JP7402428B2 - 脱リン酸化試薬の品質を評価する方法及び標的核酸を検出する方法 - Google Patents
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Description
・配列番号10に記載のアミノ酸配列(ウシ由来のアルカリホスファターゼのアミノ酸配列)の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A1)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の86~90位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A2)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の93~105位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A3)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B1)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する11~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の177~187位を含む1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B2)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C1)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する9~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の469~477位を含む1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C2)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D1)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~528位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D2)
・配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する12~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~545位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D3)
・配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片
・配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片
・配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片
・配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片
・配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片
・配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片
・配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片
・配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片
・配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片
・ペプチド断片群(A1)の含有量、
・ペプチド断片群(A2)の含有量、
・ペプチド断片群(A3)の含有量、
・ペプチド断片群(B1)の含有量、
・ペプチド断片群(B2)の含有量、
・ペプチド断片群(C1)の含有量、
・ペプチド断片群(C2)の含有量、
・ペプチド断片群(D1)の含有量、
・ペプチド断片群(D2)の含有量、
・ペプチド断片群(D3)の含有量、
・第2のペプチド断片の含有量(好ましくは、第2のペプチド断片の含有量、並びに、第1及び第3のペプチド断片から選択された1種又は2種のペプチド断片の含有量)、
・第4のペプチド断片の含有量、
・第5のペプチド断片の含有量、
・第7のペプチド断片の含有量(好ましくは、第7のペプチド断片の含有量、並びに、第6、第8及び第9のペプチド断片から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片の含有量)、
・第8のペプチド断片の含有量(好ましくは、第8のペプチド断片の含有量、並びに、第6、第7及び第9のペプチド断片から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片の含有量)、
・第9のペプチド断片の含有量(好ましくは、第9のペプチド断片の含有量、並びに、第6、第7及び第8のペプチド断片から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片の含有量)、又は、
・第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量(好ましくは、第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量、並びに、第1、第3及び第6のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片の含有量)
を低減させることにより、脱リン酸化試薬を使用して調製された標識化核酸(当該脱リン酸化試薬により核酸の5’末端及び/又は3’末端を脱リン酸化し、脱リン酸化された核酸の5’末端及び/又は3’末端に標識物質を結合させることにより得られた標識化核酸)の、核酸検出法における検出感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1-1)アルカリホスファターゼと、前記アルカリホスファターゼに由来するペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片の含有量の比率が所定の基準値以下である場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、前記方法。
[2]前記脱リン酸化試薬が、2000U/mg以上のアルカリホスファターゼ比活性を有する、[1]に記載の方法。
[3]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A1)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A1)の含有量の比率が、下記式(A1):
(XA1/Y)×100≦5.0000 ・・・(A1)
[式中、XA1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[5]前記ペプチド断片群(A1)が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、及び、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片を含む、[4]に記載の方法。
[6]前記ペプチド断片群(A1)が、前記第1のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A1)の含有量の比率が前記式(A1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[5]に記載の方法。
[7]前記ペプチド断片群(A1)が、前記第2のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A1)の含有量の比率が前記式(A1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]前記ペプチド断片群(A1)が、前記第3のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A1)の含有量の比率が前記式(A1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦2.3000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[5]~[7]のいずれか一つに記載の方法。
[9]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の86~90位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A2)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A2)の含有量の比率が、以下の式(A2):
(XA2/Y)×100≦2.4000 ・・・(A2)
[式中、XA2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[10]前記ペプチド断片群(A2)が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、及び、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[9]に記載の方法。
[11]前記ペプチド断片群(A2)が、前記第1のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A2)の含有量の比率が前記式(A2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[10]に記載の方法。
[12]前記ペプチド断片群(A2)が、前記第2のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A2)の含有量の比率が前記式(A2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[10]又は[11]に記載の方法。
[13]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の93~105位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A3)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A3)の含有量の比率が、以下の式(A3):
(XA3/Y)×100≦4.5000 ・・・(A3)
[式中、XA3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A3)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[14]前記ペプチド断片群(A3)が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、及び、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[13]に記載の方法。
[15]前記ペプチド断片群(A3)が、前記第1のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A3)の含有量の比率が前記式(A3)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[14]に記載の方法。
[16]前記ペプチド断片群(A3)が、前記第3のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A3)の含有量の比率が前記式(A3)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦2.3000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[14]又は[15]に記載の方法。
[17]前記脱リン酸化試薬が、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[18]前記脱リン酸化試薬が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が前記式(2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[17]に記載の方法。
[19]前記脱リン酸化試薬が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が前記式(2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦2.3000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす、[17]又は[18]に記載の方法。
[20]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b1):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b1)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[4]~[19]のいずれか一つに記載の方法。
[21]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B1)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B1)の含有量の比率が、以下の式(B1):
(XB1/Y)×100≦0.6000 ・・・(B1)
[式中、XB1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(B1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[22]前記ペプチド断片群(B1)が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片を含む、[21]に記載の方法。
[23]前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B1)の含有量の比率が前記式(B1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
[式中、X4は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[22]に記載の方法。
[24]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する11~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の177~187位を含む1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(B2)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B2)の含有量の比率が、以下の式(B2):
(XB2/Y)×100≦0.6000 ・・・(B2)
[式中、XB2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(B2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[25]前記ペプチド断片群(B2)が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片を含む、[24]に記載の方法。
[26]前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(B2)の含有量の比率が前記式(B2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
[式中、X4は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[25]に記載の方法。
[27]前記脱リン酸化試薬が、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
[式中、X4は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[28]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b2):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b2)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[21]~[27]のいずれか一つに記載の方法。
[29]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C1)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C1)の含有量の比率が、以下の式(C1):
(XC1/Y)×100≦0.1800 ・・・(C1)
[式中、XC1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(C1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[30]前記ペプチド断片(C1)が、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片を含む、[29]に記載の方法。
[31]前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C1)の含有量の比率が前記式(C1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第5のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(5):
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
[式中、X5は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第5のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[30]に記載の方法。
[32]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する9~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の469~477位を含む1種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(C2)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C2)の含有量の比率が、以下の式(C2):
(XC2/Y)×100≦0.1800 ・・・(C2)
[式中、XC2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(C2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[33]前記ペプチド断片(C2)が、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片を含む、[32]に記載の方法。
[34]前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(C2)の含有量の比率が前記式(C2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第5のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(5):
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
[式中、X5は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第5のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[33]に記載の方法。
[35]前記脱リン酸化試薬が、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第5のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(5):
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
[式中、X5は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第5のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[36]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b3):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b3)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[29]~[35]のいずれか一つに記載の方法。
[37]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D1)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が、以下の式(D1):
(XD1/Y)×100≦4.4000 ・・・(D1)
[式中、XD1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[38]前記ペプチド断片(D1)が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片、及び、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種、3種又は4種のペプチド断片を含む、[37]に記載の方法。
[39]前記ペプチド断片群(D1)が、前記第6のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が前記式(D1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[38]に記載の方法。
[40]前記ペプチド断片群(D1)が、前記第7のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が前記式(D1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(7):
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
[式中、X7は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第7のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[38]又は[39]に記載の方法。
[41]前記ペプチド断片(D1)が、前記第8のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が前記式(D1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(8):
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
[式中、X8は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第8のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[38]~[40]のいずれか一つに記載の方法。
[42]前記ペプチド断片(D1)が、前記第9のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が前記式(D1)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[38]~[41]のいずれか一つに記載の方法。
[43]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~528位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D2)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D2)の含有量の比率が、以下の式(D2):
(XD2/Y)×100≦3.4000 ・・・(D2)
[式中、XD2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[44]前記ペプチド断片群(D2)が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片、及び、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[43]に記載の方法。
[45]前記ペプチド断片群(D2)が、前記第6のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D2)の含有量の比率が前記式(D2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[44]に記載の方法。
[46]前記ペプチド断片群(D2)が、前記第7のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D2)の含有量の比率が前記式(D2)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(7):
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
[式中、X7は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第7のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[44]又は[45]に記載の方法。
[47]前記脱リン酸化試薬が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する12~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~545位を含む2種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D3)を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D3)の含有量の比率が、以下の式(D3):
(XD3/Y)×100≦1.0000 ・・・(D3)
[式中、XD3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D3)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[48]前記ペプチド断片群(D3)が、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片、及び、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片を含む、[47]に記載の方法。
[49]前記ペプチド断片群(D3)が、前記第8のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D3)の含有量の比率が前記式(D3)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(8):
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
[式中、X8は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第8のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[48]に記載の方法。
[50]前記ペプチド断片群(D3)が、前記第9のペプチド断片を含み、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D3)の含有量の比率が前記式(D3)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[48]又は[49]に記載の方法。
[51]前記脱リン酸化試薬が、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(7):
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
[式中、X7は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第7のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[52]前記脱リン酸化試薬が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が前記式(7)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[51]に記載の方法。
[53]前記脱リン酸化試薬が、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が前記式(7)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量が、下記式(8):
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
[式中、X8は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第8のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[51]又は[52]に記載の方法。
[54]前記脱リン酸化試薬が、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が前記式(7)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[51]~[53]のいずれか一つに記載の方法。
[55]前記脱リン酸化試薬が、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(8):
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
[式中、X8は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第8のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[56]前記脱リン酸化試薬が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が前記式(8)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[55]に記載の方法。
[57]前記脱リン酸化試薬が、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が前記式(8)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[55]又は[56]に記載の方法。
[58]前記脱リン酸化試薬が、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[59]前記脱リン酸化試薬が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量の比率が前記式(9)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[58]に記載の方法。
[60]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b4):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b4)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[37]~[59]のいずれか一つに記載の方法。
[61]前記脱リン酸化試薬が、
配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片、
配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片、
配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片、
配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片、及び
配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片
を含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量が、それぞれ、下記式(2)、(4)、(5)、(7)、(8)及び(9):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X2、X4、X5、X7、X8及びX9は、それぞれ、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。
[62]前記脱リン酸化試薬が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量が、それぞれ、下記式(2)、(4)、(5)、(7)、(8)及び(9)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第1のペプチド断片の含有量が、下記式(1):
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
[式中、X1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第1のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[61]に記載の方法。
[63]前記脱リン酸化試薬が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量が、それぞれ、下記式(2)、(4)、(5)、(7)、(8)及び(9)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第3のペプチド断片の含有量が、下記式(3):
(X3/Y)×100≦2.3000 ・・・(3)
[式中、X3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第3のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[61]又は[62]に記載の方法。
[64]前記脱リン酸化試薬が、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片をさらに含有し、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量が、それぞれ、下記式(2)、(4)、(5)、(7)、(8)及び(9)を満たすとともに、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第6のペプチド断片の含有量が、下記式(6):
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
[式中、X6は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第6のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する、[61]~[63]のいずれか一つに記載の方法。
[65]前記アルカリホスファターゼが、以下の(a)及び(b5):
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b5)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の78~90位、177~187位、469~477位、516~528位及び534~551位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、[61]~[64]のいずれか一つに記載の方法。
[66]前記アルカリホスファターゼ(b5)が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の91~109位、93~105位及び529~531位からなる群から選択された1種又は2種以上を含む、[65]に記載の方法。
[67]前記アルカリホスファターゼ(b5)が、配列番号10に記載のアミノ酸配列の91~109位及び529~531位を含む、[65]に記載の方法。
[68]標的核酸を検出する方法であって、
前記方法が、以下の工程:
(2-1)前記標的核酸を含むサンプルを準備する工程;
(2-2)アルカリホスファターゼと、前記アルカリホスファターゼに由来するペプチド断片群とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;
(2-3)前記サンプルを前記脱リン酸化試薬で処理して前記標的核酸を脱リン酸化する工程;
(2-4)脱リン酸化された前記標的核酸を標識化する工程;
(2-5)標識化された前記標的核酸を検出する工程
を含み、
前記工程(2-2)で準備される前記脱リン酸化試薬が、請求項1~67のいずれか一項に記載の方法により品質が高いと評価された脱リン酸化試薬である、前記方法。
[69]前記標的核酸がRNAである、[68]に記載の方法。
[70]前記工程(2-5)において、前記標的核酸と、前記標的核酸にハイブリダイズし得るプローブとを接触させ、前記プローブにハイブリダイズした前記標的核酸を検出する、[68]又は[69]に記載の方法。
[71]前記プローブが支持体に固定されている、[70]に記載の方法。
以下、本明細書で使用される用語を説明する。
アルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ活性を有する酵素である。アルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ活性を有する限り特に限定されない。アルカリホスファターゼ活性は、アルカリ性(pH8~11、例えば、pH8~10又はpH9~11)において、リン酸モノエステル結合を加水分解する活性であり、その反応形式は、EC3.1.3.1に分類される。アルカリホスファターゼは、1種のアルカリホスファターゼであってもよいし、2種以上のアルカリホスファターゼの混合物であってもよい。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b1)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b1)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b2)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b2)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b3)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b3)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b4)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b4)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ;及び
(b5)配列番号10に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列の78~90位、177~187位、469~477位、516~528位及び534~551位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b5)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
第1のペプチド断片は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる。第1のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号1:EAEAEFLIPAEEENPAFWNRQAAQ)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の86~109位に相当する。
第2のペプチド断片は、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる。第2のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号2:EGVSLEKREAEAE)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の78~90位に相当する。
第3のペプチド断片は、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる。第3のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号3:IPAEEENPAFWNR)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の93~105位に相当する。
第4のペプチド断片は、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる。第4のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号4:DRQVPDSAGTA)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の177~187位に相当する。
第5のペプチド断片は、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる。第5のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号5:APGKALDSK)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の469~477位に相当する。
第6のペプチド断片は、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる。第6のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号6:VPLASETHGGEDVAVF)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~531位に相当する。
第7のペプチド断片は、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる。第7のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号7:VPLASETHGGEDV)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~528位に相当する。
第8のペプチド断片は、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる。第8のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号8:GPQAHLVHGVQEETFVAH)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~551位に相当する。
第9のペプチド断片は、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる。第9のペプチド断片のアミノ酸配列(配列番号9:GPQAHLVHGVQE)は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~545位に相当する。
ペプチド断片群(A1)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(A1)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群(A1)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。好ましい実施形態において、ペプチド断片群(A1)は、3種以上のペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(A2)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(A2)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の86~90位(EAEAE)を含む。ペプチド断片群(A2)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の86~90位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(A3)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(A3)を構成するそれぞれのペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の93~105位(IPAEEENPAFWNR)を含む。ペプチド断片群(A3)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の71~130位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の93~105位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(B1)は、1種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(B1)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群(B1)は、1種以上のペプチド断片で構成されてもよいし、2種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群(B1)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(B2)は、1種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(B2)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する11~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の177~187位(DRQVPDSAGTA)を含む。ペプチド断片群(B2)は、1種以上のペプチド断片で構成されてもよいし、2種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群(B2)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の161~200位から選択された連続する11~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の177~187位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(C1)は、1種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(C1)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群(C1)は、1種以上のペプチド断片で構成されてもよいし、2種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群(C1)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する5~20個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(C2)は、1種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(C2)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する9~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の469~477位(APGKALDSK)を含む。ペプチド断片群(C2)は、1種以上のペプチド断片で構成されてもよいし、2種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群(C2)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の451~490位から選択された連続する9~20個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の469~477位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(D1)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(D1)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群(D1)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する5~50個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。好ましい実施形態において、ペプチド断片群(D1)は、3種以上のペプチド断片で構成される。さらに好ましい実施形態において、ペプチド断片群(D1)は、4種以上のペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(D2)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(D2)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~528位(VPLASETHGGEDV)を含む。ペプチド断片群(D2)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する13~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の516~528位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
ペプチド断片群(D3)は、2種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群(D3)を構成する各ペプチド断片は、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する12~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~545位(GPQAHLVHGVQE)を含む。ペプチド断片群(D3)は、脱リン酸化試薬に含有されるペプチド断片のうち、配列番号10に記載のアミノ酸配列の501~578位から選択された連続する12~50個のアミノ酸残基からなり、配列番号10に記載のアミノ酸配列の534~545位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
以下、本明細書で使用される式を説明する。
本明細書で使用される式は、以下の通りである。
(XA1/Y)×100≦5.0000 ・・・(A1)
(XA2/Y)×100≦2.4000 ・・・(A2)
(XA3/Y)×100≦4.5000 ・・・(A3)
(XB1/Y)×100≦0.6000 ・・・(B1)
(XB2/Y)×100≦0.6000 ・・・(B2)
(XC1/Y)×100≦0.1800 ・・・(C1)
(XC2/Y)×100≦0.1800 ・・・(C2)
(XD1/Y)×100≦4.4000 ・・・(D1)
(XD2/Y)×100≦3.4000 ・・・(D2)
(XD3/Y)×100≦1.0000 ・・・(D3)
(X1/Y)×100≦1.0000 ・・・(1)
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
(X3/Y)×100≦2.3000 ・・・(3)
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
(X6/Y)×100≦1.0000 ・・・(6)
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
以下、LC-MS/MS分析及びLC-UV分析について説明する。
LC-MS/MS分析及びLC-UV分析は、求めるべき比率が、脱リン酸化試薬と同一であるサンプルを使用して実施される。LC-MS/MS分析及びLC-UV分析は、例えば、脱リン酸化試薬から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が10重量%である水溶液を使用して実施することができる。
LC-MS/MS分析の具体的条件は、以下の通りである。
<装置構成>
質量分析計:maXis impact(Bruker Daltnics,Inc.製)
<質量分析条件>
イオン化方式:ESI
測定イオン:正イオン
キャピラリー電圧:4500V
ネブライザー:2.0bar
ドライガス:8.0L/分
検出器電圧:1823V
測定範囲(MS):m/z 50~2200
<MS/MS条件>
測定範囲(MS):m/z 50~2200
コリジョンガス:窒素
LC-UV分析の具体的条件は、以下の通りである。
<装置構成>
液体クロマトグラフ:LC-30Aシステム(島津製作所製)
検出器:UV-Vis(190~900nm、島津製作所製)
<液体クロマトグラフィー条件>
カラム:Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation製)カラムサイズ:2.1mm×100mm
カラム温度:50℃
移動相流速:0.2mL/分
移動相A:水/ギ酸混液(1000:1)
移動相B:アセトニトリル/水/ギ酸混液(900:100:1)
注入量:20μL
グラジエントプログラム:
本発明は、第1態様として、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法を提供する。
(1-1)アルカリホスファターゼと、該アルカリホスファターゼに由来するペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片の含有量の比率が所定の基準値以下である場合に、脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む。
この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b1)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b1)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b2)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
この実施形態において、脱リン酸化試薬は、上記アルカリホスファターゼ(a)及び(b2)から選択された1種又は2種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
・ペプチド断片群(A1)
・ペプチド断片群(A2)
・ペプチド断片群(A3)
・ペプチド断片群(B1)
・ペプチド断片群(B2)
・ペプチド断片群(C1)
・ペプチド断片群(C2)
・ペプチド断片群(D1)
・ペプチド断片群(D2)
・ペプチド断片群(D3)
・第2のペプチド断片(好ましくは、第2のペプチド断片、並びに、第1及び第3のペプチド断片からなる群から選択された1種又は2種のペプチド断片)
・第4のペプチド断片
・第5のペプチド断片
・第7のペプチド断片(好ましくは、第7のペプチド断片、並びに、第6、第8及び第9のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片)
・第8のペプチド断片(好ましくは、第8のペプチド断片、並びに、第6、第7及び第9のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片)
・第9のペプチド断片(好ましくは、第9のペプチド断片、並びに、第6、第7及び第8のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片)・第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片(好ましくは、第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片、並びに、第1、第3及び第6のペプチド断片からなる群から選択された1種、2種又は3種のペプチド断片)
本発明の第2の態様に係る方法は、標的核酸を検出する方法に関する。なお、標的核酸の定量が実施されれば必然的に標的核酸の検出も実施されることになるので、本発明の第2の態様に係る方法には、標的核酸の定量に伴う標的核酸の検出も包含される。標的核酸の定量は、例えば、検出された標的核酸の強度(例えば、検出された標識物質の強度)に基づいて行うことができる。
(2-1)標的核酸を含むサンプルを準備する工程;
(2-2)アルカリホスファターゼと、該アルカリホスファターゼに由来するペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;
(2-3)サンプルを脱リン酸化試薬で処理して標的核酸を脱リン酸化する工程;
(2-4)脱リン酸化された標的核酸を標識化する工程;及び
(2-5)標識化された標的核酸を検出する工程
を含む。
実施例及び比較例で使用されたLC-MS/MS分析の条件は以下の通りである。
<装置構成>
質量分析計:maXis impact(Bruker Daltnics,Inc.製)
<質量分析条件>
イオン化方式:ESI
測定イオン:正イオン
キャピラリー電圧:4500V
ネブライザー:2.0bar
ドライガス:8.0L/分
検出器電圧:1823V
測定範囲(MS):m/z 50~2200
<MS/MS条件>
測定範囲(MS):m/z 50~2200
コリジョンガス:窒素
実施例及び比較例で使用されたLC-UV分析の条件は以下の通りである。
<装置構成>
液体クロマトグラフ:LC-30Aシステム(島津製作所製)
検出器:UV-Vis(190~900nm,島津製作所製)
<液体クロマトグラフィー条件>
カラム:Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation製)カラムサイズ:2.1mm×100mm
カラム温度:50℃
移動相流速:0.2mL/分
移動相A:水/ギ酸混液(1000:1)
移動相B:アセトニトリル/水/ギ酸混液(900:100:1)
注入量:20μL
グラジエントプログラム:
実施例及び比較例で使用された核酸検出法は以下の通りである。
核酸の検出は、DNAチップ(DNAマイクロアレイ)を使用して行った。具体的には、東レ株式会社製の“3D-Gene” human miRNA oligo chip(miRBase release 21対応)を使用して行った。
5社から購入した8種類のアルカリホスファターゼ製品(以下「組成物C1」~「組成物C8」という。)を、比較例1~8のアルカリホスファターゼ組成物として使用した。組成物C1~C8のそれぞれに含まれるアルカリホスファターゼは、ウシの腸管由来のアルカリホスファターゼである。組成物C1~C8のそれぞれのアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物C1は2238U/mg、組成物C2は2492U/mg、組成物C3は2431U/mg、組成物C4は2519U/mg、組成物C5は2411U/mg、組成物C6は2552U/mg、組成物C7は2448U/mg、組成物C8は2490U/mgであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、p-ニトロフェニルリン酸を使用する方法で測定した。具体的には、以下の通りである。
溶液A:1M ジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)
溶液B:0.67M p-ニトロフェノールリン酸水溶液
溶液A 2.9mLと溶液B 0.1mLとをキュベット(光路長=1cm)に調製し、37℃で5分間加温した。次いで、アルカリホスファターゼ水溶液 0.1mLを添加し、分光光度計で405nm(37℃)の吸光度変化を3~5分間測定し、単位時間あたりの吸光度変化を求めた(ΔOD)。対照としてアルカリホスファターゼ水溶液の代わりに水を添加したサンプルで吸光度変化を求めた(ΔODブランク)。下記式によりアルカリホスファターゼ活性(U/mL)を算出した。
アルカリホスファターゼ活性(U/mL)=(ΔOD-ΔODブランク)×3.1/(18.2×0.1×1.0)
図2は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第2のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図3は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第3のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図4は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第4のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図5は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第5のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図6は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第6のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図7は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第7のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図8は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第8のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図9は、比較例2において組成物C2のLC-MS/MS分析により得られた、第9のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
比較例2~4及び8のアルカリホスファターゼ組成物(組成物C2~C4及びC8)を以下の方法で精製して、実施例1~4のアルカリホスファターゼ組成物(以下「組成物E1」~「組成物E4」という。)を得た。精製方法は、以下の通りである。
組成物C2(30μL)を、透析カップ(カットオフ分子量3.5K)を使用して、透析バッファ(1mL,50mM Tris-HCl,2mM MgCl2,0.2mM ZnCl2)で3回透析処理し、濃縮液を回収した。
透析処理後の濃縮液をゲル濾過カラムを使用して、バッファ(2.5mL,10mM Tris-HCl,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,50mM KCl,55重量% グリセリン)で濾過回収した。
ゲル濾過後の回収液から、疎水カラムを使用して、下記条件でアルカリホスファターゼ画分を回収した。
移動相A:20mM リン酸水素二ナトリウム、3M 硫酸アンモニウム(50/50)
移動相B:20mM リン酸水素二ナトリウム
検出器:UV214nm
グラジエントプログラム:
回収したアルカリホスファターゼ画分を上記透析と同じ条件で3回透析処理し、濃縮液を回収した。
回収した濃縮液を、限外濾過カラム(カットオフ分子量10K)を使用して、バッファ(2.5mL,10mM Tris-HCl,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,50mM KCl,55重量% グリセリン)で濾過回収し、組成物E1を得た。
図11は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第2のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図12は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第3のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図13は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第4のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図14は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第5のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図15は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第6のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図16は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第7のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図17は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第8のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図18は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-MS/MS分析により得られた、第9のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図19は、実施例1において組成物E1(組成物C2の精製品)のLC-UV分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。なお、実施例2~4及び比較例1~8において各組成物のLC-UV分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムは、図19と同様であった。
Claims (14)
- 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A1)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A1)の含有量の比率が、下記式(A1):
(XA1/Y)×100≦5.0000 ・・・(A1)
[式中、XA1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、以下のLC-MS/MS分析条件:
<質量分析条件>
イオン化方式:ESI
測定イオン:正イオン
キャピラリー電圧:4500V
検出器電圧:1823V
で実施され、
前記LC-UV分析が、以下のLC-UV分析条件:
<液体クロマトグラフィー条件>
カラム:Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation製)カラムサイズ:2.1mm×100mm
検出波長:214nm
移動相A及び移動相Bによるグラジエント条件
移動相A:水/ギ酸混液(1000:1)
移動相B:アセトニトリル/水/ギ酸混液(900:100:1)
で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片及び配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A2)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A2)の含有量の比率が、以下の式(A2):
(XA2/Y)×100≦2.4000 ・・・(A2)
[式中、XA2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる第1のペプチド断片及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる第3のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(A3)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(A3)の含有量の比率が、以下の式(A3):
(XA3/Y)×100≦4.5000 ・・・(A3)
[式中、XA3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(A3)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(2):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
[式中、X2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第4のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(4):
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
[式中、X4は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第4のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第5のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(5):
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
[式中、X5は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第5のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記と同義である。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片及び配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D1)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D1)の含有量の比率が、以下の式(D1):
(XD1/Y)×100≦4.4000 ・・・(D1)
[式中、XD1は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D1)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる第6のペプチド断片及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D2)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D2)の含有量の比率が、以下の式(D2):
(XD2/Y)×100≦3.4000 ・・・(D2)
[式中、XD2は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D2)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片及び配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片で構成されるペプチド断片群(D3)とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群(D3)の含有量の比率が、以下の式(D3):
(XD3/Y)×100≦1.0000 ・・・(D3)
[式中、XD3は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群(D3)のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第7のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(7):
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
[式中、X7は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第7のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第8のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(8):
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
[式中、X8は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第8のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;及び
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第9のペプチド断片の含有量の比率が、下記式(9):
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X9は、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 以下の工程:
(1-1)アルカリホスファターゼと、
配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる第2のペプチド断片、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる第4のペプチド断片、
配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる第5のペプチド断片、
配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる第7のペプチド断片、
配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる第8のペプチド断片、及び
配列番号9に記載のアミノ酸配列からなる第9のペプチド断片
とを含有する脱リン酸化試薬を準備する工程;並びに
(1-2)前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片の含有量が、それぞれ、下記式(2)、(4)、(5)、(7)、(8)及び(9):
(X2/Y)×100≦0.8000 ・・・(2)
(X4/Y)×100≦0.6000 ・・・(4)
(X5/Y)×100≦0.1800 ・・・(5)
(X7/Y)×100≦1.6000 ・・・(7)
(X8/Y)×100≦0.2000 ・・・(8)
(X9/Y)×100≦0.3500 ・・・(9)
[式中、X2、X4、X5、X7、X8及びX9は、それぞれ、前記脱リン酸化試薬のLC-MS/MS分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第2、第4、第5、第7、第8及び第9のペプチド断片のピーク面積値を表し、Yは、前記脱リン酸化試薬のLC-UV分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。]
を満たす場合に、前記脱リン酸化試薬の品質が高いと評価する工程
を含む、脱リン酸化試薬の品質を評価する方法であって、
前記LC-MS/MS分析が、請求項1に記載のLC-MS/MS分析条件で実施され、
前記LC-UV分析が、請求項1に記載のLC-UV分析条件で実施される、前記方法。 - 標的核酸を検出する方法であって、
前記方法が、以下の工程:
(2-1)前記標的核酸を含むサンプルを準備する工程;
(2-2)請求項1~13のいずれか一項に記載の方法を実施し、前記方法により品質が高いと評価された脱リン酸化試薬を準備する工程;
(2-3)前記サンプルを前記脱リン酸化試薬で処理して前記標的核酸を脱リン酸化する工程;
(2-4)脱リン酸化された前記標的核酸を標識化する工程;
(2-5)標識化された前記標的核酸を検出する工程
を含む、前記方法。
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