CN103380213B

CN103380213B - 碱性磷酸酶

Info

Publication number: CN103380213B
Application number: CN201280009685.5A
Authority: CN
Inventors: 相场洋志; 岸本高英; 西矢芳昭
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2032-02-20
Also published as: JPWO2012115023A1; WO2012115023A1; CN103380213A; EP2679682A1; JP6065587B2; EP2679682A4; US9133446B2; EP2679682B1; US20140030790A1

Abstract

本发明提供具有高比活性、尤其期望对高灵敏度免疫测定中所通用的各种发光基质的反应性优异的AP。更优选提供除具有上述特性外还具有比CIAP更高的热稳定性的AP。碱性磷酸酶源自希瓦氏菌属（Shewanella）细菌且具有以下特性。（A）分子量：约104,000、（B）最佳反应pH值：约9.5、（C）稳定pH值范围：5.5～10.4、（D）热稳定性：65℃、（E）比活性：5,000U/mg以上。

Description

碱性磷酸酶

技术领域

本发明涉及源自细菌的碱性磷酸酶。

背景技术

碱性磷酸酶（EC3.1.3.1、以下也称为AP）已知是对水解磷酸单酯而产生醇和无机磷酸的反应起催化作用的酶，其在原核生物和真核生物中均广泛分布。AP除作为基因工程学用酶被利用外还作为酶免疫测定（EIA）法中的标记酶被广泛利用。现在，该EIA所用的AP大部分是来自牛小肠的AP（CIAP）。CIAP被珍视的理由之一在于其比活性高。市售的CIAP的比活性根据制造商、品级的不同而多种多样，但是在以对硝基苯基磷酸为基质的情况下，还存在高比活性型而超出6000U/mg-蛋白的情况。此外，基本骨架中包含1,2-二氧杂环丁烷或吖啶酮（acridone）的CIAP用各种高灵敏度发光基质也被大量出售，实现免疫测定的高测定灵敏度。

免疫测定的重要课题之一在于实现高灵敏度。作为用于实现高灵敏度的尝试，迄今利用增加每一分子抗原所吸附的标记酶的分子数并开发标记酶的高灵敏度基质的方法已越发取得进步。但是，目前的免疫诊断法的灵敏度未必会充分满足该要求，例如在基于免疫诊断的流感检测试剂盒中即便其结果会是阴性实际上也还是存在无法完全排除感染嫌疑的情况。根据测定对象的不同，检体中的浓度为1pM以下的情况并不少见，并且出于缩短诊断所需时间的目的，也可以说提高灵敏度是永恒的话题。

为了提高灵敏度，本领域技术人员通过以下方式来应对高灵敏度的需求，即，在迄今存在多种同工酶的CIAP中以纯化的过程分离高比活性的CIAP；或者，确定高比活性型CIAP的基因并将其重组生产，再通过引入对实现高比活性而言重要的部位特异性氨基酸变异而提高比活性等。另一方面，还没有从牛犊以外的供给源分离出具有比得上或超越于CIAP的高比活性的AP的实例。此外，通常AP的比活性以对标准的AP的基质即对硝基苯基磷酸的反应性为指标来进行评价。尤其期望对在实际的高灵敏度免疫测定法中使用的各种发光基质具有高反应性的AP，但是迄今从此类实用性观点出发，还并未已知从其他起源取得像CIAP这么优异的AP的实例。

CIAP还具有缺乏稳定性等问题。另一方面，源自以大肠杆菌为代表的细菌的AP比CIAP稳定性高，但是从比活性的观点出发，大幅低于CIAP。作为比活性较高的AP，例如非专利文献1和非专利文献2中报道了源自希瓦氏菌属的AP，但是比活性均不足2000U/mg。非专利文献1中记载的AP在产业上有用而被授予专利权（专利文献1），但这是由于该酶比源自大肠杆菌的AP热稳定性差而在基因工程学的用途中有用而提出的申请，对于作为免疫测定用标记酶的有用性的可能性还并未涉及。此外，专利文献2中记载了源自杆菌属（bacillus）的AP，但该酶的比活性为3000U/mg左右，也不充分，而且对1,2-二氧杂环丁烷系或吖啶酮系发光基质的反应性低，还称不上能够实用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3507890号公报

专利文献2：日本专利第4035738号公报

非专利文献

非专利文献1：BiosciBiotechnolBiochem.200569（2）p364-73.

非专利文献2：BiosciBiotechnolBiochem.200266（4）p754-61.

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供具有高比活性、尤其期望对高灵敏度免疫测定中所通用的各种发光基质的反应性优异的AP。更优选提供除具有上述特性外还具有比CIAP更高的热稳定性的AP。

用于解决问题的方案

本发明人等反复进行了深入研究，结果发现：源自希瓦氏菌属（Shewanella）细菌且具有与CIAP的高比活性型同工酶匹敌的比活性、并且尤其对AP用高灵敏度基质的反应性高的AP。此外，取得该AP的基因，并对将该基因转化而得的微生物进行培养，由此成功地重组生产AP，以至完成本发明。

即，本发明包含以下构成。

[1]一种碱性磷酸酶，其源自希瓦氏菌属（Shewanella）细菌，并且具有以下特性。

（A）分子量：约104,000

（B）最佳反应pH值：约9.5

（C）稳定pH值范围：5.5～10.4

（D）热稳定性：65℃

（E）比活性：5,000U/mg以上

[2]一种碱性磷酸酶，其为下述（A）～（C）中的任一者。

（A）包含具有序列号2所述的氨基酸序列的多肽而成的碱性磷酸酶；

（B）包含具有在序列号2所述的氨基酸序列中缺失、置换、插入或增添1个或多个氨基酸残基而成的序列的多肽的碱性磷酸酶；

（C）包含与序列号2所述的氨基酸序列具有85%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶。

[3]一种DNA，其为下述（A）～（C）中的任一者。

（A）包含序列号1所述的碱基序列的DNA；

（B）编码序列号2所述的氨基酸序列的DNA；

（C）在严格的条件下与序列号1所述的碱基序列杂交的DNA。

[4]一种重组载体，其包含[3]所述的DNA。

[5]一种转化体，其用[4]所述的质粒转化宿主细胞而成。

[6]根据[5]所述的转化体，其中，宿主细胞为大肠杆菌。

[7]一种[1]或[2]所述的碱性磷酸酶的制造方法，其包括以下步骤：对[5]或[6]所述的转化体进行培养，并从所得培养物中采集具有碱性磷酸酶活性的蛋白。

发明的效果

根据本发明，能够提供作为免疫测定的标记酶有用的碱性磷酸酶、以及能够以高灵敏度检测对象物质的碱性磷酸酶标记抗体。

附图说明

图1表示源自希瓦氏菌·SPT3-3株的AP的反应pH值和相对活性。

图2表示源自希瓦氏菌·SPT3-3株的AP在各pH值下的稳定性。

图3表示源自希瓦氏菌·SPT3-3株的AP和CIAP在各温度下的稳定性。

图4表示使用源自希瓦氏菌·SPT3-3株的AP标记抗人CRP抗体及重组人CRP而制成的夹心酶联免疫分析法（SandwichELISA）的标准曲线。

具体实施方式

本发明涉及具有高比活性而且对基本骨架包含1,2-二氧杂环丁烷或吖啶酮的发光基质的反应性高的碱性磷酸酶。本发明的AP具有以下特性。

（A）分子量：约104,000

（B）最佳反应pH值：约9.5

（C）pH值稳定性：5.5～10.4

（D）热稳定性：65℃

（E）比活性：5,000U/mg以上

本发明的AP的供给源只要具有上述特性，则没有特别的限定，优选源自细菌，特别优选源自希瓦氏菌属（Shewanella）。

本发明所述的分子量利用以下的方法进行测定。

将AP溶液50μL供于以50mM磷酸盐缓冲液（pH值6.9、还包含0.3M氯化钠和0.05%叠氮化钠）缓冲化的东曹（株）制造的TSK-GELG3000SW（7.5mm×300mm），使用该缓冲液以流速1ml/分钟进行洗脱。对280nm的吸光度进行监控，由该出峰位置确定洗脱时间，基于预先制作出的标准曲线算出分子量。

本发明所述的最佳反应pH值以包含活性测定时显示最高AP活性的pH值的pH值范围来定义。此时，活性测定条件中pH值以外的条件均按照活性测定例所示进行测定。

本发明所述pH值稳定性如下定义：在包含0.1mol/L的缓冲液成分和1mM氯化镁、0.1mM硫酸锌的溶液中溶解AP使蛋白量达到10μg/mL的浓度，将该溶液在25℃培养（incubate）24小时时，培养后的活性相对于培养前的活性的残存率。而且，pH值稳定性一项所示的pH值范围的数值表示在上述条件下显示出85%以上活性残存率的pH值范围。例如，pH值稳定性5.5～10.4是指：在pH值5.5～10.4的缓冲液中将AP培养24小时后，该AP与培养前相比保持至少85%的活性。换言之，是指：当在一定pH值下将AP培养24小时时，与培养前相比，培养后的AP的活性为85%以上的特定的pH值在pH值5.5～10.4之间。

本发明所述的热稳定性如下定义：在50mM三乙醇胺、1mM氯化镁、0.1mM硫酸锌（pH值7.0）中溶解AP使蛋白量达到0.01mg/mL的浓度，将该AP溶液加热60分钟时，加热后的AP活性相对于加热前的AP活性的残存率。而且，热稳定性一项所示的温度范围的数值表示在上述条件下显示85%以上的活性残存率的温度范围。例如65℃的热稳定性是指：将包含AP的溶液在65℃以下的温度培养30分钟后，该AP与加热前相比保持至少85%的活性。换言之，是指：当在一定温度下将AP培养30分钟时，与其培养之前相比，培养后的AP具有85%以上的活性的温度的上限为65℃。此外，活性的测定方法如后所述。

本发明所述的比活性利用后述的“蛋白的定量和比活性的计算例”记载的方法而求出。本发明的AP的比活性为至少5000U/mg以上，进一步优选为5500U/mg以上，最优选为6000U/mg以上。就公知的源自希瓦氏菌属的AP的比活性而言，据非专利文献1推定：源自SIB1株的AP在50℃的高温下为1880U/mg，在37℃时会更低。此外，非专利文献2中记载的株在作为最佳条件的70℃、pH值10.6下为1500U/mg，在37℃下为大约1200U/mg。从比活性的观点出发，本发明的AP凌驾于公知的源自希瓦氏菌属的AP之上，与这些AP明确地区分。

在本发明的优选方案中，本发明为包含具有序列号2所示氨基酸序列的多肽的碱性磷酸酶，或者为包含具有在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或增添1个或多个氨基酸残基而成的序列的多肽的碱性磷酸酶。该AP可以是从对作为来源的希瓦氏菌属细菌进行培养的培养液得到的AP，并且也可以是向与作为来源的细菌不同的宿主生物引入基因并使其表达而得到的AP。

在本发明的碱性磷酸酶包含在序列号2所示的氨基酸序列中置换、增添、缺失或插入1个以上氨基酸的多肽时，此类氨基酸的变异的数量、种类只要不对碱性磷酸酶活性、上述热稳定性、pH值稳定性、基质特异性等酶特性带来影响，则没有特别的限制。变异的具体数量优选为1～30个，更优选为1～15个，进一步优选为1～10个，更进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。

在本发明的碱性磷酸酶包含在序列号2所示的氨基酸序列中置换1个以上氨基酸的多肽时，该氨基酸的置换只要不损害碱性磷酸酶活性、上述酶特性，则没有特别的限制，优选利用类似的氨基酸进行置换。作为类似的氨基酸，可以列举出例如以下氨基酸。

芳香族氨基酸：Phe、Trp、Tyr

脂肪族氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val

极性氨基酸：Gln、Asn

碱性氨基酸：Lys、Arg、His

酸性氨基酸：Glu、Asp

具有羟基的氨基酸：Ser、Thr

此外，在本发明的优选方案中，本发明为包含与序列号2所示的氨基酸序列具有85%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶，更优选为包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶，更进一步优选包含与序列号2所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶，更进一步优选包含与序列号2所示的氨基酸序列具有98%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶，最优选包含与序列号2所示的氨基酸序列具有99%以上的同源性的多肽的碱性磷酸酶。

在此，“同源性”是指：在使用该技术领域中公知的数学公式对2个氨基酸序列进行比对（align）时，最佳的对比（alignment）（优选该公式是为了实现最佳的对比而考虑向序列的一方或两方引入缺口的公式）中，同一氨基酸残基相对于重叠的全部氨基酸残基的比例（%）。

作为用于确定氨基酸序列的同源性的公式，可举出例如Karlinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877（1993）中记载的公式[该公式被组入NBLAST和XBLASTPROGRAM（version2.0）（Altschuletal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402（1997））]。

在基于同源性计算公式NCBIBLAST（NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool）的氨基酸序列同源性检索中，与序列号2所示序列显示最高同源性的已知序列是由被注释为存在于腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）CN-32株基因组中的AP的ORF所推定的序列，其同源性为75%。即，并不存在与序列号2具有80%以上同源性的公知的AP。此外，与非专利文献1和2中记载的源自希瓦氏菌属的AP的序列的同源性分别为67%、70%，且这些AP如上述那样比活性具有3倍以上的差异，由此也可以将本发明的AP与公知的AP明确地区分。明确规定本发明的AP的基准之一是与该序列号2的同源性高，作为优选的同源性，具体而言，至少为85%以上、更优选为90%以上、更优选为95%以上、更进一步优选为98%以上、最优选为99%以上。

本发明的碱性磷酸酶可以通过从环境中取得能够产生该酶的微生物并对其进行培养而取得，并且还可以通过将编码该酶的基因导入其他宿主并使其表达而取得。

本发明的AP可以通过适当采用以下方法而取得，即（1）将产生该酶的细胞作为原料进行提取纯化的方法、（2）进行化学合成的方法、（3）由像利用基因重组技术表达AP那样操作而得的细胞进行纯化的方法、或者（4）使用无细胞转录/翻译体系由编码AP的核酸进行生化合成的方法等。

作为得到产生本发明的AP的天然细胞的方法，有例如以下所述的方法。首先，将大多希瓦氏菌属细菌喜好的生育环境、例如海洋中或海洋沿岸部的海水、砂、土等样品涂布于LB琼脂平板、M9葡萄糖平板之类的通用细菌培养用琼脂培养基上，在25℃～30℃左右的温度条件下进行培养，由此形成菌落。通过以AP活性为指标从所形成的菌落选拔AP产生细菌以及利用常法解析16SrRNA序列，从而可以采集产生本发明的AP的天然细胞。

从天然的AP产生细胞进行的AP分离纯化可以通过例如以下方式来进行。在适当的缓冲液中搅匀AP产生细胞，利用超声波处理、表面活性剂处理等得到细胞提取液，再适当组合在蛋白的分离纯化中常被利用的分离技术，由此可以纯化AP。作为这样的分离技术，可举出例如：盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度差的方法；透析、超滤、凝胶过滤、非变性聚丙烯酰胺电泳（PAGE）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）等利用分子量差的方法；离子交换色谱、羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法；亲和色谱等利用特异性亲和性的方法；反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法；等电点电泳等利用等电点差的方法等，但并不限于这些方法。

基于化学合成的AP的制造，例如可以通过使用肽合成机依据序列号2所示的氨基酸序列合成序列的全部或一部分来进行。肽合成法可以是例如固相合成法、液相合成法中的任一种。在使能够构成本发明的AP的部分肽或氨基酸与残余部分缩合且产物包含保护基的情况下，通过脱离保护基，从而可以制造目标蛋白。在此，缩合、保护基的脱离可以按照本身公知的方法、例如以下的（1）和（2）中记载的方法来进行。

（1）M.BodanszkyandM.A.Ondetti,PeptideSynthesis,IntersciencePublishers,NewYork（1966）

（2）SchroederandLuebke,ThePeptide,AcademicPress,NewYork（1965）

如此得到的本发明的AP可以利用公知的纯化法进行纯化分离。在此，作为纯化法，可举出例如溶剂提取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶、它们的组合等。

在由上述方法得到的AP为游离体的情况下，可以利用公知的方法或基于公知方法的方法将该游离体变换为适当的盐，相反在以盐的形式得到蛋白的情况下，可以利用公知的方法或者基于公知方法的方法将该盐变换为游离体或其他盐。

本发明的AP优选通过以下方式来制造，即，对编码该蛋白的核酸进行克隆（或化学合成），从包含担载该核酸的表达载体的转化体的培养物进行分离纯化，由此可以制造本发明的AP。

酶基因的克隆通常利用以下方法来进行。首先，从产生所需酶的细胞或组织完全或部分纯化该酶，使用埃德曼（Edman）法、质谱分析等确认该N末端氨基酸序列。此外，用对肽进行序列特异性切断的蛋白酶、化学物质使该酶部分分解，同样利用埃德曼法、质谱分析确定所得寡肽的氨基酸序列。合成具有与所确定的部分氨基酸序列对应的碱基序列的寡核苷酸，将其用作探针，依据由产生该酶的细胞或组织调制出的cDNA或基因组DNA文库，利用菌落（或噬斑（plaque））杂交法对编码该酶的DNA进行克隆。或者也可以如下进行酶基因的克隆，即，以被完全或部分纯化的酶的全部或一部分作为抗原，按照常法制作该酶的抗体，依据由产生该酶的细胞或组织调制出的cDNA或基因组DNA文库，利用抗体筛选法对编码该酶的DNA进行克隆。

在与目标酶的酶学性质类似的酶的基因为公知的情况下，例如可以如下进行酶基因的克隆，即，登录NCBIBLAST的主页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），对与该公知基因的碱基序列具有同源性的序列进行检索，依据适合的碱基序列按照上述方式制作探针，利用菌落（或噬斑）杂交法对编码该酶的DNA进行克隆。

此外，还可以依据适合的碱基序列，以适当的寡核苷酸作为引物来合成，并使用由产生AP的细胞调制出的基因组DNA级分或者全部RNA或mRNA级分作为模板，利用聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，以下简称“PCR法”）或逆转录PCR（ReverseTranscriptase-PCR，以下简称为“RT-PCR法”）进行直接扩增。

按上述方式得到的DNA的碱基序列可以使用化学测序法（Maxam-Gilbertmethod）、双脱氧链末端终止法等公知序列技术来确定。

编码本发明的AP的基因只要是使所表达的蛋白满足上述特性的AP，则没有特别的限定，优选的方案为以下的DNA。即，具有编码序列号2所示氨基酸的碱基序列的DNA，作为更具体的一个实例，为包含序列号1所示碱基序列的DNA。此外，该DNA只要使所表达的AP的特性与本申请记载的特性同等或其以上，则可以在序列号1所示碱基序列中置换、缺失、增添或插入1个或多个碱基。在其他方案中，该DNA可举出包含在严格条件下与具有序列号1所示碱基序列的DNA杂交的DNA、且编码与包含上述序列号2所示氨基酸序列的多肽具有同样性质的多肽的核酸等。作为在严格条件下与序列号1所示碱基序列杂交的核酸，例如使用包含与序列号1所示碱基序列具有60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、特别优选90%以上、最优选95%以上的同源性的碱基序列的核酸等。

本说明书的碱基序列的同源性可以使用同源性计算公式NCBIBLAST（NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool）并在以下条件（期待值＝10；允许缺口；过滤＝ON；配对数＝1；错配数＝-3）下进行计算。

杂交可以按照本身公知的方法或基于公知方法的方法、例如MolecularCloning，第2版（J.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLab.Press,1989）中记载的方法等来进行。此外，在使用市售的文库的情况下，杂交可以按照添附的使用说明书中记载的方法来进行。杂交优选按照严格的条件来进行。

上述“严格的条件”是指：仅与序列号1所示碱基序列具有同等的转录终结区域功能的碱基序列和与序列号1互补的碱基序列形成杂交体（所谓的特异性杂交体），不具有同等功能的碱基序列不和与序列号1互补的碱基序列形成杂交体（所谓的非特异性杂交体）的条件。本领域技术人员可以通过改变杂交反应和清洗时的温度、杂交反应液和清洗液的盐浓度等而容易地选择此类条件。具体而言，作为本发明的严格的条件的一个实例，可举出6×SSC（0.9MNaCl，0.09M柠檬酸三钠）或6×SSPE（3MNaCl，0.2MNaH₂PO₄，20mMEDTA）·2Na，pH值7.4）中在42℃下进行杂交、并在42℃下利用0.5×SSC进行清洗的条件，但并不限定于此。

该严格的条件优选为严格性强（highstringent）的条件。严格性强的条件是指例如以相当于0.1×SSC及0.1%SDS的盐浓度在60℃下进行清洗的条件。

编码本发明的AP的DNA也可以如上述那样利用希瓦氏菌属细菌的基因组DNA或RNA（cDNA）取得；也可以化学合成DNA链，或者通过利用PCR法将合成的部分重叠的寡DNA短链连接而构建编码AP全长的DNA。通过化学合成、或者化学合成与PCR法的组合来构建全长DNA的优点在于：能够对应导入该基因的宿主而设计基因全长的使用密码子这一点。编码同一氨基酸的多个密码子并非均匀地使用，其使用频率根据生物种的不同而不同。在一般的生物种中高表达的基因所含的密码子大量包含该生物种中使用频率高的密码子，反之，表达量低的基因由于使用频率低的密码子的存在成为“瓶颈（bottleneck）”而妨碍高表达的实例并不少见。迄今报道了大量在异种基因的表达时通过将该基因序列置换成宿主生物中使用频率高的密码子来增大该异种蛋白表达量的实例，这种使用密码子的改变被期待对异种基因表达量的增大具有效果。

基于上述理由，编码本发明的AP的DNA理想的是改变为对导入该DNA的宿主细胞更适合的密码子（即该宿主中使用频率高的密码子）。各宿主的密码子使用频率以在该宿主生物的基因组序列上存在的全部基因中各密码子的使用比例来定义，例如以每1000个密码子的使用次数来表示。此外，在遇到未解明全部基因组序列的生物时，密码子使用频率也可以由代表性的多个基因的序列近似地算出。将要重组的宿主生物中的密码子使用频率的数据，例如可以使用KazusaDNAResearchInstitute的主页（http://www.kazusa.or.jp）所公开的遗传暗号使用频率数据库，或者可以参照记载有各生物的密码子使用频率的文献，或者自行确定所使用的宿主生物的密码子使用频率数据。此外，还可以参照所获得的数据和想要引入的基因序列，将基因序列中使用的密码子中在宿主生物中使用频率低的基因置换成编码同一氨基酸且使用频率高的密码子。

引入编码本发明的AP的DNA的宿主细胞只要是如后述那样确立重组表达体系的宿主细胞，则没有特别的限制，优选举出大肠杆菌、枯草菌等细菌、放线菌、曲菌、酵母之类的微生物宿主以及昆虫细胞、动物细胞、高等植物等，更优选举出大肠杆菌（例如K12株、B株等）。作为大肠杆菌中使用频率高的密码子，例如在K12株的情况下，Gly可举出GGT或GGC；Glu可举出GAA；Asp可举出GAT；Val可举出GTG；Ala可举出GCG；Arg可举出CGT或CGC；Ser可举出AGC；Lys可举出AAA；Ile可举出ATT或ATC；Thr可举出ACC；Leu可举出CTG；Gln可举出CAG；Pro可举出CCG等。

作为编码如此置换成在宿主中使用频率高的密码子的AP的DNA，可举出例如将编码源自希瓦氏菌属细菌的AP的DNA置换成编码与该AP相同的氨基酸序列且在大肠杆菌K12株中使用频率高的密码子的DNA。

本发明还提供包含编码本发明的AP的DNA的重组载体。本发明的重组载体只要是能够在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞内保持复制或自主复制（autonomousreplication）的重组载体，则没有特别的限定，包含质粒载体、病毒载体等。该重组载体可以如下调制，即，使用适当的限制酶和连接酶、或根据需要再加上连接子或接头DNA，将编码上述AP的DNA简便地连结到该技术领域中能够获得的公知的克隆载体或表达载体上。此外，如果使用像Taq聚合酶那样在扩增末端增添一个碱基之类的DNA聚合酶而扩增制得的基因片断，则利用TA克隆也能连接到载体上。

就载体而言，作为源自大肠杆菌的质粒，可举出例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pBluescriptSK（-）、pBluescriptKS（＋）等；作为源自酵母的质粒，可举出例如pSH19、pSH15等；作为源自枯草菌的质粒，可举出例如pUB110、pTP5、pC194等。此外，作为病毒，可例示出λ噬菌体等噬菌体；SV40、牛乳头状瘤病毒（BPV）等乳头瘤病毒；莫洛尼鼠白血病病毒（MoMuLV）等反转录病毒；腺病毒（AdV）、腺伴随病毒（AAV）、痘苗病毒、杆状病毒等动物和昆虫的病毒。

尤其，本发明提供配置有在目标宿主细胞内在功能性启动子的控制下编码AP的DNA的AP表达载体。作为所使用的载体，只要是在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞内发挥功能，含有能控制配置于其下游的基因的转录的启动子区域（例如，在宿主为大肠杆菌时，为trp启动子、lac启动子、lecA启动子等；在宿主为枯草菌时，为SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等；在宿主为酵母时，为PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等；在宿主为哺乳动物细胞时，为源自SV40的初期启动子、源自MoMuLV的长末端重复序列、源自腺病毒的初期启动子等病毒启动子）和该基因的转录终结信号、即终止子区域，且该启动子区域和该终止子区域介由包含至少1个限制酶识别部位、优选仅在该位置切断该载体的独特的限制部位的序列被连结的载体，则没有特别的限制，优选进一步含有用于选择转化体的选择标记基因（赋予对四环素、氨苄西林、卡那霉素、潮霉素、草胺膦等药剂的抗药性的基因、与营养要求性变异互补的基因等）。进而，在所插入的编码AP的DNA不含起始密码子和终止密码子时，优选使用分别在启动子区域的下游和终止子区域的上游包含起始密码子（ATG或GTG）和终止密码子（TAG、TGA、TAA）的载体。

在使用细菌作为宿主细胞时，通常表达载体除需包含上述的启动子区域和终止子区域之外，还需要包含能够在宿主细胞内自主复制的能够复制的单元。此外，启动子区域在启动子的附近包含操纵子和Shine-Dalgarno（SD）序列。

在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，表达载体优选进一步包含增强子序列、APmRNA的5’测和3’测的非翻译区域、聚腺苷酸化部位等。

作为引入所制成的重组载体的宿主生物，可举出重组表达体系已确立的大肠杆菌、枯草菌等细菌、放线菌、曲菌、酵母之类的微生物宿主以及昆虫细胞、动物细胞、高等植物等，其中，优选使用蛋白表达能力优异的大肠杆菌。作为引入重组质粒的方法，除了利用电穿孔引入重组质粒外，只要是利用氯化钙等药品处理而活化的宿主，则也可以利用热激引入重组质粒。对于目标重组质粒有无移入到宿主载体的选择，可以检索同时表达以保持目标DNA的载体的各种药剂耐性基因为代表的标记和AP活性的微生物，例如可以选择在基于药剂耐性标记的选择性培养基中生长且表达AP的微生物。

本发明的AP可以如下制造，即，将包含如上述那样调制的AP表达载体的转化体在培养基中进行培养，从所得培养物中回收AP，由此制造本发明的AP。

所使用的培养基优选含有宿主细胞（转化体）的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，例示出例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等；作为无机氮源或有机氮源，例示出例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、豆饼、马铃薯提取液等。此外，也可以根据需要含有其他营养素〔例如无机盐（例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁）、维生素类，抗生素（例如四环素、新霉素、氨苄西林、卡那霉素等）等〕。

培养利用该领域已知的方法来进行。下述例示出与宿主细胞对应使用的具体的培养基和培养条件，但是本发明的培养条件并不受这些培养条件的任何限定。

在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌等时，例如含有上述营养源的液体培养基较为适合。优选pH值为5～9的培养基。在宿主为大肠杆菌时，作为优选的培养基，例示出LB培养基、M9培养基[Miller.J.,Exp.Mol.Genet,p.431,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork（1972）]等。培养可以根据需要边通气、搅拌边在通常14～43℃下进行约3～72小时。在宿主为枯草菌时，可以根据需要边通气、搅拌边在通常30～40℃下进行约16～96小时。在宿主为酵母时，作为培养基，可举出例如Burkholder最少培养基[Bostian.K.L.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505（1980）]，理想的是使pH值为5～8。培养在通常约20～35℃下进行约14～144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。

在宿主为动物细胞时，作为培养基，可以使用例如含有约5～20%的胎牛血清的最少必需培养基（MEM）[Science，122，501（1952）]、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）[Virology，8，396（1959）]、RPMI1640培养基[J.Am.Med.Assoc.,199,519（1967）]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1（1950）]等。可以在这些培养基中添加用于稳定AP的金属盐，作为此类金属盐，优选使用镁盐和/或锌盐。这些金属盐只要在对所培养的细胞不显示毒性的范围内进行设定即可，在镁盐时，例示出终浓度0.001mM～10mM为优选的添加量范围，在锌盐时，例示出终浓度0.001mM～1mM为优选的添加量范围，但并不限于该范围。培养基的pH值优选为约6～8，培养在通常约30～40℃下进行约15～72小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。

在宿主为昆虫细胞时，作为培养基，可举出例如含有胎牛血清的Grace’s培养基[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,8404（1985）]等，其pH值优选为约5～8。培养在通常约20～40℃下进行15～100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。

AP的纯化可以根据存在AP活性的级分通过适当组合通常使用的各种分离技术来进行。

培养物的培养基中存在的AP可以如下得到，即，对培养物进行离心或过滤而得到培养上清（滤液），通过适当选择进行例如盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、非变性PAGE、SDS-PAGE、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、亲和色谱、反相高效液相色谱、等电点电泳等公知的分离方法，从而可以从该培养上清得到AP。

另一方面，细胞质中存在的AP可以如下地进行分离纯化，即，对培养物进行离心或过滤，收集细胞，将其悬浮于适当的缓冲液中，利用例如超声波处理、溶菌酶处理、冻融、渗压震扰、和/或Triton-X100等表面活性剂处理等，将细胞和细胞器膜破碎（溶解）后，利用离心分离、过滤等去除碎片，得到可溶性级分，利用与上述同样的方法对该可溶性级分进行处理，由此可以分离纯化细胞质中存在的AP。

作为迅速且简便地取得重组AP的手段，优选例示出以下方法，即，在AP的编码序列的某一部分（优选N或C末端）利用基因操作增添编码能够吸附于金属离子螯合物的氨基酸序列（例如包含组氨酸、精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的序列，优选包含组氨酸的序列）的DNA序列，使其在宿主细胞中表达，并利用与固定化该金属离子螯合物的载体的亲和力，从该细胞的培养物的AP活性级分分离回收AP。编码能够吸附于金属离子螯合物的氨基酸序列的DNA序列可以如下引入，即，例如在对编码AP的DNA进行克隆的过程中，使用在编码AP的C末端氨基酸序列的碱基序列上连结有该DNA序列的杂交体引物进行PCR扩增，或者向终止密码子之前包含该DNA序列的表达载体中符合读框（inframe）地插入编码AP的DNA，由此可以在AP编码序列中引入该DNA。此外，纯化中使用的金属离子螯合物吸附体可以如下调制，即，使含有过渡金属、例如钴、铜、镍、铁的二价离子、或铁、铝的三价离子等、优选钴或镍的二价离子的溶液与附着有配体、例如亚氨基二乙酸（IDA）基、次氮基三乙酸（NTA）基、三（羧甲基）乙二胺（TED）基等的基质接触，并与该配体结合，由此调制出该吸附体。螯合物吸附体的基质部只要是通常的不溶性载体，则没有特别的限定。

或者，也可以使用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、HA、FLAG肽等作为标记物（tag）来进行亲和纯化。

上述纯化工序中，也可以根据需要进行膜浓缩、减压浓缩、添加活化剂及稳定剂等处理。作为在这些工序中使用的溶剂，没有特别的限定，优选在pH值6～9左右的范围内具有缓冲能力的K-磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸盐缓冲液、GOOD的缓冲液等所代表的各种缓冲液。此外，为了担保该AP的稳定性，可以在这些缓冲液中添加金属盐，作为此类金属盐，优选使用镁盐和/或锌盐。这些金属盐只要在对AP的稳定化奏效的范围内进行设定即可，在镁盐时，例示出终浓度0.001mM～10mM为优选的添加量的范围，在锌盐时，例示出终浓度0.001mM～1mM为优选的添加量的范围，但并不限于该范围。

在如此得到的AP为游离体时，可以利用本身公知的方法或者基于公知方法的方法将该游离体变换为盐，在以盐的形式得到该蛋白时，可以利用本身公知的方法或基于公知方法的方法将该盐变换为游离体或其他盐。

纯化酶还可以以液态供于产业利用，也可以进行粉末化或进一步造粒。液态酶的粉末化通过利用常规方法进行冷冻干燥而完成。

进而，本发明的AP可以如下合成，即，以与编码该AP的DNA对应的RNA为模板，使用包含兔网状红血球裂解物、小麦胚芽裂解物、大肠杆菌裂解物等无细胞蛋白翻译体系，进行体外翻译，由此也可以合成该AP。

编码本发明的AP的RNA可以如下取得，即，使用常规方法从表达该RNA的宿主细胞纯化编码本发明的AP的mRNA，或者以编码AP的DNA为模板，使用包含RNA聚合酶的无细胞转录体系，调制cRNA，由此可以取得该RNA。无细胞蛋白转录/翻译体系也可以使用市售的产品，还可以按照其本身已知的方法来调制，具体而言，大肠杆菌提取液也可以依据PrattJ.M.etal.,“TranscriptionandTranlation”，HamesB.D.andHigginsS.J.eds.,IRLPress,Oxford179-209（1984）中记载的方法等来调制。作为市售的细胞裂解物，源自大肠杆菌的细胞裂解物可举出E.coliS30extractsystem（Promega公司制造）、RTS500RapidTranlationSystem（Roche公司制造）等；源自兔网状红血球的细胞裂解物可举出RabbitReticulocyteLysateSystem（Promega公司制造）等；进而源自小麦胚芽的细胞裂解物可举出PROTEIOSTM（TOYOBO公司制造）等。其中，优选使用小麦胚芽裂解物。作为小麦胚芽裂解物的制作法，可以使用例如JohnstonF.B.etal.,Nature,179:160-161（1957）或EricksonA.H.etal.,Meth.Enzymol.,96:38-50（1996）等中记载的方法。

作为用于蛋白合成的系统或装置，可举出间歇法[上述Pratt,J.M.etal.（1984）]；将氨基酸、能源等连续地供给到反应体系的连续式无细胞蛋白合成系统[SpirinA.S.etal.,Science,242:1162-1164（1988）]；透析法（Kigawaetal.,第21次日本分子生物学会，WID6）；或者复层法（PROTEIOSTMWheatgermcell-freeproteinsynthesiscorekit使用说明书；TOYOBO公司制造）等。进而，也可以使用在需要时向合成反应体系供给模板RNA、氨基酸、能源等，并在需要时排出合成物、分解物的方法（日本特开2000-333673）等。

此外，本发明的其他方案是利用上述的碱性磷酸酶标记出的轭合物（conjugate），作为标记对象的物质适合选择例如核酸探针、生物素等生物体物质、多肽·亲和素·抗体等蛋白等等。标记的方法可以应用马来酰亚胺法、吡啶基二硫醚法、戊二醛法、并且使本发明的AP在真核宿主中表达时利用AP表面的糖链的高碘酸法等各种方法，并且根据标记对象物质、所用官能团、使用目的等而分开使用。在ELISA、免疫诊断试剂中使用的AP标记抗体·AP标记抗原的制作方法以及使用其的免疫测定的方法详见“超高灵敏度酶免疫测定法”（石川荣治著、学会出版中心刊发）等。

就典型的免疫测定方法的一个实例而言，首先，添加包含作为测定对象的物质的一次抗体的溶液并进行培养，由此使其吸附于固相。该固相可以是作为反应层使用的容器，并且也可以是与反应层分开准备的磁性珠等。吸附一次抗体后，去除溶液，用清洗缓冲液进行数次淋洗，去除非吸附物质。清洗缓冲液能够利用在能使抗体稳定存在的中性附近的pH值范围具有缓冲能力的清洗缓冲液能，并且为了提高清洗能力也可以含有表面活性剂。清洗后的固相还被浸渍于包含牛血清白蛋白、不活化型AP等蛋白的液体，并通过培养来进行封闭。封闭后的固相用上述的清洗缓冲液清洗后，与作为测定对象的样品接触，培养一定时间，由此使测定对象物吸附于一次抗体。完全去除样品溶液，用上述清洗缓冲液清洗后，添加包含AP标记二次抗体的溶液，培养一定时间，由此使AP标记二次抗体吸附于被固相上的一次抗体所捕捉到的测定对象物上。完全去除溶液，用上述清洗缓冲液清洗后，添加AP的基质，测定活性。作为AP的基质，在活性的检测方法为比色法时，可以利用对硝基苯基磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸；在活性的检测方法为荧光法时，可以利用4-甲基伞形酮磷酸；在活性的检测方法为发光法时，可以利用包含1,2-二氧杂环丁烷系或吖啶酮系发光基质的各种发光基质。其中，本发明的AP尤其对发光基质的反应性优异，更优选选择使用其的方法。作为发光基质，可举出例如AMPPD、CSPD、CDP-star、LumigenPPD、Lumi-Phos530、APS-5等，但并不限于此。由预先使用测定对象物质的标准液制作的标准曲线对测定对象物质进行定量。

典型的免疫测定试剂的构成的一个实例包括：将反应层、一次抗体固定化，并且用血清白蛋白、不活化型AP等蛋白封闭的固相；作为测定对象的抗原的标准液；标记有AP的二次抗体；在反应层中使样品、二次抗体反应后用于清洗的清洗液；AP的基质溶液；使用指南。作为AP的基质，在活性的检测方法为比色法时，可以利用对硝基苯基磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸；在活性的检测方法为荧光法时，可以利用4-甲基伞形酮磷酸；在活性的检测方法为发光法时，可以利用包含1,2-二氧杂环丁烷系或吖啶酮系发光基质的各种发光基质。这些之中，本发明的AP尤其对发光基质的反应性优异，更优选选择使用其的方法。作为发光基质，可举出例如AMPPD、CSPD、CDP-star、LumigenPPD、Lumi-Phos530、APS-5等，但并不限于此。

活性测定例

只要无特别说明，本发明所述的AP活性利用以下方法来测定。

首先，调制下述的溶液A、B。

A：1M二乙醇胺缓冲液（pH值9.8）

B：0.67M对硝基苯基磷酸（溶解于溶液A）

在比色皿（光路长度＝1.0cm）调制溶液A2.9ml和溶液B0.1ml，在37℃预加热5分钟。添加AP溶液0.1ml，慢慢地混和，以水为对照用控制在37℃的分光光度计记录3～5分钟的405nm的吸光度变化，从其直线部分求出每1分钟的吸光度变化（ΔODTEST）。对于盲检，代替酶而添加溶解有酶的缓冲液0.1ml，同样地求出每1分钟的吸光度变化（ΔODBLANK）。使用这些值，根据下述式求出AP活性。

AP活性（U/ml）＝{（ΔODTEST-ΔODBLANK）×3.1}/{18.2×1.0×0.1}

3.1：AP溶液添加后的反应液量（ml）

18.2：上述测定条件下的对硝基苯酚的毫摩尔分子吸光系数（cm²/μmol）

1.0：光路长度（cm）

0.1：酶溶液的添加量（ml）

蛋白的定量和比活性的计算例

本发明所述的蛋白量是通过测定280nm的吸光度而测得的蛋白量。即，用蒸馏水稀释酶溶液以使280nm下的吸光度在0.1～1.0的范围，采用以蒸馏水进行零点校正的吸光度计，测定280nm的吸光度（Abs）。本发明所述的蛋白浓度近似为1Abs≈1mg/ml并以吸光度的测定值和测定的溶液的稀释倍率的乘积的值来表示。此外，本发明所述的比活性为与基于本测定方法的蛋白量1mg对应的AP的活性（U/mg），此时的AP活性是通过按照上述活性测定例进行测定而得的值。

以下，具体示出本发明的实施例，但本发明不受以下实施例的限定。

实施例1

AP产生菌株的取得

将从日本福井县敦贺市的敦贺湾沿岸采集的海中土砂样品涂布于包含50μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（BCIP）的LB琼脂培养基（pH值7.5）上，在25℃进行培养。在形成于培养基上的菌落中，对因BCIP的磷酸酯水解而呈蓝色的菌落进行纯化。对于该菌株，使用日本药典“基于基因解析的微生物的迅速鉴定法”中记载的10F/800R的各引物，利用菌落直接PCR扩增构成16SrRNA序列的DNA区域的一部分。用NCBI-BLAST对该序列进行检索，结果推定为属于希瓦氏菌属的细菌，因此将该菌株命名为Shewanellasp.T3-3株。

实施例2

AP基因的克隆

将Shewanellasp.T3-3株接种到试管中的5mlLB培养基中，在30℃振荡培养24小时。将培养液置于1.5ml容量的微量离心管，用冷却离心机以12000rpm离心5分钟，吸引去除上清，由此得到菌体。使用基因组DNA提取试剂盒（TOYOBO制造、NPK-1），按照该试剂盒附带的指南从该菌体取得基因组DNA。用限制酶BamHI或BglII使该基因组DNA消化，使用DNA纯化试剂盒（TOYOBO制造、NPK-6）进行纯化，去除限制酶。将该DNA片断与用BamHI消化并纯化后的pBR322混合，加入与混合液等量的结扎液（TOYOBO制造、LigationHigh），在16℃培养一夜。将该结扎溶液添加到大肠杆菌JM109株感受态细胞（TOYOBO制造、CompetentHighJM109），利用热激对质粒进行转化，由此制作T3-3株的基因组DNA文库。向包含50μg/ml的BCIP和100μg/ml的氨苄西林的LB琼脂培养基中接种该文库，在30℃下进行培养，使其形成转化菌落。用牙签沾取所形成的菌落中呈现蓝色的菌落，接种到试管中的5mlLB培养基（包含100μg/ml的氨苄西林）中，在30℃下振荡培养16小时。使用质粒提取试剂盒（TOYOBO制造、NPK-3）从该培养液中提取包含源自T3-3株的AP基因的质粒（pBRT3-3LPP），并进行纯化。所得质粒具有约6kb的插入片断，对该序列进行序列解析，由此确定AP基因全长和其相邻区域的序列。将确定的AP基因的碱基序列表示为序列号1，并且由该碱基序列推定的氨基酸序列表示为序列号2。

实施例3

大肠杆菌宿主中的AP的表达

按照覆盖包含AP基因全长以及T3-3株AP基因的启动子区域的序列、且在各个5‘末端部具有BamHI位点的方式制作引物（序列号3、4），使用该引物以质粒（pBRT3-3LPP）为模板进行PCR。扩增的DNA片断供于包含1%琼脂糖的TAE凝胶，进行电泳，边照射UV边切割扩增片断的扩增带，使用DNA纯化试剂盒（NPK-6）从凝胶提取和纯化DNA。用限制酶BamHI消化该基因组DNA片断，并结扎到被该限制酶处理过的pBluescprSK（-）上，由此制作表达质粒（pBST3-3LPP1）。利用电穿孔将结扎后的质粒引入大肠杆菌C600株，涂布于包含100μg/ml的氨苄西林的LB琼脂培养基上，在30℃培养一夜，由此形成转化菌落。用一个铂环将该转化菌落接种到500ml容量的坂口烧瓶中的60mlLB培养基（包含100μg/ml的氨苄西林）中，在30℃下以180rpm振荡培养一夜。将全部量的该培养液全量投入10L容量的发酵罐中的6L生产培养基（1.2%胨、2.4%酵母提取物、0.1%NaCl、0.1mM硫酸锌、100μg/ml的氨苄西林、pH值7.0）中，在通气量2L/分钟、搅拌380rpm、温度30℃下搅拌通气培养48小时。由此产生800U/ml的AP。

实施例4

大肠杆菌重组AP的纯化

将实施例3中得到的培养液分注到500ml容量的离心管中，用高速冷却离心装置以8000rpm离心30分钟，倾析去除上清，由此得到菌体。将菌体悬浮于1.5L的20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5），利用弗氏压碎破碎机以压力80MPa进行破碎。向破碎液中添加相对于破碎液为3%的5%（w/v）聚乙烯亚胺，用高速冷却离心装置以8000rpm离心30分钟来沉降去除所生成的固体成分。使0.15饱和硫酸铵溶解于该溶液中，用高速冷却离心装置以8000rpm离心30分钟，由此去除所产生的固体成分。进而，追加溶解硫酸铵使溶解终浓度为0.55并达到饱和，用高速冷却离心装置以8000rpm离心30分钟，倾析去除上清，得到包含AP的沉淀。对该沉淀加入90ml的20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5、且包含1mM的氯化镁），使其溶解。使用以20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5、且包含1mM的氯化镁）缓冲化的G-25琼脂糖凝胶（GEHEALTHCARE制造），对该溶液进行脱盐。使该溶液吸附于以20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5、且包含1mM的氯化镁）缓冲化的DEAE琼脂糖凝胶（GEHEALTHCARE制造）上，用该缓冲液将NaCl浓度提高至0.5M，由此进行梯度洗脱。收集具有AP活性的级分，溶解硫酸铵使其达到0.05饱和。将该溶液供于以20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5、且包含0.05饱和的硫酸铵和1mM的氯化镁）缓冲化的辛基琼脂糖凝胶（GEHEALTHCARE制造），持续通入该缓冲液，回收非吸附级分。向该溶液中追加溶解硫酸铵使达到终浓度0.2饱和，供于以20mMTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.5、且包含0.2饱和的硫酸铵和1mM的氯化镁）缓冲化的苯基琼脂糖凝胶（GEHEALTHCARE制造），用该缓冲液将硫酸铵浓度降低至0，由此进行梯度洗脱。收集含有AP的级分，用以20mM三乙醇胺（pH值7.5、且包含1mM的氯化镁和0.1mM的硫酸锌）缓冲化的G-25琼脂糖凝胶进行脱盐，制成源自纯化T3-3株的重组AP。对该AP溶液测定比活性，结果为6090U/mg。

实施例5

利用凝胶过滤得到的源自T3-3株的重组AP的分子量测定

将实施例4中制作出的AP溶液50μL供于以50mM磷酸盐缓冲液（pH值6.9、还包含0.3M氯化钠和0.05%叠氮化钠）缓冲化的东曹（株）制造TSK-GELG3000SW（7.5mm×300mm），用该缓冲液以1ml/分钟的流速进行洗脱。对280nm的吸光度进行监控，由其出峰位置确定洗脱时间，根据预先制作出的标准曲线算出分子量。其结果，本AP的分子量估计为约104,000。

实施例6

源自T3-3株的重组AP的pH值稳定性

使用pH值4～12的范围的各种缓冲液对实施例4中制作出的AP进行稀释，使其浓度达到10μg/ml，在25℃下培养24小时。对各个溶液比较培养前后的AP活性，由此算出活性残存率。将pH值和活性残存率的关系示于图1。另外，对于使用的缓冲液种类，pH值4.0～5.5为醋酸、pH值5.5～6.5为MES、pH值6.5～9.5为三乙醇胺、pH值9.7～11.6为甘氨酸，均在缓冲液浓度为50mM下进行。本AP在pH值5.5～10.4的范围显示出85%以上的残存率。

实施例7

源自T3-3株的重组AP的最佳反应pH值

使活性测定例所示的缓冲液A的pH值在8.0～10.5内以0.5为间隔进行变化，准备pH值不同的6种反应液。使用这些反应液进行如活性测定例所示的测定。结果如图2所示。另外，图2表示以显示最高活性的pH值条件下的活性为100时的相对活性。可见：在pH值9.5显示最高活性，因此最佳pH值存在于超过9.25且低于9.75的范围内。

实施例8

源自T3-3株的重组AP的热稳定性

使用50mM三乙醇胺、1mM氯化镁、0.1mM硫酸锌（pH值7.0）对实施例4中制作出的AP进行稀释，使其浓度达到10μg/mL。将该溶液在25℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃的各温度下培养60分钟，对培养前后的AP活性进行比较。此外，对作为比较对象的比活性6000U/mg的CIAP也进行了同样的处理。将各培养温度和培养后的活性残存率示于图3。本发明的AP即便在65℃也维持有87%的活性。另一方的CIAP在60℃的处理中显示49%的残存率，在65℃显示8%的残存率，可见本发明的AP具有比CIAP更高的热稳定性。

实施例9

AP对发光基质的反应性的比较

对于实施例4中制作出的AP和作为比较对照的源自牛犊小肠的AP（比活性6000U/mg），分别使用20mM磷酸钾缓冲液（pH值7.5、包含1mM氯化镁）进行稀释，使其达到0.5U/ml或0.05U/ml。取该AP稀释液各5μL分注到96孔的ELISA平板。向其中加入50μL的AMPPD、APS-5、Lumi-Phos530、CDP-star作为发光基质，使用多标签平板计数器（PERKINELMER公司制造、Wallac1420ARVOMX），测定发光强度。将各个基质在以使CIAP反应时的发光强度为100的相对发光强度示于表1。源自T3-3株的AP对任一基质均显示出超越CIAP的灵敏度。

[表1]

实施例10

AP标记小鼠抗人CRP抗体的制作

用50mM硼酸钠、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌（pH值7.6）对实施例4中制作出的AP2mg进行稀释，使其体积达到0.5ml，再将其装入赛璐玢管，使用该缓冲液在4℃透析一夜。在透析液中加入10μL的N-琥珀酰亚胺-6-马来酰亚胺己酯溶液（将0.17mg溶解于10μL的N,N-二甲基甲酰胺），在30℃培养30分钟。将其供于以0.1MTris-盐酸盐缓冲液（pH值7.0、包含1mM的氯化镁和0.1mM的硫酸锌）缓冲化的5ml的G-25FastFlow预填充柱（GEHEALTHCARE制造），通入该缓冲液，收集蛋白级分，由此进行缓冲液置换。引入到马来酰亚胺化AP中的马来酰亚胺基的定量按照“超高灵敏度酶免疫测定法”（石川荣治著、学会出版中心刊发）中记载的方法来进行。其结果，确认到每一分子AP引入平均5.0个马来酰亚胺基。

另一方面，在小鼠抗人CRP抗体（IgG）2mg/0.45ml的0.1M磷酸钠缓冲液（pH值6.0）中加入50μL的0.1M2-巯基乙胺并进行混合，在37℃下培养90分钟，由此产生还原IgG。使用以包含5mM乙二胺四乙酸的0.1M磷酸钠缓冲液（pH值6.0）缓冲化的5ml的G-25FastFlow预填充柱（GEHEALTHCARE制造），将该还原IgG用该缓冲液进行缓冲液置换。

将还原IgG溶液和马来酰亚胺化AP溶液等量混合，在4℃下培养20小时，由此产生轭合物。用以10mMTris-盐酸盐缓冲液、0.1M氯化钠、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌（pH值6.8）缓冲化的TSKgelG3000SW（东曹制造）对该溶液进行凝胶过滤，以AP活性和280nm下的吸光度为指标，回收包含AP标记小鼠抗人CRP抗体的级分。

实施例11

使用AP标记小鼠抗人CRP抗体的免疫测定

将包含与实施例9中所用抗体不同的源自克隆的小鼠抗人CRP抗体10μg/ml的溶液在96孔ELISA平板上每孔添加50μL，通过振荡使溶液遍布底面全体后，在25℃培养2小时，完全去除溶液。接着，每孔添加300μL的PBS＋0.05%Tween20（pH值7.4），去除溶液。将该操作重复3次，清洗后，每孔添加300μL的PBS＋0.1%牛血清白蛋白，在25℃培养1小时，由此进行封闭，完全去除溶液。接着，每孔添加300μL的PBS＋0.05%Tween20（pH值7.4），去除溶液，将该操作重复3次，进行清洗，制作抗人CRP抗体包被ELISA平板。将包含10^-6～10^-1mg/dl的重组型人CRP（rCRP、OrientalYeastCo.,ltd.制造）的溶液，对该平板每孔添加50μL，通过振荡使溶液遍布底面全体后，在37℃培养1小时，由此使固相上的一次抗体捕捉抗原，完全去除溶液。接着，每孔添加300μL的PBS＋0.05%Tween20（pH值7.4），去除溶液。将该操作重复3次，去除游离的抗原。在此，每孔添加50μL实施例9中制作出的AP标记小鼠抗人CRP抗体（0.4μg/ml溶液），通过振荡使溶液遍布底面全体后，在37℃培养1小时，由此使轭合物捕捉抗原，完全去除溶液。接着，每孔添加300μL的PBS＋0.05%Tween20（pH值7.4），去除溶液，将该操作重复3次，由此去除游离的轭合物。接着，每孔添加50μL在遮光37℃下预加热过的Lumi-Phos530（LUMIGEN公司制造），使用多标签平板计数器（PERKINELMER公司制造、Wallac1420ARVOMX），测定来自各孔的发光，制成标准曲线（图4）。通过使用本发明的AP标记轭合物，表明能够对作为测定对象的抗原量进行定量。

产业上的可利用性

本发明的碱性磷酸酶除了作为免疫测定用标记酶有用之外，还能够作为探针杂交、蛋白印迹用标记酶来利用。进而，本发明的碱性磷酸酶能够作为用于DNA片断的脱磷酸化的基因工程学用酶来利用。

Claims

1.一种碱性磷酸酶，其为序列号2所述的氨基酸序列的多肽的碱性磷酸酶。

2.一种DNA，其为下述(A)所述的DNA：

(A)为序列号1所述的碱基序列的DNA。

3.一种DNA，其为下述(B)所述的DNA：

(B)编码序列号2所述的氨基酸序列的DNA。

4.一种重组载体，其包含权利要求2或3所述的DNA。

5.一种转化体，其用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞而成。

6.根据权利要求5所述的转化体，其中，宿主细胞为大肠杆菌。

7.一种权利要求1所述的碱性磷酸酶的制造方法，其包括以下步骤：对权利要求5或6所述的转化体进行培养，并从所得培养物中采集具有碱性磷酸酶活性的蛋白。

8.一种轭合物，其利用权利要求1所述的碱性磷酸酶标记而成。

9.根据权利要求8所述的轭合物，其中，要标记的对象是抗体。

10.一种免疫测定方法，其使用权利要求8或9所述的轭合物。

11.一种免疫测定试剂，其包含权利要求8或9所述的轭合物。