CN109738469A - 一种fop表面微坑镀膜的致密性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种FOP表面微坑镀膜的致密性检测方法；将镀膜的FOP放入酸性刻蚀液中刻蚀；检测刻蚀穿孔。这种镀膜的检测方法可以筛选合适的应用于基因测序的FOP基片，消除本身元素的影响。本发明利用酸性刻蚀液，满足一定的条件的情况下，检测镀膜的致密性。

Description

一种FOP表面微坑镀膜的致密性检测方法

技术领域

本发明涉及一种基因测序所用的FOP微坑片的镀膜检测的方法，属于基因测序领域。

背景技术

高通量测序仪是近几年高速发展的技术。高通量测序，相较于传统桑格测序，最大的优势是可以同时读出海量的序列信息。虽然准确度不如传统测序方法，但由于海量数据分析，便可得出超出序列本身的信息，如基因表达量、拷贝数变异。当今主流测序仪均使用SBS(sequencing by synthesis边合成边测序)方法，如solexa/illumina、454、iontorrent等。这些测序仪的结构相似，都包括流体系统，光学系统，和芯片系统。测序反应在芯片内发生。测序过程也很相似，都包括：将反应液通入芯片，发生SBS反应，采集信号，冲洗，进行下一轮。FOP(fiber optical plates)光学纤维面板或者光纤面板是测序基础原材料之一。FOP经过刻蚀工艺可以获得表面带微坑的片子。但是，FOP的材料中含有很多镧系，锕系元素等，导致很多测序中使用的酶失活，不能用于测序反应。本发明提供一种镀膜遮蔽FOP的微坑的表面的检测方法以及FOP镀膜。利用酸性刻蚀液和电镜的组合，检测FOP表面镀膜的致密性。

发明内容

一种FOP表面微坑镀膜的致密性检测方法，包括，利用酸性刻蚀液刻蚀FOP表面，形成微坑结构；微坑结构所在表面镀二氧化硅薄膜；将镀膜的FOP放入酸性刻蚀液中刻蚀；检测刻蚀穿孔。

根据优选的实施方式，所述FOP微坑的开口直径或者边长为1-6微米，优选1.5-5微米，更优选1.8-3.8微米，更优选2.3-3.2微米。

根据优选的实施方式，所述FOP微坑的深度为1-5微米，优选1.5-4微米。

根据优选的实施方式，所述FOP微坑的酸性刻蚀液中刻蚀时间为0.5-5h；优选0.6-4小时，更优选0.8-3小时，更优选1-2小时。

根据优选的实施方式，所述所述酸性刻蚀液包括盐酸、硝酸中的至少一种；所述酸性刻蚀液的浓度范围为0.5≤M≤3mol/L。

根据优选的实施方式，所述酸性刻蚀液的浓度为Mmol/L，镀膜的厚度为N微米，刻蚀时间为H小时，满足经验公式MH≥5N。

根据优选的实施方式，所述FOP对于488nm光的透过率大于70％。

根据优选的实施方式，所述FOP对于绿光的透过率大于70％。

根据优选的实施方式，所述FOP的周期为2-7微米，优选2.3-6微米，更优选2.5-5微米，更优选3-4微米。

根据优选的实施方式，所述镀膜厚度为N，微坑的直径或者边长为P，满足公式3P≥6N≥P。

根据优选的实施方式，所述镀膜厚度为N，微坑的深度为Q，满足公式Q≤6N。

根据优选的实施方式，所述镀膜的FOP放入酸性刻蚀液中刻蚀的时候，可以用硫酸、盐酸、硝酸中的至少一种作为刻蚀液。

一种基因测序芯片，包括以FOP为基底的反应区；所述FOP基底的表面有微坑；微坑所在的FOP的表面有二氧化硅薄膜层，厚度为0.3-3微米；所述二氧化硅薄膜层能够阻挡酸性刻蚀液的刻蚀；酸性刻蚀液的浓度为Mmol/L，镀膜的厚度为N微米，刻蚀时间为H小时，满足公式MH≥5N；所述酸性刻蚀液包括盐酸、硝酸中的至少一种；所述酸性刻蚀液的浓度范围为0.5≤M≤3mol/L。

一种基因测序方法，包括，提供以FOP为基底的基因测序芯片；提供第一测序试剂；提供第一密封油液；在芯片的一侧设置光源，另一侧设置物镜；其中，所述所述的以FOP的一个表面有预先刻蚀好的微坑，并且其表面有二氧化硅薄膜层；所述二氧化硅薄膜层能够阻挡酸性刻蚀液的刻蚀；物镜聚焦于FOP的另一个表面；摄像系统通过物镜获得测序反应信息。

根据优选的实施方式，FOP的另一个表面是光滑的平面。FOP是方形扁平的透明基片，在其一个表面刻蚀微坑，用做测序反应的反应室；另一个表面是光滑的平面，用物镜可以采集该表面的图像信息。

根据优选的实施方式镀膜厚度为N，微坑的直径或者边长为P，满足公式3P≥6N≥P。

一般的，酸性刻蚀液指的是常规的可以刻蚀FOP材料的酸液。

一般的酸性刻蚀液指的是盐酸、硝酸，或者其组合。

一般的，酸性刻蚀液指的是，盐酸、硝酸或者组合，然后加入双氧水。

一般的，微坑的深度同微坑直径的比例为1:(0.5-2)，优选的微坑的深度和直径的比例为1:1。

本发明提供一种特殊的FOP微坑表面镀膜及其检测方法，具备以下优点：镀膜致密，可以阻止FOP材料与其接触的生物化学样品的直接接触。

本发明中所涉及的词均为本领域的通用说法，为了进一步的表述清楚，下面对于本发明涉及的用词做进一步的解释。

附图说明

图1.镀膜刻蚀质检未发现穿孔FOP电镜图

图2.镀膜刻蚀之间发现穿孔FOP电镜图

具体实施方式

为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。

FOP也称为光学纤维面板或者光纤面板。属于一种常见的光学中间部件。光学纤维面板具有传光效率高，级间耦合损失小，传像清晰、真实，在光学上具有零厚度等特点。最典型的应用是作为微光像增强器的光学输入、输出窗口，对提高成像器件的品质起着重要作用。广泛的应用于各种阴极射线管、摄像管、CCD耦合及其他需要传送图像的仪器和设备中。光纤面板的每一个光纤可以称为一个单丝。单丝是有皮层和芯层组成的。单丝一般是圆形的，尺寸可以从1微米到几百微米，甚至更大。

本发明利用了FOP皮层芯层材料的不同，对于芯层材料进行刻蚀的方法制备表面的微坑。FOP的皮层材料主要是氧化硅等，芯层材料含有很多镧系，锕系元素等。FOP的皮层材料不易被常规的酸刻蚀，比如盐酸、硫酸、硝酸等。FOP的芯层材料可以在常温常压的条件下，被常见的酸刻蚀。利用这种性质，可以达到只刻蚀芯层材料的目的，从而制备表面的微坑。

本发明中，刻蚀FOP芯层材料所用的酸主要是盐酸、硫酸、硝酸，或者他们的组合；或者盐酸、硫酸、硝酸，或者其组合，然后跟双氧水的组合。本发明中，所涉及的酸不包括可以刻蚀常规玻璃材料的酸，比如氢氟酸。

本发明中，所用常规酸的浓度选自0.3-2M，优选0.5-1.5M，更优选0.7-1M。刻蚀形成5微米深度的微坑的时间为0.8-3h，优选1-2h，更优选1.2-1.8h。、

FOP的每个单丝的直径可以称为一个周期。每个单丝的芯层材料的直径称为芯层直径。两个单丝之间皮层的厚度称为皮层厚度。一个单丝实际是由中心的芯层和外面的皮层组成的。皮层类似环套的形式包围在芯层的周围。因此，皮层材料的厚度应该为环形皮层材料厚度的两倍。但是实际的测量的时候，单丝与单丝属于相同的结构，只需要测量两个相邻单丝之间皮层材料的厚度，就可以得到实际的皮层厚度。

本发明中，所述FOP的周期为2-10微米，优选2.3-6微米，更优选2.5-5微米，更优选3-4微米。

一般的，FOP芯层材料的刻蚀深度于刻蚀时间是成正比的。双倍的刻蚀时间，可以获得双倍深度的刻蚀结果。

一般的，FOP是单丝密集组合形成的整体。FOP的表面是光纤的头部，有裸露的皮层和芯层。一般的，组成FOP的单丝是严格平行并且沿直线方向延伸的。

一般的，从单丝组成FOP需要用加热的方式将单丝熔融在一起。在这个过程中，不可避免的导致单丝的形变。一般的，这种形变不严重，不影响整体的使用或观察。

一般的，用电镜可以表征FOP的各个参数。将需要测量的光纤面板沿着光纤长轴的方向裂片。裂开的片子可以用电镜获得FOP刻蚀出来微坑的深度信息，或者镀膜的厚度信息，或者镀膜以后被遮掩的芯层的刻蚀信息。

一般的，FOP表面进行镀膜的时候，氧化硅薄膜是首选。镀氧化硅薄膜的方式有很多，但是大部分都不能满足需求。一般的PECVD常规镀膜的方法不能满足抗酸刻蚀的需求。一般的，使用部分IBD设备，控制镀膜条件趋向致密的情况下，可以控制镀膜抵抗常规酸液的一定时间刻蚀。

一般的，当芯层直径3微米，刻蚀深度3微米的时候；微坑的形状接近圆柱体。镀膜的时候，可以通过控制IBD的镀膜条件，比如加热、高功率，可以获得更致密的镀膜。一般的,该镀膜条件适合于微坑比较密集,并且深宽比约为1:1的情况。简单的说，当微坑的深度相对较深的时候，镀膜会导致微坑的侧壁薄膜层的厚度降低，直接导致镀膜抗酸刻蚀能力的降低。一般的镀膜厚度为N，微坑的深度为Q，满足公式Q≤6N。

一般的，常规镀膜，例如PECVD，例如热蒸发，例如磁控溅射都不能满足酸刻蚀的需求。经过试验论证，镀膜的致密性不仅同镀膜的方式有关，还同表面处理，以及表面水分子的控制有关。氧等离子体处理是一种比较有效的处理方法，不仅能够清除表面的可能存在的有机物等，还可以增加表面的富氧程度。水分子的处理也需要严格的控制，需要严格的烘干才能够使得镀膜更加致密。

一般的化学反应镀膜并不能满足本申请的要求。

一般的，利用IBD，或者离子辅助镀膜，并且达到一定的温度、压力、功率等条件，可以得到致密的镀膜。可以满足特殊刻蚀的要求。

一般的，一般的，镀膜以后，适当的刻蚀时间内，FOP被刻蚀的微坑比例在0.1％以上，认为镀膜失败。

经验性的，不同的FOP周期孔径，需要选择不同的厚度。

本发明中，公开了一种用于特殊领域的FOP镀膜及其质检方法，例如基因测序。这种镀膜的片子，可以提高FOP测序中所用到酶的利用率。经过研究发现，只有满足刻蚀条件的镀膜才能够有这种作用。

一般的，FOP表面微坑镀膜以后，上表面的镀膜厚度：侧壁的镀膜厚度：底部的镀膜厚度比例为＝10：(1-3.5)：(1.5-4)。根据优选的实施方式，镀膜以后，上表面的镀膜厚度：侧壁的镀膜厚度：底部的镀膜厚度＝10：(1-3)：(2-3.5).

一般的，侧壁的镀膜厚度与底部的镀膜厚度可以影响阻挡酸性刻蚀液的效率或者时间。侧壁的镀膜厚度加厚，底部的镀膜厚度加厚可以获得更长的阻挡刻蚀的效率或者时间。但是条件的改变可能导致总体镀膜厚度的增加。

一般的，表面镀氧化硅薄膜的厚度根据需要选择，并且考虑微坑的结构和深度。一般的，当微坑的深度为5微米，FOP的内径为5微米的时候，镀膜可以为2微米左右。一般的，当微坑的深度为2微米，FOP的内径为2微米的时候，镀膜的厚度可以为0.5微米左右。

一般的，经实验发现，FOP刻蚀以后表面的水分子含量会影响到镀膜的质量。刻蚀完的片子，如果不经过加热或者其它方法除水，直接镀膜会导致镀膜致密度不够，从而导致穿孔现象。经实验发现，FOP表面水分子物质的量含量达到0.1％，则可能导致镀膜失败。更高的水分子含量会导致镀膜失败。因此，需要控制镀膜之前，FOP的表面水分子含量低于0.1％。

一般的，将刻蚀以后的FOP放在热板上，120度以上，加热2h或更长时间，则可以有效去除水分子。

一般的，当FOP刻蚀的微孔内部质量粗糙的时候，比如用硫酸刻蚀液刻蚀，会导致镀膜质量降低，部分区域出现穿孔。

一般的当酸性刻蚀液的浓度比较高，刻蚀速度比较快的时候，刻蚀速度≥4微米/小时，会导致后续镀膜质量降低，部分区域出现穿孔。

一般的，不考虑镀十分厚的薄膜。厚的薄膜可能会因为两种材料伸缩系数不一致从而导致薄膜的局部脱落，或者局部质量缺陷。考虑到整个表面的镀膜质量，一般控制镀膜厚度为N，微坑的直径或者边长为P，满足公式3P≥6N≥P；其中，FOP微坑的开口直径或者边长为1-6微米，优选1.5-5微米，更优选1.8-3.8微米，更优选2.3-3.2微米。

特殊的，本申请中所述数据均为大量实验总结的结论，公式均为实验数据总结的结果。特别的，镀膜质量并不是需要广泛考虑的事情，只有利用FOP形成微坑进行测序或者类似领域，才会有这种特殊需求。

FOP并不是一种常见的材料。在其表面蚀刻微坑并且用于生物化学检测，或者说基因检测并不是常见的方法。一直以来，FOP更经常的被用于夜视仪等领域，不是经常见的，有个别应用于生物化学或者基因测序的领域，但是也仅仅作为基板使用。FOP材料的对于基因测序反应的影响并不是一个被研究过的领域。申请人多次的实验发现，FOP被刻蚀形成微坑结构以后，在微坑中的测序会失败。这种由于原料本身元素导致的十分微弱的影响是不被经常研究的。申请人并未发现除测序外的其它应用也存在了这种问题。

特殊的,常规的测序反应中,一般用石英作为基底或者用未刻蚀的FOP作为基底,并不存在镀膜致密性的问题。本发明要求保护的致密的FOP镀膜适合用于专利CN201710630287X，专利CN2017211569462，专利CN201510822361.9，专利CN201510815685.X中所涉及的基因测序中；以上专利内容可以用引用的方式加入本专利。一般性的测序中，比如illumina或者常规的2+2测序，并不会涉及到微坑镀膜致密性的要求。这主要跟反应的环境有关。本文所引用的专利中所涉及到的主要是油封式的基因测序方法，其反应体积小，每个微坑是一个反应室；对于反应室内的酶和反应液的活性要求比较高。敞开体系的测序反应则不存在这个问题。敞开体系中存在足够量的酶或者反应物。

实施例1

取FOP片子，首先利用有机溶剂丙酮，超声15min，清除表面的有机物。然后放入盐酸，双氧水的混合溶液中进行刻蚀。取37％的盐酸10ml，取30％的双氧水1ml，加入89ml水，混合制备成刻蚀溶液。将清洗的FOP浸入刻蚀溶液中刻蚀1小时左右。具体时间根据刻蚀的速度来控制。FOP芯层直径为2微米，皮层厚度为1微米。刻蚀深度为2微米。刻蚀完毕，取出，利用超纯水清洗干净，然后在130度热板上加热2h，然后放入plasma(hurrican)高档处理10min。处理完的片子密封保存。

将刻蚀处理完毕的片子用IBD镀膜(VEECO)，厚度为800nm，镀膜时加热到120摄氏度左右。镀膜完的片子放入刻蚀液中刻蚀1h，没有发现穿孔现象。如图1所示，微坑的上表面附着有一层镀膜。经过刻蚀液的刻蚀，未发现穿孔现象。通过简单的统计，符合质量要求的微坑的比例达到99.9％以上。

本实施例中,用到了剖面的成像手段。一般的，微小尺度的剖面电镜图片不是很容易拿到好的结果。常规的做法是将表面微结构的片子夹装，固定以后，目标点附近精确磨抛获得目标点附近的剖面。FOP是一种类似玻璃的硬质材料。在具体实验的过程中，采用了两种方式获得剖面。一种方法是随机剖面获得方式。将FOP的非结构面朝上，放在硬质台面上，用硬物，比如榔头敲击，获得碎裂的结构，即可得到具有剖面结构的小片，通过挑选获得结构完整的剖面。另一种方法是目标结构附近裂片。将FOP的非结构面朝上，用玻璃刀切割获得切痕，然后采用类似玻璃的方法将切痕两边的片子分开，获得目标附近剖面，通过电镜挑选，获得比较好的剖面图。两边的片子分开的时候，需要注意的是，不能损坏表面的微结构。

实施例2

根据实施例1所述的方法。利用pecvd方法镀膜，镀膜温度控制在120度左右。镀膜以后刻蚀液刻蚀1h，发现穿孔严重。具体穿孔的例子见图2。本实施例中，所用的裂片质检的方法同实施例1相同。采用了目标附近的玻璃刀辅助裂片。可以看到的是，部分镀膜不会出现问题，但是在部分区域，比如中间区域的一个微坑中，底部形成可空腔的结构。这是由于镀膜不够致密，导致了酸刻蚀液刻蚀了下面的芯层。这种刻蚀可能不会出现在所有的微坑中，通过简单的统计，大约有5-10％的微坑出现了被刻蚀的现象。

实施例3

根据实施例1所述的方法。FOP刻蚀以后，不进行加热除水，并且不用plasma处理。相同的镀膜条件以后，发现偶尔穿孔。并且，镀膜有显微镜可发现的差异。这种差异可能是镀膜在表面的附着性不够造成的。

实施例4

根据实施例1所述的方法。FOP刻蚀液更改为相同浓度的硫酸，双氧水浓度不变。通过控制刻蚀时间，使得其刻蚀深度与实施例1相同。刻蚀时间约1小时30分钟。刻蚀完毕，使用相同的条件镀膜。检测发现，偶尔有穿孔。并且微坑底部的镀膜有起伏。这种差异猜测是酸性刻蚀液的刻蚀条件导致的。

实施例5

根据实施例1所述的方法，更换硝酸作为刻蚀液。刻蚀以后，没有发现穿孔。

实施例6

根据实施例1所述的方法。使用国产IBD(北京金盛微纳)。不加热镀膜，发现镀膜质量不够好，偶尔穿孔。

实施例7

根据实施例1所述的方法。改变FOP。选择20微米周期，微坑直径为16微米，微坑深度16微米。镀膜厚度为800nm的时候，经检测，穿孔率极高，约为80％以上。镀膜厚度为3微米，经检测，穿孔率约为15％。如果再增加镀膜的厚度，则会出现镀膜堆积过高而出现的镀膜强度下降，局部脱落，或者其它缺陷。因此，特别厚的镀膜并不是有益的事情。

实施例8

根据实施例1所述的方法。改变镀膜厚度。发现，镀膜厚度为500纳米以下，穿孔率超过1％。镀膜厚度1微米以上的时候，由于微坑尺度较小，部分区域堵塞微坑。

本发明具体实施方式中的具体实施例，仅仅是对于本发明的进一步说明，并不够构成成本发明的限制因素。

Claims (9)

1.一种FOP表面微坑镀膜的致密性检测方法，包括，利用酸性刻蚀液刻蚀FOP表面，形成微坑结构；微坑结构所在表面镀二氧化硅薄膜；将镀膜的FOP放入酸性刻蚀液中刻蚀；

检测刻蚀穿孔。

2.根据权利要求1所述的方法，所述FOP微坑的开口直径或者边长为1-6微米，优选1.5-5微米，更优选1.8-3.8微米，更优选2.3-3.2微米。

3.根据权利要求1所述的方法，所述FOP微坑的酸性刻蚀液中刻蚀时间为0.5-5h；优选0.6-4小时，更优选0.8-3小时，更优选1-2小时。

4.根据权利要求1所述的方法，所述所述酸性刻蚀液包括盐酸、硝酸中的至少一种；所述酸性刻蚀液的浓度范围为0.5≤M≤3mol/L。

5.一种基因测序芯片，包括以FOP为基底的反应区；所述FOP基底的表面有微坑；微坑所在的FOP的表面有二氧化硅薄膜层，厚度为0.3-3微米；所述二氧化硅薄膜层能够阻挡酸性刻蚀液的刻蚀；酸性刻蚀液的浓度为Mmol/L，二氧化硅薄膜层的厚度为N微米，刻蚀时间为H小时，满足公式MH≥5N；所述酸性刻蚀液包括盐酸、硝酸中的至少一种；所述酸性刻蚀液的浓度范围为0.5≤M≤3mol/L。

6.根据权利要求5所述的芯片，其特征在于，所述二氧化硅薄膜层厚度为N微米，微坑的直径或者边长为P微米，满足公式3P≥6N≥P。

7.根据权利要求5所述的芯片，其特征在于，所述镀膜厚度为N微米，微坑的深度为Q微米，满足公式Q≤6N。

8.一种基因测序方法，包括，提供以FOP为基底的基因测序芯片；提供第一测序试剂；提供第一密封油液；在芯片的一侧设置光源，另一侧设置物镜；其中，所述所述的以FOP的一个表面有预先刻蚀好的微坑，并且其表面有二氧化硅薄膜层；所述二氧化硅薄膜层能够阻挡酸性刻蚀液的刻蚀；物镜聚焦于FOP的另一个表面；摄像系统通过物镜获得测序反应信息。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，酸性刻蚀液的浓度为Mmol/L，二氧化硅薄膜层的厚度为N微米，刻蚀时间为H小时，微坑的直径或者边长为P微米，微坑的深度为Q微米，满足公式3P≥6N≥P，以及公式Q≤6N，以及公式MH≥5N。