KR20170140177A - 회전 환 증폭 생성물의 양을 계측하기 위한 다공성 모세관 막의 용도 - Google Patents

회전 환 증폭 생성물의 양을 계측하기 위한 다공성 모세관 막의 용도 Download PDF

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Abstract

시료 분석 방법이 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다 : (a) 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 다공성 모세관 막을 이용하여 여과하고, 이로써 상기 막 상에 상기 RCA 생성물의 어레이(array)를 생산하는 단계로서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 상기 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단은 구별가능하도록 표지되는, 상기 단계; 및 (b) 상기 막 영역 안에서 상기 RCA 생성물의 표지된 제1 집단의 양과 상기 RCA 생성물의 표지된 제2 집단의 양을 계측하는 단계.

Description

회전 환 증폭 생성물의 양을 계측하기 위한 다공성 모세관 막의 용도
상호-참고
본 출원은 2015년 4월 30일자로 제출된 UK 특허 출원 일련 번호 1507376.0의 편익을 주장하며, 본 출원은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 통합된다.
비-침습성 산전 검사는 임산부 혈액 시료 또는 임산부로부터 비-침습적으로 획득된 또다른 시료를 이용하여 태아의 상태 또는 건강에 대한 정보를 제공한다. 태아의 상태 또는 건강의 조기 발견으로 표적화된 중재 또는 의학적 치료가 가능하다.
회전 환 증폭 (RCA)은 모체 혈액에 있는 무세포 DNA 분석에 유용하다. 그러나, 확고한 통계에 의해 RCA 생성물을 정량화하는 것이 어려울 수 있다. 실용적 수준에서, RCA 반응에서 생성물의 절대적 수는 통계학적 확고성을 충분히 제공할 정도로 높을 수는 있지만, 상기 반응에서 특정 RCA 증폭산물의 몰 농도는 매우 낮을 수 있고, 이로써 이들의 정량에 사용할 수 있는 방법의 유형이 제한된다. 예를 들면, 이론적으로 시료 안에 RCA 생성물에 표지하고, 유리 슬라이드의 표면 상에 상기 시료를 증착하고, 그리고 해당 슬라이드 상에 표지된 생성물을 계수하여 RCA 생성물을 측정할 수 있다. 그러나, 표지된 RCA 생성물이 포함된 용액을 단순히 유리 슬라이드 상에 두고, 상기 표지된 RCA 생성물이 상기 표면으로 확산되도록 한 다음, 상기 슬라이드에 부착된 표지된 RCA 생성물을 계수하는데 몇 시간이 소요되며, 상기 슬라이드에 도달된 표지된 RCA 생성물이 모두 집계되지는 않는다.
표지된 RCA 생성물을 정량화하기 위하여 고형 지지체 상에 여과의 사용이 본 명세서에서 기술된다. 하기에서 더 상세하게 설명되겠지만, 이들 방법은 RCA 생성물을 함유하는 시료의 분석을 용이하게 할 수 있다.
요약
시료 분석 방법이 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다 : (a) 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 다공성 모세관 막을 이용하여 여과하고, 이로써 상기 막 상에 상기 RCA 생성물의 어레이(array)를 생산하는 단계로서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 상기 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단은 구별가능하도록 표지되는, 상기 단계; 및 (b) 상기 막 영역 안에서 RCA 생성물의 표지된 제1 집단의 양과 RCA 생성물의 표지된 제2 집단의 양을 계측하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 계측 단계는 그 영역 안에 제1 및 제2 표지된 RCA 생성물을 계수하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 계측 단계는 그 영역으로부터 집합(aggregate) 신호를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 어느 방법에 의해서든지, 상기 방법은 상기 시료 안에 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단의 추산치를 제공할 수 있다.
상기 방법을 어떻게 실행하는 지에 따라, 상기 다공성 모세관 막의 사용으로 시료 안에 실질적으로 모든 RCA 생성물(유리 슬라이드의 표면으로 확산되는 것들뿐만 아니라)의 정량화가 가능하며, 이로써 상기 분석의 정확성, 민감성 및 재현성이 증가된다. 더욱이, 상기 다공성 모세관 막을 이용하면 상기에서 언급한 바와 같이, 유리 슬라이드 상에 시료를 피펫팅하고, 그 다음 상당 시간 동안 상기 슬라이드를 항온처리하여 RCA 생성물이 확산되어 상기 슬라이드 표면에 달라붙기를 기다리는 일부 대체 방법들과 비교하여, 몇 시간이 걸리는 대신 몇 분 안에 상기 분석이 실행될 수 있게 된다. 이와 일관되게, 본 출원의 실험 부분에서 본 발명의 실행으로 유리 슬라이드 상에서 16 시간의 항온처리와 비교하였을 때, 90초(시료를 막에 올리고, 그 다음 막을 통하여 상기 시료를 채취하는 시간에 맞먹는) 후에 적어도 2.5-배 더 많은 RCA 생성물이 산출될 수 있음을 보고한다. 더욱이, 상기 막의 사용으로 잠재적 백그라운드가 되는 공급원(가령, RCA 생성물 또는 이와 유사한 것들에 혼성화되지 않은 형광 올리고뉴클레오티드 분자들)은 상기 막(특히 RCA 생성물을 제공 한후 상기 막이 세정되는 경우)을 통과하도록 함으로써, 백그라운드를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은 상대적으로 광범위한 농도의 RCA 생성물 (가령, 50 ㎕ 내지 200 ㎕ 또는 그 이상의 용적 안에 10 내지 10M의 RCA 생성물)을 가진 시료를 분석하는데 특히 유용하며, 많은 경우 전술한 바와 같이, 막의 표면 상에 RCA 생성물을 농축시키는 역할을 하기 때문에 상대적으로 낮은 농도를 가질 수 있다. 달리 말하자면, 막을 사용하지 않는 대체 방법을 사용하면, 50 ㎕ 시료는 유리 현미경 슬라이드의 표면에 확산되고, 비록 모든 RCA 생성물이 상기 슬라이드에 결합되도록 유도되더라도, 상기 RCA 생성물은 슬라이드 상에서 공간적으로 서로 분리되어 있으므로, 단일 시야 안에 충분한 수의 RCA 생성물을 담을 수 있고, 이로써 현미경 또는 합리적 정확성을 갖는 다른 수단으로 이들을 정량화하는데 시간이 많이 소요되어 비효율적이다. 상기 방법을 어떻게 이행하는 지에 따라, 상기 막은 상기 RCA 생성물을 농축시키고 지지하는 역할을 하면서, 동시에 백그라운드를 감소시키기 위하여 상기 RCA 생성물을 세정하는 수단을 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 막은 특히 투명하거나, 또는 습윤제 추가에 의해 투명하게 될 수 있는 경우, 현미경 슬라이드 역할을 할 수 있다.
요약하면, 본 발명은 RCA 생성물-각 표적 분자는 오직 하나의 RCA 생성물을 나타낸다(각 표적 분자는 얼마나 증폭되는 지를 알 수 있을 정도로 증폭되며, 상이한 표적 분자들이 상이한 양으로 증폭되는 PCR과는 대조적으로)는 의미로 편견없이 시료 안에 이미 만들어진 생성물-의 양을 계측하는데 있어서 신속, 정확, 민감하고 그리고 재현가능한 방법을 제공한다. 이와 같이, 본 방법은 시료 안에 DNA 분자 풍도(abundance)의 신속, 정밀, 그리고 정확한 측정이 필수적인 분야에 매우 중요하다는 것이 증명되어야 한다. 특히, 본 방법은 모체 혈류의 무세포 분획 안에 있는 상대적으로 저농도의 DNA 분자 풍도의 신속, 정밀 그리고 정확한 측정이 중요한 비-침습성 산전 검사에서 매우 중요하다는 것이 증명되어야 한다.
이러한 특징 및 장점들과 다른 잠재적 특징 및 장점들은 다음의 설명에서 명백해질 수 있다.
당업자는 하기에서 설명된 도면들은 오직 설명을 목적으로 제공된 것임을 이해할 것이다. 이들 도면은 어떤 식으로던 본 발명의 교시 범위를 제한하지 않는다.
도 1은 본 발명의 일부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명의 일부 원리들을 개략적으로 도시한다.
도 3은 y-축 상에 각 이미지의 계수를 나타내고, x-축에는 시료, 항온처리 시간, 그리고 유리 또는 산화 알루미늄 플레이트 유형을 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 2에서 설명된 실험 결과중 일부를 도시하는 막대그래프이다.
도 5는 세포주 혼합 조성물에 대한 2개 채널의 계수 간의 비율의 플롯이다.
다양한 실시예를 기술하기 앞서, 본 명세서의 교시는 설명된 특정 실시예에 국한되지 않으며, 마땅히 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 이에 국한시키려는 의도는 없으며, 그 이유는 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한되기 때문이라는 것 또한 인지해야 한다.
여기에 사용된 구역별 제목은 단지 구성 체계적 목적을 위한 것이며 어떤 식으로든 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 교시는 다양한 실시예들을 통하여 설명되었지만, 본 발명의 교시가 그러한 실시예들에 한정되는 것은 아니다. 반대로, 본 발명의 교시는 당업자에게 자명한 바와 같이, 다양한 대안, 변형 및 등가 범위를 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 지금부터 몇가지 예시적인 방법 및 재료들이 설명되지만, 여기에 설명된 것과 유사한 또는 균등한 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다.
모든 간행물의 인용은 출원일 이전에 그 내용을 공개한 것이지만, 본 청구범위들이 선행 발명에 의거하여 이러한 간행물보다 더 선행되지 못한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 간행물의 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수 있으며 이는 개별적으로 확인될 필요가 있다.
이 명세서를 파악할 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 여기에 설명되고 도시된 개별적인 실시예 각각은 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으며, 다른 몇몇 실시예의 임의의 특징으로부터 간단히 분리되거나 또는 이들과 결합될 수 있는 개별적인 구성 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 모든 방법은 열거된 사건의 순서로, 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에 언급된 상기 특허 및 공보에 개시된 모든 서열을 포함하여 모든 특허 및 공보는 참조자료로서 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
예시적인 실시예들을 보다 상세하게 설명하기 앞서, 명세서에서 사용된 용어들의 의미 및 범위를 설명하기 위해 다음의 표현들이 제공된다.
명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에 따라 달리 명시되지 않는 한, 이러한 단어의 복수 형태를 포함한다는 것을 주지해야 한다. 예를 들면, 용어 "프라이머"는 하나 이상의 프라이머, 즉, 단일 프라이머 및 복수의 프라이머를 지칭한다. 임의의 선택적 요소를 배제하도록 청구 범위를 작성할 수 있음을 또한 주지해야 한다. 그러한 경우, 이러한 명시는 청구 요소들의 언급시 "단독으로", "오직"등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적" 한정부사를 선행구로 사용하여 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "여과(filtering)"는 필터를 통하여 분석물 (가령, 회전 환 증폭 생성물)이 포함된 액체를 이동시켜, 상기 필터에 의해 분석물의 일부가 유지되도록 하는 작업을 포함한다. 여과시, 상기 액체의 적어도 일부는 필터의 한 면으로부터 다른 면으로 이전된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "회전 환 증폭(rolling circle amplification)" 또는 "RCA"는 가닥-변위 중합효소를 이용하여 원형 핵산 주형의 선형의 연쇄화된(concatemerized) 복사체를 만드는 등온 증폭(isothermal amplification)을 포함한다. RCA는 분자생물학 분야에서 잘 알려진 것이며, Lizardi 등, (Nat. Genet. 1998 19:225-232), Schweitzer 등, (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 97:10113-10119), Wiltshire 등, (Clin. Chem. 2000 46:1990-1993) 및 Schweitzer 등, (Curr. Opin. Biotech 2001 12:21-27)을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 공보물에서 설명되며, 이들 공보는 본 명세서에 참고자료에 편입되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "회전 환 증폭 생성물"은 회전 환 증폭 반응의 연쇄화된 생성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형광 표지된 회전 환 증폭 생성물"이란 가령, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 상기 회전 환 증폭 생성물에 혼성화시키거나 또는 다른 수단 (가령, 증폭하는 동안 상기 생성물에 형광 뉴클레오티드를 통합시킴으로써)에 의해 형광 표지된 회전 환 증폭 생성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "다공성 모세관 막"에는 막의 두께에 걸쳐, 즉 막의 한 측면에서 다른 측면까지 걸쳐있는 상대적으로 조밀하게 패킹된 개별 모세관을 갖고, 이로써 막의 한 면으로부터 다른 면으로 액체는 통과하지만 그러나 입자들은 통과하지 못하는 막이 포함된다. 다공성 모세관 막의 예로는 가령, 양극 산화 알루미늄 막 (하기 참고), 나노채널 유리 막, 트랙 에칭된(track etched) 막 그리고 폴리테트라플로오르에틸렌이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 나노채널 유리 막은 유리로 만들어지며, 그리고 15 미크론 내지 15 나노미터의 직경을 갖는 균일한 고밀도 채널을 갖는다(가령, Tonucci 등, Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959: 59-71; Pearson 등, Science 1995 270: 68-70 and Tonucci 등, Science 1992 258: 783-785, 뿐만 아니라 US 특허 5,306,661; 5,332,681; 5,976,444; 6,087,274; 6,376,096; 6,483,640; 및 6,599,616 참고, 이들은 참고자료로 편입되어 있다). 트랙 에칭된 막은 하전된 입자 투하(또는 조사) 및 화학적 에칭의 조합에 의해 만들어진 0.01 ㎛ 내지 30 ㎛ 범위의 직경을 가진 다공이 포함된 투명한 폴리머 (가령, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 폴리이미드 및 이와 유사한 것들)로 만들어진다. 관심대상의 다른 다공 막으로는 비정질 플루오르폴리머, 이를 테면 NAFION™, TEFLON AF™, FEFLON FEIP™, 및 CYTOP™ (DuPont 플루오르생성물, Fayetteville, NC)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 인식할 수 있는 바와 같이, 다공성 모세관 막은 막이 만들어지는 물질과 상이한 표면 (가령, 피복 또는 화학적으로 변형 된 표면)을 가질 수 있다. 예를 들면, 다공성 모세관 막의 표면은 변경된 전하 특성 또는 변경된 소수성 또는 친수성 특성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면은 RCA 생성물이 표면에 유지되는 것을 지원하는 양전하를 제공하기 위해 아미노 실란, 폴리-리신 또는 다른 화합물로 피복될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 상기 표면은 그 내부에 증착된 금속의 얇은 층 (가령, 티타늄, 금)을 가질 수 있으며, 이는 필터의 표면 특성을 변경시키는 다른 물질과 연계될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "양극 산화 알루미늄 막"이라는 용어는 특정 산성 매질에서 Al이 양극처리될 때 생성되는 규칙적이고, 자가-조직화되는 나노다공성 막 구조를 포함한다. 막에서 공극의 내경, 막에서 인접한 공극들의 중심 사이의 거리 및 막에서 인접한 공극들의 가장자리 간의 거리는 증착 전압(voltage of the deposition), 산의 유형 및 다른 매개 변수에 의해 조절될 수 있다. 양극 산화 알루미늄 막은 젖었을 때 실질적으로 투명하다. 양극 산화 알루미늄 막, 이의 특성 및 이러한 막을 만드는 방법들은 Li 등, (Chem. Mater 1998 10: 2470-2480), Santos 등, (Trends on Analytical Chemistry 2013 44: 25-38), Ingham 등, (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) 및 Poinern 등, (Materials 2011 4: 487-526)을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 공보에서 상세하게 검토되고 있으며, 이러한 교시들에 대하여 이들 공보들이 참고자료로 편입되어 있다. 양극 산화 알루미늄 막들은 가령, SPI Supplies (West Chester, PA) 및 다른 판매자, 이를 테면 Sykera Technolgoies Inc (Longmont, CO) 및 Signma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 상표 ANOPORE™로 시판되고 있으며, 지지 고리와 함께 구매할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 막의 영역 또는 이미지 영역과 관련하여 용어 "영역(area)"이란 연속 또는 비-연속 영역을 포함한다. 예를 들면, 한 영역에서 표지된 RCA 생성물의 수를 산출하는 것과 같이 한 영역에서 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하는 방법의 경우, RCA 산물이 정량화되는 영역은 단일 연속 공간 또는 연속되지 않은 다중 공간이될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이미지화(imaging)"은 물체의 표면으로부터의 광 신호가 검출되고, 이것은 위치(즉, "픽셀")와 연관된 데이터로서 저장되는 프로세스를 포함한다. 물체의 디지털 영상은 상기 데이터로부터 재구성될 수 있다. 막의 영역은 단일 영상 또는 하나 이상의 영상을 이용하여 이미지화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "개별 표지된 RCA 생성물"에는 표지된 개별 RCA 분자들이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "양을 계측하는"것은 개별적으로 분해된(resolved) RCA 생성물을 계수하는 방법들 뿐만 아니라 복수의 RCA 생성물로부터 집합 신호를 측정하는 것이 포함된 방법들을 포함한다. 집합 신호의 강도를 측정하는 것과 관련된 방법들에 있어서, 개별 RCA 생성물로 분해시킬 필요는 없다. RCA 생성물의 양은 임의의 적합한 단위를 이용하여 표현될 수 있다. 일부 경우에 있어서, RCA 생성물의 양은 개별적으로 분해된 RCA 생성물의 계수된 수로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "계수(counting)"는 더 큰 더미(collection)에서 개별 객체의 수를 계측하는 것을 포함한다. 구현예에 있어서, "계수"란 복수의 개별 객체들로부터 별도의 신호를 검출하고(복수 개체들로부터 얻은 집합적 신호가 아님), 그리고 개별 신호를 계수함으로써 얼마나 많은 객체가 복수로 존재하는 지를 계측할 필요가 있다. 본 방법들과 관련하여, "계수"는 신호들의 어레이에서 개별 신호의 수를 계측함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투명한"이란 이용되는 파장에서 물체가 광학적으로 투명한 상태를 포함한다. 형광 현미경의 경우, "투명한" 것이란 해당 대상이 형광단의 여기(excitation) 및 방출 스펙트럼중 하나 또는 둘 모두에 대하여 투명하게 된다는 의미다. 하기에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 특정 막들은 젖었을 때만 투명하다. 이러한 막들은 비록 막의 건조한 상태가 투명하지 않더라도 투명 막으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, RCA 생성물의 어레이와 관련하여 용어 "어레이(array)"는 평면 표면 상에 단일 RCA 생성물 더미를 포함하며, 여기에서 상기 RCA 생성물은 상기 표면 평면 상에서 서로 공간적으로(상기 어레이의 푸아송(Poisson) 분포에 의해 허용되는 정도까지 실제로 무작위로) 분리되어 있다. "무작위(random)" 어레이는 요소들, 가령, RCA 생성물이 기질의 표면상에 사전 계측되지 않은 위치들에 분포되어 있는 어레이를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 무작위 어레이 상에 있는 RCA 생성물의 분포는 푸아송 통계에 의해 설명될 수 있는데, 가령, 무작위 어레이의 RCA 생성물 간에 거리 분포는 푸아송 분포에 의해 근사값으로 얻어질 수 있다. 환언하면, 상기 RCA 생성물은 막 상에서 무작위로, 즉 사전 계측되지 않은 위치에 분포될 수 있다.
이들 용어 및 다른 용어들의 다른 의미들은 명세서를 통하여 드러날 수 있다.
본 방법을 더욱 상세하게 설명하기에 앞서, 본 방법은 PCR 생성물을 위한 필터로 작용할 수 있는 임의의 유형의 포획 지지체(capture support)를 이용하여 실행될 수 있음을 알 수 있다. 이러한 포획 지지체는 분석에서 이용되는 파장에서 낮은 백그라운드 신호를 가져야만 하고, 액체의 신속한 유체 통과 및 RCA 생성물을 포획할 수 있도록 충분한 크기의 공극을 가져야만 한다. 적합한 포획 지지체는 　다공 금속, 세라믹,　균질 필름　 (가령, 폴리머) 및　이질성　고체 (폴리머 믹스, 혼합형 유리)와 같은 고체들이 포함된 다공 유기 또는 무기 재료로부터 만들어질 수 있다. 　다공 세라믹 막은　무기 재료 (예를 들면, 알루미나, 티타니아, 지르코니아 산화물, 재계측 탄화 규소)로부터 만들어질 수 있다. 가령, the PamChip sold by Pamgene (The Netherlands), Wu 등, Nucleic Acids Res. 2004 32: e123 and Anthony 등, Biotechniques. (2003) 34:1082-6, 1088-9 참고. 예시적인 다공 폴리머 막은 셀룰로오스 아세테이트, 니트로 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르 (CA, CN 및 CE), 폴리술폰 (PS), 폴리에테르 술폰 (PES), 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 (PE 및 PP), 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE), 폴리비닐리덴 불화물 (PVDF) 및 폴리염화비닐 (PVC)로부터 만들어질 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) RCA 생성물에 대한 필터로 작용하는 포획 지지체를 이용하여 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 여과하고, 이로써 상기 지지체 상에 상기 RCA 생성물의 어레이를 생산하는 단계로서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 이때 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단은 구별가능하도록 표지되는, 상기 단계; 및 (b) 상기 막 영역 안에서 RCA 생성물의 표지된 제1 집단의 양과 RCA 생성물의 표지된 제2 집단의 양을 계측하는 단계.
하기 설명은 이용되는 다공성 모세관 막이 이용되는 구현예를 설명한다. 다공성 모세관 막은 이용할 수 있는 포획 지지체의 한 가지 예가 된다. 다음 설명은 실시예를 통하여 본 방법을 설명한다.
상기에서 요약된 바와 같이, 시료 분석 방법이 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 다공성 모세관 막을 통하여 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 여과하고, 이로써 상기 막 상에 RCA 생성물의 어레이를 생산하는 단계; (b) (a) 단계 전 또는 후에, 상기 RCA 생성물을 형광 표지하는 단계; 및 (c) 상기 막의 영역에서 개별 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하고, 이로써 상기 시료 안에 상기 표지된 RCA 생성물의 추산치를 제공하는 단계. 상기 방법은 다양한 상이한 방식으로 수행될 수 있으며, 그 한 가지 구현예는 도 1에서 개략적으로 도시되고 있다. 도 1을 참고하면, 상기 방법의 특정 구현예는 다음과 관련된다: 다공성 모세관 막 6 (가령, 양극 산화 알루미늄 막)을 통하여 형광 표지된 회전 환 증폭 (RCA) 생성물 4를 포함하는 액체 시료 2를 여과한다. 여과 단계는 입자들을 농축시키고, 막 6 상에 RCA 생성물 8의 어레이를 만든다. 도시된 구현예에서, 다음 단계는 입자들이 막 상에 있는 동안 이들을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단계는 어레이 8의 이미지 10를 만들 수 있다. 명백한 바와 같이, 검출은 고해상도 CMOS 또는 CCD 검출기를 사용하거나, 또는 PMT 또는 이와 유사한 것을 사용하는 임의의 적합한 형광 검출기, 예를 들어 형광 현미경, 스캐너로 수행될 수 있다. 최종적으로, 막의 영역에서의 표지된 RCA 생성물의 양은 예를 들어, 개별적으로 분해된 RCA 산물을 계수하거나, 또는 집합 신호 등을 측정함으로써 계측된다. 이와 같은 측정으로 시료 2 안에 표지된 RCA 생성물 12의 수의 추산치를 제공한다. 특정 구현예에 있어서 그리고 상기 방법이 어떻게 수행되는 지에 따라, 상기 필터는 막을 적시고, 투명하게 되도록 하기 위하여 가령, 습윤제 (가령, 침지 오일 또는 글리세롤)로 가습될 수 있다. 이들 구현예에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 RCA 생성물이 여과된 후 그리고, RCA 생성물의 양이 계측되기 전, 습윤제의 사용에 의해 투명하게 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 RCA 생성물은 여과 단계 후 표지될 수 있다. 더욱이, 일부 경우에 있어서, 상기 어레이의 이미지를 만들고, 저장할 필요는 없다. 이들 구현예에 있어서, 상기 어레이의 분석은 이미지화 동안 또는 이미지화 직후 실행될 수 있다. 분석에 계수가 포함되는 일부 구현예에서, 이용되는 형광 검출기는 상기 막 상에 있는 상이한 RCA 생성물을 충분히 분해할 수 있어야 한다. 일부 구현예에서, 상기 형광 검출기는 10 ㎛ 미만, 가령, 5 ㎛ 미만 또는 1 ㎛ 미만의 분해능을 가질 수 있다. 집합 신호를 측정하는 것을 포함하는 구현예에 있어서, 상기 형광 검출기는 이러한 분해능을 가질 필요는 없다.
임의의 구현예에서, 모세관 막의 공극은 이 공극을 통하여 RCA 생성물이 통과하지 못하도록 충분한 크기를 가져야 한다. 예를 들면, 구현예에 있어서, 모세관 막의 공극 직경은 RCA 생성물의 정중 직경의 불과 50%에 지나지 않을 수 있고, 한편 일부 구현예에서 상기 직경은 RCA 생성물의 정중 직경의 불과 20%에 지나지 않을 수 있으며, 그리고 일부 구현예에서 RCA 생성물의 정중 직경의 불과 10%에 지나지 않을 수 있다. 이와 같이, 상기 다공성 모세관 막을 이용한 시료의 여과에서, 상기 RCA 생성물은 막의 상부에 남아있어야 하고, 공극으로 완전히 들어가거나 또는 공극을 통과해서는 않된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 상기 RCA 생성물에 특이적으로 혼성화되거나 또는 이에 결합하는 묶여있는(tethered) 포획 물질 (가령, 묶여있는 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 스트렙타아비딘 또는 이와 유사한 것들)을 포함하지 않는다. 이들 구현예에 있어서, 상기 RCA 생성물은 특이적 (가령, 서열-특이적) 상호작용을 통하여 상기 다공성 모세관 막에 결합하지 않는다. 이러한 구현예에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 US2006022813에서 설명된 바와 같이, 마이크로어레이 형태로 공간적으로 접근가능한 위치들에서 막에 묶여있는 상이한 복수의 서열-특이적 포획 물질들(가령, 올리고뉴클레오티드)을 포함하지 않는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 RCA 생성물이 막을 통하여 여과된 후, 상기 막 상에서 광 신호의 생성 이외에 생화학적 반응(가령, 공유 결합의 파괴 또는 형성을 초래하는 반응)은 일어나지 않아야 한다
명백한 바와 같이, 상기 회전 환 증폭 (RCA) 생성물은 막을 통하여 여과되기 전, 변성되지 않는다 (가령, 최소 2분 동안 적어도 90 ℃의 온도에 노출되지 않음).
도 2는 상기 방법의 예시적인 구현예의 일부 원리를 나타낸다. 제1 단계에서, 형광 표지된 RCA 생성물이 포함된 시료는 용기, 가령, 바닥 표면으로 막을 포함하는 웰(well) 안에 배치된다. 상기 시료는 상기 막을 통하여 시료의 액상을 끌어나는 압력을 적용함으로써 농축된다. 상기 RCA 생성물은 가령, 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 또는 적어도 10,000/mm2의 밀도에서 어레이 형태로 막의 표면에 유지된다. 상기 막이 여전히 투명해지지 않는 경우, 그러면 습윤제를 추가한 후, 상기 막이 투명해지도록 만들고, 그리고 상기 RCA 생성물은 검출, 가령 영상화될 수 있다. 막을 이동하거나 및/또는 보관하기 위하여, 고정제를 이용하여 상기 RCA 생성물은 제자리에 또한 고정될 수 있고, 따라서 이들 생성물은 양성 결과가 획득되면 재-판독될 수 있다. 일부 구현예에서, 습윤제는 상기 막을 투명하게 만드는데 것 이외에 고정제로 또한 작용한다. 상기 어레이는 막의 어느 한 측면, 가령 막을 통하여(도 2에 나타낸 바와 같이) 분석될 수 있다. 명백한 바와 같이, 상기 막이 "상부", 즉 RCA 생성물과 동일한 측면에서 판독된다면, 상기 막은 투명할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 상기 막은 운반 및 분석 전에 건조될 수 있다. 분석된 영역은 적어도 10개, 가령, 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 또는 적어도 200,000개 또는 그 이상의 RCA 생성물을 포함할 수 있다.
원한다면, 상기 RCA 생성물이 막에 결합되어 있는 동안 표지될 수 있으며, 특정 구현예에 있어서, 표지된 RCA 생성물의 어레이가 만들어진 후, 그리고 분석에 앞서, 상기 막은 물 또는 염을 함유하는 수성 완충액으로 세정될 수 있다. 상기 세정 단계로 인하여 잠재적 백그라운드가 되는 공급원(가령, RCA 생성물에 혼성화되지 않는 표지된 뉴클레오티드 또는 표지된 올리고뉴클레오티드)이 필터를 통해 씻겨나갈 수 있고, 상기 필터가 분석되는 시점에서 필터와 연합되지 않기 때문에, 백그라운드를 감소시킬 수 있다. 백그라운드를 감소시키거나, 또는 신호 또는 이와 유사한 것들을 증가시키기 위하여, 필요하다면, 다른 시약, 가령, 항-퇴색제(anti-fade) 또는 형광 또는 이와 유사한 것들을 강화시키는 시약이 분석 전에 추가될 수 있다. 마찬가지로, 필요하다면, 상기 표지된 RCA 생성물은 분석에 앞서, 막 표면에 결합(공유 또는 비-공유)될 수 있다. 생물분자들을 표면에 연결시키는 화학물질들은 잘 알려져 있고, 특정 경우에서 상기 RCA 생성물은 막의 표면과 특이적으로 반응하는 기를 가지고 있는 변형된 뉴클레오티드 또는 프라이머를 이용하여 연결될 수 있고, 이로써 오직 RCA 생성물만 상기 표면에 부착된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 여과 단계는 (i) 상기 시료를 상기 다공 막에 위치시키는 것; 및 (ii) 막을 통하여 시료를 이동시키는 힘을 적용하는 것에 의해 실행된다. 시료에 적용되는 힘은 능동적인 힘 (예를 들어, 원심력, 부압 또는 양압) 또는 수동적인 힘 (예를 들어, 모세관 작용 (예를 들어, 블롯팅 페이퍼를 사용) 또는 증발을 통하여)일 수 있다.
상기에서 명시한 바와 같이, 막에서 공극의 내경, 막에서 인접한 공극들의 중심 사이의 거리 및 막에서 인접한 공극들의 가장자리 간의 거리는 증착 전압, 산의 유형 및 다른 매개 변수에 의해 조절될 수 있다(일반적으로, Poinern, 상기 참고). 일부 구현예에서, 상기 막에서 공극의 내경은 5 nm 내지 500nm, 가령, 4 nm 내지 250 nm, 4 nm 내지 50 nm, 50 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 200 nm 또는 200 nm 내지 500 nm의 범위 안에 있을 수 있다. 독립적으로, 상기 막에서 인접하는 공극들의 중심간 평균 거리는 50 nm 내지 1000 nm, 가령, 50 nm 내지 420 nm, 50 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 500 nm 또는 500 nm 내지 1000 nm의 범위 안에 있을 수 있다. 상기 막에서 인접하는 공극들의 모서리간 평균 거리는 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 50 nm, 50 nm 내지 200 nm, 또는 200 nm 내지 500 nm 범위 안에 있을 수 있다. 본원에서 제공된 공극들 사이의 직경 및 평균 거리 값은 예시적인 것이며, 이러한 값은 구현예에 기초하여 달라질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 공극 직경 및 인접한 공극들의 중심 사이의 거리를 최적화함으로써, 사용 검출 시스템에 의해 개별적으로 분해될 수 있는 표지된 RCA 생성물을 제공할 수 있다. 구체적으로, 특정 경우에서, 상기 막에서 공극은 상대적으로 큰 직경 (가령, 100 nm 내지 500 nm 범위의 직경)을 가질 수 있고, 상기 막에서 인접 공극들의 중심 간 평균 거리는 상대적으로 클 수 있고 (가령, 200 nm 내지 1000 nm, 가령, 200 nm 내지 420 nm 범위), 각 표지된 RCA 생성물은 공극의 입구로 끌려나와(상기 공극을 효과적으로 "막고"), 그리고 표지된 인접 RCA 생성물 간의 거리는 형광 현미경에 의해 분석가능하다. 이들 최적 거리는 수퍼 해상도 형광 현미경 (Huang 등, Annu. Rev. Biochem. 2009 78: 993-1016)을 이용하는 경우 감소될 수 있다.
이용되는 막은 원하는 경우, 임의의 적합한 두께, 가령, 20 ㎛ 내지 500 ㎛ 또는 50 ㎛ 내지 200 ㎛ 범위일 수 있고, 그리고 상기에서 명시된 바와 같이, 하나 이상의 지지 구조 (가령, 지지 고리)를 포함하여, 막이 사용하는 동안 상기 막의 온전성을 유지시킬 수 있다.
상기에서 명시한 바와 같이, 본 방법은 시료, 특히 가변 농도의 RCA 생성물 (가령, 상대적으로 저 농도인 10 내지 10M, 가령, 50 ㎕ 내지 200 ㎕ 또는 그 이상의 용적에서 5,000 내지 1M의 RCA 생성물)을 가진 시료에서 RCA 생성물 수의 정확한 정량을 요구하는 프로토콜에 이용될 수 있고, 그리고 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000 또는 적어도 200,000개 또는 그 이상의 상기 RCA 생성물이 계수될 경우에만 통계학적으로 요구되는 차이를 확인할 수 있다. 하기에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 상기 방법은 복제 수 분석 및 비-침습성 태아 검사용으로 특별히 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 시료는 다중 RCA 생성물 (가령, RCA 생성물의 2, 3 또는 4개 또는 그 이상의 집단, 이를 테면 RCA 생성물의 표지된 제1 집단 및 RCA 생성물의 표지된 제2 집단)을 포함할 수 있고, 이때 RCA 생성물의 상이한 집단들은 구별가능하도록 표지되어, 각 RCA 생성물 집단 표지의 개별 성분들은 이들 집단들이 혼합되어 있더라도 독립적으로 검출되고, 계수된다. 대상 방법들에 적합한 유용한 구별가능한 형광 표지 쌍들은 Cy-3과 Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, NJ), Quasar 570과 Quasar 670 (Biosearch Technology, Novato CA), Alexafluor555와 Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene, OR), BODIPY V-1002와 BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, OR), POPO-3과 TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR), 그리고 POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, OR)을 포함한다. 구별가능하게 검출가능한 더욱 적합한 표지들은 Kricka 등,. (Ann Clin Biochem. 39:114-29, 2002)에서 볼 수 있다. 예를 들면, 상기 RCA 생성물은 ATTO, ALEXA, CY, 또는 이량체 시아닌 염료, 이를 테면 YOYO, TOTO 등의 임의의 조합으로 표지될 수 있다. 추가 표지들이 또한 포함될 수 있다. 표지된 RCA 생성물의 구별가능한 집단을 만드는 예시적인 방법들은 가령, 2014년 11월 26일자 출원된 PCT/US2014/06771, 그리고 2014년 11월 26일자 출원된 PCT/US2014/067719에서 설명되며, 이들은 이들 교시에 대하여 본 명세서에 참고자료로 편입되어 있다. 일부 경우에서, RCA 생성물의 집단은 복수의 표지로 구별가능하도록 표지될 수 있고, 이로써 다중화(multiplexing) 가능성은 증가된다. 예를 들면, 일부 경우에서 RCA 생성물의 한 집단은 2개의 구별가능한 염료 (가령, Cy3과 Cy5)로 각각 표지될 수 있다. 판독시, 이러한 이중-표지된 RCA 생성물은 개별 염료(가령, Cy3 또는 Cy5)로 표지된 RCA 생성물과 구별가능할 것이다.
일부 구현예에서, RCA 생성물의 제1 집단은 표지된 RCA 생성물의 "시험" 집단을 나타낼 수 있고, RCA 생성물의 제2 집단은 RCA 생성물의 제1 집단의 수와 비교될 수 있는 RCA 생성물의 "참조" 집단이 될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 상기 RCA 생성물의 제1 집단은 제1 염색체 영역 (가령, 염색체 21과 같은 제1 염색체)에 상응할 수 있으며, RCA 생성물의 제2 집단은 제2 염색체 영역에 상응할 수 있고 (가령, 염색체 13 또는 18과 같은 제2의 염색체, 또는 제1 집단 염색체와 상이한 영역), 그리고 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단의 수를 계수 및 비교함으로써 이들 영역의 복사 수에서 차이가 있는 지(테스트 영역의 중복 또는 결실이 있음을 나타낸다)를 계측할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 이때 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단은 표지 단계에서 구별가능하도록 표지된다. 이들 구현예에 있어서, 상기 방법들은 막의 영역 (상동한 영역 또는 상이한 영역)에서 제1 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하는 단계(가령, 그 수를 계수하고), 및 상기 막의 영역에서 제2 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하고(가령, 그 수를 계수하고), 이로써 상기 시료 안에 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단의 수의 추산치를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 구현예는 상기 시료 안에 있는 제1 RCA 생성물의 수와 제2 RCA 생성물의 수를 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법들의 이들 구현예의 일부에 있어서, 상기 방법들은 하나 이상의 이미지 (가령, 하나의 이미지, 또는 각각 제1 이미지와 제2 이미지)를 생산하기 위하여 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단을 이미지화하는 것을 포함할 수 있으며, 그리고 임의로, (i) 상기 하나 이상의 이미지에서 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하고, 이로써 상기 시료 안에 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단의 수의 추산치를 제공한다. RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단은 공지의 방법들(가령, 적절한 필터 등을 이용)을 이용하여 별도로 검출될 수 있다. RCA 생성물의 검출은 순차적으로 실행될 수 있다 (구현예에서, 가령, 각각의 표지에 대하여 개별 이미지가 생성될 수 있고, 각 집단으로부터 RCA 생성물이 순차적으로 분석될 수 있다. 검출은 또한 실질적으로 동시에 수행될 수 있다 (구현예에서, 가령, RCA 생성물의 양RCA 생성물의 집단을 모두 나타내는 단일 이미지가 생성될 수 있고, 각 집단으로부터 RCA 생성물은 실질적으로 동시에, 즉 실질적으로 일제히 분석될 수 있다. 상기 방법들의 이러한 구현예는 시료 내의 제1 표지된 RCA 생성물의 양을 시료 내의 제2 표지된 RCA 생성물의 양과 비교하는 단계를 추가로 포함 할 수 있다. 상기 방법들의 상기 단계는 제1 집단에서 적어도 1,000 (가령, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000개 내지 최대 1M 또는 그 이상) 표지된 RCA 생성물을 계수하고, 그리고 상기 막의 영역에서 적어도 1,000 (가령, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000 또는 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000 내지 최대 1M 또는 그 이상)의 표지된 RCA 생성물을 계수하고, 이로써 복제 수에서 차이가 통계학적으로 철저하게 계측될 수 있음이 보장된다.
구현예에 있어서, 상기 방법들은 시료 안에서 제1 RCA 생성물의 양과 제2 RCA 생성물의 양의 차이를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이때 상기 차이는 적어도 0.95, 적어도 0.98 또는 적어도 0.99의 P-값을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 0.95, 0.98 또는 0.99 이상의 P-값으로 적어도 1% 차이, 적어도 2% 차이, 적어도 3% 차이, 또는 적어도 5% 차이를 검출하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 임산부의 모체 시료와 관련된 구현예에 있어서, 상기 시료의 태아 분획이 상기 산출법에 포함될 수 있다.
상기에서 명시된 바와 같이, 일부 경우에 있어서, 상기 방법을 이용하여 분석되는 시료는 혈액, 가령 임산부의 혈액으로부터 수득한 무-세포 DNA 시료일 수 있다. 이들 구현예에 있어서, 상기 방법은 발달중인 태아에서 염색체 이상을 검출하는데 이용되거나(상기에서 설명된 바와 같이), 또는 예를 들면 시료 안에 태아 DNA의 분획을 산출하는데 이용될 수 있다. 상기 방법을 이용하여 검출될 수 있는 복제 수 이상은 3염색체(trisomy) 21, 3염색체 13, 3염색체 18, 3염색체 16, XXY, XYY, XXX, 1염색체 X, 1염색체 21, 1염색체 22, 1염색체 16, 및 1염색체 15를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본 방법을 이용하여 검출될 수 있는 추가 복제 수 이상은 다음 표에 나열되어 있다.
염색체 이상 관련 질환
X XO 터너(Turner) 증후군
Y XXY 클라인펠터(Klinefelter) 증후군
Y XYY 이중 Y 증후군
Y XXX 3염색체 X 증후군
Y XXXX 4X 증후군
Y Xp21 결손 더켄/베커(Duchenne/Becker) 증후군, 선천적 부신 저형성증, 만성 육아종 질환
Y Xp22 결손 스테로이드 술파타제 결핍
Y Xq26 결손 X-연계된 임파증식성 질환
1 1p(체세포)
1염색체
3염색체		 신경아세포종
2 1염색체
3염색체 2q		 성장 지체, 발달 및 정신 지체,
그리고 가벼운 신체적 비정상
3 1염색체
3염색체(체세포)		 비-호지킨 임파종
4 1염색체
3염색체(체세포)		 급성 비 임파성 백혈병(ANLL)
5 5p 묘성 증후군(Cri du chat), 레젼(Lejeune) 증후군
5 5q
(체세포)
1염색체
3염색체		 골수형성이상 증후군
6 1염색체
3염색체(체세포)		 투명세포 육종
7 7q11.23 결손 윌리엄(William) 증후군
7 1염색체
3염색체		 어린이 1염색체 7 증후군; 체세포; 신장 부신 종양; 골수 이형성 증후군
8 8q24.1 결손 랭어 기에돈(Langer-Giedon) 증후군
8 1염색체
3염색체		 골수 이형성 증후군; 와카니(Warkany) 증후군;
체세포; 만성 골수성 백혈병
9 1염색체 9p 알피(Alfi) 증후군
9 1염색체 9p
부분적 3염색체		 레토르(Rethore) 증후군
9 3염색체 완전한 3염색체 9 증후군; 모자이크 3염색체 9 증후군
10 1염색체
3염색체 (체세포)		 ALL 또는 ANLL
11 11p- 무채홍증; 윌름스(Wilms) 종양
11 11q- 제이콥센(Jacobsen) 증후군
11 1염색체
(체세포) 3염색체		 골수 계통 영향을 받음(ANLL, MDS)
12 1염색체
3염색체(체세포)		 CLL, 유년형 과립막 세포 종양(JGCT)
13 13q- 13q-증후군; Orbeli 증후군
13 13q14 결손 망막아종
13 1염색체
3염색체		 파탄(Patan) 증후군
14 1염색체
3염색체(체세포)		 골수 장애(MDS, ANLL, 비전형 CML)
15 15q11-q13
결손
1염색체		 프래더-윌리(Prader-Willi), 안젤만(Angelman) 증후군
15 3염색체(체세포) 골수 및 임파계통이 영향을 받음, 가령, MDS, ANLL, ALL, CLL)
16 16q13.3 결손 루벤스테인-테이비(Rubenstein-Taybi)
3 1염색체
3염색체(체세포)		 유두 신장 세포 암종(악성)
17 17p-(체세포) 골수 악성에서 17p 증후군
17 17q11.2 결손 스미스-매그니스(Smith-Magenis)
17 17q13.3 밀러-디에커(Miller-Dieker)
17 1염색체
3염색체(체세포)		 신장피질샘종
17 17p11.2-12
3염색체		 카르콧-마리 투쓰(Charcot-Marie Tooth) 증후군 유형 1; HNPP
18 18p- 18p 부분적 1염색체 증후군 또는 그라우치 라미 티에프리(Grouchy Lamy Thieffry) 증후군
18 1염색체
3염색체		 에드워즈(Edwards) 증후군
19 1염색체
3염색체
20 20p- 3염색체 20p 증후군
20 20p11.2-12 결손 알라질(Alagille)
20 20q- 체세포; MDS, ANLL, 진성적적혈구증가증,
만성 호중구성 백혈병
20 1염색체
3염색체		 유두 신장 세포 암종(악성)
21 1염색체
3염색체		 다운(Down) 증후군
22 22q11.2 결손 디조지(DiGeorge) 증후군, 입천장-심장-얼굴 증후군, 큰동맥이상 안면 증후군, 상염색체 우성 옵틱스(Optix) G/BBB 증후군, 케일러(Caylor) 심안면 증후군
22 1염색체
3염색체		 완전한 3염색체 22 증후군
RCA 생성물을 만들고, 이를 표지하는 예시적인 방법은 가령, 2014년 11월 26일자로 제출된 PCT/US2014/06771, 그리고 2014년 11월 26일자로 제출된 PCT/US2014/067719에서 설명되고 있으며, 이들 방법들의 교시를 위하여 참고자료로 편입되어 있다.
조성물
조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서 상기 조성물은 다음을 포함할 수 있다: a) 다공성 모세관 막, 가령, 다공성 양극 산화 알루미늄 막; 및 b) 상기 막의 표면 상에 형광 표지된 RCA 생성물의 어레이. 상기 어레이는 적어도 1,000개의 표지된 RCA 생성물 (가령, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000, 또는 적어도 1M 표지된 RCA 생성물)을 포함할 수 있고, 상기 표지된 RCA 생성물은 가령, 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 또는 적어도 10,000/mm2의 밀도에서 무작위로 막의 표면에 걸쳐 분포될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 조성물은 다공성 모세관 막; 및 상기 막의 표면 상에 형광 표지된 RCA 생성물의 적어도 2개 집단을 포함할 수 있고, 여기에서 형광 표지된 RCA 생성물의 상이한 집단들은 구별가능하도록 표지된다. 상기 조성물의 추가 세부 사항 및 변형은 본 명세서의 방법 구역에서 찾아볼 수 있다.
키트
전술한 바와 같이, 대상 방법들을 실행하기 위한 키트가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 다음을 포함할 수 있다: 서열-특이적 방식으로 선택된 단편을 원형화시키고, 원형화된 생성물의 회전 환 증폭을 수행할 수 있는 시약. 예를 들면, 하나 이상의 제한 효소, 리가아제, 그리고 상기 생성물의 원형화에 있어서 부목(splint) 역할을 하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, RCA에 의해 원형화된 생성물을 증폭시키기 위한 가닥-치환 중합효소, 상기 RCA 생성물을 표지시키는 하나 이상의 표지된 올리고뉴클레오티드, 그리고 전술한 바와 같이 다공성 모세관 막, 가령, 다공성 양극 산화 알루미늄 막. 키트의 다양한 성분들은 별도의 용기에 존재하거나, 또는 필요하다면, 소정의 양립가능한 성분들이 단일 용기 안에 사전-복합될 수 있다. 상기 키트의 성분에 대한 추가 세부 사항 및 변형은 본 명세서의 방법 구역에서 찾아볼 수 있다.
상기 성분 이외에, 대상 키트는 대상 방법을 실행하기 위하여 키트의 성분들을 이용하기 위한 설명서서, 즉 시료 분석을 위한 설명서서를 추가로 포함할 수 있다. 대상 방법들을 실시하는 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체상에 기록된다. 예를 들면, 상기 설명서들은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄되어 제공될 수 있다. 이와 같이, 이러한 설명서들은 포장 삽입물, 키트의 용기 표지 또는 키트의 성분의 표지(즉, 포장 또는 하위 포장에 연합되어) 형태로 키트 안에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 설명서들은 적절한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 가령, CD-ROM, 디스켓, 등등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로 존재한다. 또다른 구현예에 있어서, 실질적인 설명서는 키트 안에 없지만, 가령, 인터넷을 통하여 원격 소스로부터 설명서를 구하는 수단이 제공된다. 상기 구현예의 일례로써 키트는 설명서들을 보거나, 및/또는 설명서들을 다운로드 받을 수 있는 웹 주소를 포함한다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻는 방법은 적절한 기판에 기록된다.
구현예
다음은 상기 방법의 예시적인 구현예를 설명한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 형광 표지된 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료는 다공성 양극 산화 알루미늄 막을 이용하여 여과하고, 이로써 상기 막 상에 상기 RCA 생성물의 어레이를 생성하는 단계; 및 b) 상기 막의 영역 안에 있는 표지된 RCA 생성물의 양을 계측하고, 이로써 상기 시료 안에 있는 상기 표지된 RCA 생성물의 추산치를 제공하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 계측 단계는 그 영역 안에 제1 및 제2 표지된 RCA 생성물을 계수하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 계측 단계는 그 영역으로부터 집합(aggregate) 신호를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
구현예에 있어서, 상기 방법의 단계 (a)는 (i) 상기 다공성 양극 산화 알루미늄 막 상에 상기 시료를 배치시키는 것; 및 (ii) 막을 통하여 상기 시료를 이동시키는 힘을 적용하는 것에 의하여 실행될 수 있다. 이들 구현예에 있어서, 상기 힘은 능동적 힘 (원심력, 부압 또는 양압) 또는 수동적 힘 (모세관 작용 또는 증발에 의해 적용될 수 있음) 일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a)와 (b) 사이에 상기 다공성 양극 산화 알루미늄 막의 세정 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 계측 단계는 이미지 영역 안에 적어도 1,000개의 표지된 RCA 생성물을 계수하는 단계를 포함할 수 있다.
구현예에 있어서, 상기 막에서 공극의 내경은 5 nm 내지 500nm 범위 안에 있을 수 있으며, 독립적으로, 상기 막에서 인접 공극들의 중심간의 평균 거리는 50 nm 내지 1000 nm 범위 안에 있을 수 있다. 구현예에 있어서, 상기 막에서 인접하는 공극들의 모서리간 평균 거리는 10 nm 내지 500 nm 범위 안에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시료는 표지된 RCA 생성물의 적어도 제1 집단과 제2 집단을 포함할 수 있으며, 이때 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단은 구별가능하도록 표지된다. 이들 구현예에 있어서, 상기 방법들은 하나 이상의 이미지 (가령, 각각 제1 이미지와 제2 이미지)가 생성되도록 표지된 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단을 이미지화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이들 방법들은 하기를 추가로 포함할 수 있다: (i) 제1 집단 이미지의 영역에서 표지된 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계, 및 (ii) 영역, 가령, 제2 이미지의 동일한 영역 상에 있는 표지된 RCA 생성물의 수를 별도로 계수하여, 이로써 상기 시료 안에 있는 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단의 추산치를 제공하는 단계. 상기 구현예는 시료 내의 제1 표지된 RCA 생성물의 양을 시료 내의 제2 표지된 RCA 생성물의 양과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
a) 다공성 모세관 막; 및 b) 상기 막의 표면 상에 형광 표지된 회전 환 증폭 (RCA) 생성물의 어레이를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 이들 구현예의 일부에서, 상기 다공성 모세관 막은 다공성 양극 산화 알루미늄 막일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 어레이는 적어도 1,000개의 RCA 생성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 형광 표지된 RCA 생성물의 다중 어레이를 포함할 수 있는데, 이때 상기 다중 어레이는 상기 막의 표면 상에 있으며, 구별가능하도록 표지된다. 상기 조성물 안에 존재할 수 있는 각각의 성분들 뿐만 아니라 임의선택적 요소들은 다음의 설명에서 찾아볼 수 있다.
a) 다공성 모세관 막; 및 b) DNA를 원형화하고, 회전 환 증폭 (RCA)을 수행하기 위한 시약; 및 c) RCA 생성물을 표지하기 위한 시약이 포함된 키트 또한 제공된다. 상기 키트 안에 존재할 수 있는 각각의 성분들 뿐만 아니라 임의선택적 요소들은 다음의 설명에서 찾아볼 수 있다.
구현예 1, 다음을 포함하는 시료 분석 방법: (a) 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 투명한 다공성 모세관 막을 통하여 여과하고, 이로써 상기 막 상에 상기 RCA 생성물을 농축시키고, 상기 RCA 생성물의 어레이를 생산하는 단계; (b) 단계 (a) 전 또는 후에 상기 RCA 생성물을 형광 표지시키는 단계; 및 (c) 상기 막의 영역에서 개별 표지된 RCA 생성물의 수를 계수하고, 이로써 상기 시료 안에 표지된 RCA 생성물의 추산치를 제공하는 단계.
구현예 2. 구현예 1의 방법에서, 상기 다공성 투명한 모세관 막은 다공성 양극 산화 알루미늄 막인, 방법
구현예 3. 구현예 1 또는 2의 방법에서, 단계 (b)는 단계 (a) 전 또는 후에, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 상기 RCA 생성물에 혼성화시킴으로써 수행되는, 방법.
구현예 4. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 방법은 하나 이상의 이미지를 생산하기 위하여 상기 막의 영역을 이미지화하는 단계, 및 상기 하나 이상의 이미지에서 개별 표지된 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 5. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 단계 (a)는 (i) 상기 다공성 투명한 모세관 막 상에 상기 시료를 위치시키는 것; 및 (ii) 막을 통하여 시료를 이동시키는 힘을 적용하는 것에 의해 수행되는, 방법.
구현예 6. 구현예 5의 방법에서, 상기 힘은 능동 힘 또는 수동 힘인, 방법.
구현예 7. 구현예 6의 방법에서, 상기 능동 힘은 원심력, 부압 또는 양압인, 방법.
구현예 8. 구현예 6의 방법에서, 상기 수동 힘은 모세관 작용 또는 증발에 의해 적용되는, 방법.
구현예 9. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 단계 (a)와 (b) 사이에 상기 투명한 다공성 모세관 막의 세정 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 10. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 계수 단계는 상기 막의 영역 안에 적어도 1,000개의 표지된 RCA 생성물을 계수하는 것을 포함하는, 방법.
구현예 11. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 막 내 상기 공극의 내경은 2 nm 내지 500nm 범위인, 방법.
구현예 12. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 막에서 인접 공극들의 중심간 평균 거리는 50 nm 내지 1000 nm 범위인, 방법.
구현예 13. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 막에서 인접하는 공극들의 모서리간 평균 거리는 10 nm 내지 500 nm 범위인, 방법.
구현예 14. 전술한 임의의 구현예의 방법에서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 이때 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단은 단계 (b)에서 구별가능하도록 표지되는, 방법.
구현예 15. 구현예 11의 방법에서, 상기 방법은 상기 막의 영역에서 제1 표지된 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계, 및 상기 막의 영역에서 제2 표지된 RCA 생성물의 수를 계수하고, 이로써 상기 시료 안에 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단의 수의 추산치를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 16. 구현예 15의 방법에서, 상기 시료 안에 있는 제1 RCA 생성물의 수와 제2 RCA 생성물의 수를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예
하기 실시예들은 본 발명을 제조하고, 사용하는 방법에 대한 완벽한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제공되며, 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니며, 하기 수행된 실험의 전부 또는 일부만을 나타내려는 의도 또한 아니다.
실시예 1
AAO 필터의 사용
개요
분자 진단의 많은 응용 분야에서 첫 번째 단계는 DNA와 같은 환자의 생물학적 물질을 효과적인 생물표지로 전환하는 것이다. DNA는 추출되고, 대개 정제되고, 그리고 회전 환 생성물 (RCP)과 같은 대리 분자로 추가 변환되며, 이들은 측정되거나 정량화될 수 있다. 형광 염료를 이러한 대리 분자들에게 특이적으로 부착시키면 검출에 흔히 도움이 된다. 상이한 염료들이 상이한 대리 표지들에 부착될 수 있고, 이로써 복합 혼합물 안에서도 다중 검출이 가능하다. 유리 플레이트 또는 슬라이드와 같은 평평한 표면에 증착 표지된 분자들의 계수는 현미경 또는 스캐닝을 통하여 가능하다.
용액 안에 시료의 농도가 낮고, 정확한 산출을 위하여 충분한 수의 분자를 증착시키기가 곤란한 경우에 특히 고전한다. 유리 슬라이드를 폴리 l-라이신 (PLL), 아미노-실란 또는 유사체와 같은 제제로 피복하는 것은 주로 DNA로 구성된 대리 표지의 증착 개선에 효과적인 수단임이 입증되었다 (가령, 2014년 11월 26일자로 제출된 PCT/US2014/06771, 및 2014년 11월 26일자로 제출된 PCT/US2014/067719 참고). 이것은 증착 효율을 어느 정도 향상시키지만, 많은 분자들은 여전히 용액에 남아 있고, 이들은 후속 분석에 포함되지 못한다. 형광 표지된 생물표지를 편평한 표면에 증착시키는 수율을 증가시키기 위한 노력의 일환으로, 다음의 여과 방법이 수행되었다.
재료 및 방법
장치: 산화 알루미늄 막은 직접 제작되었거나 Ibidi(part# 81201)에서 구입한 웰-플레이트 수퍼 구조물에 결합되었다.
아미노-실란 피복된 플레이트 (96-웰 유리 바닥 플레이트 SuperAmine, part# M96M)는 ArrayIt Corporation으로부터 구입하였다.
이미 기술된 방법(PCT/US2014/06771)을 이용하여 2개의 별도 회전 환 증폭 생성물을 만들었다. 하나의 RCA 반응은 5' Atto 550 표지이 포함된 상보적 검출 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 표지되었고, 다른 RCA 반응은 5' Atto 647N을 이용하여 유사한 방식으로 표지되었다. 상기 RCA 반응물은 50 fM 농도에서 50:50 혼합물로 혼합되었다.
유리 플레이트의 경우, 100 ㎕의 반응물을 상기 플레이트의 3개 웰 안에 분주하였고, 실온에서 16시간 동안 항온처리하였다. 또다른 일련의 3개 웰은 90초간 항온처리하였다. 상기 항온처리 후, 2x SSC를 이용하여 웰들을 2차례 세정하고, 건조되도록 두었다.
막의 경우, 바닥에 막이 있는 플레이트에 100 ㎕ 시료를 첨가하였고, 그 다음 상기 플레이트는 블랏팅 종이(VWR part# 28298-022) 위에 두었다. 상기 시료들은 대략 90초 안에 산화 알루미늄 막을 통과하였다. 상기 바닥에 막이 있는 플레이트를 블랏팅 종이로부터 떼내고, 그 다음 항-퇴색 시약 (Life Technologies)의 2 방울을 각 웰에 첨가하여 투명하게 만들었다.
20X 대물렌즈가 있는 Olympus X81 현미경과 Hamamatsu Orca 4.0lt 카메라를 이용하여 두 가지 형식으로 이미지화가 시행되었다. 이미지화는 각 웰의 전체 바닥을 덮을 수 있도록 9x9 이미지를 타일링하여 수행되었다. 이미지가 분석되었으며, 자체 제작된 소프트웨어를 이용하여 RCA 생성물이 계수되었다.
결과
이들 결과는 도 3에 요약되어 있다. 16 시간 동안 항온처리 하였을 때, 유리 플레이트에 증착시키면 Atto 550로 표지된 RCA 생성물의 경우 이미지 당 평균 2,000-4,000개(counts)가 계수된다. Atto 647N의 경우 이미지당 평균 계수는 2,000 내지 3,000개였다. 유리 플레이트 상에서 90초 동안 항온처리하면 양 채널에 대하여 이미지당 평균 계수는 500 내지 2,500개였다. 대조적으로, 산화 알루미늄 플레이트 상에서 항온처리/증착은 Atto 550 표지된 RCP의 경우 이미지 당 평균 6,000 내지 10,000개, 그리고 647N 표지된 RCA 생성물의 경우 6,000 내지 9,000개가 계수되었다.
상기 데이터는 동일한 90 초 간격 동안 유리 플레이트 상에 증착된 경우보다 알루미늄 산화물 막에 대략 4 배 더 많은 수의 증착이 일어난다는 것을 입증한다. 유리 플레이트의 경우 항온처리 시간이 16 시간으로 증가되면, 결과는 유리 플레이트에서 검출되는 RCA 생성물은 증가하지만, 산화 알루미늄 상에서 90 초에서 관찰된 것보다 여전히 2.5 배 적다.
실시예 2
다중 검출 방법
재료 및 방법
장치: 20nm 공극을 갖는 산화 알루미늄 막은 4titude Ltd, UK에서 맞춤 제작된 96-웰 플레이트 슈퍼-구조물에 결합되었다.
이 다중 실험에서, 2개 세포주로부터 DNA 혼합물이 유전자 출발 물질로 이용되었다. 상기 세포주 DNA는 염색체 21의 2개 복사체 (정상적 유전체 구성) 또는 염색체의 3개 복사체(3염색체 21)가 포함된 세포주를 포함하였다. 상기 세포주로부터 추출된 DNA는 다음의 비율로 혼합되었다: 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. 각각의 DNA 혼합물을 제한 효소를 사용하여 우선 분해하고, 혼성화시키고, 프로브 세트에 결찰하고, 이어서 전술한 바와 같이 RCA에 의해 효소적으로 증폭되었다(WO2015083001　 및 WO2015083002 참고). 2개 염색체 특이적 검출 올리고뉴클레오티드 (염색체 18의 경우 Atto 550, 염색체 21의 경우 Atto 647)는 각 시료에 첨가하고, 혼성화되도록 두고, 각 시료 안에 염색체 특이적 RCA 생성물을 형광 표지하였다.
표지 후, 막-바닥의 플레이트에 100 ㎕ 시료들이 첨가되고, 그리고 그 다음 이들 플레이트는 진공 맨포드 (Supleco part #66879-U) 상에 두었다. 상기 시료들은 대략 90초 안에 산화 알루미늄 막을 통과하였다. 상기 막-바닥 플레이트는 400㎕ 0.5X SSC으로 2회 세정된 후, 건조되도록 두었다. 300 ㎕의 습윤제/고정제를 각 웰에 가하여 투명하게 만들고, 상기 RCA 생성물을 상기 막에 고정되도록 하였다.
이미지화는 20X 대물렌즈가 있는 Olympus X81 현미경과 Hamamatsu Orca 4.0lt 카메라를 이용하여 시행되었다. 이미지화는 각 웰의 전체 바닥을 덮을 수 있도록 10x10 이미지를 타일링하여 수행되었다. 이미지가 분석되었으며, 자체 제작된 소프트웨어를 이용하여 RCA 생성물이 계수되었다.
결과
이들 결과는 도 4에 요약되어 있다. 실험에 포함된 91 개의 모든 샘플에 대한 이미지 당 평균 계수는 3000개 내지 5000개를 약간 넘는 범위였다. 히스트그램은 0:100 비율 혼합물에서 550과 647 채널 간의 계수 비율의 차이를 분명하게 나타내지만(마지막 22개 레플리케이트), 그러나 도면만으로 0, 5, & 10% 시료에서 비율 차이를 구별해내는 것은 더욱 어렵다. 도 5는 세포주 혼합물 조성에 대한 2 개의 채널에 대한 계수 간의 비율의 플롯이다. 상기 그래프에서 경향은 명확하게 표현되는데, 입력 세포주 DNA 시료의 비율에 따른 계수의 상대적 비율 변화를 예시한다.
상기 데이터는 동일한 90 초 간격 동안 유리 플레이트 상에 증착된 경우보다 알루미늄 산화물 막에 대략 4 배 더 많은 수의 증착이 일어난다는 것을 입증한다. 유리 플레이트의 경우 항온처리 시간이 16 시간으로 증가되면 결과는 유리 플레이트에서 검출되는 RCA 생성물은 증가하지만, 산화 알루미늄 상에서 90 초에서 관찰된 것보다 여전히 2.5 배 적다.

Claims (34)

  1. 시료 분석 방법으로서,
    (a) 회전 환 증폭 (RCA) 생성물을 포함된 액체 시료는 다공성 모세관 막을 이용하여 여과하고, 이로써 상기 막 상에 상기 RCA 생성물의 어레이를 생산하는 단계로서, 상기 시료는 적어도 RCA 생성물의 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하며, 상기 표지된 RCA 생성물의 제1 집단과 제2 집단은 구별가능하도록 표지되는, 상기 단계; 및
    (b) 상기 막 영역 안에서 상기 RCA 생성물의 표지된 제1 집단의 양과 상기 RCA 생성물의 표지된 제2 집단의 양을 계측하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 계측 단계 (b)는 상기 영역 안에 상기 제1 표지된 RCA 생성물과 상기 제2 표지된 RCA 생성물을 계수하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 계측 단계 (b)는 상기 영역으로부터 집합 신호를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 다공성 양극 산화 알루미늄 막인, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RCA 생성물은 단계 (a) 전에, 상기 RCA 생성물의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 구별가능하도록 표지되는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 이미지를 생산하기 위하여 상기 막의 영역을 이미지화하는 단계, 및 상기 하나 이상의 이미지에서 상기 개별적으로 표지된 RCA 생성물의 수를 계측하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 다음에 의해 수행되는, 방법:
    (i) 상기 시료를 상기 다공성 모세관 막에 위치시키는 것; 및
    (ii) 상기 막을 통하여 상기 시료를 이동시키는 힘을 적용하는 것.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 힘은 능동 힘 또는 수동 힘인, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 능동 힘은 원심력, 부압 또는 양압인, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 수동 힘은 모세관 작용 또는 증발에 의해 적용되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에 상기 다공성 모세관 막의 세정 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막의 상기 영역 안에 적어도 1,000개의 표지된 RCA 생성물을 계수하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 내 상기 공극의 내경은 2 nm 내지 500nm 범위인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막에서 인접 공극들의 중심간 평균 거리는 50 nm 내지 1000 nm 범위인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막에서 인접하는 공극들의 모서리간 평균 거리는 10 nm 내지 500 nm 범위인, 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료 내 제1 RCA 생성물의 수와 상기 시료 내 제2 RCA 생성물의 수를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 단계 (a)와 (b) 사이에서 습윤제의 사용에 의해 투명하게 제조되는, 방법.
  18. 시료 분석 방법으로서,
    (a) RCA 생성물을 위한 필터로 작용하는 포획 지지체를 이용하여 회전 환 증폭 (RCA) 생성물이 포함된 액체 시료를 여과하고, 이로써 상기 지지체 상에 상기 RCA 생성물의 어레이를 생산하는 단계로서, 상기 시료는 RCA 생성물의 적어도 제1 집단과 RCA 생성물의 제2 집단을 포함하고, 상기 RCA 생성물의 제1 집단 및 제2 집단은 구별가능하도록 표지되는, 상기 단계; 및
    (b) 상기 막 영역 안에서 상기 RCA 생성물의 표지된 제1 집단의 양과 상기 RCA 생성물의 표지된 제2 집단의 양을 계측하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 계측 단계 (b)는 상기 영역 안에 상기 제1 표지된 RCA 생성물과 상기 제2 표지된 RCA 생성물을 계수하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 계측 단계 (b)는 상기 영역으로부터 집합 신호를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 18 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 다공성 양극 산화 알루미늄 막인, 방법.
  22. 청구항 18 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RCA 생성물은 단계 (a) 전에, 상기 RCA 생성물의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 구별가능하도록 표지되는, 방법.
  23. 청구항 18 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 이미지를 생산하기 위하여 상기 막의 영역을 이미지화하는 단계, 및 상기 하나 이상의 이미지에서 상기 개별 표지된 RCA 생성물의 수를 계측하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 다음에 의해 수행되는, 방법:
    (i) 상기 시료를 상기 다공성 모세관 막에 위치시키는 것; 및
    (ii) 상기 막을 통하여 상기 시료를 이동시키는 힘을 적용하는 것.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 힘은 능동 힘 또는 수동 힘인, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 능동 힘은 원심력, 부압 또는 양압인, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 수동 힘은 모세관 작용 또는 증발에 의해 적용되는, 방법.
  28. 청구항 18 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에 상기 다공성 모세관 막의 세정 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막의 상기 영역 안에 적어도 1,000개의 표지된 RCA 생성물을 계수하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 청구항 18 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 내 상기 공극의 내경은 2 nm 내지 500nm 범위인, 방법.
  31. 청구항 18 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막에서 인접 공극들의 중심간 평균 거리는 50 nm 내지 1000 nm 범위인, 방법.
  32. 청구항 18 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막에서 인접하는 공극들의 모서리간 평균 거리는 10 nm 내지 500 nm 범위인, 방법.
  33. 청구항 18 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료 내 제1 RCA 생성물의 수와 상기 시료 내 제2 RCA 생성물의 수를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 청구항 18 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 모세관 막은 단계 (a)와 (b) 사이에서 습윤제의 사용에 의해 투명하게 제조되는, 방법.
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