WO2022075313A1 - 標的物質の検出方法、流体デバイス及びキット - Google Patents

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WO2022075313A1
WO2022075313A1 PCT/JP2021/036802 JP2021036802W WO2022075313A1 WO 2022075313 A1 WO2022075313 A1 WO 2022075313A1 JP 2021036802 W JP2021036802 W JP 2021036802W WO 2022075313 A1 WO2022075313 A1 WO 2022075313A1
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well
target substance
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array
substance
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力也 渡邉
麻美 牧野
肇 篠田
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
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    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target substance, a fluid device and a kit.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-169092 filed in Japan on October 6, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • ABSx Activity-Based Diagnostics
  • Diseases to be diagnosed by ABDx include infectious diseases such as virus infection, non-communicable diseases such as cancer, and the like.
  • virus infection can be detected by detecting a nucleic acid derived from a virus as a marker.
  • cancer can be detected by detecting the activity of an enzyme such as cathepsin that has become uncontrollable in cancer tissue as a marker of disease.
  • cfDNA cell-free DNA
  • ctDNA blood tumor DNA
  • exosomes secrete membrane vesicles
  • biological samples such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, and malignant ascites, and in the supernatant of cultured cells.
  • Exosomes contain various proteins, lipids, microRNAs, DNAs, etc. derived from the cells that secrete them.
  • microRNA DNA
  • DNA DNA
  • membrane vesicles such as cfDNA and exosomes
  • Patent Document 1 describes that enzyme activity is detected at the single molecule level using a microchamber having a size on the order of femtolitre.
  • an object of the present invention is to provide a technique capable of detecting a target substance with high sensitivity.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting a target substance in a sample wherein the sample and a reagent that produces a fluorescent substance when the target substance is present are introduced into each well of the well array, and the well.
  • the step of producing the fluorescent substance when the target substance is present in the contents while being dehydrated and the volume is reduced, and the fluorescence generated by irradiating the fluorescent substance with excitation light is generated in the well array.
  • a method comprising a step of detecting for each well, wherein the detection of fluorescence in the well indicates the presence of the target substance in the well.
  • Each well of the well array has a first well and a second well which is arranged at the bottom of the first well and has a smaller volume than the first well. The method according to [1], wherein when the volume of the contents of the first well becomes smaller, the contents are accumulated in the second well.
  • the ratio of the volume of the first well to the volume of the second well is 10: 1 to 1,000,000: 1. 2] The method described in.
  • [4] The method according to [2] or [3], wherein the volume of the first well is 1 to 1,000 pL and the volume of the second well is 0.1 to 1,000 fL.
  • [5] The method according to any one of [2] to [4], wherein 0 or 1 of the target substance is introduced into each of the first wells.
  • FIG. 1 A and (b) are schematic diagrams illustrating an example of a method for detecting a target substance.
  • A is a schematic diagram illustrating an example of a well array having a first well and a second well.
  • (B) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of (a).
  • A) is a schematic diagram illustrating an example of a well array having a first well and a second well.
  • (B) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of (a).
  • (A)-(f) are schematic cross-sectional views explaining each process of manufacturing a well array.
  • A) and (b) are schematic cross-sectional views explaining each process of manufacturing a well array.
  • (A) is a top view showing an example of a fluid device.
  • (B) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of (a).
  • (A) to (d) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out a method for detecting a target substance using a fluid device. It is a micrograph of a well array.
  • (A) to (d) are photographs showing the results of Experimental Example 1.
  • (A) and (b) are graphs showing the results of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of Experimental Example 2. It is a graph which shows the result of Experimental Example 3.
  • the present invention is a method for detecting a target substance in a sample, in which the sample and a reagent that produces a fluorescent substance when the target substance is present are introduced into each well of the well array.
  • the contents of the well are dehydrated to reduce the volume, and the fluorescent substance is generated when the target substance is present in the contents, and the fluorescent substance is irradiated with excitation light to generate the fluorescent substance.
  • a step of detecting fluorescence for each well of the well array is provided, and the detection of fluorescence in the wells provides a method for indicating the presence of the target substance in the wells.
  • the target substance can be detected with high sensitivity.
  • sample The sample is not particularly limited, and examples thereof include biological samples such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, malignant ascites, pharyngeal swab, and nasal swab, and supernatants of cultured cells.
  • the target substance is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme, a single-stranded nucleic acid fragment, a double-stranded nucleic acid fragment, and the like.
  • the nucleic acid fragment may be a nucleic acid derived from a virus, cfDNA, ctDNA, miRNA, or the like.
  • the enzyme any enzyme can be targeted, and examples thereof include a main protease of coronavirus, alkaline phosphatase, and a protease derived from a living body. Examples of the protease derived from a living body include serine protease, cysteine protease, cathepsin and the like.
  • reagent that produces a fluorescent substance in the presence of a target substance examples include a fluorescent substrate corresponding to the target enzyme when the target substance is an enzyme.
  • a fluorescent substrate is one in which a fluorescent substance is produced by an enzymatic reaction.
  • a peptide substrate labeled with a fluorescent substance and a quenching substance can be mentioned. Fluorescence is detected when such peptide substrates are cleaved by peptidases.
  • the enzyme is phosphatase, a fluorescent substance or the like that is quenched by adding a phosphate group can be mentioned. Fluorescence is detected when the phosphate group is removed from such a substance.
  • Cas12 and Cas13 form a tripartite complex with gRNA and target nucleic acid, and when the target nucleic acid is cleaved, the surrounding DNA or RNA is cleaved. It has been clarified that it expresses the activity of
  • a fluorescent substance can be produced by using a single-stranded nucleic acid fragment or a double-stranded nucleic acid fragment as a target substance (target nucleic acid).
  • a target substance target nucleic acid
  • a double-stranded DNA fragment can be detected as a target substance.
  • a single-stranded RNA fragment or a single-stranded DNA fragment can be detected as a target substance.
  • FIGS. 1 (a) and 1 (b) are schematic views illustrating this reaction.
  • the case where the CRISPR / Cas family protein is the Cas12a protein will be described as an example.
  • Cas12a protein 110 and gRNA 120 are brought into contact with each other, they bind to each other to form a two-way complex 130.
  • the gRNA 120 partially has a base sequence complementary to the target nucleic acid fragment 140 (target substance).
  • the Cas12a protein 110 does not express nuclease activity, so the substrate nucleic acid fragment 150 is not cleaved.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 is a single-stranded DNA fragment labeled with the fluorescent substance F and the quenching substance Q. No fluorescence is generated even when the substrate nucleic acid fragment 150 is irradiated with excitation light.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing a tripartite complex 100'in which the target site of the target nucleic acid fragment 140 has been cleaved.
  • FIG. 1 (b) the tripartite complex 100'expresses nuclease activity.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 existing around the tripartite complex 100' is cleaved.
  • the fluorescent substance F of the substrate nucleic acid fragment 150 is separated from the quenching substance Q. Fluorescence can be detected by irradiating the fluorescent substance F away from the quenching substance Q with excitation light. When fluorescence is detected, it can be determined that the target nucleic acid fragment 140 was present in the sample.
  • the reagents for which the fluorescent substance is generated in the presence of the target substance are CRISPR / Cas family protein 110, gRNA 120 and substrate nucleic acid fragment 150.
  • the sample, CRISPR / Cas family protein 110, gRNA 120, and substrate nucleic acid fragment 150 may be mixed and contacted in any order.
  • the CRISPR / Cas family protein 110 and the gRNA 120 may be first contacted to form the two-party complex 130 in advance, and then the sample may be contacted.
  • the target nucleic acid fragment 140 when the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the target nucleic acid fragment 140 binds to the two-way complex 130 to form the three-way complex 100.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 may then be contacted.
  • the target nucleic acid fragment 140 and the substrate nucleic acid fragment 150 may be brought into contact at the same time.
  • the CRISPR / Cas family protein 110, gRNA120, and sample may be brought into contact at the same time. Even in this case, if the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the tripartite complex 100 is finally formed. The substrate nucleic acid fragment 150 may then be contacted.
  • the sample, CRISPR / Cas family protein 110, gRNA 120, and substrate nucleic acid fragment 150 may be brought into contact at the same time. Even in this case, if the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the tripartite complex 100 is finally formed, and when the target site of the target nucleic acid fragment 140 is cleaved in the tripartite complex 100, It is converted to a tripartite complex 100', expresses nuclease activity, and cleaves the substrate nucleic acid fragment 150.
  • the guide RNA is not particularly limited as long as it can be used for the CRISPR / Cas family protein to be used, and is limited to CRISPR RNA (crRNA) and trans-activated CRISPR RNA (tracrRNA). It may be a complex with, a single gRNA (sgRNA) which is a combination of tracrRNA and crRNA, or may be only crRNA.
  • the crRNA can be, for example, the following base sequence.
  • the base sequence obtained by removing the protospacer adjacent motif (PAM) sequence from the target base sequence is used as the spacer base sequence.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • a base sequence in which a scaffold sequence is linked is designed at the 3'end of the spacer base sequence, and the complementary strand thereof is used as the base sequence of crRNA.
  • the base sequence obtained by removing the PAM sequence from the target base sequence is "5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'" (SEQ ID NO: 1)
  • the base sequence of crRNA for Cas12a protein is "5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'”. (SEQ ID NO: 2) can be used.
  • the crRNA can be, for example, the following base sequence.
  • a base sequence in which a scaffold sequence is linked is designed at the 3'end of a base sequence complementary to the target base sequence, and the complementary strand is used as the base sequence of crRNA.
  • the target base sequence is "5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'" (SEQ ID NO: 3)
  • the base sequence of crRNA for Cas13a protein is "5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'" (SEQ ID NO: 4). Can be done.
  • CRISPR / Cas family protein any protein that expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with gRNA and a target nucleic acid fragment can be used. As mentioned above, more precisely, it forms a tripartite complex and expresses nuclease activity after the CRISPR / Cas family protein cleaves the target nucleic acid fragment.
  • CRISPR / Cas family proteins examples include Cas12 protein and Cas13 protein.
  • the Cas12 protein and Cas13 protein may be Cas12 protein, Cas13 protein, orthologs of these proteins, variants of these proteins, and the like.
  • CRISPR / Cas family proteins that can be used in the method of the present embodiment, for example, Lachnospiraceae bacterium ND2006-derived Cas12a protein (LbCas12a, UniProtKB accession number: A0A182DWE3), Acidaminococcus. Derived Cas12a protein (AsCas12a, UniProtKB accession number: U2UMQ6), Francisella tularensis subsp.
  • Cas12a protein (FnCas12a, UniProtKB accession number: A0Q7Q2) derived from novicida
  • Cas12b protein (AaCas12b, UniProtKB accession number: T0D7A2) derived from Ali Prevotellarestris (AaCas12b, UniProtKB accession number: T0D7A2), Le ),
  • Cas13a protein derived from Lachnospiraceae bacterium NK4A179 (LbaCas13a, NCBI accession number: WP_022785443.1), Leptotricia baccaris C-1013-b derived Cas13a protein (LbaCya Cas13b protein (BzoCas13b, NCBI accession number: WP_002664492), Prevotella intermediaia-derived Cas13b protein (PinCas13b, NCBI accession number: WP_036860899), Prevo
  • MA2016-derived Cas13b protein (PsmCas13b, NCBI accession number: WP_036929175), Reemerella anatipestifer-derived Cas13b protein (RanCas13b, NCBI accession number: WP_004919755), Prevotellasession number: WP_004919755, Prevotella Prevotella saccharolytica derived Cas13b protein (PsaCas13b, NCBI accession number: WP_051522484), Cas13b protein derived from Prevotella intermedia (Pin2Cas13b, NCBI accession number: WP_061868553), Cas13b protein derived from Capnocytophaga canimorsus (CcaCas13b, NCBI accession number: WP_013997271) , Porphyromonas gulae-derived Cas13b protein (PguCas13b, NCBI accession number: WP_039434803)
  • Cas13b protein derived from P5-125 (PspCas13b, NCBI accession number: WP_044065294), Cas13b protein derived from Porphyromonas gingivalis (PigCas13b, NCBI accession number: WP_0534444117), Prevotella ), Csm6 protein derived from Enteroccus italicus (EiCsm6, NCBI accession number: WP_007208953.1), Csm6 protein derived from Lactobacillus salivalius (LsCsm6, NCBI accession number: WP_081509) Accession number: WP_11229148.1) and the like can be mentioned.
  • the CRISPR / Cas family protein may be a variant of the Cas family protein described above.
  • the mutant for example, a mutant having increased nuclease activity after forming a tripartite complex can be used.
  • Substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and when the fluorescent substance is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex and the fluorescent substance separates from the quenching substance, it emits fluorescence by irradiation with excitation light. ..
  • the substrate nucleic acid fragment may be appropriately selected according to the substrate specificity of the CRISPR / Cas family protein to be used.
  • the Cas12 protein is cleaved using single-stranded DNA as a substrate. Therefore, when Cas12 protein is used, single-stranded DNA may be used as the substrate nucleic acid fragment.
  • Cas13 protein is cleaved using single-strand RNA as a substrate. Therefore, when Cas13 protein is used, it is preferable to use single-strand RNA as a substrate nucleic acid fragment.
  • the combination of the fluorescent substance and the quenching substance a combination that can quench the fluorescence of the fluorescent substance when they are brought close to each other is used.
  • a combination that can quench the fluorescence of the fluorescent substance when they are brought close to each other is used.
  • FAM, HEX, or the like is used as the fluorescent substance
  • Iowa Black FQ (IDT), TAMRA, or the like can be used as the quenching substance.
  • each well of the well array has a first well and a second well located at the bottom of the first well and having a smaller volume than the first well. As the volume of the contents of the first well becomes smaller, the contents may be accumulated in the second well.
  • FIG. 2 (a) and 2 (b) are schematic views illustrating an example of a well array having a first well and a second well.
  • 2 (a) is a top view
  • FIG. 2 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 2 (a).
  • the well array 200 is formed on one surface of the substrate 210.
  • Each well of the well array 200 has a first well 220 and a second well 230 located at the bottom of the well 220 and having a smaller capacity than the well 220. As will be described later, when the volume of the contents of the first well 220 becomes smaller, the contents are accumulated in the second well 230.
  • the target substance can be detected with high sensitivity, and the time required for detection is shortened.
  • the volume ratio of the first well 220 to the second well 230 may be 10: 1 to 1,000,000: 1.
  • the volume of the first well 220 may be 1 to 1,000 pL, and the volume of the second well 230 may be 0.1 to 1,000 fL.
  • FIG. 3 (a) and 3 (b) are schematic views illustrating another example of a well array having a first well and a second well.
  • 3 (a) is a top view
  • FIG. 3 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 3 (a).
  • the well array 300 is formed on one surface of the substrate 210.
  • a plurality of second wells 230 may be arranged per first well 220. Also in this case, when the volume of the contents of the first well 220 becomes smaller, the contents are accumulated in the second well 230.
  • the shapes of the first well 220 and the second well 230 are not particularly limited, and may be, for example, a cylinder, a polyhedron composed of a plurality of faces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal column, an octagonal column, etc.). good.
  • the plurality of first wells 220 have the same shape and size
  • the plurality of second wells 230 have the same shape and size.
  • the same shape and the same size may be used as long as they have the same shape and the same capacity to the extent required for digital measurement, and variations of the degree of manufacturing error are allowed.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (b) are schematic cross-sectional views illustrating each step of manufacturing the well array 300.
  • the film 400 is laminated on the surface of the substrate 210.
  • Examples of the material of the substrate 210 include glass, resin, and the like.
  • Examples of the resin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, acrylic and the like.
  • Examples of the material of the film 400 include fluororesin, cyclic polyolefin, and silicone resin.
  • the resist film 410 is laminated on the surface of the film 400. Subsequently, the resist film 410 is exposed by irradiating the resist film 410 with active energy rays using the mask of the well array pattern. Subsequently, it is developed with a developing solution, and as shown in FIG. 4D, the resist film 410 at the portion forming the well is removed.
  • the film 400 masked with the resist film 410 is etched to form the second well 230 in the film 400.
  • the resist film 410 is removed by cleaning the substrate to obtain an array of wells 230.
  • the resist film 410 is laminated again on the array of wells 230 obtained in FIG. 4F.
  • a sheet-type resist can be preferably used as the resist film 410.
  • the resist film 410 is exposed by irradiating the resist film 410 with active energy rays using a mask with a well array pattern. Subsequently, it is developed with a developing solution to remove the resist film 410 at the portion forming the first well 220. As a result, a well array 300 having a first well 220 and a second well 230 is obtained.
  • the method of the present embodiment it is preferable to introduce 0 or 1 target substance per 1st well.
  • Digital measurement can be performed by introducing 0 or 1 target substance per 1st well. That is, the number of wells in which fluorescence is detected can be made to correspond to the number of molecules of the target substance in the sample.
  • the encapsulant is preferably immiscible with water.
  • Immiscible with water means that water and the encapsulant are sufficiently mixed and then allowed to stand to separate into an aqueous phase and an organic phase.
  • the sealing liquid preferably has low water absorption. Low water absorption means that the volume change of the organic layer is 1% or less when it is mixed with water of equal volume and allowed to stand at 20 ° C. and separated into an aqueous phase and an organic phase.
  • the sealing liquid a substance having a boiling point of about 100 ° C. or higher and liquid at room temperature can be used.
  • Specific encapsulants include fluorine such as FC-40, FC-43, FC-770, FC-72, FC-3283 (all manufactured by 3M), and von Bryn (registered trademark) oil (Solvay). Examples thereof include system liquids, mineral oils (Sigmar Aldrich Co., Ltd.), straight-chain or branched-chain saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms include heptane (C 7 H 16 ), octene (C 8 H 18 ), nonan (C 9 H 20 ), and dodecane (C 9 H 20).
  • examples of the isomer of octane include 1-octane, 2-methylheptane, 3-methylheptane, 2,2-dimethylhexane, 2,3-dimethylhexane, 2,3,3-trimethylpentane and the like.
  • examples of the isomers of octene include 1-octene, 2-methyl-1-heptene, 2,3-dimethyl-1-hexene, 2-ethyl-1-hexene, and 2,3,3-trimethyl-1. -Butene etc. can be mentioned.
  • Water-absorbent organic solvent As the water-absorbent organic solvent, a water-absorbent organic solvent having a boiling point of about 100 ° C. or higher, liquid at room temperature, and immiscible with water can be used, and is linear or branched with 4 to 11 carbon atoms. Examples include chain saturated or unsaturated aliphatic alcohols. Immiscible with water means that water and an organic solvent are sufficiently mixed and then allowed to stand to separate into an aqueous phase and an organic phase. Further, water absorption means that water is dissolved.
  • the water-absorbent organic solvent may be a monohydric alcohol or a divalent or higher alcohol.
  • Specific water-absorbing organic solvents include butanol (C 4 H 10 O), pentanol (C 5 H 12 O), hexanol (C 6 H 14 O), heptanol (C 7 H 16 O), and octanol. (C 8 H 18 O), nonanol (C 9 H 20 O), decanol (C 10 H 22 O), undecanol (C 11 H 24 O), pentanediol (C 5 H 12 O 2 ) and the like can be mentioned. These may be any isomer. In addition, these may be used alone or in combination of two or more.
  • examples of the isomer of octanol include 1-octanol, isooctyl alcohol, 2-ethylhexanol and the like.
  • examples of the isomer of pentanediol include 1,5-pentanediol, 1,2-pentanediol, 2,3-pentanediol and the like.
  • the invention comprises a well array comprising a first well and a plurality of wells located at the bottom of the first well and having a second well having a smaller volume than the first well.
  • the well array and the lid member have a substrate arranged on the surface thereof, a lid member arranged so as to face the well array, and a spacer for separating the substrate and the lid member from each other. The space between them provides a fluid device, forming a flow path through which the fluid flows.
  • the substrate on which the well array is arranged on the surface is the same as that described above.
  • FIG. 6A is a top view showing an example of the fluid device of the present embodiment.
  • FIG. 6 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 6 (a).
  • the fluid device 600 is located at the bottom of the first well 220 and the first well 220, and has a smaller capacity than the first well 220. It has a substrate 210 on which a well array 200 having a plurality of wells having wells 230 is arranged on the surface, a spacer 610, and a lid member 620 forming a liquid inlet 621.
  • the space 630 between the substrate 210 and the lid member 620 functions as a flow path for flowing a sample, a detection reagent, a sealing liquid, a water-absorbent organic solvent, and the like.
  • the fluid device of this embodiment can be suitably used for the above-mentioned application of the target substance detection method.
  • the method for detecting the target substance includes a step of introducing the sample and a reagent that produces a fluorescent substance when the target substance is present into each well of the well array, and each of the well arrays.
  • the fluorescent substance is generated when the target substance is present in the contents, and the fluorescent substance is irradiated with excitation light, and the generated fluorescence is generated for each well of the well array.
  • FIGS. 7 (a) to 7 (d) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out a method for detecting a target substance.
  • a single-strand RNA fragment tgRNA
  • crRNA gRNA
  • substrate nucleic acid fragment are used as reagents for producing a fluorescent substance in the presence of a target substance.
  • an assay solution 710 in which a sample, Cas13a protein, crRNA, and a substrate nucleic acid fragment are mixed is introduced from the liquid inlet 621 of the fluid device 600.
  • the interior of the well 220, the interior of the well 230, and the space 630 between the substrate 210 and the lid member 620 are filled with the assay solution 710. That is, a sample and a reagent that produces a fluorescent substance when a target substance is present are introduced into each well of the well array.
  • each well of the well array is sealed with a sealing liquid.
  • the sealant 720 is introduced from the liquid introduction port 621.
  • the opening of the well 220 is sealed with the sealant 720 with the assay solution 710 filled inside the well 220.
  • each well forms an independent reaction space.
  • the encapsulant 720 is replaced with a water-absorbent organic solvent 730.
  • the contents of the well assay solution 710) are dehydrated, the volume is reduced (concentrated), and the three-way complex of Cas13a-crRNA-tgRNA in the assay solution 710 forms a substrate nucleic acid fragment (Reporter). Disconnect.
  • the fluorescent substance F bound to the substrate nucleic acid fragment is separated from the quenching substance Q and becomes fluorescent when irradiated with the excitation light. Fluorescence detected in a well indicates the presence of a target substance in that well.
  • the substrate nucleic acid fragment is not cleaved and fluorescence does not occur because the ternary complex of Cas13a-crRNA-tgRNA is not formed.
  • the water-absorbent organic solvent 730 may be replaced with the sealing agent 720 again. This allows the dehydration of the well contents (assay solution 710) to be stopped. That is, the method for detecting the target substance in the sample may further include a step of replacing the water-absorbent organic solvent with the encapsulant.
  • the target substance is captured in the large-capacity well 220 to improve the capture probability of the target substance, and the detection is performed in the small-capacity well 230 to detect the target substance with high sensitivity. And the time required for detection is shortened.
  • the present invention comprises a target substance detection kit comprising the fluid device described above, a reagent that produces a fluorescent substance in the presence of the target substance, a sealant, and a water-absorbing organic solvent. I will provide a.
  • the above-mentioned method for detecting a target substance can be suitably carried out.
  • the fluid device is the same as that described above. Further, the same applies to the target substance, the reagent for which the fluorescent substance is generated when the target substance is present, the encapsulant, and the water-absorbent organic solvent.
  • the target nucleic acid fragment (single-stranded RNA fragment, SEQ ID NO: 5) was chemically synthesized by outsourcing (IDT).
  • gRNA DNA fragment encoding gRNA (crRNA) was prepared by PCR amplification using an overlapping primer containing a T7 promoter sequence, a 20-base target sequence and a scaffold sequence as a template. Subsequently, the obtained DNA fragment was subjected to an in vitro transcription reaction to prepare crRNA.
  • the base sequence of gRNA (crRNA) for Cas13a protein is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Substrate nucleic acid fragments (single-stranded RNA fragments) were chemically synthesized by outsourcing (IDT).
  • the 5'end of the substrate nucleic acid fragment was labeled with FAM, a fluorescent material, and the 3'end was labeled with Iowa Black FQ (IDT), a quencher.
  • the base sequence of the chemically synthesized substrate nucleic acid fragment (single-stranded RNA fragment) was "5'-(FAM) UUUUU (IABkFQ) -3'" (where "IABkFQ" indicates Iowa Black FQ). ..
  • the well array A was produced by the same procedure as in FIGS. 4 (a) to 4 (f) described above. First, as shown in FIG. 4A, the glass substrate 210 was immersed in an 8M potassium hydroxide solution for about 24 hours to form a hydroxyl group on the surface.
  • a fluororesin (CYTOP, manufactured by AGC Co., Ltd.) was spin-coated on the surface of the glass substrate 210 to form a film 400.
  • the spin coating conditions were set to 1,000 rpm (revolutions per minute) for 30 seconds. Under this condition, the film thickness of the film 400 is about 1.8 ⁇ m.
  • the film 400 was brought into close contact with the surface of the glass substrate 210 by dehydrating and condensing the silanol group of the film 400 (CYTOP) and the hydroxyl group on the glass surface by baking on a hot plate at 180 ° C. for 1 hour.
  • CYTOP silanol group of the film 400
  • a resist product name "AZ-P4903", manufactured by AZ Electrical Materials
  • AZ-P4903 manufactured by AZ Electrical Materials
  • the glass substrate 210 was baked on a hot plate at 110 ° C. for 1 hour to evaporate the organic solvent in the resist film 410, whereby the resist film 410 was brought into close contact with the surface of the film 400.
  • the resist film 410 was exposed by irradiating the resist film 410 with ultraviolet rays at 250 W for 14 seconds with an exposure machine (manufactured by Union Optical Co., Ltd.) using a mask with a well array pattern. Subsequently, it was immersed in a developing solution (AZ developer, manufactured by AZ Electrical Materials) for 1.5 minutes for development. As a result, the resist film 410 at the portion forming the well was removed.
  • AZ developer manufactured by AZ Electrical Materials
  • the film 400 masked with the resist film 410 is subjected to 30 under the conditions of O 2 200 sccm, pressure 5 Pa, and output 50 W using a Reactive ion etching apparatus (manufactured by YAC). Wells 230 were formed on the film 400 by dry etching for a minute.
  • the resist film 410 was removed by immersing the glass substrate 210 in acetone, washing with isopropanol, and then washing with pure water to remove the resist film 410, and the array of wells 230 (well array A).
  • the well array A had a shape in which 1,500,000 columnar wells 230 having a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 1.8 ⁇ m were arranged in 1 cm 2 .
  • Well 230 The volume per well was 17 fL.
  • a well array B having a first well and a second well was prepared by the same procedure as in FIGS. 4 (a) to 4 (f), FIGS. 5 (a) and 5 (b).
  • the well array obtained in the same manner as in FIGS. 4 (a) to 4 (f) is dry-etched (O 2 13 sccm, pressure 14 Pa, output 125 W) for 5 seconds using a reactive ion etching apparatus (manufactured by Samco). Therefore, the surface of the well array was hydrolyzed.
  • a sheet-type resist product name "SU-8 3020CF DFR Type-S", KAYAKU Advanced Materials, Inc.
  • a laminating roller As shown in FIG. 5A, a resist film 410 was formed.
  • the resist film 410 was exposed by irradiating ultraviolet rays for 20 seconds with an exposure machine (manufactured by Union Optical Co., Ltd.) using a mask with a well array pattern. Subsequently, it was immersed in a developing solution (product name "SU8 developer", KAYAKU Advanced Materials, Inc.) for 8 minutes for development. As a result, the resist film 410 at the portion forming the well was removed, and a well array B having the first well 220 and the second well 230 was obtained.
  • a developing solution product name "SU8 developer", KAYAKU Advanced Materials, Inc.
  • the well array B consists of a well array in which 1,500,000 columnar wells 230 having a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 1.8 ⁇ m are arranged in 1 cm 2 and a columnar well 220 having a diameter of 40 ⁇ m and a depth of 20 ⁇ m. It had a shape in which 40,000 well arrays were stacked in 1 cm 2 .
  • the well array B had a shape in which 12 to 18 wells 230 were arranged at the bottom of each well 220.
  • FIG. 8 is a photomicrograph of the prepared well array B.
  • an assay solution in which the above-mentioned tripartite complex solution and a solution of the substrate nucleic acid fragment were mixed was prepared, and immediately introduced from the liquid inlet of each fluid device A. As a result, the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 9 (a) is a representative fluorescence micrograph showing the result of the assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 0 pM.
  • FIG. 9B is a representative fluorescence micrograph showing the results of an assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 0.3 pM.
  • FIG. 9 (c) is a representative fluorescence micrograph showing the results of an assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 3 pM.
  • FIG. 9 (d) is a representative fluorescence micrograph showing the result of the assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 30 pM.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 10A is a typical graph showing the number of wells showing a predetermined fluorescence intensity (relative value) based on a photograph of a well array into which each assay solution was introduced.
  • FIG. 10 (b) shows the same graph as in FIG. 10 (a) for assay solutions in which the final concentrations of the target nucleic acid fragments are 30 pM, 3 pM, 0.3 pM, and 0 pM, respectively, in FIG. 10 (a). It is a graph which enlarged and arranged the area corresponding to the area surrounded by a dotted line.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • a sealant (hexadecane, Sigma-Aldrich) was introduced from the liquid inlet of the fluid device B.
  • a sealant hexadecane, Sigma-Aldrich
  • a water-absorbent organic solvent was introduced from the liquid inlet of the fluid device B to replace the encapsulant.
  • the water-absorbent organic solvent 1-pentanol, 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, and 1-nonanol were examined.
  • the contents of the well were dehydrated, the volume was reduced, and the alkaline phosphatase in the contents reacted with sTG-phos to produce a fluorescent substance (sTG).
  • sTG fluorescent substance
  • the chemical formula of sTG is shown in the following formula (2).
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring the change over time in the fluorescence intensity (relative value) of sTG when each water-absorbent organic solvent is used.
  • a sealant (hexadecane, Sigma-Aldrich) was introduced from the liquid inlet of the fluid device B.
  • a sealant hexadecane, Sigma-Aldrich
  • 1-octanol was introduced from the liquid inlet of the fluid device to replace the encapsulant.
  • the contents of the well were dehydrated, the volume was reduced, and the alkaline phosphatase in the contents reacted with sTG-phos to produce a fluorescent substance (sTG).
  • FIG. 13 is a representative graph showing the percentage of wells showing a predetermined fluorescence intensity (relative value) based on a photograph of a well array in which fluorescence of sTG was detected.
  • the horizontal axis of the graph shows the concentration of alkaline phosphatase (ALP).

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Abstract

試料中の標的物質の検出方法であって、ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、及び、前記標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬を導入する工程と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する工程と、前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、前記内容物中に前記標的物質が存在する場合に前記蛍光物質が生成される工程と、前記蛍光物質に励起光を照射し、発生する蛍光を前記ウェルアレイのウェルごとに検出する工程と、を含み、前記ウェルで蛍光が検出されたことが、前記ウェルに前記標的物質が存在することを示す、方法。

Description

標的物質の検出方法、流体デバイス及びキット
　本発明は、標的物質の検出方法、流体デバイス及びキットに関する。本願は、２０２０年１０月６日に、日本に出願された特願２０２０－１６９０９２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、酵素活性に基づいて、疾患の検出やモニタリングを行うことが検討されている。このような診断方法は、Ａｃｔｉｖｉｔｙ－Ｂａｓｅｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＢＤｘ）と呼ばれている（例えば、非特許文献１を参照）。
　ＡＢＤｘが診断対象とする疾患としては、ウイルス感染等の感染性疾患、癌等の非感染性疾患等が挙げられる。例えばウイルス由来の核酸をマーカーとして検出することにより、ウイルス感染を検出することができる。また、癌組織において制御不能になったカテプシン等の酵素の活性を疾患のマーカーとして検出することにより、癌を検出することができる。
　また、血液中には、細胞死によって細胞から放出された遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）が存在することが知られている。癌患者のｃｆＤＮＡの中には癌細胞由来のＤＮＡである血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）も含まれている。
　また、様々な細胞がエクソソームと呼ばれる膜小胞を分泌し、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の生体試料や、培養細胞の上清中には、エクソソームが含まれていることが知られている。エクソソームには、それを分泌した細胞に由来する様々なタンパク質、脂質、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等が含まれている。
　近年、ｃｆＤＮＡやエクソソーム等の膜小胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ等を、癌やその他の様々な疾患の早期発見、抗癌剤の効果予測、病気の素因診断、遺伝性疾患の診断等に応用する研究が行われている。
　このように、ウイルス由来の核酸、酵素、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を標的物質として、高感度に検出する技術が求められている。
　ところで、特許文献１には、フェムトリットルオーダーの大きさのマイクロチャンバを用いて１分子レベルで酵素活性を検出することが記載されている。
特開２００４－３０９４０５号公報
Soleimany A. P. and Bhatia S. N., Activity-Based Diagnostics: An Emerging Paradigm for Disease Detection and Monitoring, Trends Mol Med, 26 (5), 450-468, 2020.
　特許文献１に記載されたマイクロチャンバのように、酵素反応を行う反応空間の容積を微小化することにより、酵素反応の検出時間を短縮することができる。しかしながら、反応空間の容積を微小化すると、標的物質が反応空間に捕捉される割合が減少し、検出感度が低下する場合がある。そこで、本発明は、標的物質を高感度に検出することができる技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の標的物質の検出方法であって、ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、及び、前記標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬を導入する工程と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する工程と、前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、前記内容物中に前記標的物質が存在する場合に前記蛍光物質が生成される工程と、前記蛍光物質に励起光を照射し、発生する蛍光を前記ウェルアレイのウェルごとに検出する工程と、を含み、前記ウェルで蛍光が検出されたことが、前記ウェルに前記標的物質が存在することを示す、方法。
［２］前記ウェルアレイの各ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、前記第１のウェルの内容物の容積が小さくなると、前記内容物が前記第２のウェルに集積する、［１］に記載の方法。
［３］前記第１のウェルと前記第２のウェルの容積の比（第１のウェルの容積：第２のウェルの容積）が、１０：１～１,０００,０００：１である、［２］に記載の方法。
［４］前記第１のウェルの容積が１～１，０００ｐＬであり、前記第２のウェルの容積が０．１～１，０００ｆＬである、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］前記標的物質が、前記第１のウェル１つあたりに０個又は１個導入される、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記封止液が、フッ素系液体、ミネラルオイル又は炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記吸水性の有機溶媒が、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有するウェルを複数備えたウェルアレイが表面に配置された基板と、前記ウェルアレイに対向して配置された蓋部材と、前記基板及び前記蓋部材との間を離間させるスペーサーと、を有し、前記ウェルアレイと前記蓋部材との間の空間は流体が流れる流路を形成している、流体デバイス。
［９］［８］に記載の流体デバイスと、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬と、封止液と、吸水性の有機溶媒とを含む、標的物質検出用キット。
　本発明によれば、標的物質を高感度に検出することができる技術を提供することができる。
（ａ）及び（ｂ）は、標的物質の検出方法の一例を説明する模式図である。 （ａ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を説明する模式図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 （ａ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を説明する模式図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 （ａ）～（ｆ）は、ウェルアレイの製造の各工程を説明する模式断面図である。 （ａ）及び（ｂ）は、ウェルアレイの製造の各工程を説明する模式断面図である。 （ａ）は、流体デバイスの一例を示す上面図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 （ａ）～（ｄ）は、流体デバイスを用いて標的物質の検出方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。 ウェルアレイの顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例１の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。 実験例１の結果を示すグラフである。 実験例２の結果を示すグラフである。 実験例３の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［標的物質の検出方法］
　１実施形態において、本発明は、試料中の標的物質の検出方法であって、ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、及び、前記標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬を導入する工程と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する工程と、前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、前記内容物中に前記標的物質が存在する場合に前記蛍光物質が生成される工程と、前記蛍光物質に励起光を照射し、発生する蛍光を前記ウェルアレイのウェルごとに検出する工程と、を含み、前記ウェルで蛍光が検出されたことが、前記ウェルに前記標的物質が存在することを示す方法を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、標的物質を高感度に検出することができる。
（試料）
　試料としては、特に限定されず、例えば、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の生体試料や、培養細胞の上清等が挙げられる。
（標的物質）
　標的物質としては、特に限定されず、酵素、１本鎖核酸断片、２本鎖核酸断片等が挙げられる。核酸断片は、ウイルス由来の核酸、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ等であってもよい。酵素としては、あらゆる酵素を対象とすることができ、例えば、コロナウイルスのメインプロテアーゼ、アルカリフォスファターゼ、生体由来のプロテアーゼ等が挙げられる。生体由来のプロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、カテプシン等が挙げられる。
（標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬）
　標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬（検出試薬）としては、標的物質が酵素である場合には、対象とする酵素に対応した蛍光基質が挙げられる。このような蛍光基質は、酵素反応により蛍光物質が生成されるものである。
　より具体的には、酵素がペプチダーゼである場合には、蛍光物質及び消光物質で標識されたペプチド基質等が挙げられる。このようなペプチド基質がペプチダーゼにより切断されると蛍光が検出される。また、酵素がフォスファターゼである場合には、リン酸基を付加することにより消光させた蛍光物質等が挙げられる。このような物質からリン酸基が除去されると蛍光が検出される。
　また、近年ゲノム編集に応用されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質のうち、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３は、ｇＲＮＡ及び標的核酸と３者複合体を形成し、標的核酸を切断すると、周囲のＤＮＡ又はＲＮＡを切断する活性を発現することが明らかにされている。
　この反応を利用することにより、１本鎖核酸断片や２本鎖核酸断片を標的物質（標的核酸）として、蛍光物質を生成することができる。具体的には、Ｃａｓ１２タンパク質を用いることにより、標的物質として２本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。また、Ｃａｓ１３タンパク質を用いることにより、標的物質として１本鎖ＲＮＡ断片又は１本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。
　図１（ａ）及び（ｂ）は、この反応を説明する模式図である。図１（ａ）及び（ｂ）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合を例に説明する。
　まず、図１（ａ）に示すように、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０と、ｇＲＮＡ１２０とを接触させると、これらは結合し、２者複合体１３０を形成する。ｇＲＮＡ１２０は、一部に標的核酸断片１４０（標的物質）と相補的な塩基配列を有している。
　続いて、２者複合体１３０に試料中の標的核酸断片１４０が接触すると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、標的核酸断片１４０が３者複合体１００を形成する。この段階では、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０は、ヌクレアーゼ活性を発現していないため、基質核酸断片１５０は切断されない。図１（ａ）及び（ｂ）の例では、基質核酸断片１５０は、蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑで標識された１本鎖ＤＮＡ断片である。基質核酸断片１５０に励起光を照射しても蛍光は発生しない。
　３者複合体１００が形成されると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０が、標的核酸断片１４０の標的部位を切断する。図１（ａ）では、標的核酸断片１４０の標的部位を矢頭で示す。図１（ｂ）は、標的核酸断片１４０の標的部位が切断された３者複合体１００’を示す模式図である。図１（ｂ）に示すように、３者複合体１００’はヌクレアーゼ活性を発現する。そして、３者複合体１００’の周囲に存在する基質核酸断片１５０を切断する。この結果、基質核酸断片１５０の蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れる。消光物質Ｑから離れた蛍光物質Ｆに励起光を照射すると、蛍光を検出することができる。蛍光が検出された場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在していたと判断することができる。
　この場合、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０及び基質核酸断片１５０であるということができる。
　なお、試料、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、基質核酸断片１５０は、どのような順序で混合して接触させてもよい。
　例えば、まず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０及びｇＲＮＡ１２０を接触させて、予め２者複合体１３０を形成させた後に、試料を接触させてもよい。この場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合には、２者複合体１３０に標的核酸断片１４０が結合し、３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。
　あるいは、２者複合体１３０を形成した後に、標的核酸断片１４０及び基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。
　あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、試料を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。
　あるいは、試料、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成され、３者複合体１００において、標的核酸断片１４０の標的部位が切断されると、３者複合体１００’に変換され、ヌクレアーゼ活性を発現し、基質核酸断片１５０が切断される。
《ｇＲＮＡ》
　本実施形態の方法において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に用いることができるものであれば特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡのみであってもよい。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'」（配列番号１）である場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'」（配列番号２）とすることができる。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列に相補的な塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列が「5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'」（配列番号３）である場合、Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'」（配列番号４）とすることができる。
《ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質》
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであれば用いることができる。上述したように、より正確には、３者複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が標的核酸断片を切断した後に、ヌクレアーゼ活性を発現する。
　このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質等が挙げられる。本明細書において、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、これらのタンパク質のオルソログ、これらのタンパク質の改変体等であってもよい。
　本実施形態の方法に用いることができるより具体的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＤ２００６由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＬｂＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｕ２ＵＭＱ６）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＦｎＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ｑ７Ｑ２）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のＣａｓ１２ｂタンパク質（ＡａＣａｓ１２ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｔ０Ｄ７Ａ２）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｗａｄｅｉ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＫ４Ａ１７９由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｂｕｃｃａｌｉｓ　Ｃ－１０１３－ｂ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１５７７０００４．１）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ　ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００２６６４４９２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６８６０８９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｂｕｃｃａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４３４３９７３）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｓｐ．　ＺＯＲ０００９由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４７４４７９０１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡ２０１６由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６９２９１７５）、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４９１９７５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２５０００９２６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５１５２２４８４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０６１８６８５５３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１３９９７２７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｕｌａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３９４３４８０３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　Ｐ５－１２５由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４４０６５２９４）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｇＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５３４４４４１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５０９５５３６９）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｔａｌｉｃｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＥｉＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００７２０８９５３．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＬｓＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０８１５０９１５０．１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＴｔＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１２２９１４８．１）等が挙げられる。
　本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、上述したＣａｓファミリータンパク質の変異体であってもよい。変異体としては、例えば、３者複合体を形成した後のヌクレアーゼ活性が上昇した変異体等を用いることができる。
《基質核酸断片》
　基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。
　基質核酸断片は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の基質特異性に応じて適宜選択すればよい。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質は、１本鎖ＤＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１２タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＤＮＡを使用するとよい。また、Ｃａｓ１３タンパク質は、１本鎖ＲＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１３タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＲＮＡを使用するとよい。
　蛍光物質及び消光物質の組み合わせは、互いに近接させた場合に蛍光物質の蛍光を消光させることができる組み合わせのものを用いる。例えば、蛍光物質として、ＦＡＭ、ＨＥＸ等を用いる場合には、消光物質としてＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）やＴＡＭＲＡ等を用いることができる。
（ウェルアレイ）
　本実施形態の方法において、ウェルアレイの各ウェルが、第１のウェルと、第１のウェルの底部に配置され、第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、第１のウェルの内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェルに集積するものであってもよい。
　図２（ａ）及び（ｂ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を説明する模式図である。図２（ａ）は上面図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、ウェルアレイ２００は、基板２１０の一方面上に形成されている。そして、ウェルアレイ２００の各ウェルは、第１のウェル２２０と、ウェル２２０の底部に配置され、ウェル２２０よりも小容量の第２のウェル２３０とを有している。後述するように、第１のウェル２２０の内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェル２３０に集積する。
　すなわち、標的物質を大容量のウェル２２０に捕捉し、検出を小容量のウェル２３０で行うことにより、標的物質を高感度に検出することができ、検出に要する時間も短縮される。
　第１のウェル２２０と第２のウェル２３０の容積の比（ウェル２２０の容積：ウェル２３０の容積）は、１０：１～１,０００,０００：１であってもよい。
　あるいは、第１のウェル２２０の容積が１～１，０００ｐＬであり、第２のウェル２３０の容積が０．１～１，０００ｆＬであってもよい。
　図３（ａ）及び（ｂ）は、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの別の一例を説明する模式図である。図３（ａ）は上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ウェルアレイ３００は、基板２１０の一方面上に形成されている。ウェルアレイ３００のように、第１のウェル２２０　１つあたり、第２のウェル２３０は複数配置されていてもよい。この場合においても、第１のウェル２２０の内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェル２３０に集積する。
　第１のウェル２２０及び第２のウェル２３０の形状には特に制限はなく、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）等であってもよい。
　複数の第１のウェル２２０はそれぞれ同形同大であることが好ましく、複数の第２のウェル２３０はそれぞれ同形同大であることが好ましい。ここで、同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
（ウェルアレイの製造方法）
　ウェルアレイ３００を例に、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの製造方法の一例を説明する。
　図４（ａ）～（ｆ）及び図５（ａ）及び（ｂ）はウェルアレイ３００の製造の各工程を説明する模式断面図である。まず、図４（ａ）に示すように、基板２１０の表面に、膜４００を積層する。
　基板２１０の材質としては、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。膜４００の材質としては、フッ素樹脂、環状ポリオレフィン、シリコーン樹脂等が挙げられる。
　続いて、図４（ｃ）に示すように、膜４００の表面にレジスト膜４１０を積層する。続いて、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜４１０を露光する。続いて現像液で現像し、図４（ｄ）に示すように、ウェルを形成する部分のレジスト膜４１０を除去する。
　続いて、図４（ｅ）に示すように、レジスト膜４１０でマスクされた膜４００を、エッチングすることにより、膜４００に第２のウェル２３０を形成する。
　続いて、図４（ｆ）に示すように、基板を洗浄することにより、レジスト膜４１０を除去し、ウェル２３０のアレイを得る。
　続いて、図５（ａ）に示すように、図４（ｆ）で得られたウェル２３０のアレイに再度レジスト膜４１０を積層する。レジスト膜４１０としては、シート型レジストを好ましく用いることができる。
　続いて、図５（ｂ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜４１０を露光する。続いて、現像液で現像し、第１のウェル２２０を形成する部分のレジスト膜４１０を除去する。この結果、第１のウェル２２０及び第２のウェル２３０を有するウェルアレイ３００が得られる。
　本実施形態の方法において、標的物質は、第１のウェル１つあたりに０個又は１個導入されることが好ましい。標的物質を、第１のウェル１つあたりに０個又は１個導入することにより、デジタル計測を行うことができる。つまり、蛍光が検出されたウェルの個数を、試料中の標的物質の分子数と対応させることができる。
（封止液）
　封止液は、水と混和しないものであることが好ましい。水と混和しないとは、水と封止液を十分混合した後、静置すると、水相及び有機相に分離することを意味する。また、封止液は、吸水性が低いことが好ましい。吸水性が低いとは、２０℃において等容量の水と混合して静置し、水相及び有機相に分離した場合の有機層の体積変化が１％以下であることを意味する。
　封止液としては、沸点が約１００℃以上であり、室温で液体の物質を使用することができる。具体的な封止液としては、ＦＣ－４０、ＦＣ－４３、ＦＣ－７７０、ＦＣ－７２、ＦＣ－３２８３（いずれも３Ｍ社製）、フォンブリン（登録商標）オイル（ソルベイ社）等のフッ素系液体、ミネラルオイル（シグマーアルドリッチ社）、炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素等が挙げられる。これらは一種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素としては、ヘプタン（Ｃ７Ｈ１６）、オクタン（Ｃ８Ｈ１８）、ノナン（Ｃ９Ｈ２０）、デカン（Ｃ１０Ｈ２２）、ウンデカン（Ｃ１１Ｈ２４）、ドデカン（Ｃ１２Ｈ２６）、トリデカン（Ｃ１３Ｈ２８）、テトラデカン（Ｃ１４Ｈ３０）、ペンタデカン（Ｃ１５Ｈ３２）、ヘキサデカン（Ｃ１６Ｈ３４）、ヘプタデカン（Ｃ１７Ｈ３６）、ヘプテン（Ｃ７Ｈ１４）、オクテン（Ｃ８Ｈ１６）、ノネン（Ｃ９Ｈ１８）、デセン（Ｃ１０Ｈ２０）、ウンデセン（Ｃ１１Ｈ２２）、ドデセン（Ｃ１２Ｈ２４）、トリデセン（Ｃ１３Ｈ２６）、テトラデセン（Ｃ１４Ｈ２８）、ペンタデセン（Ｃ１５Ｈ３０）、ヘキサデセン（Ｃ１６Ｈ３２）、ヘプタデセン（Ｃ１７Ｈ３４）等が挙げられる。これらはいずれの異性体であってもよい。
　例えば、オクタンの異性体としては、１－オクタン、２－メチルヘプタン、３－メチルヘプタン、２，２－ジメチルヘキサン、２，３－ジメチルヘキサン、２，３，３－トリメチルペンタン等が挙げられる。また、例えば、オクテンの異性体としては、１－オクテン、２－メチル－１－ヘプテン、２，３－ジメチル－１－ヘキセン、２－エチル－１－ヘキセン、２，３，３－トリメチル－１－ブテン等が挙げられる。
（吸水性の有機溶媒）
　吸水性の有機溶媒としては、沸点が約１００℃以上であり、室温で液体であり、水と混和しない、吸水性の有機溶媒使用することができ、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールが挙げられる。水と混和しないとは、水と有機溶媒を十分混合した後、静置すると、水相及び有機相に分離することを意味する。また、吸水性とは、水を溶解することを意味する。吸水性の有機溶媒は、一価のアルコールであってもよく、二価以上のアルコールであってもよい。
　具体的な吸水性の有機溶媒としては、ブタノール（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）、ペンタノール（Ｃ５Ｈ１２Ｏ）、ヘキサノール（Ｃ６Ｈ１４Ｏ）、へプタノール（Ｃ７Ｈ１６Ｏ）、オクタノール（Ｃ８Ｈ１８Ｏ）、ノナノール（Ｃ９Ｈ２０Ｏ）、デカノール（Ｃ１０Ｈ２２Ｏ）、ウンデカノール（Ｃ１１Ｈ２４Ｏ）、ペンタンジオール（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）等が挙げられる。これらはいずれの異性体であってもよい。また、これらは一種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　例えば、オクタノールの異性体としては、１－オクタノール、イソオクチルアルコール、２－エチルヘキサノール等が挙げられる。また、例えば、ペンタンジオールの異性体としては、１，５－ペンタンジオール、１，２－ペンタンジオール、２，３－ペンタンジオール等が挙げられる。
　実施例において後述するように、特に、１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノールを用いた場合に、脱水濃縮による蛍光強度の上昇が認められ、標的物質を高感度に検出することができる傾向にある。
［流体デバイス］
　１実施形態において、本発明は、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有するウェルを複数備えたウェルアレイが表面に配置された基板と、前記ウェルアレイに対向して配置された蓋部材と、前記基板及び前記蓋部材との間を離間させるスペーサーと、を有し、前記ウェルアレイと前記蓋部材との間の空間は流体が流れる流路を形成している、流体デバイスを提供する。
　本実施形態の流体デバイスにおいて、ウェルアレイが表面に配置された基板については上述したものと同様である。
　図６（ａ）は、本実施形態の流体デバイスの一例を示す上面図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、流体デバイス６００は、第１のウェル２２０と、第１のウェル２２０の底部に配置され、第１のウェル２２０よりも小容量の第２のウェル２３０とを有するウェルを複数備えたウェルアレイ２００が表面に配置された基板２１０と、スペーサー６１０と、液体導入口６２１を形成した蓋部材６２０とを有している。基板２１０と蓋部材６２０との間の空間６３０は、試料、検出試薬、封止液、吸水性の有機溶媒等を流す流路として機能する。
　本実施形態の流体デバイスは、上述した標的物質の検出方法の用途に好適に使用することができる。
（標的物質の検出方法）
　ここで、図７（ａ）～（ｄ）を参照しながら、上述した実施形態に係る標的物質の検出方法をより具体的に説明する。
　上述したように、標的物質の検出方法は、ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、及び、前記標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬を導入する工程と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する工程と、前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、前記内容物中に前記標的物質が存在する場合に前記蛍光物質が生成される工程と、前記蛍光物質に励起光を照射し、発生する蛍光を前記ウェルアレイのウェルごとに検出する工程とを含む。
　図７（ａ）～（ｄ）は、標的物質の検出方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。図７（ａ）～（ｄ）では、１本鎖ＲＮＡ断片（ｔｇＲＮＡ）を標的物質として検出している。また、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬として、Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及び基質核酸断片を使用している。
　まず、図７（ａ）に示すように、試料、Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｃｒＲＮＡ、基質核酸断片を混合したアッセイ溶液７１０を流体デバイス６００の液体導入口６２１から導入する。その結果、図７（ａ）に示すように、ウェル２２０の内部、ウェル２３０の内部及び基板２１０と蓋部材６２０との間の空間６３０が、アッセイ溶液７１０で満たされる。すなわち、ウェルアレイの各ウェルに、試料、及び、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬が導入される。
　続いて、ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する。具体的には、液体導入口６２１から封止剤７２０を導入する。封止剤７２０が導入されると、ウェル２２０の内部にアッセイ溶液７１０が満たされた状態で、ウェル２２０の開口部が封止剤７２０により封止される。その結果、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する。
　続いて、図７（ｂ）に示すように、封止剤７２０を吸水性の有機溶媒７３０で置換する。その結果、ウェルの内容物（アッセイ溶液７１０）が脱水され、容積が減少する（濃縮される）と共に、アッセイ溶液７１０中でＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ－ｔｇＲＮＡの３者複合体が基質核酸断片（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を切断する。その結果、基質核酸断片に結合していた蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、励起光の照射により蛍光を発するようになる。ウェルで蛍光が検出されることは、当該ウェルに標的物質が存在することを示す。
　なお、アッセイ溶液７１０中に標的物質が存在しない場合には、Ｃａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ－ｔｇＲＮＡの３者複合体が形成されないため、基質核酸断片は切断されず、蛍光は生じない。
　また、脱水量が所望の量に達したところで、吸水性の有機溶媒７３０を再び封止剤７２０に置換してもよい。これにより、ウェルの内容物（アッセイ溶液７１０）の脱水を停止することができる。すなわち、試料中の標的物質の検出方法は、吸水性の有機溶媒を封止液に置換する工程を更に有していてもよい。
　このようにして、標的物質を大容量のウェル２２０に捕捉することにより、標的物質の捕捉確率を向上させるとともに、検出を小容量のウェル２３０で行うことにより、標的物質を高感度に検出することができ、検出に要する時間も短縮される。
［標的物質検出用キット］
　１実施形態において、本発明は、上述した流体デバイスと、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬と、封止液と、吸水性の有機溶媒とを含む、標的物質検出用キットを提供する。
　本実施形態のキットを用いることにより、上述した標的物質の検出方法を好適に実施することができる。本実施形態のキットにおいて、流体デバイスは上述したものと同様である。また、標的物質、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬、封止液、吸水性の有機溶媒についても上述したものと同様である。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（Ｃａｓ１３ａタンパク質の調製）
　Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｗａｄｅｉ　Ｃａｓ１３ａ（ＬｗＣａｓ１３ａ）の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクションして発現させた。発現ベクターは、Ｎ末端に、１０×Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴベースのベクターであった。発現したＣａｓ１３ａタンパク質はＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。続いて、ＴＥＶプロテアーゼを４℃、一晩反応させた後、ＭＢＰＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）及びこれに接続したＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
（標的核酸断片の調製）
　標的核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片、配列番号５）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。
（ｇＲＮＡの調製）
　Ｔ７プロモーター配列、２０塩基の標的配列及びスキャフォールド配列を含むオーバーラッピングプライマーを鋳型としたＰＣＲ増幅により、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ断片を調製した。続いて、得られたＤＮＡ断片をインビトロ転写反応に供しｃｒＲＮＡを調製した。Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の塩基配列を配列番号４に示す。
（基質核酸断片の調製）
　基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。基質核酸断片の５’末端を蛍光物質であるＦＡＭで標識し、３’末端を消光物質であるＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）で標識した。化学合成した基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）の塩基配列は「5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'」（ここで、「IABkFQ」はＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱを示す。）であった。
（ウェルアレイＡの作製）
　上述した、図４（ａ）～（ｆ）と同様の手順により、ウェルアレイＡを作製した。まず、図４（ａ）に示すように、ガラス基板２１０を８Ｍの水酸化カリウム溶液に２４時間程度浸し、表面にヒドロキシル基を形成させた。
　続いて、図４（ｂ）に示すように、ガラス基板２１０の表面に、フッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ、ＡＧＣ株式会社製）をスピンコートして膜４００を形成した。スピンコートの条件は、１，０００ｒｐｍ（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）で３０秒とした。この条件では、膜４００の膜厚が約１．８μｍとなる。
　続いて、１８０℃のホットプレートで１時間ベークして、膜４００（ＣＹＴＯＰ）のシラノール基とガラス表面のヒドロキシル基とを脱水縮合することにより、膜４００をガラス基板２１０の表面に密着させた。
　続いて、図４（ｃ）に示すように、膜４００の表面にレジスト（製品名「ＡＺ－Ｐ４９０３」、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を４０００ｒｐｓで６０秒スピンコートし、レジスト膜４１０を形成した。
　続いて、ガラス基板２１０を１１０℃のホットプレートで１時間ベークして、レジスト膜４１０内の有機溶媒を蒸発させることにより、レジスト膜４１０を膜４００の表面に密着させた。
　続いて、図４（ｄ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ユニオン光学製）で２５０Ｗ、１４秒間紫外線を照射してレジスト膜４１０を露光した。続いて現像液（ＡＺ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）に１．５分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜４１０が除去された。
　続いて、図４（ｅ）に示すように、レジスト膜４１０でマスクされた膜４００を、Ｒｅａｃｔｉｃｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置（ＹＡＣ社製）を用いて、Ｏ２　２００ｓｃｃｍ、圧力５Ｐａ、出力５０Ｗの条件で３０分間ドライエッチングすることにより、膜４００にウェル２３０を形成した。
　続いて、図４（ｆ）に示すように、ガラス基板２１０をアセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより、レジスト膜４１０を除去し、ウェル２３０のアレイ（ウェルアレイＡ）を得た。ウェルアレイＡは、直径３．５μｍ、深さ１．８μｍの円柱状のウェル２３０が１ｃｍ２に１，５００，０００個並んだ形状であった。ウェル２３０　１ウェルあたりの容積は１７ｆＬであった。
（ウェルアレイＢの作製）
　図４（ａ）～（ｆ）、図５（ａ）及び（ｂ）と同様の手順により、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイＢを作製した。まず、図４（ａ）～（ｆ）と同様にして得られたウェルアレイを、Ｒｅａｃｔｉｃｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置（Ｓａｍｃｏ社製）を用いて５秒間ドライエッチング（Ｏ２　１３ｓｃｃｍ、圧力１４Ｐａ、出力１２５Ｗ）することで、ウェルアレイ表面の親水化処理を行った。続いて、ウェルアレイを６５℃のホットプレート上に置き、ラミネートローラーを用いてシート型レジスト（製品名「ＳＵ－８　３０２０ＣＦ　ＤＦＲ　Ｔｙｐｅ－Ｓ」、ＫＡＹＡＫＵ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．社製）を密着させ、図５（ａ）に示すように、レジスト膜４１０を形成した。
　続いて、図５（ｂ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ユニオン光学製）で２０秒間紫外線を照射してレジスト膜４１０をを露光した。続いて現像液（製品名「ＳＵ８　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ」、ＫＡＹＡＫＵ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．社製）に８分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜４１０が除去され、第１のウェル２２０及び第２のウェル２３０を有するウェルアレイＢを得た。
　ウェルアレイＢは、直径３．５μｍ、深さ１．８μｍの円柱状のウェル２３０が１ｃｍ２に１，５００，０００個並んだウェルアレイに、直径４０μｍ、深さ２０μｍの円柱状のウェル２２０が１ｃｍ２に４０，０００個並んだウェルアレイが積層された形状であった。
　ウェルアレイＢは、ウェル２２０　１つあたりの底部にウェル２３０が１２～１８個配置された形状をしていた。図８は、作製したウェルアレイＢの顕微鏡写真である。
（流体デバイスＡの作製）
　図６と同様にして、上述したウェルアレイＡにスペーサー２２０を配置し、更に、液体導入口６２１を形成したガラス板６２０を載せ、流体デバイスＡを作製した。この結果、ウェルアレイＡとガラス板６２０との間の空間が流路である流体デバイスＡが得られた。
（流体デバイスＢの作製）
　図６と同様にして、上述したウェルアレイＢにスペーサー２２０を配置し、更に、液体導入口６２１を形成したガラス板６２０を載せ、流体デバイスＢを作製した。この結果、ウェルアレイＢとガラス板６２０との間の空間が流路である流体デバイスＢが得られた。
［実験例１］
（Ｃａｓ１３ａを用いた検討）
　Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号４）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、３０ｐＭ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、０ｐＭとなるように、下記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３者複合体を形成させた。以下、この溶液を３者複合体溶液という。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述した流体デバイスＡを４個用意した。また、上記バッファーＡに、終濃度１０μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液を調製した。
　続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合したアッセイ溶液をそれぞれ調製し、直ちに各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図９（ａ）は標的核酸断片の終濃度が０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図９（ｂ）は標的核酸断片の終濃度が０．３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図９（ｃ）は標的核酸断片の終濃度が３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。また、図９（ｄ）は標的核酸断片の終濃度が３０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。
　図１０（ａ）は、各アッセイ溶液を導入したウェルアレイの写真に基づいて、所定の蛍光強度（相対値）を示したウェルの数を示す代表的なグラフである。図１０（ｂ）は、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、３０ｐＭ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、０ｐＭであるアッセイ溶液についての図１０（ａ）と同様のグラフおいて、図１０（ａ）における点線で囲んだ領域に相当する領域を拡大して並べたグラフである。
　その結果、標的核酸断片の濃度依存的に蛍光が検出されたウェルの割合が上昇したことが明らかとなった。
　図１１は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。その結果、流体デバイスを用いた場合の検出感度が約５６ｆＭであることが明らかとなった。
［実験例２］
（濃縮の検討１）
　１５０ｆＭのアルカリフォスファターゼ（シグマ－アルドリッチ社）と、１μＭの蛍光基質（ｓＴＧ－ｐｈｏｓ）を混合したアッセイ溶液を調製し、上述した流体デバイスＢの液体導入口から導入した。ｓＴＧ－ｐｈｏｓの化学式を下記式（１）に示す（Sakamoto S., et al., Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples, Sci Adv. 6 (11), eaay0888, 2020. を参照。）。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を流体デバイスＢの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。
　続いて、流体デバイスＢの液体導入口から吸水性の有機溶媒を導入して封止剤を置換した。吸水性の有機溶媒としては、１－ペンタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノールをそれぞれ検討した。この結果、ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、内容物中のアルカリフォスファターゼとｓＴＧ－ｐｈｏｓが反応して蛍光物質（ｓＴＧ）が生成された。ｓＴＧの化学式を下記式（２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　続いて、経時的にｓＴＧの蛍光を検出した。図１２は、各吸水性の有機溶媒を用いた場合における、ｓＴＧの蛍光強度（相対値）の経時変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、特に、１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノールを用いた場合に、脱水濃縮による蛍光強度の上昇が認められた。
［実験例３］
（濃縮の検討２）
　段階希釈したアルカリフォスファターゼ（シグマ－アルドリッチ社）と、１μＭの蛍光基質（ｓＴＧ－ｐｈｏｓ）を混合したアッセイ溶液を調製し、上述した流体デバイスＢの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を流体デバイスＢの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。
　続いて、流体デバイスの液体導入口から１－オクタノールを導入して封止剤を置換した。この結果、ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、内容物中のアルカリフォスファターゼとｓＴＧ－ｐｈｏｓが反応して蛍光物質（ｓＴＧ）が生成された。
　続いて、１－オクタノールの導入から２．５分後に、１－オクタノールを封止剤（製品名「フォンブリン（登録商標）オイル」、ソルベイ社）に置換した。この結果ウェルの内容物の脱水が停止した。続いて、ｓＴＧの蛍光を検出した。図１３は、ｓＴＧの蛍光を検出したウェルアレイの写真に基づいて、所定の蛍光強度（相対値）を示したウェルの割合（％）を示す代表的なグラフである。図１３中、グラフの横軸は、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の濃度を示す。
　その結果、約８０ａＭのアルカリフォスファターゼの存在を検出することができたことが明らかとなった。すなわち、流体デバイスＢを用いて、１－オクタノールを用いた脱水濃縮を行った場合の検出感度が約８０ａＭであることが明らかとなった。
　本発明によれば、標的物質を高感度に検出することができる技術を提供することができる。
　１００，１００’…３者複合体、１１０…Ｃａｓ１２ａタンパク質、１２０…ｇＲＮＡ、１３０…２者複合体、１４０…標的物質（標的核酸断片）、１５０…基質核酸断片、２００，３００…ウェルアレイ、２１０…基板、２２０…第１のウェル、２３０…第２のウェル、４００，４１０…膜、６００…流体デバイス、６１０…スペーサー、６２１…液体導入口、６２０…蓋部材、６３０…空間、７１０…アッセイ溶液、７２０…封止剤、７３０…吸水性の有機溶媒、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (9)

  1. 　試料中の標的物質の検出方法であって、
    　ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、及び、前記標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬を導入する工程と、
    　前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する工程と、
    　前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、前記内容物中に前記標的物質が存在する場合に前記蛍光物質が生成される工程と、
    　前記蛍光物質に励起光を照射し、発生する蛍光を前記ウェルアレイのウェルごとに検出する工程と、
    　を含み、前記ウェルで蛍光が検出されたことが、前記ウェルに前記標的物質が存在することを示す、方法。
  2. 　前記ウェルアレイの各ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、前記第１のウェルの内容物の容積が小さくなると、前記内容物が前記第２のウェルに集積する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第１のウェルと前記第２のウェルの容積の比（第１のウェルの容積：第２のウェルの容積）が、１０：１～１,０００,０００：１である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記第１のウェルの容積が１～１，０００ｐＬであり、前記第２のウェルの容積が０．１～１，０００ｆＬである、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　前記標的物質が、前記第１のウェル１つあたりに０個又は１個導入される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記封止液が、フッ素系液体、ミネラルオイル又は炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記吸水性の有機溶媒が、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有するウェルを複数備えたウェルアレイが表面に配置された基板と、
    　前記ウェルアレイに対向して配置された蓋部材と、
    　前記基板及び前記蓋部材との間を離間させるスペーサーと、を有し、
    　前記ウェルアレイと前記蓋部材との間の空間は流体が流れる流路を形成している、流体デバイス。
  9. 　請求項８に記載の流体デバイスと、標的物質が存在する場合に蛍光物質が生成される試薬と、封止液と、吸水性の有機溶媒とを含む、標的物質検出用キット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023195542A1 (ja) * 2022-04-08 2023-10-12 国立研究開発法人理化学研究所 複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキット

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004309405A (ja) 2003-04-10 2004-11-04 Univ Tokyo 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバ
WO2005023124A2 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Ovature Research Inc. Apparatus for handling cells, embryos or oocytes
JP2012529643A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 単一細胞または他の粒子の分析用ピコウェル捕捉装置
WO2017043530A1 (ja) * 2015-09-08 2017-03-16 凸版印刷株式会社 生体物質検出方法
JP2019066480A (ja) * 2012-05-25 2019-04-25 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル マイクロ流体デバイス、複数の反応ウェルを含むマイクロ流体デバイスへの試薬の提供方法および反応の遂行方法
JP2020169092A (ja) 2019-04-04 2020-10-15 花王株式会社 シート移送方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004309405A (ja) 2003-04-10 2004-11-04 Univ Tokyo 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバ
WO2005023124A2 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Ovature Research Inc. Apparatus for handling cells, embryos or oocytes
JP2012529643A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 単一細胞または他の粒子の分析用ピコウェル捕捉装置
JP2019066480A (ja) * 2012-05-25 2019-04-25 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル マイクロ流体デバイス、複数の反応ウェルを含むマイクロ流体デバイスへの試薬の提供方法および反応の遂行方法
WO2017043530A1 (ja) * 2015-09-08 2017-03-16 凸版印刷株式会社 生体物質検出方法
JP2020169092A (ja) 2019-04-04 2020-10-15 花王株式会社 シート移送方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. WP_081509150.1
"UniProtKB", Database accession no. A0A182DWE3
SAKAMOTO S. ET AL.: "Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples", SCI ADV., vol. 6, no. 11, 2020
SOLEIMANY A.P.BHATIA S.N.: "Activity-Based Diagnostics: An Emerging Paradigm for Disease Detection and Monitoring", TRENDS MOL MED, vol. 26, no. 5, 2020, pages 450 - 468, XP055791005, DOI: 10.1016/j.molmed.2020.01.013

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023195542A1 (ja) * 2022-04-08 2023-10-12 国立研究開発法人理化学研究所 複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキット

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