JPWO2020067122A1 - アルカリホスファターゼ組成物並びに脱リン酸化核酸及び標識化核酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
(XA/Y)×100≦4.4000 ・・・(A)
[式中、XAは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物を提供する。
Description
・配列番号5に記載のアミノ酸配列(ウシ由来のアルカリホスファターゼのアミノ酸配列)の501〜578位から選択された連続する5〜50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A)
・配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する13〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の516〜528位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B)
・配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する12〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の534〜545位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C)
・配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片
・配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片
・配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片
・配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A)の含有量の比率が、下記式(A):
(XA/Y)×100≦4.4000 ・・・(A)
[式中、XAは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。
[2]前記ペプチド断片群(A)が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片、及び、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種、3種又は4種のペプチド断片を含む、[1]に記載の組成物。
[3]前記ペプチド断片群(A)が、前記第1のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[2]に記載の組成物。
[4]前記ペプチド断片群(A)が、前記第2のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[2]又は[3]に記載の組成物。
[5]前記ペプチド断片群(A)が、前記第3のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[2]〜[4]のいずれか一つに記載の組成物。
[6]前記ペプチド断片群(A)が、前記第4のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[2]〜[5]のいずれか一つに記載の組成物。
[7]アルカリホスファターゼと、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する13〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の516〜528位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B)とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B)の含有量の比率が、下記式(B):
(XB/Y)×100≦3.4000 ・・・(B)
[式中、XBは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(B)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。
[8]前記ペプチド断片群(B)が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、及び、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[7]に記載の組成物。
[9]前記ペプチド断片群(B)が、前記第1のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[8]に記載の組成物。
[10]前記ペプチド断片群(B)が、前記第2のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[8]又は[9]に記載の組成物。
[11]アルカリホスファターゼと、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する12〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の534〜545位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C)とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C)の含有量の比率が、下記式(C):
(XC/Y)×100≦1.0000 ・・・(C)
[式中、XCは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(C)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。
[12]前記ペプチド断片群(C)が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片、及び、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[11]に記載の組成物。
[13]前記ペプチド断片群(C)が、前記第3のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[12]に記載の組成物。
[14]前記ペプチド断片群(C)が、前記第4のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[12]又は[13]に記載の組成物。
[15]アルカリホスファターゼと、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。
[16]前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[15]に記載の組成物。
[17]前記組成物が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[15]又は[16]に記載の組成物。
[18]前記組成物が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[15]〜[17]のいずれか一つに記載の組成物。
[19]アルカリホスファターゼと、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、前記組成物。
[20]前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[19]に記載の組成物。
[21]前記組成物が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[19]又は[20]に記載の組成物。
[22]アルカリホスファターゼと、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、前記組成物。
[23]前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[22]に記載の組成物。
[24]前記組成物が、2000U/mg以上のアルカリホスファターゼ比活性を有する、[1]〜[23]のいずれか一つに記載の組成物。
[25]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b):
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[1]〜[24]のいずれか一つに記載の組成物。
[26]前記組成物が、核酸をさらに含有する、[1]〜[25]のいずれか一つに記載の組成物。
[27]前記組成物が、前記核酸を脱リン酸化するための組成物である、[26]に記載の組成物。
[28]前記組成物が、脱リン酸化核酸をさらに含有する、[1]〜[25]のいずれか一つに記載の組成物。
[29]前記組成物が、前記脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である、[28]に記載の組成物。
[30]前記組成物が、脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸をさらに含有する、[1]〜[25]のいずれか一つに記載の組成物。
[31]前記組成物が、核酸検出法に供される核酸サンプルである、[30]に記載の組成物。
[32]前記核酸検出法が、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である、[31]に記載の組成物。
[33]以下の工程:
[1]〜[25]のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;及び
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。
[34]以下の工程:
[1]〜[25]のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;
標識物質を準備する工程;
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程;及び
前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法。
本発明の組成物は、アルカリホスファターゼを含有する。本発明の組成物は、1種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、2種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を含んでなるアルカリホスファターゼ;及び
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、本発明の組成物は、上記(a)及び(b)から選択される1種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、上記(a)及び(b)から選択された2種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。
第1態様に係る組成物は、ペプチド断片群(A)を含有する。ペプチド断片群(A)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(A)を構成する各ペプチド断片は、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する5〜50個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群(A)は、第1態様に係る組成物に含有されるペプチド断片のうち、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する5〜50個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。好ましい実施形態において、ペプチド断片群(A)は、3種以上のペプチド断片で構成される。さらに好ましい実施形態において、ペプチド断片群(A)は、4種以上のペプチド断片で構成される。
第2態様に係る組成物は、ペプチド断片群(B)を含有する。ペプチド断片群(B)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(B)を構成する各ペプチド断片は、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する13〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の516〜528位(VPLASETHGGEDV)を含む。ペプチド断片群(B)は、第2態様に係る組成物に含有されるペプチド断片のうち、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する13〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の516〜528位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
第3態様に係る組成物は、ペプチド断片群(C)を含有する。ペプチド断片群(C)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(C)を構成する各ペプチド断片は、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する12〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の534〜545位(GPQAHLVHGVQE)を含む。ペプチド断片群(C)は、第3態様に係る組成物に含有されるペプチド断片のうち、配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する12〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の534〜545位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
好ましい実施形態において、第1、第2、第3、第4、第5又は第6態様に係る組成物は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片を含有する。
第4態様に係る組成物は、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片を含有する。好ましい実施形態において、第4態様に係る組成物は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片、及び、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片をさらに含有する。この実施形態において、第4態様に係る組成物は、第1〜第4のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
第5態様に係る組成物は、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片を含有する。好ましい実施形態において、第5態様に係る組成物は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、及び、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片をさらに含有する。この実施形態において、第5態様に係る組成物は、第1〜第4のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
第6態様に係る組成物は、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片を含有する。好ましい実施形態において、第6態様に係る組成物は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、及び、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片をさらに含有する。この実施形態において、第6態様に係る組成物は、第1〜第4のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
第1態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(A)の含有量の比率は、下記式(A):
(XA/Y)×100≦4.4000 ・・・(A)
を満たす。
<装置構成>
質量分析計:maXis impact(Bruker Daltnics,Inc.製)
<質量分析条件>
イオン化方式:ESI
測定イオン:正イオン
キャピラリー電圧:4500V
ネブライザー:2.0bar
ドライガス:8.0L/分
検出器電圧:1823V
測定範囲(MS):m/z 50〜2200
<MS/MS条件>
測定範囲(MS):m/z 50〜2200
コリジョンガス:窒素
<装置構成>
液体クロマトグラフ:LC−30Aシステム(島津製作所製)
検出器:UV−Vis(190〜900nm、島津製作所製)
<液体クロマトグラフィー条件>
カラム:Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation製)カラムサイズ:2.1mm×100mm
カラム温度:50℃
移動相流速:0.2mL/分
移動相A:水/ギ酸混液(1000:1)
移動相B:アセトニトリル/水/ギ酸混液(900:100:1)
注入量:20μL
グラジエントプログラム:
第2態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(B)の含有量の比率は、下記式(B):
(XB/Y)×100≦3.4000 ・・・(B)
を満たす。
第3態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(C)の含有量の比率は、下記式(C):
(XC/Y)×100≦1.0000 ・・・(C)
を満たす。
第1、第2、第3、第4、第5又は第6態様に係る組成物が第1のペプチド断片を含有する実施形態では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
を満たすことが好ましい。
第4態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対する第2のペプチド断片の含有量の比率は、下記式(2):
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
を満たす。
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
を満たすことが好ましい。
第5態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対する第3のペプチド断片の含有量の比率は、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
を満たす。
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
を満たすことが好ましい。
第6態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対する第4のペプチド断片の含有量の比率は、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
を満たす。
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
を満たすことが好ましい。
本発明の組成物は、2000U/mg以上のアルカリホスファターゼ比活性を有することが好ましい。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、さらに好ましくは2500U/mg以上、さらに一層好ましくは3000U/mg以上である。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、次のようにして測定される。p−ニトロフェニルリン酸水溶液にアルカリホスファターゼを添加することで生成するp−ニトロフェノール由来の405nmの吸光度を測定することにより、アルカリホスファターゼの比活性を算出することができる。
本発明の組成物は、1種又は2種以上のその他の成分を含有することができる。その他の成分としては、例えば、水等の水性媒体、マグネシウム塩、ナトリウム塩等の金属塩、界面活性剤、有機酸、グリセリン等が挙げられる。
本発明の組成物は、ウシ、エビ等の臓器からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物の菌体破砕物、市販のアルカリホスファターゼ製品等から、ペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片を分離することにより製造することができる。ペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の分離方法としては、例えば、透析、塩析、ゲル濾過、限外濾過、膜分離、イオン交換、カラムクロマトグラフィー、電気泳動等が挙げられる。ペプチド断片の分離方法は、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品をカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の含有量を所望の範囲とすることができる。カラムクロマトグラフィーは、例えば、液体クロマトグラフィーである。液体クロマトグラフィーで使用されるカラム及び移動相は、ペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片を分離し得る限り特に限定されないが、C18が担持された逆相カラムを使用することが好ましい。
本発明の組成物は、アルカリホスファターゼ活性が求められる様々な方法に使用することができる。
本発明の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;及び
上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率を向上させることができる。
本発明の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;
標識物質を準備する工程;
上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程;及び
上記脱リン酸化核酸に上記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際、及び/又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群(A)、ペプチド断片群(B)、ペプチド断片群(C)、第2のペプチド断片、第3のペプチド断片又は第4のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率、及び/又は、脱リン酸化された核酸の標識化効率を向上させることができる。
実施例及び比較例で使用されたLC−MS/MS分析の条件は以下の通りである。
<装置構成>
質量分析計:maXis impact(Bruker Daltnics,Inc.製)
<質量分析条件>
イオン化方式:ESI
測定イオン:正イオン
キャピラリー電圧:4500V
ネブライザー:2.0bar
ドライガス:8.0L/分
検出器電圧:1823V
測定範囲(MS):m/z 50〜2200
<MS/MS条件>
測定範囲(MS):m/z 50〜2200
コリジョンガス:窒素
実施例及び比較例で使用されたLC−UV分析の条件は以下の通りである。
<装置構成>
液体クロマトグラフ:LC−30Aシステム(島津製作所製)
検出器:UV−Vis(190〜900nm、島津製作所製)
<液体クロマトグラフィー条件>
カラム:Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation製)カラムサイズ:2.1mm×100mm
カラム温度:50℃
移動相流速:0.2mL/分
移動相A:水/ギ酸混液(1000:1)
移動相B:アセトニトリル/水/ギ酸混液(900:100:1)
注入量:20μL
グラジエントプログラム:
実施例及び比較例で使用された核酸検出法は以下の通りである。
核酸検出法は、DNAチップ(DNAマイクロアレイ)を使用して行った。具体的には、東レ株式会社製の“3D−Gene” human miRNA oligo chip(miRBase release 21対応)を使用して行った。
5社から購入した8種類のアルカリホスファターゼ製品(以下「組成物C1」〜「組成物C8」という。)を、比較例1〜8のアルカリホスファターゼ組成物として使用した。組成物C1〜C8のそれぞれに含まれるアルカリホスファターゼは、ウシの腸管由来のアルカリホスファターゼである。組成物C1〜C8のそれぞれのアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物C1は2238U/mg、組成物C2は2492U/mg、組成物C3は2431U/mg、組成物C4は2519U/mg、組成物C5は2411U/mg、組成物C6は2552U/mg、組成物C7は2448U/mg、組成物C8は2490U/mgであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、p−ニトロフェニルリン酸を使用する方法で測定した。具体的には、以下の通りである。
溶液A:1M ジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)
溶液B:0.67M p−ニトロフェノールリン酸水溶液
溶液A 2.9mLと溶液B 0.1mLとをキュベット(光路長=1cm)に調製し、37℃で5分間加温した。次いで、アルカリホスファターゼ水溶液 0.1mLを添加し、分光光度計で405nm(37℃)の吸光度変化を3〜5分間測定し、単位時間あたりの吸光度変化を求めた(ΔOD)。対照としてアルカリホスファターゼ水溶液の代わりに水を添加したサンプルで吸光度変化を求めた(ΔODブランク)。下記式によりアルカリホスファターゼ活性(U/mL)を算出した。
アルカリホスファターゼ活性(U/mL)=(ΔOD−ΔODブランク)×3.1/(18.2×0.1×1.0)
図2は、比較例2において組成物C2のLC−MS/MS分析により得られた、第2のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図3は、比較例2において組成物C2のLC−MS/MS分析により得られた、第3のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図4は、比較例2において組成物C2のLC−MS/MS分析により得られた、第4のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
比較例2〜4及び8のアルカリホスファターゼ組成物(組成物C2〜C4及びC8)を以下の方法で精製して、実施例1〜4のアルカリホスファターゼ組成物(以下「組成物E1」〜「組成物E4」という。)を得た。精製方法は、以下の通りである。
組成物C2(30μL)を、透析カップ(カットオフ分子量3.5K)を使用して、透析バッファ(1mL,50mM Tris−HCl,2mM MgCl2,0.2mM ZnCl2)で3回透析処理し、濃縮液を回収した。
透析処理後の濃縮液をゲル濾過カラムを使用して、バッファ(2.5mL,10mM Tris−HCl,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,50mM KCl,55重量% グリセリン)で濾過回収した。
ゲル濾過後の回収液から、疎水カラムを使用して、下記条件でアルカリホスファターゼ画分を回収した。
移動相A:20mM リン酸水素二ナトリウム、3M 硫酸アンモニウム(50/50)
移動相B:20mM リン酸水素二ナトリウム
グラジエントプログラム:
回収したアルカリホスファターゼ画分を上記透析と同じ条件で3回透析処理し、濃縮液を回収した。
回収した濃縮液を、限外濾過カラム(カットオフ分子量10K)を使用して、バッファ(2.5mL,10mM Tris−HCl,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,50mM KCl,55重量% グリセリン)で濾過回収し、組成物E1を得た。
図6は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC−MS/MS分析により得られた、第2のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図7は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC−MS/MS分析により得られた、第3のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図8は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC−MS/MS分析により得られた、第4のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図9は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC−UV分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。なお、実施例2〜4及び比較例1〜8において各組成物のLC−UV分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムは、図9と同様であった。
Claims (14)
- アルカリホスファターゼと、
配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する5〜50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A)と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A)の含有量の比率が、下記式(A):
(XA/Y)×100≦4.4000 ・・・(A)
[式中、XAは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。 - アルカリホスファターゼと、
配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する13〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の516〜528位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B)と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B)の含有量の比率が、下記式(B):
(XB/Y)×100≦3.4000 ・・・(B)
[式中、XBは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(B)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。 - アルカリホスファターゼと、
配列番号5に記載のアミノ酸配列の501〜578位から選択された連続する12〜50個のアミノ酸残基からなり、配列番号5に記載のアミノ酸配列の534〜545位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C)と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C)の含有量の比率が、下記式(C):
(XC/Y)×100≦1.0000 ・・・(C)
[式中、XCは、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(C)のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。 - アルカリホスファターゼと、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦1.6000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記組成物のLC−UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす、前記組成物。 - 前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項4に記載の組成物。 - 前記組成物が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項4又は5に記載の組成物。 - 前記組成物が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項4〜6のいずれか一項に記載の組成物。 - アルカリホスファターゼと、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦0.2000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、前記組成物。 - 前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項8に記載の組成物。 - 前記組成物が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項8又は9に記載の組成物。 - アルカリホスファターゼと、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.3500 ・・・(4)
[式中、X4は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、前記組成物。 - 前記組成物が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記組成物のLC−MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、請求項11に記載の組成物。 - 以下の工程:
請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;及び
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。 - 以下の工程:
請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程;
核酸を準備する工程;
標識物質を準備する工程;
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程;及び
前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法。
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