔。
本发明中，对轮廓之间的间隔区域进行疏水修饰，是利用与涂层反应而与轮廓内表面不反应的物质来实现的。如利用巯基和金的特异性反应，通过癸硫醇、辛硫醇等含有脂肪链的硫醇，或全氟癸硫醇、全氟辛硫醇等含有碳氟链的硫醇(1H,1H,2H,2H-Perfluorodecanethiol)，在金涂层表面进行疏水修饰。也可以利用带有脂肪链，或碳氟链的膦酸(1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanephosphonic acid)与氧化铝、氧化锌等金属氧化物以及氮化镓等物质的特异性反应，在金属氧化物或氮化物涂层上进行疏水修饰。
根据优选的实施方式，所述第二固体支撑物邻近所述涂层的表面(即图1中102所示)也发生所述疏水修饰反应。
本发明中，轮廓内亲水修饰采用化学气相沉积(CVD)方法，CVD是指把含有构成薄膜元素的气态反应剂或液态反应剂的蒸气及反应所需其他气体引入反应室，在衬底表面发生化学反应生成薄膜的过程。本发明中，利用各类硅烷引入巯基、氨基、羧基、降冰片烯、炔基等官能团，再利用与之对应的如马来酰亚胺、琥珀酸异丙酯、EDC化学、点击化学等反应，再连接如聚乙二醇、聚乙烯醇、水凝胶、聚乳酸等亲水高分子，从而实现对轮廓内的亲水修饰。
本发明中，轮廓内部的化学修饰需要根据后续的应用决定，比如修饰上特殊的化学基团用于连接核酸分子或者微球等核酸载体。
根据优选的实施方式，所述亲水修饰后的轮廓内包括固载点，可将特定的核酸引物或者将已连接核酸分子的微球固载到轮廓内。
根据优选的实施方式，轮廓内表面可以修饰水凝胶。水凝胶(Hydrogel)是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，由于固有的交联，水凝胶网络的结构完整性不会因高浓度的水而溶解。常用的有PAZAM水凝胶、BPAM水凝胶等。在水凝胶上预留出来可以反应的基团，与核酸末端的化学基团进行反应，从而将核酸片段固载到轮廓内，所述核酸片段可以是引物。可选的，在芯片轮廓内表面修饰上带溴原子的水凝胶，其上的溴原子可与5’端硫代磷酸修饰的核酸引物反应，从而将引物固定在芯片的轮廓内。
根据优选的实施方式，轮廓内表面可以预先连接上裸露的巯基，通过和氨基反应，将带氨基的基团或者微球等固体物质连接到一起。
根据优选的实施方式，芯片轮廓内表面与其外间隔区的化学修饰不发生相互串扰。
需要特别说明的是，本发明中所述的芯片的疏水修饰的接触角是指，在芯片整体修饰完毕以后，整个表面对于水的接触角。可能存在轮廓内部的亲水修饰导致芯片整体的接触角略微减小的情况，此时对芯片整体的接触角的要求不改变。
本发明所述的亲疏水修饰具有很好的区分性，一般的，芯片轮廓内部的亲水修饰，不会明显影响芯片的接触角。
根据优选的实施方式，芯片轮廓外部进行疏水修饰，疏水修饰后的表面接触角(芯片内表面进行同样的化学修饰或者未进行化学修饰)大于118°，优选大于120°。从有利于应用的目的，所述疏水修饰的接触角指的是平均接触角。
根据优选的实施方式，对于轮廓内部亲水修饰后的表面性质的测量，由于轮廓为微米或纳米尺度大小，不适合接触角测量法。因此，可以用相同的亲水物质修饰平面后，再测量相似的表面的接触角。本发明中，亲水修饰后的表面接触角小于90°。
根据优选的实施方式，在选择轮廓内表面的化学修饰基团时需要考虑有利于基因测序反应的进行，例如可以结合常见的SBS基因测序技术的方式进行。
本发明中，第一固体支撑物和第二固体支撑物可以是长方形的薄片结构。固体支撑物的长度范围可以是1-10厘米，优选3-8厘米；宽度范围可以是1-8厘米，优选1.5-4.5厘米。厚度可以是0.1-2毫米，优选0.4-1毫米，更优选0.5-0.9毫米。
根据优选的实施方式，基因测序芯片还包括胶层。该胶层是切割出流道形状的双面胶，将第一固体支撑物和第二固体支撑物粘结在一起，形成测序反应流动池，所述反应流动池包括可进行反应的腔室、用于将反应试剂递送至腔室的入口以及用于从腔室移除试剂的出口。腔室还包括至少一个透明表面，以允许光学检测。
本发明的第二方面公开了一种基因测序芯片的使用方法，所述基因测序芯片的特征在于：包括第一固体支撑物和第二固体支撑物，其中第一固体支撑物包括表面，所述表面之上包括连续的涂层；所述表面之下具有微米尺度或纳米尺度的轮廓；所述第二固体支撑物表面材料与所述涂层相同；所述基因测序芯片的使用方法包括以下步骤：
1)对所述涂层轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内不反应；
2)对微米尺度或纳米尺度的轮廓内进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
3)将核酸引物或连接有核酸分子的微球固载至轮廓内；
4)进行扩增和/或测序反应。
在本发明的第一方面具体实施部分中所讨论的特征中的每个特征同样适用于本发明的第二方面的具体实施。如上所示，部分其他特征在此处不再重复，并且应被视为以引用方式重复。本领域普通技术人员将理解在这些具体实施中识别的特征可如何容易地与在其他具体实施中识别的基本特征组组合。
根据优选的实施方式，所述第一固体支撑物为石英玻璃、蓝宝石玻璃、普通玻璃中的一种。
根据优选的实施方式，所述涂层材料选自金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种；所述涂层厚度为10nm-150nm，优选20nm-100nm。
根据优选的实施方式，所述轮廓为第一固体支撑物中的离散的微坑，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米。
根据优选的实施方式，所述微米尺度或纳米尺度的轮廓由疏水性间隙区相互分隔。
根据优选的实施方式，所述涂层材料为金，则所述疏水修饰物可来自以下物质：癸硫醇、辛硫醇等含有脂肪链的硫醇，或全氟癸硫醇、全氟辛硫醇等含有碳氟链的硫醇；所述涂层材料为氧化铝、氧化锌等金属氧化物或氮化镓等物质，则所述疏水修饰物为带有脂肪链或碳氟链的膦酸。
根据优选的实施方式，所述亲水修饰包括：先修饰带巯基、氨基、羧基、降冰片烯、炔基等官能团的硅烷，再利用与之对应的如马来酰亚胺、琥珀酸异丙酯、EDC化学、点击化学等反应，再连接如聚乙二醇、聚乙烯醇、水凝胶、聚乳酸等亲水高分子。
根据优选的实施方式，所述亲水修饰后的轮廓内包括固载点，可将特定的核酸引物或者将已连接核酸分子的微球固载到轮廓内。
可选的，在芯片轮廓内表面修饰上带溴原子的水凝胶，其上的溴原子可与5’端硫代磷酸修饰的核酸引物反应，从而将引物固定在芯片的轮廓内，固载完核酸引物后，可以继续进行核酸扩增反应。本发明中，多种不同的核酸扩增技术可以与本文所述的芯片结合使用，示例性技术包括但不限于：多重置换扩增(MDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。完成扩增后，可对轮廓内的核酸进行测序反应。
可选的，核酸扩增也可在芯片外预先完成，例如在微球等载体上扩增待测核酸分子，再将连接有扩增产物的微球等载体加载至芯片的轮廓内，与所述固载点反应进行微球固载，之后，可以继续进行测序反应。所述微球可以是水凝胶微球或磁性微球。
本发明的第三方面还提供一种基因测序芯片，其特征在于，所述芯片的流动池表面包括重复特征图案，其中第一特征图案为微米或纳米尺度的轮廓，所述轮廓包括离散的微坑，其内为亲水修饰物；第二特征图案为轮廓间隔区，其包括涂层以及涂层上的疏水修饰物；所述涂层为金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米；所述轮廓内有固载点，可以将核酸引物或连接核酸分子的微球固载至轮廓内，进行扩增和/或测序反应。
在本发明的第一方面具体实施部分中所讨论的特征中的每个特征同样适用于本发明的第三方面的具体实施。如上所示，所有其他特征在此处不再重复，并且应被视为以引用方式重复。本领域普通技术人员将理解在这些具体实施中识别的特征可如何容易地与在其他具体实施中识别的基本特征组组合。
特别的，本发明所述的流动池表面包括重复特征图案的基因测序芯片，尤其适用于荧光发生测序方法。该方法在进行测序反应时需要进行“油封”，以将反应释放的荧光分子限制在每个微反应室(微坑)内，利用油相流体将水相流体封闭在测序芯片的微反应室内，水相流体中的测序试剂与微反应室内的待测核酸发生反应。微反应室外特异性的疏水修饰保证了油封的成功率，使得数百次的“油封”、“去油封”循环得以正常进行。
本发明所涉及的测序方法具体可参见CN201510822361.9，CN201710630287.X。特殊的，上述两个专利的内容可以以引用的形式加入本专利。
实施例1
1.第一固体支撑物表面加涂层：分别用异丙醇和水冲洗表面镀铝的石英芯片，用氮气枪吹干。用98％浓硫酸浸泡该芯片，常温下放置10分钟，在铝的表面钝化一层致密的三氧化二铝薄膜。随后将芯片从浓硫酸中取出，浸泡在清水中，迅速用大量清水冲洗芯片，随后再用氮气枪吹干。表面镀铝的玻璃底板(即第二固体支撑物)用以上同样的流程进行处理。
2.刻蚀：在涂层上涂覆光刻胶，用空气PLASMA处理上述第一固体支撑物10分钟，形成微反应室(微坑)。
3.芯片封装：用切割出流道形状的双面胶，将上述表面镀铝的玻璃底板和第一固体支撑物粘结在一起，形成测序反应流动池。
4.微反应室外表面疏水修饰：将1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanephosphonic acid(PFPOA)干粉溶解在乙醇中，配制成5mM的溶液。将PFPOA溶液灌充在反应流动池内，常温下反应24小时，或者70℃加热1小时。反应结束后，用乙醇冲洗流动池，然后150℃加热2小时。加热后再依次用大量乙醇和氟油清洗流动池，完成疏水修饰。经过PFPOA的表面修饰，水溶液在微坑阵列芯片上的接触角会从处理前的90°增加到130°。
5.微反应室内表面亲水修饰：用丙烯酰胺及其衍生物(N-(5-(2-bromoacetamido)pentyl)acrylamide(BRAPA)共聚合得到低交联度的水凝胶。在10mL 0.28M的丙烯酰胺水溶液中加入700μL 0.1mg/μL的BRAPA DMF溶液，鼓氩气15分钟。鼓气脱氧后先后加入11.5μLTEMED，100μL 0.18M过硫酸钾水溶液，迅速搅拌混匀，然后灌入反应流动池内，在氩气和饱和水蒸气环境下常温聚合30分钟。聚合结束后用200mL去离子水冲洗反应流动池。
这样便可以得到微坑内部亲水修饰、微坑外疏水修饰的测序芯片。
实施例2
微坑内表面核酸分子的固载。
用5’端硫代磷酸修饰的DNA与实施例1中的水凝胶表面的溴原子发生反应，从而将DNA固定在水凝胶上。
1.配制DNA溶液：DNA带有5’端硫代磷酸修饰，用PBS缓冲液将此DNA干粉配成终浓度20uM的溶液。
2.将上述DNA溶液灌入反应流动池中，65℃加热1小时。
3.用去离子水清洗流动池。
4.向芯片中灌入10mM巯基乙醇PBS缓冲溶液，室温反应30分钟，将表面没有完全反应的溴原子全部取代下来。
5.再次用去离子水洗净芯片。
完成上述反应后便可以在微坑内部固载DNA。
虽然已经详细描述了上述几个实施例，但是应当理解，所公开的实施例可以被修改。因此，前述描述应被视为非限制性的，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种芯片表面化学修饰方法，其特征在于，包括：
提供包括表面的第一固体支撑物，所述表面之上包括连续的涂层；
穿过所述涂层形成表面之下的微米尺度或纳米尺度的轮廓；
提供表面材料与所述涂层相同的第二固体支撑物，将其与第一固体支撑物封装成芯片；
对所述涂层轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内部不反应；
对微米尺度或纳米尺度的轮廓内部进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
其中，所述第一固体支撑物包括玻璃；所述轮廓包括微坑。
2.一种基因测序芯片的使用方法，所述基因测序芯片的特征在于：包括第一固体支撑物和第二固体支撑物，其中第一固体支撑物包括表面，所述表面之上包括连续的涂层；所述表面之下具有微米尺度或纳米尺度的轮廓；所述第二固体支撑物表面材料与所述涂层相同；所述基因测序芯片的使用方法包括以下步骤：
对所述轮廓外部进行疏水修饰，所述修饰物与涂层表面反应，而与所述轮廓内不反应；
对微米尺度或纳米尺度的轮廓内进行亲水修饰，所述修饰物与轮廓内表面反应，而与所述涂层不反应；
将核酸引物或连接有核酸分子的微球固载至所述轮廓内；
进行扩增和/或测序反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一固体支撑物为石英玻璃、蓝宝石玻璃、普通玻璃中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述涂层材料选自金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述涂层厚度为10nm-150nm，优选20nm-100nm。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述轮廓为第一固体支撑物中的离散的微坑，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述涂层材料为金，则所述疏水修饰物可选自以下物质：癸硫醇、辛硫醇等含有脂肪链的硫醇，或全氟癸硫醇、全氟辛硫醇等含有碳氟链的硫醇；所述涂层材料为氧化铝、氧化锌等金属氧化物或氮化镓等物质，则所述疏水修饰物为带有脂肪链或碳氟链的膦酸。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述亲水修饰包括：先修饰带巯基、氨基、羧基、降冰片烯、炔基等官能团的硅烷，再利用与之对应的如马来酰亚胺、琥珀酸异丙酯、EDC化学、点击化学等反应，再连接如聚乙二醇、聚乙烯醇、水凝胶、聚乳酸等亲水高分子。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述亲水修饰后的轮廓内包括固载点，可将特定的核酸引物或者将已连接核酸分子的微球固载到轮廓内。
10.一种基因测序芯片，其特征在于，所述芯片的流动池表面包括重复特征图案，其中第一特征图案为微米或纳米尺度的轮廓，所述轮廓包括离散的微坑，其内为亲水修饰物；第二特征图案为轮廓间隔区，其包括涂层以及涂层上的疏水修饰物；所述涂层为金、铝、铜、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氮化镓中的一种；所述轮廓的开口直径为0.2-5微米，优选0.3-3微米；轮廓的深度为0.1-5微米，优选0.2-2微米；轮廓的周期为0.6-8微米，优选1-5微米；所述轮廓内有固载点，可以将核酸引物或连接核酸分子的微球固载至轮廓内，进行扩增和/或测序反应。
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2022
- 2022-01-28 CN CN202210104017.6A patent/CN114561455A/zh active Pending
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