JP3507890B2 - Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｓｐ．ＳＩＢ１株由来の新規なアルカリフォスファターゼ - Google Patents
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｓｐ．ＳＩＢ１株由来の新規なアルカリフォスファターゼInfo
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- JP3507890B2 JP3507890B2 JP2001172653A JP2001172653A JP3507890B2 JP 3507890 B2 JP3507890 B2 JP 3507890B2 JP 2001172653 A JP2001172653 A JP 2001172653A JP 2001172653 A JP2001172653 A JP 2001172653A JP 3507890 B2 JP3507890 B2 JP 3507890B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Shewanella sp. S
IB1 株由来の新規なアルカリホスファターゼに関する。
更に本発明は、当該アルカリホスファターゼを規定する
ポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードする遺伝
子に関する。更に本発明は、当該酵素を核酸を脱リン酸
化するための試薬として使用する方法に関する。
IB1 株由来の新規なアルカリホスファターゼに関する。
更に本発明は、当該アルカリホスファターゼを規定する
ポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードする遺伝
子に関する。更に本発明は、当該酵素を核酸を脱リン酸
化するための試薬として使用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルカリホスファターゼ（alkaline pho
sphatase）は、DNA 断片の脱リン酸化反応を触媒する酵
素である。本酵素は動物組織に広く分布しており、血清
中のアルカリホスファターゼ活性は肝臓、小腸、骨組織
に由来する為に、臨床検査の現場において、肝臓や骨の
疾患のマーカーの一つにされている。また、アルカリホ
スファターゼは大腸菌の典型的なペリプラズム酵素でも
ある。
sphatase）は、DNA 断片の脱リン酸化反応を触媒する酵
素である。本酵素は動物組織に広く分布しており、血清
中のアルカリホスファターゼ活性は肝臓、小腸、骨組織
に由来する為に、臨床検査の現場において、肝臓や骨の
疾患のマーカーの一つにされている。また、アルカリホ
スファターゼは大腸菌の典型的なペリプラズム酵素でも
ある。
【０００３】また、脱リン酸化反応を触媒するアルカリ
ホスファターゼは、生化学や分子生物学の分野におい
て、研究用試薬としても広く用いられている。例えば、
エンザイムイムノアッセイにおいてアルカリホスファタ
ーゼは汎用されており、抗体の標識酵素として抗原抗体
反応の検出に用いられている。また、アルカリホスファ
ターゼは遺伝子工学用試薬としても利用されている。一
例として、核酸の5'末端を32P ラベルするにあたって、
前処理において使用する試薬としても、アルカリホスフ
ァターゼは用いられている。即ち、アルカリホスファタ
ーゼを用いて核酸の末端のリン酸基を除去を行った後
に、［γ−32P ］ATP と反応させることにより、その5'
末端を標識するということがよく行われている。この様
にして標識された核酸は、例えばプローブ等として使用
することができる。
ホスファターゼは、生化学や分子生物学の分野におい
て、研究用試薬としても広く用いられている。例えば、
エンザイムイムノアッセイにおいてアルカリホスファタ
ーゼは汎用されており、抗体の標識酵素として抗原抗体
反応の検出に用いられている。また、アルカリホスファ
ターゼは遺伝子工学用試薬としても利用されている。一
例として、核酸の5'末端を32P ラベルするにあたって、
前処理において使用する試薬としても、アルカリホスフ
ァターゼは用いられている。即ち、アルカリホスファタ
ーゼを用いて核酸の末端のリン酸基を除去を行った後
に、［γ−32P ］ATP と反応させることにより、その5'
末端を標識するということがよく行われている。この様
にして標識された核酸は、例えばプローブ等として使用
することができる。
【０００４】また、プラスミドベクターに異種のDNA を
組み込む操作を行うにあたって、プラスミドDNA の自己
ライゲーションを防止する目的で、アルカリホスファタ
ーゼで処理を行ってその5'末端のリン酸基を除去するこ
とが行われている。この場合には、後の操作にアルカリ
ホスファターゼ活性を影響させない為に、異種のDNAを
組み込んだ後にアルカリホスファターゼ活性を除く必要
がある。5'末端のリン酸基を除去する目的で、大腸菌由
来アルカリホスファターゼ（BAP ）が利用されている。
しかし、BAP は熱に対して極めて安定なので、反応後に
酵素活性を除くためには、フェノール／クロロホルム抽
出など煩雑な操作を必要とする。アルカリホスファター
ゼ処理により、プラスミドDNA の5'末端のリン酸基を除
去することについては、後に詳しく述べる。
組み込む操作を行うにあたって、プラスミドDNA の自己
ライゲーションを防止する目的で、アルカリホスファタ
ーゼで処理を行ってその5'末端のリン酸基を除去するこ
とが行われている。この場合には、後の操作にアルカリ
ホスファターゼ活性を影響させない為に、異種のDNAを
組み込んだ後にアルカリホスファターゼ活性を除く必要
がある。5'末端のリン酸基を除去する目的で、大腸菌由
来アルカリホスファターゼ（BAP ）が利用されている。
しかし、BAP は熱に対して極めて安定なので、反応後に
酵素活性を除くためには、フェノール／クロロホルム抽
出など煩雑な操作を必要とする。アルカリホスファター
ゼ処理により、プラスミドDNA の5'末端のリン酸基を除
去することについては、後に詳しく述べる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、DNA 等の核酸
の5'末端リン酸基を除去するための試薬として、BAP と
比較して熱処理に対して安定性が弱い、新規なアルカリ
ホスファターゼが求められていた。熱安定性が低いアル
カリホスファターゼを用いることにより、酵素反応後に
用いたアルカリホスファターゼを失活させることがで
き、後処理が容易となるために、その様なアルカリホス
ファターゼは遺伝子工学の研究用試薬として有用であ
る。
の5'末端リン酸基を除去するための試薬として、BAP と
比較して熱処理に対して安定性が弱い、新規なアルカリ
ホスファターゼが求められていた。熱安定性が低いアル
カリホスファターゼを用いることにより、酵素反応後に
用いたアルカリホスファターゼを失活させることがで
き、後処理が容易となるために、その様なアルカリホス
ファターゼは遺伝子工学の研究用試薬として有用であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の一つの観点は、
Shewanella sp. SIB1 株由来の新規な組み換え蛋白質で
あり、本蛋白質は以下の性質を有する。 （１）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有し； （２）分子量が49kDa であり； （３）等電点が4.9 であり； （４）アルカリホスファターゼ活性の至適温度が30℃か
ら40℃の範囲内にあり； （５）70℃において、10分以内にアルカリホスファター
ゼ活性を消失する。
Shewanella sp. SIB1 株由来の新規な組み換え蛋白質で
あり、本蛋白質は以下の性質を有する。 （１）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有し； （２）分子量が49kDa であり； （３）等電点が4.9 であり； （４）アルカリホスファターゼ活性の至適温度が30℃か
ら40℃の範囲内にあり； （５）70℃において、10分以内にアルカリホスファター
ゼ活性を消失する。
【０００７】本発明の他の観点は、アルカリホスファタ
ーゼ活性を有し、かつ70℃において10分以内に該アルカ
リホスファターゼ活性を失活する、Shewanella sp. SIB
1 株由来のポリペプチドであり、本ポリペプチドは以下
の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなること
を特徴とする。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号1-455
で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポ
リペプチド。 （ｂ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有する、（ａ）の一部が
欠損、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
ーゼ活性を有し、かつ70℃において10分以内に該アルカ
リホスファターゼ活性を失活する、Shewanella sp. SIB
1 株由来のポリペプチドであり、本ポリペプチドは以下
の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなること
を特徴とする。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号1-455
で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポ
リペプチド。 （ｂ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有する、（ａ）の一部が
欠損、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
【０００８】本発明の更なる観点は、アルカリホスファ
ターゼ活性を有し、かつ70℃において10分以内に該アル
カリホスファターゼ活性を失活する、Shewanella sp. S
IB1株由来のポリペプチドをコードする遺伝子であり、
本遺伝子は以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列か
らなることを特徴とする。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号1-1368で示
される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ｄ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードし、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され
た、遺伝子。
ターゼ活性を有し、かつ70℃において10分以内に該アル
カリホスファターゼ活性を失活する、Shewanella sp. S
IB1株由来のポリペプチドをコードする遺伝子であり、
本遺伝子は以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列か
らなることを特徴とする。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号1-1368で示
される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ｄ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードし、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され
た、遺伝子。
【０００９】
【発明の実施の形態】好冷菌、耐冷菌などの低温菌が生
産する酵素（好冷酵素）の反応至適温度は、一般に、常
温菌由来酵素の反応至適温度よりも低温側にシフトして
いることが知られている。またこれらの酵素の熱安定性
は常温生物由来酵素のものより一般に著しく低い。本発
明者らは、その様な好冷酵素の特質に注目し、熱処理に
より容易に失活させることが可能なアルカリホスファタ
ーゼを採取することを試みた。本発明者らは、国内の石
油備蓄タンクから0 ℃でも生育する低温菌Shewanella s
p. SIB1 株を単離することに成功している［Kato, T.,
et al. (2001) Appl. Microbiol. Biotech. in press.
］。そこで、本菌からalkaline phosphataseをコード
する遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させ、その
特性を解析した。その結果、本菌由来アルカリホスファ
ターゼが大腸菌由来アルカリホスファターゼ（BAP ）よ
り、熱に対して著しく不安定であることを見いだした。
産する酵素（好冷酵素）の反応至適温度は、一般に、常
温菌由来酵素の反応至適温度よりも低温側にシフトして
いることが知られている。またこれらの酵素の熱安定性
は常温生物由来酵素のものより一般に著しく低い。本発
明者らは、その様な好冷酵素の特質に注目し、熱処理に
より容易に失活させることが可能なアルカリホスファタ
ーゼを採取することを試みた。本発明者らは、国内の石
油備蓄タンクから0 ℃でも生育する低温菌Shewanella s
p. SIB1 株を単離することに成功している［Kato, T.,
et al. (2001) Appl. Microbiol. Biotech. in press.
］。そこで、本菌からalkaline phosphataseをコード
する遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させ、その
特性を解析した。その結果、本菌由来アルカリホスファ
ターゼが大腸菌由来アルカリホスファターゼ（BAP ）よ
り、熱に対して著しく不安定であることを見いだした。
【００１０】従って、低温菌Shewanella sp. SIB1 株に
由来するアルカリホスファターゼは、フェノール／クロ
ロホルム抽出などの煩雑な操作を行わなくても加熱処理
だけで容易に失活させることができると期待される。ア
ルカリホスファターゼは、以下において詳しく述べる様
に、遺伝子工学の研究の現場において重要な役割を果た
す酵素であり、Shewanella sp. SIB1 株由来のアルカリ
ホスファターゼは、遺伝子工学研究において非常に有用
なツールを与えるものと思われる。
由来するアルカリホスファターゼは、フェノール／クロ
ロホルム抽出などの煩雑な操作を行わなくても加熱処理
だけで容易に失活させることができると期待される。ア
ルカリホスファターゼは、以下において詳しく述べる様
に、遺伝子工学の研究の現場において重要な役割を果た
す酵素であり、Shewanella sp. SIB1 株由来のアルカリ
ホスファターゼは、遺伝子工学研究において非常に有用
なツールを与えるものと思われる。
【００１１】プラスミドベクターに目的とする異種のDN
A を組み込むにあたり、プラスミドと異種DNA をそれぞ
れ制限酵素を用いて処理することにより、特異的な切断
部位（制限部位）を作製することが行われている。そし
て、作製された切断部位の特異性を利用して、DNA リガ
ーゼによりプラスミドと異種DNA を結合させることによ
り、プラスミドベクターに異種DNA を組み込むことがで
きる。この様な手法は、遺伝子組み換え実験を行う際に
行われる、最も一般的な実験操作である。
A を組み込むにあたり、プラスミドと異種DNA をそれぞ
れ制限酵素を用いて処理することにより、特異的な切断
部位（制限部位）を作製することが行われている。そし
て、作製された切断部位の特異性を利用して、DNA リガ
ーゼによりプラスミドと異種DNA を結合させることによ
り、プラスミドベクターに異種DNA を組み込むことがで
きる。この様な手法は、遺伝子組み換え実験を行う際に
行われる、最も一般的な実験操作である。
【００１２】ここで、作製した制限部位をそのままにし
ておくと、プラスミドベクターの自己ライゲーションが
起こり、異種のDNA が組み込まれる効率が低下するとい
う弊害が起こる。そこで、プラスミドベクターに異種の
DNA を組み込む前に、アルカリホスファターゼにより、
プラスミドベクターの5'末端のリン酸基を除去して、プ
ラスミドベクターの自己ライゲーションを防ぐという操
作が一般的に行われている。その様な目的には、現在大
腸菌由来アルカリホスファターゼ（BAP ）が汎用されて
いる。
ておくと、プラスミドベクターの自己ライゲーションが
起こり、異種のDNA が組み込まれる効率が低下するとい
う弊害が起こる。そこで、プラスミドベクターに異種の
DNA を組み込む前に、アルカリホスファターゼにより、
プラスミドベクターの5'末端のリン酸基を除去して、プ
ラスミドベクターの自己ライゲーションを防ぐという操
作が一般的に行われている。その様な目的には、現在大
腸菌由来アルカリホスファターゼ（BAP ）が汎用されて
いる。
【００１３】そして、アルカリホスファターゼで末端の
リン酸基を除去した後は、アルカリホスファターゼの酵
素活性か残存していると、後の操作に影響を及ぼす為
に、酵素活性を失活させる必要がある。現在使用されて
いるBAP は、上記で述べた様には熱安定性が高いために
加熱により失活させることが困難であり、フェノール／
クロロフォルムで抽出を行うなどして、酵素活性を除く
ために煩雑な手段を用いる必要がある。
リン酸基を除去した後は、アルカリホスファターゼの酵
素活性か残存していると、後の操作に影響を及ぼす為
に、酵素活性を失活させる必要がある。現在使用されて
いるBAP は、上記で述べた様には熱安定性が高いために
加熱により失活させることが困難であり、フェノール／
クロロフォルムで抽出を行うなどして、酵素活性を除く
ために煩雑な手段を用いる必要がある。
【００１４】本発明の低温菌Shewanella sp. SIB1 株に
由来するアルカリホスファターゼは耐熱性が低い為に、
上記のBAP と異なり加熱により容易にその酵素を失活さ
せることができる。即ち、反応後にフェノール／クロロ
フォルムで抽出を行う等により酵素を除去する必要がな
く、簡便な加熱処理の操作により、反応後の酵素を失活
させることができるために、アルカリホスファターゼ反
応後の処理が容易になるという利点を有する。現在最も
汎用されているBAP は、70℃で30分間処理を行っても酵
素活性が低下しない。それと比べると、下記の実施例で
示される様に、本発明の低温菌Shewanella sp. SIB1 株
に由来するアルカリホスファターゼは、70℃の処理にお
いて10分以内にアルカリホスファターゼ活性をほぼ完全
に失活する。よって、Shewanella sp. SIB1 株由来のア
ルカリホスファターゼの耐熱性は顕著に低く、BAP と相
違した特徴を示すために、遺伝子工学の研究試薬として
種々の用途に用いることが可能である。
由来するアルカリホスファターゼは耐熱性が低い為に、
上記のBAP と異なり加熱により容易にその酵素を失活さ
せることができる。即ち、反応後にフェノール／クロロ
フォルムで抽出を行う等により酵素を除去する必要がな
く、簡便な加熱処理の操作により、反応後の酵素を失活
させることができるために、アルカリホスファターゼ反
応後の処理が容易になるという利点を有する。現在最も
汎用されているBAP は、70℃で30分間処理を行っても酵
素活性が低下しない。それと比べると、下記の実施例で
示される様に、本発明の低温菌Shewanella sp. SIB1 株
に由来するアルカリホスファターゼは、70℃の処理にお
いて10分以内にアルカリホスファターゼ活性をほぼ完全
に失活する。よって、Shewanella sp. SIB1 株由来のア
ルカリホスファターゼの耐熱性は顕著に低く、BAP と相
違した特徴を示すために、遺伝子工学の研究試薬として
種々の用途に用いることが可能である。
【００１５】下記の実施例で示す様に、本発明のShewan
ella sp. SIB1 株に由来するアルカリホスファターゼ
は、酵素学的には以下の性質を有する特徴を有する。 （１）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有し； （２）分子量が49kDa であり； （３）等電点が4.9 であり； （４）アルカリホスファターゼ活性の至適温度が30℃か
ら40℃の範囲内にあり； （５）70℃において、10分以内にアルカリホスファター
ゼ活性を消失する。
ella sp. SIB1 株に由来するアルカリホスファターゼ
は、酵素学的には以下の性質を有する特徴を有する。 （１）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有し； （２）分子量が49kDa であり； （３）等電点が4.9 であり； （４）アルカリホスファターゼ活性の至適温度が30℃か
ら40℃の範囲内にあり； （５）70℃において、10分以内にアルカリホスファター
ゼ活性を消失する。
【００１６】本願明細書において、アルカリホスファタ
ーゼとは、アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを
基質として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成す
る酵素を意味するものとする。ここで、アルカリ性条件
とは、pH8.0-pH12.0、好ましくはpH9.0-pH11.0を意味す
る。下記の実施例において示す様に、本発明のアルカリ
ホスファターゼの至適pHは10.5である。
ーゼとは、アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを
基質として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成す
る酵素を意味するものとする。ここで、アルカリ性条件
とは、pH8.0-pH12.0、好ましくはpH9.0-pH11.0を意味す
る。下記の実施例において示す様に、本発明のアルカリ
ホスファターゼの至適pHは10.5である。
【００１７】アルカリホスファターゼ活性を有する、本
発明のShewanella sp. SIB1 株由来の新規なポリペプチ
ドは、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号1-455
で示されるアミノ酸配列により特定される。このポリペ
プチドは、配列表の配列番号２に記載されている塩基配
列により特定される遺伝子によりコードされる。
発明のShewanella sp. SIB1 株由来の新規なポリペプチ
ドは、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号1-455
で示されるアミノ酸配列により特定される。このポリペ
プチドは、配列表の配列番号２に記載されている塩基配
列により特定される遺伝子によりコードされる。
【００１８】配列番号１に示すポリペプチドの一部が欠
失、置換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番
号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好まし
くは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が
置換されたポリペプチドである。また、その様なポリペ
プチドと配列番号１に示すアミノ酸配列とは、７０％以
上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上
の相同性を有する。その様なポリペプチドも、アルカリ
ホスファターゼとしての活性を有する限り、本発明の範
囲内である。
失、置換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番
号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好まし
くは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が
置換されたポリペプチドである。また、その様なポリペ
プチドと配列番号１に示すアミノ酸配列とは、７０％以
上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上
の相同性を有する。その様なポリペプチドも、アルカリ
ホスファターゼとしての活性を有する限り、本発明の範
囲内である。
【００１９】また、上記のポリペプチドをコードする、
Shewanella sp. SIB1 株由来の新規な遺伝子は、配列表
の配列番号２に示す、塩基番号1-1368で示される塩基配
列により特定される。配列表の配列番号２に示す塩基配
列は読み枠の部分に相当しており、配列表の配列番号１
記載のポリペプチドをコードしている。
Shewanella sp. SIB1 株由来の新規な遺伝子は、配列表
の配列番号２に示す、塩基番号1-1368で示される塩基配
列により特定される。配列表の配列番号２に示す塩基配
列は読み枠の部分に相当しており、配列表の配列番号１
記載のポリペプチドをコードしている。
【００２０】遺伝子組み換え技術によれば、基本となる
ＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変
化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、
人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供
される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然の
ものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の
遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものと
することが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子
を含むものである。
ＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変
化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、
人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供
される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然の
ものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の
遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものと
することが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子
を含むものである。
【００２１】即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子の
一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列
番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましく
は１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換さ
れた遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２
に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以
上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する。その
様な遺伝子も、アルカリホスファターゼとしての活性を
有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範
囲内である。
一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列
番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましく
は１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換さ
れた遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２
に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以
上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する。その
様な遺伝子も、アルカリホスファターゼとしての活性を
有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範
囲内である。
【００２２】また、本発明のShewanella sp. SIB1 由来
アルカリホスファターゼを用いて、DNA やRNA 等の核酸
又はそれらの断片において、リン酸モノエステルを加水
分解する方法もまた、本発明の範囲内である。その方法
の最も代表的な用途は、上記において述べた、制限酵素
処理したプラスミドDNA の5'末端リン酸基を除去する試
薬としての使用であるが、それに限られるものではな
く、アルカリホスファターゼとしての酵素活性を利用し
て、他の種々の用途にも使用することが可能である。
アルカリホスファターゼを用いて、DNA やRNA 等の核酸
又はそれらの断片において、リン酸モノエステルを加水
分解する方法もまた、本発明の範囲内である。その方法
の最も代表的な用途は、上記において述べた、制限酵素
処理したプラスミドDNA の5'末端リン酸基を除去する試
薬としての使用であるが、それに限られるものではな
く、アルカリホスファターゼとしての酵素活性を利用し
て、他の種々の用途にも使用することが可能である。
【００２３】
【実施例】（アルカリホスファターゼ遺伝子のクローニ
ング）プラスミドpUC19 をEcoRI で消化し、低温菌Shew
anella sp. SIB1 株ゲノムをEcoRI で消化した断片とラ
イゲーションすることにより環化した。ライゲーション
は市販のライゲーションキット(Takara)を用い、添付の
説明書に正確に従って行なった。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌JM109 株を形質転換し形質転換体
を多数得た。これらの形質転換体からプラスミドを抽出
し、挿入配列の塩基配列を決定することにより、SIB1株
由来APase の遺伝子の一部（5'末端部分）を含む断片を
見いだした。
ング）プラスミドpUC19 をEcoRI で消化し、低温菌Shew
anella sp. SIB1 株ゲノムをEcoRI で消化した断片とラ
イゲーションすることにより環化した。ライゲーション
は市販のライゲーションキット(Takara)を用い、添付の
説明書に正確に従って行なった。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌JM109 株を形質転換し形質転換体
を多数得た。これらの形質転換体からプラスミドを抽出
し、挿入配列の塩基配列を決定することにより、SIB1株
由来APase の遺伝子の一部（5'末端部分）を含む断片を
見いだした。
【００２４】次に、この断片をプローブDNA として用
い、サザンハイブリダイゼーションを行った。まず、SI
B1株ゲノムをKpnIで消化した断片を0.7 ％アガロース電
気泳動に供し、ナイロンメンブレンにトランスファーし
た。このメンブレンを用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、プローブDNA は約2.5 kbのDNA 断片
にハイブリダイズした。そこで、SIB1株ゲノムをKpnIで
消化した断片を0.7 ％アガロース電気泳動に供し、2.5
kb付近の長さの断片を精製した。この断片と、プラスミ
ドpUC19 をKpnIで消化したものとをライゲーションする
ことにより環化した。このようにして得られたプラスミ
ドで大腸菌JM109 株を形質転換し形質転換体を多数得
た。これらの形質転換体についてコロニーハイブリダイ
ゼーションを行い、プローブDNA がハイブリダイズした
コロニーからプラスミドを抽出した。
い、サザンハイブリダイゼーションを行った。まず、SI
B1株ゲノムをKpnIで消化した断片を0.7 ％アガロース電
気泳動に供し、ナイロンメンブレンにトランスファーし
た。このメンブレンを用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、プローブDNA は約2.5 kbのDNA 断片
にハイブリダイズした。そこで、SIB1株ゲノムをKpnIで
消化した断片を0.7 ％アガロース電気泳動に供し、2.5
kb付近の長さの断片を精製した。この断片と、プラスミ
ドpUC19 をKpnIで消化したものとをライゲーションする
ことにより環化した。このようにして得られたプラスミ
ドで大腸菌JM109 株を形質転換し形質転換体を多数得
た。これらの形質転換体についてコロニーハイブリダイ
ゼーションを行い、プローブDNA がハイブリダイズした
コロニーからプラスミドを抽出した。
【００２５】得られたプラスミド（pUC2500 ）について
挿入配列の塩基配列を決定したところ、SIB1株由来アル
カリホスファターゼ（Alkaline phosphatase：APase ）
の遺伝子全長を含んでいた。この遺伝子は455 アミノ酸
残基から成る分子量49kDa 、pI 4.9のタンパク質をコー
ドすることがわかった（図１、図２）。なお、図１と図
２で一連の塩基配列及びアミノ酸配列を示しており、配
列の前半を図１に示し、続いている配列の後半を図２に
示す。図１及び図２の上段及び配列表の配列番号２に本
発明の酵素の遺伝子の塩基配列を、図１及び図２の下段
及び配列表の配列番号１に推定アミノ酸配列を、それぞ
れ示す。Blast によるデータベースとのホモロジー検索
では、Enterococcus faecalis 由来APase と最も高いホ
モロジー（45％）を示した。BAP として知られている大
腸菌APase とも36% のホモロジーを示した。SIB1株由来
APase には大腸菌酵素の結晶構造から明らかにされてい
る活性中心残基がすべて保存されているので、本酵素の
触媒機構は大腸菌酵素に対して提唱されている触媒機構
と同様と考えられる。
挿入配列の塩基配列を決定したところ、SIB1株由来アル
カリホスファターゼ（Alkaline phosphatase：APase ）
の遺伝子全長を含んでいた。この遺伝子は455 アミノ酸
残基から成る分子量49kDa 、pI 4.9のタンパク質をコー
ドすることがわかった（図１、図２）。なお、図１と図
２で一連の塩基配列及びアミノ酸配列を示しており、配
列の前半を図１に示し、続いている配列の後半を図２に
示す。図１及び図２の上段及び配列表の配列番号２に本
発明の酵素の遺伝子の塩基配列を、図１及び図２の下段
及び配列表の配列番号１に推定アミノ酸配列を、それぞ
れ示す。Blast によるデータベースとのホモロジー検索
では、Enterococcus faecalis 由来APase と最も高いホ
モロジー（45％）を示した。BAP として知られている大
腸菌APase とも36% のホモロジーを示した。SIB1株由来
APase には大腸菌酵素の結晶構造から明らかにされてい
る活性中心残基がすべて保存されているので、本酵素の
触媒機構は大腸菌酵素に対して提唱されている触媒機構
と同様と考えられる。
【００２６】（APase 遺伝子の発現）通常、グラム陰性
菌のAPase は前駆体として合成され、ペリプラズム中へ
移動する際にN 末端のシグナルペプチドが切断されて成
熟体となる。そこで、SignalP V2.0 World Wide Web Se
rverによりシグナルペプチドの切断部位を予測した。つ
いで、APase 成熟体と予想される蛋白質（Asp28-Pro45
5）をコードする遺伝子をpET-25b ベクター（Novagen
）のpelB leader 配列の直後に挿入して発現ベクター
を構築した。その方法を以下に示す（図３）。まず、プ
ライマーを用いてPCR 法によりpUC2500 のAPase 遺伝子
を増幅した。プライマーとしては図４に示す化学合成し
たオリゴヌクレオチドを用いた。なお、図４において下
線は制限酵素部位を示す。プラスミドpBR2500 を鋳型DN
A とし、NcoIの制限酵素部位を含む５'-プライマー(1)
とSalIの制限酵素部位を含む3'- プライマー(2) により
約1.3kbp のDNA 断片をＰＣＲ反応により増幅し、DNA
断片を得た。なお、プライマー(1) を配列表の配列番号
３に、プライマー(2) を配列表の配列番号４に、それぞ
れ示す。PCR 反応は市販のKOD ポリメラーゼ (Toyobo)
を用い、説明書に従って行った。得られた断片を制限酵
素NcoIおよびSalIで消化した後消化物を0.7 ％アガロー
スゲル電気泳動により精製した。
菌のAPase は前駆体として合成され、ペリプラズム中へ
移動する際にN 末端のシグナルペプチドが切断されて成
熟体となる。そこで、SignalP V2.0 World Wide Web Se
rverによりシグナルペプチドの切断部位を予測した。つ
いで、APase 成熟体と予想される蛋白質（Asp28-Pro45
5）をコードする遺伝子をpET-25b ベクター（Novagen
）のpelB leader 配列の直後に挿入して発現ベクター
を構築した。その方法を以下に示す（図３）。まず、プ
ライマーを用いてPCR 法によりpUC2500 のAPase 遺伝子
を増幅した。プライマーとしては図４に示す化学合成し
たオリゴヌクレオチドを用いた。なお、図４において下
線は制限酵素部位を示す。プラスミドpBR2500 を鋳型DN
A とし、NcoIの制限酵素部位を含む５'-プライマー(1)
とSalIの制限酵素部位を含む3'- プライマー(2) により
約1.3kbp のDNA 断片をＰＣＲ反応により増幅し、DNA
断片を得た。なお、プライマー(1) を配列表の配列番号
３に、プライマー(2) を配列表の配列番号４に、それぞ
れ示す。PCR 反応は市販のKOD ポリメラーゼ (Toyobo)
を用い、説明書に従って行った。得られた断片を制限酵
素NcoIおよびSalIで消化した後消化物を0.7 ％アガロー
スゲル電気泳動により精製した。
【００２７】pET-25b プラスミドをNcoIおよび SalI で
消化し、約5.4 Kbの断片を0.7 ％アガロース電気泳動に
より精製した後、上記約1.3 kbp のDNA 断片とライゲー
ションすることにより環化した。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、形質転換
体よりAPase 遺伝子発現プラスミドpET-AP5 を得た。こ
のプラスミドを用いてAPase 欠損株である大腸菌AC109
(DE3) 株を形質転換した。得られた形質転換体を37℃に
おいて培養し、OD600 が約0.5 に達した時、IPTGを最終
濃度が1mM になるように加え、さらに5 時間培養を行っ
た。菌体を集菌後、osmotic shock buffer (30 mM Tris
-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% sucrose)に懸濁し、室
温で10分間放置することにより浸透圧ショックを加え
た。懸濁液を遠心した後、得られた沈殿を冷水に懸濁
し、氷上に15分間放置した。この懸濁液を遠心し、得ら
れた上清をペリプラズム画分とした。その結果、ペリプ
ラズム画分には明らかに強い活性が見られ、SIB1由来AP
ase の発現が確認された。APase 活性はp-ニトロフェニ
ルリン酸を基質として用い、反応に伴い生成するp-ニト
ロフェノールを410 nmの吸光度（分子吸光係数は1.61 x
104 -1 cm -1 ）を測定することにより定量した。反
応は、0.04％のp-ニトロフェニルリン酸を含む1ml の50
mM Tris-HCl (pH 8.5)-1 mM MgCl2-0.1 mM ZnCl2-50 m
M KCl 中、30℃で15分間行い、50μl の4 M NaOHを加え
ることにより反応を停止した。
消化し、約5.4 Kbの断片を0.7 ％アガロース電気泳動に
より精製した後、上記約1.3 kbp のDNA 断片とライゲー
ションすることにより環化した。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、形質転換
体よりAPase 遺伝子発現プラスミドpET-AP5 を得た。こ
のプラスミドを用いてAPase 欠損株である大腸菌AC109
(DE3) 株を形質転換した。得られた形質転換体を37℃に
おいて培養し、OD600 が約0.5 に達した時、IPTGを最終
濃度が1mM になるように加え、さらに5 時間培養を行っ
た。菌体を集菌後、osmotic shock buffer (30 mM Tris
-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% sucrose)に懸濁し、室
温で10分間放置することにより浸透圧ショックを加え
た。懸濁液を遠心した後、得られた沈殿を冷水に懸濁
し、氷上に15分間放置した。この懸濁液を遠心し、得ら
れた上清をペリプラズム画分とした。その結果、ペリプ
ラズム画分には明らかに強い活性が見られ、SIB1由来AP
ase の発現が確認された。APase 活性はp-ニトロフェニ
ルリン酸を基質として用い、反応に伴い生成するp-ニト
ロフェノールを410 nmの吸光度（分子吸光係数は1.61 x
104 -1 cm -1 ）を測定することにより定量した。反
応は、0.04％のp-ニトロフェニルリン酸を含む1ml の50
mM Tris-HCl (pH 8.5)-1 mM MgCl2-0.1 mM ZnCl2-50 m
M KCl 中、30℃で15分間行い、50μl の4 M NaOHを加え
ることにより反応を停止した。
【００２８】大腸菌ペリプラズムに分泌されたSIB1由来
APaseの粗抽出液を用いて、その活性至適温度（図
５）、活性至適pH（図６）、熱安定性（図７）を測定し
た。その結果、SIB1由来APase （図５の黒丸）の至適温
度は大腸菌酵素（BAP ：図５の白丸）より20℃ほど低温
側にシフトしていることが示唆された（図５）。また、
SIB1由来 APaseの至適pHは10.5であった（図６）。図６
において、白丸はグリシン−NaOH緩衝液で測定した値、
黒丸はTris-HClで測定した値を、それぞれ示す。図６か
ら判る様に、BAP の至適pHは8-9 と報告されているの
で、SIB1由来 APaseの至適pHはBAP の至適pHより高アル
カリ性にシフトしている。酵素溶液を70℃でインキュベ
ーションした後、残存活性を30℃で測定した結果を、図
７に示す。図７より、SIB1由来 APaseは70℃、 5分の熱
処理でほとんど完全に失活する（図７の黒丸）のに対
し、BAP （図７の白丸）はこの温度では極めて安定であ
った（図７）。以上の結果、SIB1由来 APaseを用いるこ
とにより脱リン酸化反応操作が従来より簡便になること
が期待された。
APaseの粗抽出液を用いて、その活性至適温度（図
５）、活性至適pH（図６）、熱安定性（図７）を測定し
た。その結果、SIB1由来APase （図５の黒丸）の至適温
度は大腸菌酵素（BAP ：図５の白丸）より20℃ほど低温
側にシフトしていることが示唆された（図５）。また、
SIB1由来 APaseの至適pHは10.5であった（図６）。図６
において、白丸はグリシン−NaOH緩衝液で測定した値、
黒丸はTris-HClで測定した値を、それぞれ示す。図６か
ら判る様に、BAP の至適pHは8-9 と報告されているの
で、SIB1由来 APaseの至適pHはBAP の至適pHより高アル
カリ性にシフトしている。酵素溶液を70℃でインキュベ
ーションした後、残存活性を30℃で測定した結果を、図
７に示す。図７より、SIB1由来 APaseは70℃、 5分の熱
処理でほとんど完全に失活する（図７の黒丸）のに対
し、BAP （図７の白丸）はこの温度では極めて安定であ
った（図７）。以上の結果、SIB1由来 APaseを用いるこ
とにより脱リン酸化反応操作が従来より簡便になること
が期待された。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、Shewanella sp. SIB1 株
由来の新規なアルカリホスファターゼが与えられた。更
に本発明により、当該アルカリホスファターゼを規定す
るポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードする遺
伝子が与えられた。本発明の酵素は、核酸の5'末端のリ
ン酸基を除去するのに有効であり、耐熱性が低い為に反
応後に酵素を熱処理により容易に失活させることができ
るという特徴を有するために、遺伝子工学の分野で用い
る試薬として特に有用である。
由来の新規なアルカリホスファターゼが与えられた。更
に本発明により、当該アルカリホスファターゼを規定す
るポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードする遺
伝子が与えられた。本発明の酵素は、核酸の5'末端のリ
ン酸基を除去するのに有効であり、耐熱性が低い為に反
応後に酵素を熱処理により容易に失活させることができ
るという特徴を有するために、遺伝子工学の分野で用い
る試薬として特に有用である。
【００３０】
【配列表】
＜１１０＞大阪大学長
＜１２０＞Shewanella sp. SIB1 株由来の新規なアルカリフォスファターゼ
＜１６０＞４
＜２１０＞１
＜２１１＞４５５
＜２１２＞アミノ酸
＜２１３＞Shewanella sp. SIB1 株
＜４００＞１
MHFLSTYQRI ISRLLLVSSL IVTGAMADEV IMPPAVANTA SNNVPTVGPS RPKNIIIMIG 60
DGMGPAYTTA YRYYKDNPDT EEIEQTVFDR LLVGMASTYP ASVSGYVTDS AASATALSTG 120
VKSYNGAIAV DTEKRPLTTL MEKAKALGLS TGVAVTSQVN HATPAAFLAH NESRSNYIDI 180
AEAYLTSDAD VILGGGQQYF TPTLLEQFSA KGYQHISEFS ELASVTTPKV LGLFADVQLP 240
WAINDKQAHK LSHMTQKALD LLSQNEQGFV LLVEGSLIDW AGHSNDIATA MGEMDEFASA 300
IEVVEQFVRQ SKDTLMVVTA DHNTGGLSVG AHDKYEWHPE VLHKVKASPD VIATRAIAED 360
NWQPLTATLL GFTPNEAQYS QLQSARMQGN EPLSIALRKL IDIQSNTGWT SGGHTAMDVQ 420
VFAEGPGARL FSGHQDNIDI AIKMFSLLPQ SVQTP 455
＜２１０＞２
＜２１１＞１３６８
＜２１２＞核酸
＜２１３＞Shewanella sp. SIB1 株
＜４００＞２
ATGCATTTTT TATCTACCTA CCAACGGATA ATCAGCAGAT TATTATTGGT ATCTAGCTTG 60
ATCGTAACGG GGGCTATGGC TGATGAAGTC ATTATGCCGC CTGCAGTTGC TAATACAGCA 120
AGTAATAATG TACCAACTGT GGGTCCATCA AGACCTAAAA ATATCATCAT TATGATAGGT 180
GATGGTATGG GACCGGCTTA CACCACCGCC TATCGTTATT ATAAAGATAA TCCTGACACA 240
GAAGAGATTG AACAAACTGT GTTTGATCGC TTACTCGTTG GTATGGCAAG CACTTACCCA 300
GCTTCCGTCA GTGGTTATGT CACCGACTCT GCCGCATCTG CCACAGCACT GTCAACTGGA 360
GTTAAAAGTT ATAATGGTGC CATTGCCGTT GATACCGAAA AACGCCCACT CACAACCTTA 420
ATGGAAAAAG CCAAAGCATT AGGCTTGTCA ACGGGTGTAG CAGTTACATC CCAAGTAAAC 480
CATGCTACAC CTGCAGCATT TTTGGCTCAT AATGAAAGCC GTAGTAATTA TATAGATATT 540
GCTGAGGCTT ATTTAACATC TGATGCTGAT GTGATTCTTG GTGGTGGCCA GCAATATTTC 600
ACTCCAACAT TACTTGAGCA ATTTAGCGCT AAAGGCTACC AGCACATCAG TGAATTCTCT 660
GAGCTAGCAT CAGTGACTAC GCCAAAAGTA TTGGGGCTGT TTGCAGATGT ACAATTGCCT 720
TGGGCCATTA ATGATAAACA AGCGCATAAA CTCAGTCATA TGACCCAAAA GGCATTAGAT 780
TTACTGTCAC AAAATGAGCA AGGTTTTGTA TTGTTAGTTG AAGGCAGCTT AATTGATTGG 840
GCTGGCCACA GTAACGATAT TGCTACCGCT ATGGGTGAAA TGGATGAATT TGCATCCGCT 900
ATCGAAGTGG TTGAACAATT TGTTCGTCAA AGTAAAGACA CCTTGATGGT TGTGACAGCA 960
GATCATAATA CCGGTGGATT ATCAGTTGGC GCACATGACA AATACGAATG GCACCCTGAA 1020
GTACTGCATA AGGTTAAAGC CAGCCCTGAT GTCATTGCTA CCCGTGCTAT TGCCGAAGAC 1080
AATTGGCAGC CTTTAACGGC AACGCTTCTT GGCTTTACTC CAAATGAAGC GCAATACAGT 1140
CAATTACAAA GCGCACGCAT GCAAGGTAAT GAACCATTAT CAATCGCACT GCGTAAGCTA 1200
ATTGATATTC AATCGAATAC CGGTTGGACA AGTGGCGGTC ATACCGCTAT GGATGTCCAA 1260
GTCTTTGCTG AAGGCCCTGG CGCTAGATTA TTTAGCGGTC ATCAAGACAA TATTGATATT 1320
GCGATTAAAA TGTTTAGCTT ATTGCCACAA TCGGTGCAAA CACCTTAA 1368
＜２１０＞３
＜２１１＞３０
＜２１２＞核酸
＜２１３＞人工的な配列
＜２２３＞PCR 増幅のための合成プライマー
＜４００＞３
ACGGGGGCTA CCATGGATGA AGTCATTATG 30
＜２１０＞４
＜２１１＞２４
＜２１２＞核酸
＜２１３＞人工的な配列
＜２２３＞PCR 増幅のための合成プライマー
＜４００＞４
AAGGGTCGAC GTTGATAGCG GAGG 24
【図１】 図１は、SIB1由来APase の遺伝子配列及びア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
【図２】 図２は、図１に示す配列の続きであり、SIB1
由来APase の遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す図であ
る。
由来APase の遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す図であ
る。
【図３】 図３は、Apase の発現ベクターpET-AP5 の構
築を示す図である。
築を示す図である。
【図４】 図４は、発現ベクターを構築するための合成
オリゴヌクレオチドを示す模式図である。
オリゴヌクレオチドを示す模式図である。
【図５】 図５は、APase 活性の温度依存性を示すグラ
フである。
フである。
【図６】 図６は、APase 活性のpH依存性を示すグラフ
である。
である。
【図７】 図７は、APase の熱安定性を示すグラフであ
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1998年，Ｖｏ
ｌ．62，Ｎｏ．11，ｐｐ．2246−2250
Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，2002年，Ｖｏ
ｌ．66，Ｎｏ．４，ｐｐ．754−761
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/09
C12N 9/00 - 9/99
C12P 9/00
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (5)
- 【請求項１】 以下の性質を有するShewanella sp. SIB
1 株由来の組み換え蛋白質： （１）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有し； （２）分子量が49kDa であり； （３）等電点が4.9 であり； （４）アルカリホスファターゼ活性の至適温度が30℃か
ら40℃の範囲内にあり； （５）70℃において、10分以内にアルカリホスファター
ゼ活性を消失する。 - 【請求項２】 アルカリホスファターゼ活性を有し、か
つ70℃において10分以内に該アルカリホスファターゼ活
性を失活する、Shewanella sp. SIB1 株由来のポリペプ
チドであり、以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸
配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号1-455
で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポ
リペプチド。 （ｂ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有する、（ａ）の一部が
欠損、置換若しくは付加された、ポリペプチド。 - 【請求項３】 請求項２記載のポリペプチドをコードす
る、遺伝子。 - 【請求項４】 アルカリホスファターゼ活性を有し、か
つ70℃において10分以内に該アルカリホスファターゼ活
性を失活する、Shewanella sp. SIB1 株由来のポリペプ
チドをコードし、以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基
配列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号1-1368で示
される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ｄ）アルカリ性条件下で、リン酸モノエステルを基質
として加水分解反応を触媒して無機リン酸を生成する、
アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードし、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され
た、遺伝子。 - 【請求項５】 請求項１記載の酵素を用いて、DNA 又は
その断片若しくはRNA 又はその断片において、リン酸モ
ノエステルを加水分解する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001172653A JP3507890B2 (ja) | 2001-06-07 | 2001-06-07 | Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｓｐ．ＳＩＢ１株由来の新規なアルカリフォスファターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001172653A JP3507890B2 (ja) | 2001-06-07 | 2001-06-07 | Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｓｐ．ＳＩＢ１株由来の新規なアルカリフォスファターゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002360259A JP2002360259A (ja) | 2002-12-17 |
| JP3507890B2 true JP3507890B2 (ja) | 2004-03-15 |
Family
ID=19014240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001172653A Expired - Lifetime JP3507890B2 (ja) | 2001-06-07 | 2001-06-07 | Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｓｐ．ＳＩＢ１株由来の新規なアルカリフォスファターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3507890B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012115023A1 (ja) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | 東洋紡績株式会社 | アルカリホスファターゼ |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7741100B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-06-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method for highly expressing recombinant glucose dehydrogenase derived from filamentous fungi |
| US8129168B2 (en) | 2009-01-14 | 2012-03-06 | Affymetrix, Inc. | Recombinant colwellia psychrerythraea alkaline phosphatase and uses thereof |
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Also Published As
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