JP4553568B2 - 機能性物質含有薄膜で被覆された固定化素子、及びその製造法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、該固定化素子が、溶媒を透過する0.3〜6μmの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径1〜100nmの細孔を有する多孔質固定化素子であることを特徴とする、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子を提供する。
また、本発明は、機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子、特に多孔質固定化素子を提供する。
また、本発明は、該固定化素子が、溶媒を透過する数μmの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径数nmの細孔を有する、多孔質固定化素子であることを特徴とする、機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子を提供する。
また、本発明は、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜、又が機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された多孔質固定化素子が内部に形成されているカラム、又はマイクロチップを提供する。
また、本発明は、固定化素子上に機能性物質を含む網目状構造の薄膜を被覆する方法であって:
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも1個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること;該加水分解溶液と、機能性物質を含有する溶液とを混合してゾル溶液を得ること;及び該ゾル溶液に、固定化素子を浸漬し、乾燥させることにより、該固定化素子の表面上に薄膜を形成することを含む、前記薄膜の被覆方法を提供する。
また、本発明は、前記多孔質固定化素子の製造方法であって:
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも1個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること;該加水分解溶液にゲル化の過程で相分離を引き起こす溶媒を混合すること;及び該混合液を熱重合、又は光重合により重合させることを含む、前記製造方法を提供する。
本発明で用いる機能性物質の固定化素子は、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆できるものであれば、特に限定されない。また、その形状は、使用目的に合わせ特に制限なく選択することができる。例えば、使用目的に応じた大きさを有するタブレット状粒子、又はビーズ状粒子などの定型又は非定型粒子、平坦な又は多孔質部を設けた基板上の規定領域、基板に形成された円筒形などの凹部の、平坦な又は多孔質部を設けた内壁面などを、該薄膜を被覆する固定化素子として用いることができる。また微細加工技術を利用して作製される微小空間内での利用も可能である。
該加水分解性の官能基を有する有機金属化合物の例を挙げると、下記一般式(1)で表される金属アルコキシドがある。また、少なくとも1個の金属−炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物の例を挙げると、一般式(2)〜(4)で表される金属アルコキシドがある。これらの金属アルコキシドを単独で、又は組み合わせて使用することができる。
本発明の多孔質固定化素子は、特にテトラメトキシシランの重合体、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体、又はテトラエトキシシラン、メタクリル酸3−トリメキシシリルプロピルの重合体で構成するのが好ましい。前記多孔質固定化素子は、次のように作製することができる。
該加水分解には、塩酸、硫酸、トシル酸、陽イオン交換樹脂等の酸触媒、アンモニア、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、陰イオン交換樹脂等の塩基性触媒等を用いて、水;メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類;アセトニトリル、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン等の有機溶媒;又はこれらの混合溶媒中で重合を行う。反応温度は0〜120℃、好ましくは0〜80℃とし、反応時間は1分〜200時間、好ましくは10分間〜24時間とする。
本明細書における用語「機能性物質」とは、化学的、生物化学的、又は生物学的な反応を起こす、又は触媒する物質をいい、酵素、ホルモン、抗体などの生理活性物質のみならず、広範囲の活性物質を含む。本発明の網状構造の薄膜に固定して利用できるものであれば、特に制限なく該機能性物質として用いることができる。
まず、機能性物質を含有する有機金属化合物のゾル溶液を調製する。加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも1個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解する。
また、図8に示すように、ゲルはpHが酸性側であると空隙の大きな鎖状構造に、pHが塩基性側であると分岐が多い網状構造になる。
例えば、機能性物質がタンパク質からなる生理活性物質の場合、溶液中の濃度を10−5〜1Mol/l(モル/リットル)、好ましくは10−4〜10−1Mol/lとし、該溶液のpHは2〜10、特に4〜8とするのが好ましく、かつ塩濃度を0.001〜1Mol/l、特に0.01〜0.2Mol/lとするのが好ましい。
なお、該薄膜作成時のゾル−ゲル反応をアルコキシシランの重合反応に基づき説明すると、図4に示すように、所定のアルコキシシランを加水分解し、生成したモノマーを重縮合することにより所望のゲルを形成するものであり、図5に示すように、該モノマーが重合し、網状構造が形成される過程で機能性物質が、薄膜の網状構造に固定される。
また、本発明で用いるミクロソームは、常法によりラット肝臓などから精製できる。また、P450やグルクロニルトランスフェラーゼを導入したミクロソームが市販されている(第一化学薬品)。
ウェルを有するアッセイプレートを使用する場合
アッセイプレートのウェル内に機能性物質を薄膜で被覆した多孔質固定化素子を入れ、又は固定し、該機能性物質による生化学あるいは化学反応を行う。また、該ウェルの内壁を固定化素子として、機能性物質を薄膜で被覆することもできる。
一方の端部に、長さ5cmの、ペプシン(和光純薬)を含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子を有するフューズドシリカキャピラリー(内径75μm、長さ1m、Polymicro Technologies INC.製)を用いた。
テトラメトキシシラン(TMOS)(東京化成)761μlに水169μl、0.04MのHClを11μl加え、室温で20分間攪拌を行った。該溶液20μlに25%(w/v)ペプシンを含む150mMリン酸緩衝液(pH5.5)60μlを加え混合した後、該ゾル溶液を固定化素子のみが浸漬するようにシリンジでキャピラリー内に導入した。4℃で5分間放置後、キャピラリーから該混合液を追い出し、4℃で2日以上静置することにより、固定化素子上にペプシンを包含した薄膜を作製した。
96穴アッセイプレート(Millipore製)のウェルの大きさに合うトリプシン(Sigma-Aldrich社)固定化素子を調製し、実験に用いた。
本実施例で用いたトリプシン薄膜固定化素子を次の手順で製造した。テトラメトキシシラン(TMOS)(東京化成)1mlにポリエチレングリコール0.27gを溶解した0.01M酢酸2.5mlを加え、0℃で45分間撹拌した。該溶液を40℃で1晩放置し重合反応させ、水で洗浄後、目的の形状に成型し、0.01Mアンモニア水で120℃、3時間処理後、再び水で洗浄し、40℃で3日間乾燥させた。該重合体を600℃で2.5時間加熱し、多孔質固定化素子を作製した。
テトラメトキシシラン(TMOS)(東京化成)761μlに水169μl、0.04MのHClを11μl加え、室温で20分間攪拌を行った。該溶液20μlに5%(w/v)トリプシンを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)120μlを加え混合した後、該ゾル溶液に多孔質固定化素子を5分間浸漬し、多孔質固定化素子を取り出し、4℃で2〜3日間静置することにより、多孔質固定化素子表面にトリプシン包含薄膜を形成した。
まず、実施例2と同じ手順で固定化素子を製造した。次いで、テトラメトキシシラン(TMOS)(東京化成)761μlに水169μl、及び0.04MのHClを11μl加え、室温で20分間攪拌を行った。該溶液20μlにP450を含むミクロソーム(第一化学薬品)溶液(タンパク質濃度2.75mg/ml)100μlを加え攪拌した混合液に、多孔質固定化素子を浸し、直ちに取り出し、4℃で2日以上乾燥させることで多孔質固定化素子表面にP450含有薄膜を作製した。
一方、ミクロソームのコーティングには、アルコキシシランの加水分解及び重合に伴い、その架橋構造内に緩和な条件でミクロソームを包含し、固定化する手段を用いた。
ハイスループットスクリーニングシステムに適応させるため、反応は96穴マイクロプレートを用い、ウェルに入る大きさになるよう多孔質固定化素子を作製した。96穴マイクロプレートのウェルにP450を含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子と蛍光性基質エトキシレゾルフィン溶液を入れ、37℃で反応させた。該反応は下記化学式(5)に示すように起きる。
これまでP450は容易に不活性化するので固定化して利用できず、また、P450が代謝活性の測定を妨げるため、代謝物をP450から分離しなければならなかった。これに対し、本発明でP450を含む薄膜で被覆した多孔質固定化素子を作成、使用することにより、P450を繰り返し利用できるようになり、測定すべき代謝物をP450から分離する必要がなくなり、少量の試料、及び試薬で解析が可能になった。すなわち、本発明によりP450を用いた解析が経済的かつ短時間で行えるようになった。
まずテトラメトキシシラン(TMOS)(東京化成)761μlに0.04MのHClを11μlと水169μlを加え、室温で20分間攪拌した。該溶液20μlにP450を含むミクロソーム溶液(タンパク質濃度2.75mg/ml)100μlを加えて混合した後、予めポリ酢酸ビニルで表面を親水性処理した96穴マイクロプレートの各ウェルに10μlずつ分注し、4℃で2日間以上放置することでゲル化を進行させ、P450を含む薄膜をウェル内壁に固定した。
Claims (28)
- 溶媒を透過する0.1〜10μmの貫通孔を有する多孔質構造を有し、該多孔質構造表面に直径1〜100nmの細孔、及び機能性物質を包含した網目状構造を有する、多孔質固定化素子であって、
下記式(1)、又は(2)の金属アルコキシドの重合体、又は共重合体から構成されている前記多孔質固定化素子:
式(1)
式(2)
(式中、Mはケイ素であり、かつR1〜R4は、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、アルキルメタクリル基、アリルメタクリル基、アルキルスルホニル基、アリルスルホニル基、アリルアミノ基、又はアルキルアミノ基を表す。)。 - 前記金属アルコキシドの重合体又は共重合体が、テトラメトキシシランの重合体、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体、テトラエトキシシラン、又はメタクリル酸3−トリメキシシリルプロピルの重合体である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記金属アルコキシドの重合体又は共重合体が、テトラメトキシシランの重合体、又はテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記貫通孔が、溶媒を透過する0.3〜6μmの貫通孔である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、タンパク質、核酸、脂質、糖、及び金属触媒からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、P450、グルクロニルトランスフェラーゼ、トリプシン、ペプシン、DNA、RNA、ペプチド核酸、脂質、糖、及び金属触媒からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 該機能性物質が、P450、又はグルクロニルトランスフェラーゼである、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、フラーレン、カーボンナノチューブ、ポリロタキサン、及びカテナンからなる群から選ばれる特異的な形状の化合物である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が代謝酵素である、請求項1記載の多孔質固定化素子。
- 溶媒を透過する0.1〜10μmの貫通孔を有する多孔質構造を有し、該多孔質構造表面に直径1〜100nmの細孔、及び機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造を有する、多孔質固定化素子であって、
下記式(1)、又は(2)の金属アルコキシドの重合体、又は共重合体から構成されている前記多孔質固定化素子:
式(1)
式(2)
(式中、Mはケイ素であり、かつR1〜R4は、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、アルキルメタクリル基、アリルメタクリル基、アルキルスルホニル基、アリルスルホニル基、アリルアミノ基、又はアルキルアミノ基を表す。)。 - 前記金属アルコキシドの重合体又は共重合体が、テトラメトキシシランの重合体、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体、テトラエトキシシラン、又はメタクリル酸3−トリメキシシリルプロピルの重合体である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記金属アルコキシドの重合体又は共重合体が、テトラメトキシシランの重合体、又はテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記貫通孔が、溶媒を透過する0.3〜6μmの貫通孔である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、タンパク質、核酸、脂質、糖、及び金属触媒からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、P450、グルクロニルトランスフェラーゼ、トリプシン、ペプシン、DNA、RNA、ペプチド核酸、脂質、糖、及び金属触媒からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、P450、又はグルクロニルトランスフェラーゼである、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が、フラーレン、カーボンナノチューブ、ポリロタキサン、及びカテナンからなる群から選ばれる特異的な形状の化合物である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 前記機能性物質が代謝酵素である、請求項10記載の多孔質固定化素子。
- 請求項1〜18のいずれか一項記載の多孔質固定化素子が内部に形成されているキャピラリー、カラム管、又はマイクロチップ。
- 溶媒を透過する0.1〜10μmの貫通孔を有する多孔質構造を有する固定化素子の該多孔質構造表面に、直径1〜100nmの細孔、及び、機能性物質を含む網目状構造を有する薄膜を被覆する方法であって:
下記式(1)、又は(2)の金属アルコキシド、又はこれらの混合物を加水分解すること:
式(1)
式(2)
(式中、Mはケイ素であり、かつR1〜R4は、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、アルキルメタクリル基、アリルメタクリル基、アルキルスルホニル基、アリルスルホニル基、アリルアミノ基、又はアルキルアミノ基を表す。)。;
該加水分解溶液と、機能性物質を含有する溶液とを混合してゾル溶液を得ること;及び該ゾル溶液に、該固定化素子を浸漬し、乾燥させることにより、該固定化素子の多孔質構造表面上に薄膜を形成することを含む、前記薄膜の被覆方法。 - 前記金属アルコキシドが、テトラメトキシシラン、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの混合物、テトラエトキシシラン、又はメタクリル酸3−トリメキシシリルプロピルである、請求項20記載の薄膜の被覆方法。
- 前記金属アルコキシドが、テトラメトキシシラン、又はテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの混合物である、請求項20記載の薄膜の被覆方法。
- 前記乾燥温度が0℃〜120℃である、請求項20記載の薄膜の被覆方法。
- 前記固定化素子の溶媒を透過する0.1〜10μmの貫通孔を有する多孔質構造を、
下記式(1)、又は(2)の金属アルコキシド、又はこれらの混合物を加水分解すること:
式(1)
式(2)
(式中、Mはケイ素であり、かつR1〜R4は、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、アルキルメタクリル基、アリルメタクリル基、アルキルスルホニル基、アリルスルホニル基、アリルアミノ基、又はアルキルアミノ基を表す。);
該加水分解溶液にゲル化の過程で相分離を引き起こす溶媒を混合すること;及び該混合液を熱重合、又は光重合により重合させることを含む工程で形成する、請求項20記載の薄膜の被覆方法。 - 前記多孔質構造を形成する工程の金属アルコキシドが、テトラメトキシシラン、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの混合物、テトラエトキシシラン、又はメタクリル酸3−トリメキシシリルプロピルである請求項24記載の薄膜の被覆方法。
- 前記多孔質構造を形成する工程の金属アルコキシドが、テトラメトキシシラン、又はテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの混合物である、請求項24記載の薄膜の被覆方法。
- 前記多孔質構造を形成する工程の加水分解の反応温度が0〜80℃であり、かつ反応時間が10分間〜24時間である、請求項24記載の薄膜の被覆方法。
- 前記多孔質構造を形成する工程の加水分解溶液に加える相分離を引き起こす溶媒が、トルエン、クロロホルム、又はポリエチレングリコール溶液からなる群から選ばれた少なくとも一種の溶媒である、請求項24記載の薄膜の被覆方法。
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