CN116615526A - 靶标物质的检测方法、流体装置及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种样品中的靶标物质的检测方法，该方法包括以下步骤：在孔阵列的各个孔中导入上述样品和在存在上述靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂的步骤；用封闭液封闭上述孔阵列的各个孔，各个孔形成各自独立的反应空间的步骤；将上述封闭液置换为吸水性的有机溶剂，其结果，上述孔的内容物脱水、容积减少，并且在上述内容物中存在上述靶标物质的情况下生成上述荧光物质的步骤；和对上述荧光物质照射激发光，并针对上述孔阵列的每个孔检测所产生的荧光的步骤，在上述孔中检测到荧光表示上述孔中存在上述靶标物质。

Description

靶标物质的检测方法、流体装置及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种靶标物质的检测方法、流体装置及试剂盒。本申请基于2020年10月6日在日本提交的日本特愿2020-169092号主张优先权，在此援引其内容。
背景技术
近年来，正在研究基于酶活性进行疾病的检测、监测。这种诊断方法被称为Activity-Based Diagnostics(ABDx)(例如，参照非专利文献1)。
作为ABDx诊断对象的疾病，可列举出病毒感染等感染性疾病、癌症等非感染性疾病等。例如，可以通过检测来源于病毒的核酸作为标志物来检测病毒感染。另外，可以通过检测癌组织中失控的组织蛋白酶等酶的活性作为疾病的标志物来检测癌症。
另外，已知血液中存在因细胞凋亡而从细胞中释放的游离DNA(cell-free DNA、cfDNA)。在癌症患者的cfDNA中还包含来源于癌细胞的DNA即血液肿瘤DNA(circulatingtumor DNA、ctDNA)。
另外，已知各种细胞分泌被称为外泌体的膜囊泡，在唾液、血液、尿液、羊水、恶性腹水等生物样品、培养细胞的上清液中包含外泌体。外泌体中包含来源于分泌它的细胞的各种蛋白质、脂质、microRNA、DNA等。
近年来，正在进行将cfDNA、外泌体等膜囊泡中的microRNA(miRNA)、DNA等应用于癌症、其他各种疾病的早期发现、抗癌剂的效果预测、疾病的因素诊断、遗传性疾病的诊断等的研究。
如此，需求一种以来源于病毒的核酸、酶、cfDNA、ctDNA、miRNA等作为靶标物质进行高灵敏度地检测的技术。
另外，专利文献1中记载了使用飞升(femtoliter)级尺寸的微室以单分子水平检测酶活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-309405号公报
非专利文献
非专利文献1：Soleimany A.P.and Bhatia S.N.,Activity-Based Diagnostics:An Emerging Paradigm for Disease Detection and Monitoring,Trends Mol Med,26(5),450-468,2020。
发明内容
发明要解决的课题
如专利文献1中所记载的微室那样，可以通过将进行酶反应的反应空间的容积微小化，缩短酶反应的检测时间。然而，若将反应空间的容积微小化，则靶标物质被捕获到反应空间的比例减少，存在检测灵敏度降低的情况。因此，本发明的目的在于提供一种能够高灵敏度地检测靶标物质的技术。
用于解决课题的技术手段
本发明包含以下方案。
[1]一种样品中的靶标物质的检测方法，包括以下步骤：
在孔阵列的各个孔中导入上述样品和在存在上述靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂的步骤；
用封闭液封闭上述孔阵列的各个孔、各个孔形成各自独立的反应空间的步骤；
将上述封闭液置换为吸水性的有机溶剂，其结果，上述孔的内容物脱水、容积减少，并且在上述内容物中存在上述靶标物质的情况下生成上述荧光物质的步骤；和
对上述荧光物质照射激发光，并针对上述孔阵列的每个孔检测所产生的荧光的步骤，
在上述孔中检测到荧光表示在上述孔中存在上述靶标物质。
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述孔阵列的各个孔具有第一孔和配置在上述第一孔的底部且容量小于上述第一孔的第二孔，当上述第一孔的内容物的容积变小时，上述内容物聚集于上述第二孔。
[3]根据[2]所述的方法，其中，上述第一孔和上述第二孔的容积之比(第一孔的容积：第二孔的容积)为10:1～1,000,000:1。
[4]根据[2]或[3]所述的方法，其中，上述第一孔的容积为1～1,000pL，上述第二孔的容积为0.1～1,000fL。
[5]根据[2]至[4]中任一项所述的方法，其中，向上述第一孔中每个孔导入0个或1个上述靶标物质。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，上述封闭液为氟系液体、矿物油或碳原子数7～17的直链状或支链状的饱和或者不饱和的烃。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，上述吸水性的有机溶剂为碳原子数4～11的直链状或支链状的饱和或不饱和的脂肪族醇。
[8]一种流体装置，其具有：
基板，在上述基板的表面配置有具备多个孔的孔阵列，上述孔具有第一孔和配置在上述第一孔的底部且容量小于上述第一孔的第二孔；
盖构件，与上述孔阵列相对地配置；以及
间隔件，使上述基板和上述盖构件之间隔开，
上述孔阵列和上述盖构件之间的空间形成供流体流动的流路。
[9]一种靶标物质检测用试剂盒，其包含[8]所述的流体装置、在存在靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂、封闭液和吸水性的有机溶剂。
发明效果
根据本发明，可以提供一种能够高灵敏度地检测靶标物质的技术。
附图说明
图1的(a)及图1的(b)是说明靶标物质的检测方法的一例的示意图。
图2的(a)是说明具有第一孔和第二孔的孔阵列的一例的示意图。图2的(b)是图2的(a)的b-b’线的向视剖面图。
图3的(a)是说明具有第一孔和第二孔的孔阵列的一例的示意图。图3的(b)是图3的(a)的b-b’线的向视剖面图。
图4的(a)至图4的(f)是说明制造孔阵列的各步骤的剖面示意图。
图5的(a)及图5的(b)是说明制造孔阵列的各步骤的剖面示意图。
图6的(a)是表示流体装置的一例的俯视图。图6(b)的是图6的(a)的b-b’线的向视剖面图。
图7的(a)至图7的(d)是说明使用流体装置实施靶标物质检测方法的顺序的一例的剖面示意图。
图8是孔阵列的显微镜照片。
图9的(a)至图9的(d)是表示实验例1的结果的照片。
图10的(a)及图10的(b)是表示实验例1的结果的图表。
图11是表示实验例1的结果的图表。
图12是表示实验例2的结果的图表。
图13是表示实验例3的结果的图表。
具体实施方式
以下，根据情况边参照附图边对本发明的实施方式详细地进行说明。需要说明的是，附图中，对相同或相当的部分赋予相同或对应的附图标记，并省略重复的说明。需要说明的是，各图中的尺寸比存在为了说明而放大的部分，且不一定与实际的尺寸比一致。
[靶标物质的检测方法]
在一个实施方式中，本发明提供一种样品中的靶标物质的检测方法，该方法包括以下步骤：在孔阵列的各个孔中导入上述样品和在存在上述靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂的步骤；用封闭液封闭上述孔阵列的各个孔，各个孔形成各自独立的反应空间的步骤；将上述封闭液置换为吸水性的有机溶剂，其结果，上述孔的内容物脱水、容积减少，并且在上述内容物中存在上述靶标物质的情况下生成上述荧光物质的步骤；和对上述荧光物质照射激发光，并针对上述孔阵列的每个孔检测所产生的荧光的步骤，在上述孔中检测到荧光表示在上述孔中存在上述靶标物质。
如下述实施例所示，根据本实施方式的方法，能够高灵敏度地检测靶标物质。
(样品)
作为样品，没有特别限定，例如可列举出：唾液、血液、尿液、羊水、恶性腹水、咽拭液、鼻腔拭液等生物样品、培养细胞的上清液等。
(靶标物质)
作为靶标物质，没有特别限定，可列举出：酶、单链核酸片段、双链核酸片段等。核酸片段也可以是来源于病毒的核酸、cfDNA、ctDNA、miRNA等。作为酶，可以将所有酶设为对象，例如可列举出：冠状病毒的主蛋白酶、碱性磷酸酯酶、来源于生物的蛋白酶等。作为来源于生物的蛋白酶，例如可列举出：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶(Cathepsin)等。
(在存在靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂)
作为在存在靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂(检测试剂)，在靶标物质为酶的情况下，可列举出与成为对象的酶对应的荧光底物。这样的荧光底物为通过酶反应能够生成荧光物质的底物。
更具体而言，在酶为肽酶的情况下，可列举出以荧光物质和猝灭物质标记的肽底物等。若这种肽底物被肽酶切割，则能够检测到荧光。另外，在酶为磷酸酶的情况下，可列举出通过加成磷酸根而使其猝灭的荧光物质等。若从这种物质中去除磷酸根，则能够检测到荧光。
另外，已经明确：在近年来已被应用于基因组编辑的CRISPR/Cas家族蛋白质中的Cas12、Cas13与gRNA和靶标核酸形成三元复合物，当切割靶标核酸时，表达切割周围DNA或RNA的活性。
通过利用该反应，能够以单链核酸片段、双链核酸片段为靶标物质(靶标核酸)，生成荧光物质。具体而言，通过使用Cas12蛋白质，能够将双链DNA片段作为靶标物质进行检测。另外，通过使用Cas13蛋白质，能够将单链RNA片段或单链DNA片段作为靶标物质进行检测。
图1的(a)和图1的(b)是对该反应进行说明的示意图。在图1的(a)和图1的(b)中，以CRISPR/Cas家族蛋白质为Cas12a蛋白质的情形为例进行说明。
首先，如图1的(a)所示，当使Cas12a蛋白质110与gRNA120接触时，它们结合而形成二元复合物130。gRNA120部分地具有与靶标核酸片段140(靶标物质)互补的碱基序列。
接着，当样品中的靶标核酸片段140与二元复合物130接触时，Cas12a蛋白质110、gRNA120、靶标核酸片段140形成三元复合物100。在该阶段中，由于Cas12a蛋白质110不表达核酸酶活性，因此底物核酸片段150未被切割。在图1的(a)和图1的(b)的例子中，底物核酸片段150为以荧光物质F和猝灭物质Q标记的单链DNA片段。即使对底物核酸片段150照射激发光，也不会产生荧光。
当形成三元复合物100时，Cas12a蛋白质110切割靶标核酸片段140的靶标部位。在图1的(a)中，用箭头表示靶标核酸片段140的靶标部位。图1的(b)是表示靶标核酸片段140的靶标部位被切割后的三元复合物100'的示意图。如图1的(b)所示，三元复合物100'表达核酸酶活性。然后，切割存在于三元复合物100'的周围的底物核酸片段150。其结果，底物核酸片段150的荧光物质F从猝灭物质Q分离。当对从猝灭物质Q分离的荧光物质F照射激发光时，能够检测到荧光。在检测到荧光的情况下，能够判断样品中存在靶标核酸片段140。
在这种情况下，可以说在存在靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂是CRISPR/Cas家族蛋白质110、gRNA120和底物核酸片段150。
需要说明的是，样品、CRISPR/Cas家族蛋白质110、gRNA120、底物核酸片段150可以以任意顺序混合接触。
例如，首先，可以使CRISPR/Cas家族蛋白质110与gRNA120接触而预先形成二元复合物130，然后使其接触样品。在这种情况下，在样品中存在靶标核酸片段140的情况下，靶标核酸片段140与二元复合物130结合而形成三元复合物100。然后，可以使其接触底物核酸片段150。
或者，可以在形成二元复合物130之后，使其同时接触靶标核酸片段140和底物核酸片段150。
或者，可以同时接触CRISPR/Cas家族蛋白质110、gRNA120、样品。即使在这种情况下，在样品中存在靶标核酸片段140时，最终也能形成三元复合物100。然后，可以使其与底物核酸片段150接触。
或者，可以同时接触样品、CRISPR/Cas家族蛋白质110、gRNA120、底物核酸片段150。即使在这种情况下，在样品中存在靶标核酸片段140时，最终也形成三元复合物100，在三元复合物100中，当靶标核酸片段140的靶标部位被切割时，转化为三元复合物100'，表达核酸酶活性，从而底物核酸片段150被切割。
<<gRNA>>
在本实施方式的方法中，向导RNA(gRNA)只要能够用于所使用的CRISPR/Cas家族蛋白质即可，没有特别限定，可以是CRISPR RNA(crRNA)与反式激活型CRISPR RNA(tracrRNA)的复合物，也可以是使tracrRNA与crRNA组合而成的单一的gRNA(sgRNA)，也可以仅是crRNA。
在所使用的CRISPR/Cas家族蛋白质为Cas12a蛋白质的情况下，crRNA例如可以设为以下的碱基序列。首先，将从靶标碱基序列中除去前间隔序列邻近基序(Proto spaceradjacent motif，PAM)序列后的碱基序列设为间隔碱基序列。接着，设计在间隔碱基序列的3'末端连结有支架(scaffold)序列的碱基序列，并将其互补链设为crRNA的碱基序列。
例如，当从靶标碱基序列中除去PAM序列后的碱基序列为“5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'”(序列号1)时，Cas12a蛋白质用的crRNA的碱基序列可以为5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3’(序列号2)。
在所使用的CRISPR/Cas家族蛋白质为Cas13a蛋白质的情况下，crRNA可以设为例如以下的碱基序列。首先，设计在与靶标碱基序列互补的碱基序列的3'末端连结有支架序列的碱基序列，并将其互补链设为crRNA的碱基序列。
例如，在靶标碱基序列为5’-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3’(序列号3)的情况下，C a s 13a蛋白质用的crRNA的碱基序列可以设为5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3’(序列号4)。
<<CRISPR/Cas家族蛋白质>>
作为CRISPR/Cas家族蛋白质，只要在与gRNA和靶标核酸片段形成三元复合物后表达核酸酶活性即可使用。如上所述，更准确地说，在形成三元复合物且CRIS PR/Cas家族蛋白质切割靶标核酸片段后，表达核酸酶活性。
作为这样的CRISPR/Cas家族蛋白质，可列举出：Cas12蛋白质、Cas13蛋白质等。在本说明书中，Cas12蛋白质、Cas13蛋白质可以是Cas12蛋白质、Cas13蛋白质、这些蛋白质的直系同源物、这些蛋白质的修饰物等。
作为可以用于本实施方式的方法的更具体的CRISPR/Cas家族蛋白质，例如可列举出：来源于Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cas12a蛋白质(LbCas12a，UniProtKB登录号：A0A182DWE3)、来源于Acidaminococcus sp.的Cas12a蛋白质(AsCas12a，UniProtKB登录号：U2UMQ6)、来源于Francisella tularensis subsp.novicida的Cas12a蛋白质(FnCas12a，UniProtKB登录号：A0Q7Q2)、来源于Alicyclobacillus acidoterrestris的Cas12b蛋白质(AaCas12b，UniProtKB登录号：T0D7A2)、来源于Leptotrichia wadei的Cas13a蛋白质(LwaCas13a，NCBI登录号：WP_021746774.1)、来源于Lachnospiraceaebacterium NK4A179的Cas13a蛋白质(LbaCas13a，NCBI登录号：WP_022785443.1)、来源于Leptotrichia buccalis C-1013-b的Cas13a蛋白质(LbuCas13a，NCBI登录号：WP_015770004.1)、来源于Bergeyella zoohelcum的Cas13b蛋白质(BzoCas13b，NCBI登录号：WP_002664492)、来源于Prevotella intermedia的Cas13b蛋白质(PinCas13b，NCBI登录号：WP_036860899)、来源于Prevotella buccae的Cas13b蛋白质(PbuCas13b，NCBI登录号：WP_004343973)、来源于Alistipes sp.ZOR0009的Cas13b蛋白质(AspCas13b，NCBI登录号：WP_047447901)、来源于Prevotella sp.MA2016的Cas13b蛋白质(PsmCas13b，NCBI登录号：WP_036929175)、来源于Riemerella anatipestifer的Cas13b蛋白质(RanCas13b，NCBI登录号：WP_004919755)、来源于Prevotella aurantiaca的Cas13b蛋白质(PauCas13b，NCBI登录号：WP_025000926)、来源于Prevotella saccharolytica的Cas13b蛋白质(PsaCas13b，NCBI登录号：WP_051522484)、来源于Prevotella intermedia的Cas13b蛋白质(Pin2Cas13b，NCBI登录号：WP_061868553)、来源于Capnocytophaga canimorsus的Cas13b蛋白质(CcaCas13b，NCBI登录号：WP_013997271)、来源于Porphyromonas gulae的Cas13b蛋白质(PguCas13b，NCBI登录号：WP_039434803)、来源于Prevotellasp.P5-125的Cas13b蛋白质(PspCas13b，NCBI登录号：WP_044065294)、来源于Porphyromonas gingivalis的Cas13b蛋白质(PigCas13b，NCBI登录号：WP_053444417)、来源于Prevotella intermedia的Cas13b蛋白质(Pin3Cas13b，NCBI登录号：WP_050955369)、来源于Enterococcus italicus的Csm6蛋白质(EiCsm6，NCBI登录号：WP_007208953.1)、来源于Lactobacillus salivarius的Csm6蛋白质(LsCsm6，NCBI登录号：WP_081509150.1)、来源于Thermus thermophilus的Csm6蛋白质(TtCsm6，NCBI登录号：WP_011229148.1)等。
在本实施方式的方法中，CRISPR/Cas家族蛋白质也可以是上述的Cas家族蛋白质的变异体。作为变异体，例如，可以使用形成三元复合物后的提高了核酸酶活性的变异体等。
<<底物核酸片段>>
底物核酸片段被荧光物质和猝灭物质标记，当被上述三元复合物的核酸酶活性切割而上述荧光物质从上述猝灭物质分离时，通过照射激发光而发出荧光。
底物核酸片段可以根据所使用的CRISPR/Cas家族蛋白质的底物特异性来适当选择。例如，Cas12蛋白质以单链DNA为底物进行切割。因此，在使用Cas12蛋白质的情况下，以使用单链DNA作为底物核酸片段为宜。另外，Cas13蛋白质以单链RNA为底物进行切割。因此，在使用Cas13蛋白质的情况下，以使用单链RNA作为底物核酸片段为宜。
关于荧光物质和猝灭物质的组合，使用当它们相互靠近时能够将荧光物质的荧光猝灭的组合。例如，当使用FAM、HEX等作为荧光物质时，可以使用Iowa Black FQ(IDT公司)、TAMR A等作为猝灭物质。
(孔阵列)
在本实施方式的方法中，孔阵列的各个孔具有第一孔和配置在第一孔的底部且容量小于第一孔的第二孔。当第一孔的内容物的容积变小时，内容物可以聚集于第二孔。
图2的(a)和图2的(b)是说明具有第一孔和第二孔的孔阵列的一例的示意图。图2的(a)是俯视图，图2的(b)是图2的(a)的b-b'线的向视剖面图。
如图2的(a)和图2的(b)所示，孔阵列200形成于基板210的一个面上。而且，孔阵列200的各个孔具有第一孔220和配置在孔220的底部且容量小于孔220的第二孔230。如后所述，当第一孔220的内容物的容积变小时，内容物聚集于第二孔230中。
即，通过在大容量的孔220中捕获靶标物质且利用小容量的孔230进行检测，由此可以高灵敏度地检测靶标物质，还可缩短检测所需的时间。
第一孔220与第二孔230的容积之比(孔220的容积：孔230的容积)可以为10:1～1,000,000:1。
或者，可以是第一孔220的容积为1～1,000pL，且第二孔230的容积为0.1～1,000fL。
图3的(a)和图3的(b)是说明具有第一孔和第二孔的孔阵列的另一例的示意图。图3的(a)是俯视图，图3的(b)是图3的(a)的b-b'线的向视剖面图。
如图3的(a)和图3的(b)所示，孔阵列300形成于基板210的一个面上。如孔阵列300那样，每个第一孔220可以配置多个第二孔230。在这种情况下，若第一孔220的内容物的容积变小，则内容物也聚集于第二孔230中。
对第一孔220和第二孔230的形状没有特别限制。例如，可以是圆筒形、由多个面构成的多面体(例如，长方体、六棱柱、八棱柱等)等。
优选多个第一孔220分别为相同形状相同大小，且优选多个第二孔230分别为相同形状相同大小。在此，所谓相同形状相同大小，只要是在用于进行数字测量所要求的程度上为同一形状且同一容量即可，允许制造上的误差程度的偏差。
(孔阵列的制造方法)
以孔阵列300为例，对具有第一孔和第二孔的孔阵列的制造方法的一例进行说明。
图4的(a)～图4的(f)以及图5的(a)和图5的(b)是说明制造孔阵列300的各步骤的剖面示意图。首先，如图4的(a)所示，在基板210的表面层叠膜400。
作为基板210的材质，可列举出玻璃、树脂等。作为树脂，可列举出例如：聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、环状聚烯烃、丙烯酸等。作为膜400的材质，可列举出氟树脂、环状聚烯烃、硅树脂等。
接着，如图4的(c)所示，在膜400的表面层叠抗蚀剂膜410。接着，使用孔阵列图案的掩模，利用曝光机照射活性能量射线而对抗蚀剂膜410进行曝光。接着，如图4的(d)所示，利用显影液进行显影，去除形成孔的部分的抗蚀剂膜410。
接着，如图4的(e)所示，通过对被抗蚀剂膜410掩模了的膜400进行蚀刻，在膜400上形成第二孔230。
接着，如图4的(f)所示，通过清洗基板来去除抗蚀剂膜410，得到孔230的阵列。
接着，如图5的(a)所示，在图4的(f)中获得的孔230的阵列上再次层叠抗蚀剂膜410。作为抗蚀剂膜410，可以优选使用片型抗蚀剂。
接着，如图5的(b)所示，使用孔阵列图案的掩模，利用曝光机照射活性能量射线而对抗蚀剂膜410进行曝光。接着，利用显影液进行显影，去除形成第一孔220的部分抗蚀剂膜410。其结果，获得具有第一孔220和第二孔230的孔阵列300。
在本实施方式的方法中，优选向每个第一孔中导入0个或1个靶标物质。通过向每个第一孔中导入0个或1个靶标物质，可以进行数字测量。也就是说，可以使已经检测到荧光的孔的个数对应于样品中的靶标物质的分子数。
(封闭液)
封闭液优选不与水混溶。“不与水混溶”是指在水和封闭液充分混合后，静置时分离成水相和有机相。另外，优选封闭液的吸水性低。吸水性低是指在20℃下与等容量的水混合并静置，分离成水相和有机相时的有机层的体积变化为1％以下。
作为封闭液，可以使用沸点为约100℃以上且室温下为液态的物质。作为具体的封闭液，可列举出：FC-40、FC-43、FC-770、FC-72、FC-3283(均为3M公司制造)、Fomblin(注册商标)Oil(SOLVAY公司)等含氟液体、矿物油(Sigma-Aldrich公司)、碳原子数7～17的直链状或支链状的饱和或不饱和的烃等。这些封闭液既可以单独使用一种，也可以混合两种以上来使用。
作为碳原子数7～17的直链状或支链状的饱和或不饱和的烃，可列举出：庚烷(C7H16)、辛烷(C8H18)、壬烷(C9H20)、癸烷(C10H22)、十一烷(C11H24)、十二烷(C12H26)、十三烷(C13H28)、十四烷(C14H30)、十五烷(C15H32)、十六烷(C16H34)、十七烷(C17H36)、庚烯(C7H14)、辛烯(C8H16)、壬烯(C9H18)、癸烯(C10H20)、十一碳烯(C11H22)、十二碳烯(C12H24)、十三碳烯(C13H26)、十四碳烯(C14H28)、十五碳烯(C15H30)、十六碳烯(C16H32)、十七碳烯(C17H34)等。这些烃可以是任意的异构体。
例如，作为辛烷的异构体，可列举出：1-辛烷、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、2,2-二甲基己烷、2,3-二甲基己烷、2,3,3-三甲基戊烷等。另外，例如，作为辛烯的异构体，可列举出：1-辛烯、2-甲基-1-庚烯、2,3-二甲基-1-己烯、2-乙基-1-己烯、2,3,3-三甲基-1-丁烯等。
(吸水性的有机溶剂)
作为吸水性的有机溶剂，可以使用沸点为约100℃以上、在室温下为液态、不与水混溶的吸水性的有机溶剂，可列举出碳原子数4～11的直链状或支链状的饱和或不饱和的脂肪族醇。“不与水混溶”是指在水和有机溶剂充分混合后，静置时分离成水相和有机相。另外，吸水性是指溶解水。吸水性的有机溶剂既可以是一元醇，也可以是二元以上的醇。
作为具体的吸水性的有机溶剂，可列举出：丁醇(C4H10O)、戊醇(C5H12O)、己醇(C6H14O)、庚醇(C7H16O)、辛醇(C8H18O)、壬醇(C9H20O)、癸醇(C10H22O)、十一醇(C11H24O)、戊二醇(C5H12O2)等。这些醇可以是任意的异构体。另外，这些醇可以单独使用一种，也可以混合两种以上来使用。
例如，作为辛醇的异构体，可列举出：1-辛醇、异辛醇、2-乙基己醇等。另外，例如，作为戊二醇的异构体，可列举出：1,5-戊二醇、1,2-戊二醇、2,3-戊二醇等。
如下述的实施例所示，特别是在使用1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇的情况下，可确认到由脱水浓缩所致的荧光强度提高，存在能够高灵敏度地检测靶标物质的倾向。
[流体装置]
在一个实施方式中，本发明提供一种流体装置，其具有基板、盖构件和间隔件，上述基板在表面配置有孔阵列，该孔阵列具备多个孔，该孔具有第一孔和配置在上述第一孔的底部且容量小于上述第一孔的第二孔，上述盖构件与上述孔阵列相对地配置，上述间隔件使上述基板和上述盖构件之间隔开，上述孔阵列和上述盖构件之间的空间形成供流体流动的流路。
在本实施方式的流体装置中，关于表面配置有孔阵列的基板，与上述的基板相同。
图6的(a)是表示本实施方式的流体装置的一例的俯视图。图6的(b)是图6的(a)的b-b'线的向视剖面图。
如图6的(a)和图6的(b)所示，流体装置600具有基板210、间隔件610和形成有液体导入口621的盖构件620，上述基板210在表面配置有孔阵列200，该孔阵列200具备多个孔，该孔具有第一孔220和配置在第一孔220的底部且容量小于第一孔220的第二孔230。基板210与盖构件620之间的空间630作为供样品、检测试剂、封闭液、吸水性的有机溶剂等流动的流路发挥作用。
本实施方式的流体装置能够适当地用于上述的靶标物质的检测方法的用途。
(靶标物质的检测方法)
这里，一边参照图7的(a)～图7的(d)一边更具体地说明上述的实施方式涉及的靶标物质的检测方法。
如上所述，靶标物质的检测方法包括以下步骤：
在孔阵列的各个孔中导入上述样品和试剂(该试剂在存在上述靶标物质的情况下能够生成荧光物质)的步骤；
用封闭液封闭上述孔阵列的各个孔、各个孔形成各自独立的反应空间的步骤；
将上述封闭液置换为吸水性的有机溶剂，其结果上述孔的内容物脱水、容积减少，并且在上述内容物中存在上述靶标物质的情况下生成上述荧光物质的步骤；以及
对上述荧光物质照射激发光，并针对上述孔阵列的每个孔检测所产生的荧光的步骤。
图7的(a)～图7的(d)是说明实施靶标物质的检测方法的顺序的一例的剖面示意图。在图7的(a)～图7的(d)中，将单链RNA片段(tgRNA)作为靶标物质进行检测。另外，作为在存在靶标物质的情况下能生成荧光物质的试剂，使用Cas13a蛋白质、gRNA(crRNA)和底物核酸片段。
首先，如图7的(a)所示，从流体装置600的液体导入口621导入混合有样品、Cas13a蛋白质、crRNA、底物核酸片段的测定溶液(Assay solution)710。其结果，如图7的(a)所示，孔220的内部、孔230的内部以及基板210与盖构件620之间的空间630被测定溶液710填满。即，在孔阵列的各个孔中导入样品和在存在靶标物质的情况下能生成荧光物质的试剂。
接着，用封闭液封闭孔阵列的各个孔。具体而言，从液体导入口621导入封闭剂720。当导入密封剂720时，在孔220的内部填满测定溶液710的状态下，孔220的开口部被封闭剂720封闭。其结果，各个孔形成各自独立的反应空间。
接着，如图7的(b)所示，用吸水性的有机溶剂730置换封闭剂720。其结果，孔的内容物(测定溶液710)脱水、容积减少(被浓缩)，并且在测定溶液710中Cas13a-crRNA-tgRNA三元复合物切割底物核酸片段(Reporter)。其结果，与底物核酸片段结合的荧光物质F从猝灭物质Q分离，通过照射激发光而发出荧光。在孔中检测到荧光则表示在该孔中存在靶标物质。
需要说明的是，在测定溶液710中不存在靶标物质的情况下，由于未形成Cas13a-crRNA-tgRNA三元复合物，因此底物核酸片段未被切割，不产生荧光。
另外，当脱水量达到期望的量时，也可以再次将吸水性的有机溶剂730置换为封闭剂720。由此，可以停止孔的内容物(测定溶液710)的脱水。即，样品中的靶标物质的检测方法可以还具有将吸水性的有机溶剂置换为封闭液的步骤。
如此，通过在大容量的孔220中捕获靶标物质，提高靶标物质的捕获概率，并且通过在小容量的孔230中进行检测，可以高灵敏度地检测靶标物质，还可缩短检测所需的时间。
[靶标物质检测用试剂盒]
在一个实施方式中，本发明提供一种靶标物质检测用试剂盒，其包括：上述的流体装置、在存在靶标物质的情况下能生成荧光物质的试剂、封闭液和吸水性的有机溶剂。
通过使用本实施方式的试剂盒，可以适当地实施上述的靶标物质的检测方法。在本实施方式的试剂盒中，流体装置与上述的流体装置相同。另外，关于靶标物质、在存在靶标物质的情况下能生成荧光物质的试剂、封闭液、吸水性的有机溶剂，也与上述相同。
实施例
下面示出实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[材料和方法]
(Cas13a蛋白质的制备)
将Leptotrichia wadei Cas13a(LwCas13a)的表达载体转染到大肠杆菌BL21(DE3)株中使其表达。表达载体是基于pET的载体，其在N末端具有10×His标签、麦芽糖结合蛋白质(MBP)和TEV蛋白质酶切割位点。所表达的Cas12a蛋白质使用Ni-NTA树脂进行纯化。接着，使TEV蛋白质酶在4℃下反应一夜后，使用MBPTrap HP柱(GE Healthcare公司)和与其连接的Hi Trap Heparin HP柱(GE Healthcare公司)进行阳离子交换层析，并进一步通过使用Superdex 200柱(GE Healthcare公司)的凝胶过滤层析进行纯化。
(靶标核酸片段的制备)
靶标核酸片段(单链RNA片段、序列号5)是通过外购(IDT公司)进行化学合成的。
(gRNA的制备)
以含有T7启动子序列、20个碱基的靶标序列和支架序列的重叠引物作为模板进行PCR扩增，由此制备出编码gRNA(crRNA)的DNA片段。接着，将获得的DNA片段供给体外转录反应以制备crRNA。序列号4表示Cas13a蛋白质用的gRNA(crRNA)的碱基序列。
(底物核酸片段的制备)
底物核酸片段(单链RNA片段)是通过外购(IDT公司)进行化学合成的。用作为荧光物质的FAM标记底物核酸片段的5'末端，并用作为猝灭物质的Iowa Black FQ(IDT公司)标记3'末端。化学合成的底物核酸片段(单链RNA片段)的碱基序列为“5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'”(这里，“IABkFQ”表示Iowa Black FQ)。
(孔阵列A的制作)
通过与上述的图4的(a)～图4的(f)相同的顺序来制作孔阵列A。首先，如图4的(a)所示，将玻璃基板210浸泡在8M的氢氧化钾溶液中24小时左右以在表面上形成羟基。
接着，如图4的(b)所示，在玻璃基板210的表面上旋涂氟树脂(CYTOP，AGC株式会社制造)以形成膜400。旋涂的条件设为在1,000rpm(每分钟转数(revolutions per minute))下进行30秒。在该条件下，膜400的膜厚为约1.8μm。
接着，在180℃的加热板上烘烤1小时，使膜400(CYTOP)的硅烷醇基与玻璃表面的羟基进行脱水缩合，从而使膜400与玻璃基板210的表面紧贴。
接着，如图4的(c)所示，将抗蚀剂(产品名称“AZ-P4903”，AZ ElectronicMaterials公司制造)在膜400的表面上以4000rps旋涂60秒，形成了抗蚀剂膜410。
接着，将玻璃基板210在110℃的加热板上烘烤1小时，使抗蚀剂膜410内的有机溶剂蒸发，从而使抗蚀剂膜410与膜400的表面紧贴。
接着，如图4的(d)所示，使用孔阵列图案的掩模，利用曝光机(Union Optical制造)在250W下照射紫外线14秒而对抗蚀剂膜410进行曝光。接着，在显影液(AZ developer，AZ Electronic Materials公司制造)中浸泡1.5分钟进行显影。其结果，形成孔的部分的抗蚀剂膜410被去除。
接着，如图4的(e)所示，使用反应离子刻蚀装置(YAC公司制造)，在O2为200sccm、压力为5Pa、输出为50W的条件下，对被抗蚀剂膜410掩模了的膜400进行30分钟的干法刻蚀，从而在膜400上形成了孔230。
接着，如图4的(f)所示，将玻璃基板210浸泡在丙酮中，用异丙醇清洗后用纯水清洗，从而去除抗蚀剂膜410，获得了孔230的阵列(孔阵列A)。孔阵列A是直径为3.5μm、深度为1.8μm的圆柱形的孔230在1cm2中排列1,500,000个的形状。孔230每个孔的容积为17fL。
(孔阵列B的制作)
通过与图4的(a)～图4的(f)、图5的(a)和图5的(b)相同的顺序制作具有第一孔和第二孔的孔阵列B。首先，使用反应离子蚀刻装置(Samco公司制造)对与图4的(a)至图4的(f)同样操作而得到的孔阵列进行5秒的干法蚀刻(O2为13sccm、压力为14Pa、输出为125W)，从而进行孔阵列表面的亲水化处理。接着，将孔阵列放置在65℃的加热板上，用层压辊使片状抗蚀剂(产品名称“SU-8 3020CF DFR Type-S”，KAYAKU Advanced Materials,Inc.公司制造)紧贴，如图5的(a)所示，形成了抗蚀剂膜410。
接着，如图5的(b)所示，使用孔阵列图案的掩模，利用曝光机(Union Optical制造)照射紫外线20秒而对抗蚀剂膜410进行曝光。接着，在显影液(产品名称“SU8developer”，KAYAKU Advanced Materials,Inc.公司制造)中浸泡8分钟而进行显影。其结果，形成孔的部分抗蚀剂膜410被去除，获得具有第一孔220和第二孔230的孔阵列B。
孔阵列B的形状如下：在1cm2中排列1,500,000个直径为3.5μm、深度为1.8μm的圆柱形的孔230的孔阵列上层叠在1cm2中排列40,000个直径为40μm、深度为20μm的圆柱形的孔220的孔阵列。
孔阵列B形成在每个孔220的底部配置有12～18个孔230的形状。图8是所制作的孔阵列B的显微镜照片。
(流体装置A的制作)
与图6同样，在上述的孔阵列A上配置间隔件220，进一步载置形成有液体导入口621的玻璃板620，制作流体装置A。其结果，获得了孔阵列A和玻璃板620之间的空间为流路的流体装置A。
(流体装置B的制作)
与图6同样，在上述的孔阵列B上配置间隔件220，进一步载置形成有液体导入口621的玻璃板620，制作流体装置B。其结果，获得了孔阵列B和玻璃板620之间的空间为流路的流体装置B。
[实验例1]
(使用Cas13a的探讨)
以Cas13a蛋白质的最终浓度为40nM、gRNA的最终浓度为25nM、靶标核酸片段的最终浓度分别为30pM、3pM、0.3pM、0pM的方式，将Cas13a蛋白质、gRNA(序列号4)和靶标核酸片段混合到下述表1所示的组成的缓冲液A中，形成三元复合物。以下，将该溶液称为三元复合物溶液。
[表1]
缓冲液A
20mM HEPES(pH7.5)、150mM KCl 19.89mL
2M MgCl2 100μL
1M DTT 10μL
合计 20mL
准备4个上述的流体装置A。另外，制备了将底物核酸片段溶解在上述缓冲液A中以使最终浓度为10μM的溶液。
接着，分别制备将上述的三元复合物溶液与底物核酸片段的溶液混合而成的测定溶液，并立即从各流体装置A的液体导入口导入。其结果，测定溶液被导入到孔阵列的各个孔中。
接着，从各流体装置A的液体导入口导入封闭剂(十六烷，Sigma-Aldrich公司)。其结果，导入有测定溶液的孔被封闭剂封闭，各孔成为各自独立的反应空间。几分钟后，利用荧光显微镜观察各流体装置A的孔阵列。
图9的(a)是示出靶标核酸片段的最终浓度为0pM的测定溶液的结果的代表性荧光显微镜照片。图9的(b)是示出靶标核酸片段的最终浓度为0.3pM的测定溶液的结果的代表性荧光显微镜照片。图9的(c)是示出靶标核酸片段的最终浓度为3pM的测定溶液的结果的代表性荧光显微镜照片。另外，图9的(d)是示出靶标核酸片段的最终浓度为30pM的测定溶液的结果的代表性荧光显微镜照片。比例尺为50μm。
图10的(a)是示出孔(基于导入了各测定溶液的孔阵列的照片显示出了规定的荧光强度(相对值))的数量的代表性图表。图10的(b)是针对靶标核酸片段的最终浓度分别为30pM、3pM、0.3pM、0pM的测定溶液在与图10的(a)相同的图表中对与图10的(a)中的用虚线包围的区域相当的区域进行放大排列后的图表。
其结果表明，检测到荧光的孔的比例依赖于靶标核酸片段的浓度而上升。
图11是示出检测到荧光的孔的个数与靶标核酸片段的最终浓度之间的关系的图表。纵坐标表示检测到荧光的孔的个数，横坐标表示靶标核酸片段的最终浓度。其结果表明，使用流体装置时的检测灵敏度为56fM。
[实验例2]
(浓缩的探讨1)
制备将150fM的碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich公司)和1μM的荧光底物(sTG-phos)混合而成的测定溶液，并从上述的流体装置B的液体导入口导入。在下述式(1)示出sTG-phos的化学式(参照Sakamoto S.,et al.,Multiplexed single-molecule enzyme activityanalysis for counting disease-related proteins in biological samples,SciAdv.6(11),eaay0888,2020.)。其结果，测定溶液被导入到孔阵列的各孔中。
[化学式1]
接着，从流体装置B的液体导入口导入封闭剂(十六烷，Sigma-Aldrich公司)。其结果，导入有测定溶液的孔被封闭剂封闭，各孔成为各自独立的反应空间。
接着，从流体装置B的液体导入口导入吸水性的有机溶剂来置换密封剂。作为吸水性的有机溶剂，分别探讨了1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇。其结果，孔的内容物脱水、容积减少，并且内容物中的碱性磷酸酶与sTG-phos反应而生成荧光物质(sTG)。sTG的化学式如下述式(2)所示。
[化学式2]
接着，随时间变化检测sTG的荧光。图12是示出对使用各吸水性的有机溶剂情况下的、sTG的荧光强度(相对值)的随时间变化进行测定的结果的图表。其结果，特别是在使用1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇的情况下，可确认有脱水浓缩引起的荧光强度提高。
[实验例3]
(浓缩的探讨2)
制备将阶段稀释的碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich公司)和1μM的荧光底物(sTG-phos)混合而成的测定溶液，并从上述的流体装置B的液体导入口导入。其结果，测定溶液被导入到孔阵列的各孔中。
接着，从流体装置B的液体导入口导入封闭剂(十六烷，Sigma-Aldrich公司)。其结果，导入有测定溶液的孔被封闭剂封闭，各孔成为各自独立的反应空间。
接着，从流体装置的液体导入口导入1-辛醇来置换密封剂。其结果，孔的内容物脱水、容积减少，并且内容物中的碱性磷酸酶与sTG-phos反应而生成荧光物质(sTG)。
接着，自导入1-辛醇2.5分钟后，将1-辛醇置换为封闭剂(产品名称“Fomblin(注册商标)Oil”，Solvay公司)。其结果，孔的内容物的脱水停止。接着，检测sTG的荧光。图13是示出基于已经检测到sTG荧光的孔阵列的照片显示出规定荧光强度(相对值)的孔的比例(％)的代表性图表。在图13中，图的横坐标表示碱性磷酸酶(ALP)的浓度。
其结果表明，可以检测到约80aM碱性磷酸酶的存在。即，表明使用流体装置B且用1-辛醇进行脱水浓缩时的检测灵敏度为约80aM。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够高灵敏度地检测靶标物质的技术。
附图标记说明
100,100'···三元复合物、110···Cas12a蛋白质、120···gRNA、130···二元复合物、140···靶标物质(靶标核酸片段)、150···底物核酸片段、200,300···孔阵列、210···基板、220···第一孔、230···第二孔、400,410···膜、600···流体装置、610···间隔件、621···液体导入口、620···盖构件、630···空间、710···测定溶液、720···封闭剂、730···吸水性的有机溶剂、F···荧光物质、Q···猝灭物质。
序列表
<110> 国立研究开发法人理化学研究所
<120> 靶标物质的检测方法、流体装置和试剂盒
<130> PC-33131
<150> JP2020-169092
<151> 2020-10-06
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
gccaagcgca cctaatttcc 20
<210> 2
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
aauuucuacu aaguguagau ggaaauuagg ugcgcuuggc 40
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
auggauuacu ugguagaaca gcaaucua 28
<210> 4
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuaga uugcuguucu accaaguaau 60
ccau 64
<210> 5
<211> 120
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120

Claims (9)

1.一种样品中的靶标物质的检测方法，其中，包括以下步骤：
在孔阵列的各个孔中导入所述样品和在存在所述靶标物质的情况下能够生成荧光物质的试剂的步骤；
用封闭液封闭所述孔阵列的各个孔，各个孔形成各自独立的反应空间的步骤；
将所述封闭液置换为吸水性的有机溶剂，其结果，所述孔的内容物脱水、容积减少，并且在所述内容物中存在所述靶标物质的情况下生成所述荧光物质的步骤；和
对所述荧光物质照射激发光，并针对所述孔阵列的每个孔检测所产生的荧光的步骤，
在所述孔中检测到荧光表示在所述孔中存在所述靶标物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述孔阵列的各个孔具有第一孔和配置在所述第一孔的底部且容量小于所述第一孔的第二孔，当所述第一孔的内容物的容积变小时，所述内容物聚集于所述第二孔。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
所述第一孔和所述第二孔的容积之比即第一孔的容积：第二孔的容积为10:1～1,000,000:1。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
所述第一孔的容积为1～1,000pL，且所述第二孔的容积为0.1～1,000fL。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，
向所述第一孔中每个孔导入0个或1个所述靶标物质。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
所述封闭液为氟系液体、矿物油或碳原子数7～17的直链状或支链状的饱和或不饱和的烃。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
所述吸水性的有机溶剂为碳原子数4～11的直链状或支链状的饱和或不饱和的脂肪族醇。
8.一种流体装置，其中，具有：
基板，在所述基板的表面配置有具备多个孔的孔阵列，所述孔具有第一孔和配置在所述第一孔的底部且容量小于所述第一孔的第二孔；
盖构件，与所述孔阵列相对地配置；以及
间隔件，使所述基板和所述盖构件之间隔开，
所述孔阵列和所述盖构件之间的空间形成供流体流动的流路。
9.一种靶标物质检测用试剂盒，其中，包括权利要求8所述的流体装置、在靶标物质存在的情况下生成荧光物质的试剂、封闭液和吸水性的有机溶剂。
CN202180080274.4A 2020-10-06 2021-10-05 靶标物质的检测方法、流体装置及试剂盒 Pending CN116615526A (zh)

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