JP6874252B2 - ローリングサークル増幅生成物の量を測定するための多孔性キャピラリー膜の使用 - Google Patents

ローリングサークル増幅生成物の量を測定するための多孔性キャピラリー膜の使用 Download PDF

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Description

本出願は、２０１５年４月３０日に出願された英国特許出願第１５０７３７６．０号に対する利益を主張するものであり、当該出願は全目的のために組み込まれる。
非侵襲的出生前検査は、母親の血液試料または妊娠女性から非侵襲的に得られた別の試料を用いて胎児の状態または健康についての情報を提供する。胎児の状態または健康の初期検出により、標的介入及び医学的治療が可能になる。
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、母親の血液中の無細胞ＤＮＡを分析するのに有用である。しかし、統計的頑強性でＲＣＡ生成物を定量化することは、難易度が高い可能性がある。実用的レベルで、ＲＣＡ反応での生成物の絶対数は、統計的頑強性を提供するのに十分に高い可能性があるが、反応での特定のＲＣＡアンプリコンの分子濃度は、かなり低い可能性があり、それらを定量化するのに使用することができる方法の型が限定される。例えば、試料中のＲＣＡ生成物は、理論的には、ＲＣＡ生成物を標識化すること、ガラススライドの表面上に試料を沈着させること、及びスライド上の標識化生成物の数をカウントすることによって検出することができる。しかし、ガラススライド上に標識化ＲＣＡ生成物を含有する溶液を単純に置くと、標識化ＲＣＡ生成物が表面に拡散され、その後、スライドに付着した標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントするには数時間かかり、標識化ＲＣＡ生成物の全てがスライドに到達するわけではなく、これがカウントされることになる。
標識化ＲＣＡ生成物を定量化するのに固体支持体上での濾過の使用が、本明細書に記載されている。以下にさらに詳細に記載されるとおり、本方法は、ＲＣＡ生成物を含有する試料の分析を容易にする可能性がある。
概要
試料分析の方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法が、（ａ）多孔性キャピラリー膜を用いてローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、これにより膜上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；当該試料は、少なくともＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団は、区別できるように標識化される；及び（ｂ）膜のエリア中のＲＣＡ生成物の第１の標識化集団の量及びＲＣＡ生成物の第２の標識化集団の量を測定することを含んでよい。いくつかの実施形態では、測定ステップが、エリア中の第１及び第２の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすることを含んでよい。他の実施形態では、測定ステップが、エリアからの総シグナルを検出することを含んでよい。いずれのやり方でも、本方法は、ＲＣＡ生成物試料中の第１及び第２の集団の数の推定値を提供することができる。
本方法の実施方法に応じて、多孔性キャピラリー膜の使用により、試料中の実質的に全てのＲＣＡ生成物を定量することができ（ガラススライドの表面に生じる拡散したものだけでなく）、これは、順に、アッセイの精度、鋭敏性及び再現性を増大させる。さらに、多孔性キャピラリー膜の使用により、上記に示したとおり、ガラススライド上に試料をピペットで移し、その後、ＲＣＡ生成物がスライドの表面に拡散し、固着する見込みで時間を延長してスライドをインキュベートすることに依拠する可能性があるいくつかの別の方法と比較して、数時間ではなく数分でアッセイを行うことができる。これと一致して、本出願の実験セクションは、本方法の実施の結果、ガラススライド上で１６時間のインキュベーションと比較して、９０秒（膜の上面上に試料を置き、及びその後、膜を通して試料を引きつけるのにかかる時間に等しい）後に、少なくとも２．５倍超のＲＣＡ生成物をカウントすることができることを報告している。さらに、膜の使用は、バックグラウンドの可能性があるソース（例えば、ＲＣＡ生成物などにハイブリダイズしない蛍光オリゴヌクレオチド分子）が膜を通過する（特にＲＣＡ生成物が塗布された後に膜が、洗浄される場合）のを可能にすることによって、バックグラウンドを減少させることができる。
本方法は、多くの場合、上記に記載したとおり、膜が、膜の表面上のＲＣＡ生成物を濃縮する役割を果たすため、比較的低濃度である可能性がある、比較的広い範囲の濃度（例えば、５０μｌ〜２００μｌ以上の容積中の１０〜１０Ｍ ＲＣＡ生成物）のＲＣＡ生成物である試料を分析することに特に使用されるがわかっている。言い換えれば、膜を用いないで、かわりに別のアプローチを用いると、５０μｌ試料が、ガラス顕微鏡スライドの表面上に広がり、ＲＣＡ生成物の全てをスライドに結合するように誘発することができても、ＲＣＡ生成物は、スライド上で互いから空間的に分離され、単一の視野では不十分な数のＲＣＡ生成物を含有するだけであり、これにより顕微鏡または妥当な精度での他の手段によってそれらを定量化することは、時間を消費させ、不十分なものとなる。本方法の実施方法に応じて、当該膜は、ＲＣＡ生成物を濃縮し、支持する役割を果たす可能性があるが、同時に、バックグラウンドを減少させるためにＲＣＡ生成物を洗浄することができる手段を提供する。さらに、当該膜は、特に、透明である場合、または、浸潤剤の添加によって透明にすることができる場合、顕微鏡スライドとして役割を果たすことができる。
要約すると、本方法は、試料中のＲＣＡ生成物（それぞれの標的分子が１つのＲＣＡ生成物だけによって示される（それぞれの標的分子が未知数のコピーに増幅され、異なる標的分子が異なる量によって増幅されるＰＣＲと対照的に）という意味で、それ自体が偏りなく既に生成されている生成物）の量を測定するための早くて、精度が高く、鋭敏で再現可能な方法を提供すると考えられている。こうして、本方法は、試料中のＤＮＡ分子の存在量の早くて、精密で正確な測定が不可欠である用途に極めて貴重なものであることがわかっている。特に、本方法は、母親の血流の無細胞フラクション中にある比較的低濃度のＤＮＡ分子の存在量の早くて、精密で正確な測定が重要である非侵襲的出生前検査に貴重なものであることがわかっている。
以下の説明により、これらの及び他の可能性がある特徴及び利点が明白になる。
当業者であれば、以下に記載される図面が、例示目的だけのためのものであると理解する。本図面は、いずれの方法でも本教示の範囲を限定することを意図しない。
本方法のいくつかのステップを図で示す。 本方法のいくつかの原理を図で示す。 ｙ軸にイメージごとのカウントの数を示し、ｘ軸に試料、インキュベーション回数、及びガラスまたは酸化アルミニウムプレート型を示すグラフである。 実施例２に記載された実験のいくつかの結果を示すヒストグラムである。 細胞株混合物組成物に対する２つのチャンネルのカウント間の比の図表である。
さまざまな実施形態を記載する前に、本開示の教示は、記載された特定の実施形態に限定されず、例えば、言うまでもなく、変えることができるものと理解しなければならない。さらに、本教示の範囲は、添付したクレームだけによって限定されるため、本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためにあり、限定することを意図しないものと理解しなければならない。
本明細書に用いられるセクションの表題は、組織化する目的だけにあり、記載した内容をなんら制限するものではない。本教示は、さまざまな実施形態と関連して記載されるが、本教示がかかる実施形態に限定されることを意図しない。それとは逆に、本教示は、当業者によって理解されるとおり、さまざまな代替物、変更物、及び均等物を包含する。
特に定義しない限り、本明細書に用いられる全専門用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解される意味と同じである。本教示の実施または試験では、本明細書に記載したものとほぼ同じまたは等しい任意の方法及び材料を用いることもできるが、ここにいくつかの例示的な方法及び材料を記載する。
任意の出版物の引用は、出願日前のその開示のためにあり、本クレームが以前の発明によってかかる出版物に先行する権利がないと容認するものとして解釈されない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の出版物の日付と異なる可能性があり、別々に確認する必要がある可能性がある。
本開示を読むと当業者に明らかであるように、本明細書に記載し、示した個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離させる、またはこれと混ぜることができる別々の要素及び特徴を有する。列挙した事象の順にまたは論理的に可能である任意の他の順に、いずれの列挙した方法も実施することができる。
かかる特許及び出版物内で開示された全配列を含む本明細書に言及された全特許及び出版物が、参照によって明白に組み入れられる。
さらに詳細に例示的な実施形態を記載する前に、以下の意味を記載し、本説明に用いられる用語の意味及び範囲を示す。
本明細書及び添付したクレームに用いる場合、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。例えば、用語「１つのプライマー」は、１つ以上のプライマー、すなわち、単一のプライマー及び複数のプライマーを指す。さらに、クレームを記載して、任意の要素を除外することができることを示す。こうして、本明細書は、先行詞として、クレームの要素の列挙、または「否定的な」限定の使用と関連して、「単独で」、「唯一の」などのような除外用語を用いることを意図している。
本明細書に用いられる場合、用語「濾過すること」は、フィルターを通して測定対象物質（例えば、ローリングサークル増幅生成物）を含有する液体を移動させ、その結果、いくつかの測定対象物質がフィルターによって保持される作用を含む。濾過すると、少なくともいくつかの液体が、フィルターの１つの面から他の面へ移動される。
本明細書に用いられる場合、用語「ローリングサークル増幅」または「ＲＣＡ」は、鎖置換ポリメラーゼを用いて環状核酸テンプレートの直鎖状コピーを生成する等温増幅を含む。ＲＣＡは、分子生物学技術分野でよく知られており、これらに限定されないが、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８ １９：２２５−２３２）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００ ９７：１０１１３−１０１１９）、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０００４６：１９９０−１９９３）及びＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１ １２：２１−２７）を含むさまざまな出版物に記載されており、これらは本明細書に参照によって組み込まれる。
本明細書に用いられる場合、用語「ローリングサークル増幅生成物」は、ローリングサークル増幅反応物の鎖状生成物を含む。本明細書に用いられる場合、用語「蛍光標識化ローリングサークル増幅生成物」は、例えば、蛍光標識化オリゴヌクレオチドをローリングサークル増幅生成物にハイブリダイズすること、または他の手段（例えば、増幅中に蛍光ヌクレオチドを生成物に組み入れることによって）によって、蛍光標識化されたローリングサークル増幅生成物を指す。
本明細書に用いられる場合、用語「多孔性キャピラリー膜」は、膜の厚さに及ぶ、すなわち、膜の１つの面から他の面に至る比較的密に個々のキャピラリーを詰め、これにより、膜の１つの面から他の面に液体を通過させるが、粒子を通過させない膜を含む。多孔性キャピラリー膜の例としては、例えば、陽極酸化アルミニウム膜（以下を参照）、ナノチャンネルガラス膜、トラックエッチド膜及びポリテトラフルオロエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。ナノチャンネルガラス膜は、ガラスから生成され、直径が１５ミクロン〜１５ナノメートルである高密度の均一なチャンネルを有する（例えば、Ｔｏｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ＩＩ、ＡＩＰ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、２００７ ９５９：５９−７１；Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５ ２７０：６８−７０及びＴｏｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２ ２５８：７８３−７８５、ならびに米国特許５，３０６，６６１；５，３３２，６８１；５，９７６，４４４；６，０８７，２７４；６，３７６，０９６；６，４８３，６４０；及び６，５９９，６１６を参照、これらは参照によって組み込まれる）。トラックエッチド膜は、荷電粒子衝撃（または照射）及び化学エッチングの組み合わせによって生成され、直径が０．０１ｕｍ〜３０ｕｍの範囲である孔を含有する透明ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートまたはポリイミドなど）から生成される。対象の他の多孔性膜としては、アモルファスフルオロポリマー、例えば、ＮＡＦＩＯＮ（商標）、ＴＥＦＬＯＮ ＡＦ（商標）、ＦＥＦＬＯＮ ＦＥＩＰ（商標）、及びＣＹＴＯＰ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。認識されるとおり、多孔性キャピラリー膜は、膜が生成される材料と異なる表面（例えば、コーティングまたは化学的修飾表面）を有してよい。例えば、多孔性キャピラリー膜の表面は、変化した電荷特性、または変化した疎水性もしくは親水性特性を有してよい。いくつかの実施形態では、アミノシラン、ポリ−リジンまたは別の化合物で表面を被覆してよく、表面にＲＣＡ生成物を保持するのに役立つ陽電荷が提供される。代わりに、またはさらに、表面は、その中に沈着した金属（例えば、チタニウム、金）の薄層を有してよく、フィルターの表面特性を修飾する他の薬剤に結合させることができる。
本明細書に用いられる場合、用語「陽極酸化アルミニウム膜」は、ある特定の酸性媒質中でＡｌが陽極酸化される場合に生成される通常の自己組織化ナノ多孔性膜構造を含む。沈着物の電圧、酸の型、及び他のパラメーターによって、膜中の孔の内部直径、膜中の隣接した孔の中心間の距離、及び膜中の隣接した孔の縁間の距離を制御することができる。陽極酸化アルミニウム膜は、湿っている場合、実質的に透明である。陽極酸化アルミニウム膜、その特性、及びかかる膜の生成方法が、さまざまな出版物に詳細に再検討されており、それは、これらに限定されないが、Ｌｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ １９９８ １０：２４７０−２４８０）、Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ（Ｔｒｅｎｄｓ ｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ４４：２５−３８）、Ｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３０ ２０１２ １０８９−１０９９）及びＰｏｉｎｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１１ ４：４８７−５２６）を含み、これらの教示のために参照によって本明細書に組み込まれる。陽極酸化アルミニウム膜は、例えば、ＳＰＩ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）及び他の販売業者、例えば、Ｓｙｋｅｒａ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｏｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ、ＣＯ）及びＳｉｇｎｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から商品名ＡＮＯＰＯＲＥ（商標）で市販されており、支持体リングとともに購入することができる。
本明細書に用いられる場合、膜のエリアまたはイメージのエリアの文脈での用語「エリア」は、隣接または非隣接エリアを含む。例えば、方法が、エリア中の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定すること、例えば、エリア中の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすることを含む場合、ＲＣＡ生成物が定量化されるエリアは、単一の隣接空間または複数の非隣接空間としてよい。
本明細書に用いられる場合、用語「イメージング」は、目的物の表面からの光学的シグナルが検出され、位置に関連したデータ（すなわち、「ピクセル」）として保存されるプロセスを含む。目的物のデジタルイメージは、このデータから再現することができる。膜のエリアは、単一のイメージまたは１つ以上のイメージを用いてイメージ化してよい。
本明細書に用いられる場合、用語「個々の標識化ＲＣＡ生成物」は、標識化されている個々のＲＣＡ分子を含む。
本明細書に用いられる場合、用語「量を測定すること」は、個々に解像されたＲＣＡ生成物をカウントする方法ならびに複数のＲＣＡ生成物からの総シグナルを計測することを含む方法を含む。総シグナルの強度を計測することを含む方法では、個々のＲＣＡ生成物を解像する必要がない。ＲＣＡ生成物の量は、好適なユニットを用いて表すことができる。いくつかの場合では、ＲＣＡ生成物の量は、カウントされた個々に解像されたＲＣＡ生成物の数として表してよい。
本明細書に用いられる場合、用語「カウントすること」は、より大きな収集中の個々の目的物の数を測定することを含む。実施形態では、「カウントすること」が、複数（複数の目的物からの収集シグナルではない）中の個々の目的物から分離したシグナルを検出すること、及びその後、個々のシグナルをカウントすることによってそこの多くの目的物がどれくらい複数中にあるかを測定することを必要とする。本方法の文脈では、「カウントすること」は、シグナルのアレー中の個々のシグナルの数を測定することによって実施してよい。
本明細書に用いられる場合、用語「透明な」は、目的物が、用いられる波長で光学的に透明である状態を含む。蛍光顕微鏡では、「透明な」は、目的物が蛍光団の励起及び発光スペクトル１つまたは両方に透明であることを意味する。以下にさらに詳細に記載されるとおり、ある特定の膜は、湿っている場合のみ、透明である。かかる膜は、その膜の乾燥形態が透明でない可能性があっても、透明な膜と考えられる。
本明細書に用いられる場合、ＲＣＡ生成物のアレーに関連した用語「アレー」は、平面表面上の単一のＲＣＡ生成物の収集を含み、ＲＣＡ生成物は、表面の平面上で互いから空間的に分離されている（アレーのポアソン分布が、真にランダムであることにより認められる範囲まで）。「ランダム」アレーは、要素、例えば、ＲＣＡ生成物が前もって決められていない位置で基質の表面上に分布しているアレーを含む。いくつかの場合では、ポアソン統計によってランダムアレー上のＲＣＡ生成物の分布を記載してよく、その結果、例えば、ポアソン分布を用いてランダムアレーのＲＣＡ生成物間の距離の分布を概算することができる。言い換えれば、ランダムに、すなわち、所定の位置でなく、膜上にＲＣＡ生成物を分布させてよい。
これらの用語及び他の用語の他の意味は、明細書全体にわたって記載してよい。
さらに詳細に本方法を記載する前に、本方法は、ＲＣＡ生成物のフィルターとして機能することができる任意の型の捕捉支持体を用いて実施することができると認識される。かかる捕捉支持体は、分析に用いられる波長で低バックグラウンドシグナルを有し、液体及び捕捉ＲＣＡ生成物の急速な液体フロースルーを可能にするのに十分な孔サイズを有しなければならない。好適な捕捉支持体は、例えば、多孔性金属、セラミックス、均質フィルム（例えば、ポリマー）及び不均質固体（ポリマー混合物、混合ガラス）を含む多孔性有機または無機材料固体から生成してよい。多孔性セラミック膜は、無機材料（例えば、アルミナ、チタニア、酸化ジルコニア、再結晶炭化珪素）から生成することができる。例えば、Ｐａｍｇｅｎｅ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって販売されるＰａｍＣｈｉｐ、Ｗｕ ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４ ３２：ｅ１２３及びＡｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．（２００３）３４：１０８２−６、１０８８−９を参照。例示的な多孔性ポリマー膜は、アセチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースエステル（ＣＡ、ＣＮ、及びＣＥ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレン及びポリプロピレン（ＰＥ及びＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）及びポリ塩化ビニリデン（ＰＶＣ）から生成することができる。こうして、いくつかの実施形態では、本方法が、（ａ）ＲＣＡ生成物のフィルターとして機能する捕捉支持体を用いてローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、これにより支持体上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；当該試料は、少なくともＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団は、区別できるように標識化される；及び（ｂ）膜のエリア中のＲＣＡ生成物の第１の標識化集団の量及びＲＣＡ生成物の第２の標識化集団の量を測定することを含んでよい。
以下に続く説明は、多孔性キャピラリー膜が用いられる実施を示す。多孔性キャピラリー膜は、用いることができる捕捉支持体の１つの例である。以下の説明は、例によって本方法を示す。
上記に概要を示したとおり、試料分析の方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法が、（ａ）多孔性キャピラリー膜を通してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、これにより膜上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；（ｂ）ステップ（ａ）の前または後に、ＲＣＡ生成物を蛍光標識化すること；及び（ｃ）膜のエリア中の個々の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定し、これにより試料中の標識化ＲＣＡ生成物の数の推定値を提供することを含んでよい。本方法は、さまざまな異なる方法で実施してよく、そのうちの１つの実施が図１に図で示されている。図１を参照すると、本方法のある特定の実施形態が、多孔性キャピラリー膜６（例えば、陽極酸化アルミニウム膜）を通して、蛍光標識化ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物４を含有する液体試料２を濾過することを含む。濾過ステップは、粒子を濃縮し、その結果、膜６上にＲＣＡ生成物８のアレーとなる。示した実施形態では、次のステップが、膜上にある粒子を検出することを含む。いくつかの実施形態では、このステップが、アレー８のイメージ１０を生成してよい。明らかであるとおり、任意の好適な蛍光検出器、例えば、蛍光顕微鏡、スキャナー、高解像度ＣＭＯＳまたはＣＣＤ検出器を用いて、またはＰＭＴを用いてなどによって、検出を行ってよい。最終的に、例えば、個々に解像されたＲＣＡ生成物をカウントすることによって、または総シグナルを計測することによって、などによって、膜のエリア中の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定する。この測定が、試料２中の標識化ＲＣＡ生成物１２の数の推定値を提供する。ある特定の実施形態では、本方法の実施方法に応じて、例えば、浸潤剤（例えば、イマージョンオイルまたはグリセロール）でフィルターを湿らせ、膜を湿らせて、それを透明にしてよい。これらの実施形態では、ＲＣＡ生成物を濾過した後に、及びＲＣＡ生成物の量を測定する前に、浸潤剤を用いて多孔性キャピラリー膜を透明にしてよい。いくつかの実施形態では、濾過ステップ後にＲＣＡ生成物を標識化してよい。さらに、いくつかの場合では、アレーのイメージを生成し、保存する必要がない。これらの実施形態では、イメージング中に、またはイメージング直後にアレーの分析を行ってよい。分析がカウントすることを含むいくつかの実施形態では、用いられる蛍光検出器は、膜上の異なるＲＣＡ生成物を解像するのに十分なものとしなければならない。いくつかの実施形態では、蛍光検出器が、１０ｕｍ未満、例えば、５ｕｍ未満または１ｕｍ未満の分解能を有してよい。総シグナルを計測することを含む実施形態では、蛍光検出器が、かかる分解能を有する必要がない。
任意の実施形態では、キャピラリー膜の孔が、ＲＣＡ生成物が孔を通過しないように十分なサイズとしなければならない。例えば、実施形態では、キャピラリー膜の孔直径が、ＲＣＡ生成物のメジアン直径の５０％未満としてよく、一方、いくつかの実施形態では、それは、ＲＣＡ生成物のメジアン直径の２０％未満としてよく、いくつかの実施形態では、ＲＣＡ生成物のメジアン直径の１０％未満としてよい。こうして、多孔性キャピラリー膜を用いて試料を濾過する場合、ＲＣＡ生成物が、膜の上面上に残らなければならず、孔を通して完全に入ってはならない、または孔を通過してはならない。
ある特定の実施形態では、多孔性キャピラリー膜が、特異的にＲＣＡ生成物とハイブリダイズする、またはＲＣＡ生成物と結合するつながれた捕捉剤（例えば、つながれたオリゴヌクレオチド、抗体またはストレプタビジンなど）を含まない。これらの実施形態では、ＲＣＡ生成物が、特異的（例えば、配列特異的）相互反応を介して多孔性キャピラリー膜に結合しない。かかる実施形態では、多孔性キャピラリー膜が、ＵＳ２００６０２２８１３に記載のとおり、マイクロアレーの形態で空間的に位置付け可能な位置で膜につながれている、複数の異なるつながれた配列特異的捕捉剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を含まない。
ある特定の実施形態では、光シグナルの生成以外に、膜を通してＲＣＡ生成物を濾過した後に、生化学的反応（例えば、共有結合の切断または形成の結果となる反応）が膜上に生じる必要がない。
明らかであるとおり、膜を通して濾過される前にローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物が変性されない（例えば、少なくとも２分間、少なくとも９０℃の温度にあてられない）。
図２は、本方法の例示的な実施形態のいくつかの原理を示す。第１のステップでは、容器、例えば、膜を含有するウェル、例えば、底表面に、蛍光標識化ＲＣＡ生成物を含有する試料を入れる。膜を通して試料の液体相を引きつける圧力をかけることによって試料を濃縮する。例えば、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、または少なくとも１０，０００／ｍｍ２の密度で、アレーの形態で膜の表面上にＲＣＡ生成物を保持する。膜が、既に透明ではない場合、その後、浸潤剤の添加後に膜は透明となり、ＲＣＡ生成物を検出する、例えば、イメージ化することができる。ＲＣＡ生成物は、また、定着薬を用いて決まった場所に固定することができ、その結果、膜を移動する及び／または保存することができ、陽性結果が得られる場合、再び読むことができる。いくつかの実施形態では、浸潤剤が、膜を透明にすることに加えて、また、定着薬として作用する。膜のいずれかの面から、例えば、膜を通して（図２に示したとおり）、アレーを分析することができる。明らかであるとおり、「上方」から、すなわち、ＲＣＡ生成物と同じ面から膜を読む場合、膜は透明である必要がない。いくつかの実施形態では、移動及び分析前に膜を乾燥させてよい。分析されるエリアは、少なくとも１０、例えば、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも２００，０００以上のＲＣＡ生成物を含有してよい。
必要ならば、ＲＣＡ生成物を標識化することができ、一方、膜に結合させ、ある特定の実施形態では、標識化ＲＣＡ生成物のアレーを生成した後に及び分析前に、例えば、塩を含有する水または水性緩衝液で膜を洗浄してよい。この洗浄ステップは、バックグラウンドを減少させる可能性があり、これは、バックグラウンドの可能性があるソース（例えば、ＲＣＡ生成物にハイブリダイズされない標識化ヌクレオチドまたは標識化オリゴヌクレオチド）は、フィルターを通して洗浄することができ、フィルターが分析される時間にフィルターと関係していない可能性があるためである。必要ならば、分析前に、バックグラウンドを減少させる、またはシグナルを増加させるためなどのために、他の試薬、例えば、褪色防止剤または蛍光を増やす試薬などを膜に添加することができる。同様に、必要ならば、標識化ＲＣＡ生成物を、必要ならば、分析前に、膜表面に結合（共有または非共有で）させることができる。生体分子を表面に結合する化学は、よく知られており、ある特定の場合では、膜の表面と特異的な反応性がある基を有し、これによりＲＣＡ生成物だけが表面に結合することを確実にする修飾ヌクレオチドまたはプライマーを用いて、ＲＣＡ生成物を生成してよい。
ある特定の実施形態では、（ｉ）多孔性膜上に試料を置くこと；及び（ｉｉ）膜を通して試料を動かす力を加えることによって濾過ステップを行う。試料に加えられる力は、作用力（例えば、遠心力、陰圧または陽圧）または受動力（例えば、キャピラリー作用（例えば、吸取紙を用いて）または蒸発を介して）としてよい。
上記に示したとおり、沈着物の電圧、酸の型、及び他のパラメーターによって、膜中の孔の内部直径、膜中の隣接した孔の中心間の距離、及び膜中の隣接した孔の縁間の距離を制御することができる（一般に、上記のＰｏｉｎｅｒｎを参照）。いくつかの実施形態では、膜中の孔の内部直径は、５ｎｍ〜５００ｎｍ、例えば、４ｎｍ〜２５０ｎｍ、４ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍまたは２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲としてよい。独立して、膜中の隣接した孔の中心間の平均距離は、５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば、５０ｎｍ〜４２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２５０ｎｍ、２５０ｎｍ〜５００ｎｍまたは５００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲としてよい。膜中の隣接した孔の縁間の平均距離は、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜２００ｎｍ、または２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲としてよい。本明細書に提供される直径及び孔間の平均距離値は、例示的なものであり、かかる値は、実施形態に基づいて変えてよいと理解してよい。
いくつかの実施形態では、孔直径及び隣接した孔の中心間の距離は、用いられる検出システムによって個々に解像できる標識化ＲＣＡ生成物を提供するように最適化してよい。特に、ある特定の場合では、膜中の孔は、比較的大きな直径（例えば、１００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の直径）を有してよく、膜中の隣接した孔の中心間の平均距離は、比較的大きくてよく（例えば、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲、例えば、２００ｎｍ〜４２０ｎｍ）、その結果、それぞれの標識化ＲＣＡ生成物は、孔への入口に引っ張られ（有効に孔を「ブロックする」）、隣接した標識化ＲＣＡ生成物間の距離は、蛍光顕微鏡によって解像できる。超解像蛍光顕微鏡（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９ ７８：９９３−１０１６）を用いる場合、これらの最適距離を減少させてよい。
用いられる膜は、所望のとおり、任意の好適な厚さ、例えば、２０μｍ〜５００μｍまたは５０μｍ〜２００μｍの範囲としてよく、上記に示したとおり、使用中、膜の完全性を維持するために１つ以上の支持体構造（例えば、支持体リング）を含有してよい。
上記に示したとおり、試料、特に可変濃度のＲＣＡ生成物（例えば、比較的低い濃度とすることができる１０〜１０Ｍ、例えば、５０μｌ〜２００μｌ以上の容積中の５，０００〜１Ｍ ＲＣＡ生成物）を有する試料中のＲＣＡ生成物の数の正確な定量を必要とするプロトコールに、本方法を用いてよく、差を特定するために必要な統計的分解には、ＲＣＡ生成物の少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも２００，０００以上をカウントすることだけによって、のみ到達することができる。以下にさらに詳細に記載されるとおり、本方法は、特にコピー数分析及び非侵襲的出生前検査用途に使用される。
いくつかの実施形態では、試料が、ＲＣＡ生成物の複数の集団（例えば、ＲＣＡ生成物の２、３または４以上の集団、例えば、標識化ＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団）を含有してよく、異なる集団のＲＣＡ生成物を区別できるように標識化し、これは、集団が混合されている場合にも、ＲＣＡ生成物標識のそれぞれの集団の個々のメンバーを独立して検出し、カウントすることができることを意味する。対象の方法に有用な好適な区別できる蛍光標識対は、Ｃｙ−３及びＣｙ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｑｕａｓａｒ ５７０及びＱｕａｓａｒ ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖａｔｏ ＣＡ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、または）、ＢＯＤＩＰＹ Ｖ−１００２及びＢＯＤＩＰＹ Ｖ１００５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＰＯＰＯ−３及びＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、または）、及びＰＯＰＲＯ３ ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含む。さらに好適な区別できる検出可能標識は、Ｋｒｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１４−２９、２００２）に見出してよい。例えば、ＡＴＴＯ、ＡＬＥＸＡ、ＣＹ、または二量体シアニン染料、例えば、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯなどの任意の組み合わせでＲＣＡ生成物を標識化してよい。また、さらに標識を含んでよい。標識化ＲＣＡ生成物の区別できる集団を生成する例示的な方法が、例えば、２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１、及び２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１９に記載され、これらの教示のために本明細書に参照によって組み込まれる。いくつかの場合では、ＲＣＡ生成物の集団を区別できるように標識化することができ、これは、複数の標識でそれを標識化し、これにより多重化の可能性を増大させることによって行うことができる。例えば、いくつかの場合では、２つの区別できる染料（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５の双方）で、集団のＲＣＡ生成物それぞれを標識化してよい。読む場合、個々の染料（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）で標識化されているＲＣＡ生成物と、かかる二重標識化ＲＣＡ生成物を区別できる。
いくつかの実施形態では、ＲＣＡ生成物の第１の集団が、標識化ＲＣＡ生成物の「検査」集団を表してよく、ＲＣＡ生成物の第２の集団が、第１のＲＣＡ生成物の数を比較することができるＲＣＡ生成物の「参照」集団を表してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＣＡ生成物の第１の集団が第１の染色体領域（例えば、第１の染色体、例えば、染色体２１）に一致してよく、ＲＣＡ生成物の第２の集団が、第２の染色体領域（例えば、第２の染色体、例えば、染色体１３または１８または異なる領域の第１の染色体）に一致してよく、ＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団の数をカウントし、比較し、領域のコピー数に差がある（検査領域の重複または欠失があることを示している）かどうかを判定することができる。いくつかの実施形態では、試料が少なくともＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、標識化ステップで標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を区別できるように標識化する。これらの実施形態では、本方法が、膜のエリア中の第１の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定すること（例えば、これの数をカウントすること）及び膜のエリア（同じエリアまたは異なるエリア）中の第２の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定すること（例えば、これの数をカウントすること）、これにより試料中のＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の量の推定値を提供することを含む。本実施形態は、さらに、試料中の第２のＲＣＡ生成物の数と試料中の第１のＲＣＡ生成物の数を比較することを含んでよい。
本方法のこれらの実施形態のいくつかでは、本方法が、標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団をイメージングし、１つ以上のイメージ（例えば、それぞれ、１つのイメージまたは第１のイメージ及び第２のイメージ、）を生成し及び、任意で、（ｉ）１つ以上のイメージ中の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定すること、これにより試料中の標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の量の推定値を提供することを含んでよい。公知の方法を用いて（例えば、好適なフィルターなどを用いて）標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を別々に検出することができる。ＲＣＡ生成物の検出を連続的に行うことができる（実施形態では、例えば、分離したイメージそれぞれの標識を生成してよく、それぞれの集団からのＲＣＡ生成物を連続的に分析してよい）。また、ＲＣＡ生成物の検出を実質的に同時に行うことができる（実施形態では、例えば、ＲＣＡ生成物の両集団を生成してよく、実質的に同じ時間に、すなわち、実質的に同時にそれぞれの集団からのＲＣＡ生成物を分析してよいことを示す単一のイメージ）。本方法のこれらの実施形態は、さらに、試料中の第２の標識化ＲＣＡ生成物の量と試料中の第１の標識化ＲＣＡ生成物の量を比較することを含んでよい。本方法の本ステップは、第１の集団中の少なくとも１，０００（例えば、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００最大１Ｍ以上）の標識化ＲＣＡ生成物をカウントし、膜のエリア中の少なくとも１，０００（例えば、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００または少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００最大１Ｍ以上）標識化ＲＣＡ生成物をカウントし、これにより統計的厳格さをもってコピー数の差を求めることができることを確実にすることを含んでよい。
実施形態では、本方法が、さらに、試料中の第１のＲＣＡ生成物の量と試料中の第２のＲＣＡ生成物の量との差を検出することを含んでよく、差は、Ｐ値が少なくとも０．９５、少なくとも０．９８または少なくとも０．９９である。いくつかの実施形態では、本方法を用いて、少なくとも１％差、少なくとも２％差、少なくとも３％差、または少なくとも５％差を検出することができ、Ｐ値は０．９５、０．９８または０．９９より大きい。例えば、妊娠女性からの母親の試料を含む実施形態では、この計算に試料の胎児フラクションを含んでよい。
上記に示したとおり、いくつかの場合では、この方法を用いて分析される試料は、血液、例えば、妊娠女性の血液から得られる無細胞ＤＮＡの試料としてよい。これらの実施形態では、本方法を用いて、例えば、（上記に記載のとおり）発育胎児中の染色体異常を検出してよいまたは試料中の胎児ＤＮＡのフラクションを計算してよい。本方法を用いて検出することができるコピー数異常としては、トリソミー２１、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー１６、ＸＸＹ、ＸＹＹ、ＸＸＸ、モノソミーＸ、モノソミー２１、モノソミー２２、モノソミー１６、及びモノソミー１５が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本方法を用いて検出することができるコピー数異常を以下の表に示している。
Figure 0006874252
Figure 0006874252
ＲＣＡ生成物を生成し、これを標識化する例示的な方法が、例えば、２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１、及び２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１９に記載され、これらの方法の開示のために参照によって組み込まれる。
組成物
また、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物が、ａ）多孔性キャピラリー膜、例えば、多孔性陽極酸化アルミニウム膜；及びｂ）膜の表面上の蛍光標識化ＲＣＡ生成物のアレーを含んでよい。アレーは、少なくとも１，０００標識化ＲＣＡ生成物（例えば、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、または少なくとも１Ｍ標識化ＲＣＡ生成物）を含んでよく、標識化ＲＣＡ生成物は、ランダムに、例えば、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、または少なくとも１０，０００／ｍｍ２の密度で、膜の表面に分布させてよい。上記に記載のとおり、組成物が、多孔性キャピラリー膜；及び膜の表面上の蛍光標識化ＲＣＡ生成物の少なくとも２つの集団を含んでよく、蛍光標識化ＲＣＡ生成物の異なる集団を区別できるように標識化する。さらにこの組成物の詳細及び変更は、本開示の方法セクションに見出してよい。
キット
また、上記に記載のとおり、対象の方法を実施するためのキットが本開示によって提供される。いくつかの実施形態では、キットが、少なくとも、配列特異的に選択されるフラグメントを環状化し、その後、環状化された生成物のローリングサークル増幅を実施するための試薬を含有してよい。上記に記載のとおり、例えば、１つ以上の制限酵素、リガーゼ、及び生成物を環状化するスプリントとして作用することができる１つ以上のオリゴヌクレオチド、ＲＣＡによって環状化された生成物を増幅するための鎖置換ポリメラーゼ、ＲＣＡ生成物を標識化するための１つ以上の標識化オリゴヌクレオチド、及び多孔性キャピラリー膜、例えば、多孔性陽極酸化アルミニウム膜。所望のとおり、キットのさまざまな成分は、分離した容器中に存在させてよく、またはある特定の適合成分を単一容器中で事前に混合してよい。さらに本キットの成分の詳細及び変更は、本開示の方法セクションに見出してよい。
上記記載の成分に加えて、対象のキットが、さらに、キットの成分を用いて対象の方法を実施するための指示書、すなわち、試料分析のための指示書を含んでよい。対象の方法を実施するための指示書は、一般に好適な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、基材、例えば、紙またはプラスチックなどにプリントしてよい。こうして、指示書は、添付文書としてキット中に存在させてよく、キットまたはその成分の容器にラベルをはる（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングとの関連で）などである。他の実施形態では、指示書が、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスクなどに存在する電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書が、キット中に存在していないが、リモートソースから、例えば、インターネットを介して指示書を得るための手段が、提供される。本実施形態の例が、指示書を見ることができるウェブアドレス及び／または指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段が、好適な基材に記録されている。
実施形態
以下に本方法の例示的な実施を記載する。
いくつかの実施形態では、本方法が、（ａ）多孔性陽極酸化アルミニウム膜を用いて蛍光標識化ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、これにより膜上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；及びｂ）膜のエリア中の標識化ＲＣＡ生成物の量を測定し、これにより試料中の標識化ＲＣＡ生成物の量の推定値を提供することを含んでよい。いくつかの実施形態では、測定ステップが、エリア中の第１及び第２の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすることを含んでよい。他の実施形態では、測定ステップが、エリアからの総シグナルを検出することを含んでよい。
実施形態では、（ｉ）多孔性陽極酸化アルミニウム膜上に試料を置くこと；及び（ｉｉ）試料膜を通して試料を動かす力を加えることによって、本方法のステップ（ａ）を行ってよい。これらの実施形態では、力は、作用力（遠心力、陰圧または陽圧）または受動力（キャピラリー作用または蒸発によって加えてよい）としてよい。いくつかの実施形態では、本方法が、ステップ（ａ）及び（ｂ）の間に多孔性陽極酸化アルミニウム膜を洗浄することを含んでよい。いくつかの実施形態では、測定ステップが、イメージのエリア中の少なくとも１，０００標識化ＲＣＡ生成物をカウントすることを含んでよい。
実施形態では、膜中の孔の内部直径は、５ｎｍ〜５００ｎｍの範囲としてよく、独立して、膜中の隣接した孔の中心間の平均距離は、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲としてよい。実施形態では、膜中の隣接した孔の縁間の平均距離は、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲としてよい。いくつかの実施形態では、試料が、少なくとも標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を含有してよく、標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を区別できるように標識化する。これらの実施形態では、本方法が、さらに、標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団をイメージングし、１つ以上のイメージ（例えば、それぞれ、第１のイメージ及び第２のイメージ）を生成することを含んでよい。これらの方法は、さらに、（ｉ）第１のイメージのエリア中の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすること、及び（ｉｉ）別々に第２のイメージのエリア、例えば、同じエリア中の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントし、これにより試料中の標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の数の推定値を提供することを含んでよい。本実施形態は、さらに、試料中の第２の標識化ＲＣＡ生成物の量と試料中の第１の標識化ＲＣＡ生成物の量を比較することを含んでよい。
また、ａ）多孔性キャピラリー膜；及びｂ）膜の表面上の蛍光標識化ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物のアレーを含む組成物が提供される。これらの実施形態のいくつかでは、多孔性キャピラリー膜は、多孔性陽極酸化アルミニウム膜としてよい。いくつかの実施形態では、アレーが、少なくとも１，０００ＲＣＡ生成物を含んでよい。いくつかの実施形態では、組成物が、蛍光標識化ＲＣＡ生成物の複数のアレーを含んでよく、複数のアレーは、膜の表面上にあり、区別できるように標識化される。これらの要素ならびに組成物中に存在させてよい任意の要素のそれぞれの説明は、上記の説明に見出してよい。
また、ａ）多孔性キャピラリー膜；及びｂ）ＤＮＡを環状化し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施するための試薬；及びｃ）ＲＣＡ生成物を標識化するための試薬を含むキットが提供される。これらの要素ならびにキット中に存在させてよい任意の要素のそれぞれの説明は、上記の説明に見出してよい。
実施形態１、試料分析の方法が、（ａ）多孔性透明キャピラリー膜を通して、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、これによりＲＣＡ生成物を濃縮し、膜上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；（ｂ）ステップ（ａ）の前または後に、ＲＣＡ生成物を蛍光標識化すること；及び（ｃ）膜のエリア中の個々の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントし、これにより試料中の標識化ＲＣＡ生成物の数の推定値を提供することを含む。
実施形態２．多孔性透明キャピラリー膜が、多孔性陽極酸化アルミニウム膜である、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前または後に、蛍光標識化オリゴヌクレオチドをＲＣＡ生成物にハイブリダイズすることによって行われる、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４．膜のエリアをイメージングし、１つ以上のイメージを生成し、１つ以上のイメージ中の個々の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすることを含む、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態５．ステップ（ａ）が、（ｉ）多孔性透明キャピラリー膜上に試料を置くこと；及び（ｉｉ）膜を通して試料を動かす力を加えることによって行われる、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態６．力が、作用力または受動力である、実施形態５に記載の方法。
実施形態７．作用力が、遠心力、陰圧または陽圧である、実施形態６に記載の方法。
実施形態８．受動力が、キャピラリー作用または蒸発によって加えられる、実施形態６に記載の方法。
実施形態９．さらに、ステップ（ａ）及び（ｂ）の間に多孔性透明キャピラリー膜を洗浄することを含む、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１０．カウントステップが、膜のエリア中の少なくとも１，０００標識化ＲＣＡ生成物をカウントすることを含む、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１１．膜中の孔の内部直径が、２ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１２．膜中の隣接した孔の中心間の平均距離が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲である、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１３．膜中の隣接した孔の縁間の平均距離が、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１４．試料が少なくともＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、ステップ（ｂ）で標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を区別できるように標識化する、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態１５．膜のエリア中の第１の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントし、膜のエリア中の第２の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントし、これにより試料中のＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の数の推定値を提供することを含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１６．さらに、試料中の第２のＲＣＡ生成物の数と試料中の第１のＲＣＡ生成物の数を比較することを含む、実施形態１５に記載の方法。
以下の実施例は、本発明の実施方法及び使用方法の包括的な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、発明者が、発明と考えるものの範囲を制限することを意図せず、以下の実験が、実施した全実験または唯一の実験であることを示すことも意図しない。
実施例１
ＡＡＯフィルターの使用
序論
多くの分子診断用途での第１のステップは、患者の生物学的材料、例えば、ＤＮＡを有効なバイオマーカーに変換することである。ＤＮＡは、抽出され、精製されることが多く、さらに、計測または定量化することができる代用分子、例えば、ローリングサークル生成物（ＲＣＰ）に変換される。これらの代用分子の検出は、蛍光染料の特異的結合の補助を受けることが多い。さまざまな染料を、さまざまな代用マーカーと結合させることができ、コンプレックス混合物中でも多重検出が可能になる。平面表面、例えば、ガラスプレートまたはスライドへの沈着によって、顕微鏡またはスキャニングによる標識化分子のカウントが可能になる。
試料の溶液中の濃度が低い場合、特定の難題が生じ、正確な枚挙法のために十分な数の分子を沈着させることが難しい。薬剤、例えば、ポリｌ−リジン（ＰＬＬ）、アミノ−シランまたは類似物でガラススライドをコーティングすることが、ほとんどＤＮＡからなる代用マーカーの沈着を改善する有効な手段であることが証明されている（例えば、２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１、及び２０１４年１１月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１９を参照、）。これは、ある程度、沈着有効性を改善するが、多くの分子が溶液中に残り、次の分析に含まれない。蛍光標識化バイオマーカーの平面表面への沈着の収率を増大させるために、以下の濾過方法を実施した。
材料及び方法
装置：組織内で作製した、またはＩｂｉｄｉ（ｐａｒｔ＃８１２０１）から購入したウェル−プレート上部構造に酸化アルミニウム膜を結合した。
アミノ−シランコーティングプレート（９６−Ｗｅｌｌ Ｇｌａｓｓ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｌａｔｅｓ ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅ、ｐａｒｔ＃Ｍ９６Ｍ）ＡｒｒａｙＩｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
前記記載の方法（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６７７１）を用いて、２つの分離したローリングサークル増幅生成物を生成した。５’ Ａｔｔｏ ５５０標識を含有する相補的検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、１つのＲＣＡ反応物を標識化し、同様に、５’ Ａｔｔｏ ６４７Ｎで他のＲＣＡ反応物を標識化した。５０ｆＭ濃度で、５０：５０混合物中に、ＲＣＡ反応物を混合した。
ガラスプレートのために、１００ｕｌの反応物をプレートの３ウェルに採取し、室温で１６時間、インキュべートした。別の一連の３ウェルを９０秒間、インキュべートした。インキュベーション後に、ウェルを２ｘＳＳＣで、２回、洗浄し、乾燥させた。
膜のために、１００ｕｌ試料を膜底プレートに添加し、その後、プレートを吸取紙（ＶＷＲ ｐａｒｔ＃ ２８２９８−０２２）上に置いた。およそ９０秒、試料を酸化アルミニウム膜に通過させた。吸取紙から膜底プレートを除去し、２滴の持続性褪色防止試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれのウェルに添加し、それらを透明にした。
２０Ｘ対物レンズ付きＯｌｙｍｐｕｓ Ｘ８１顕微鏡及びＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ ４．０ｌｔカメラ上で、両フォーマットについてイメージングを行った。それぞれのウェルの底全体を覆うように９ｘ９イメージをタイリングすることによってイメージングを行った。イメージを分析し、組織内専用ソフトウエアを用いてＲＣＡ生成物をカウントした。
結果
結果は、図３にまとめられている。１６時間、インキュべートした場合、ガラスプレート上に沈着し、その結果、Ａｔｔｏ ５５０ 標識化ＲＣＡ生成物では、イメージごとの平均が２，０００〜４，０００カウントとなった。Ａｔｔｏ ６４７Ｎでは、イメージごとの平均カウントが２，０００〜３，０００カウントであった。９０秒間、ガラスプレート上でインキュベーションした結果、イメージごとの平均カウントが両チャンネルとも５００〜２，５００カウントであった。これに対して、酸化アルミニウムプレート上でのインキュベーション／沈着の結果、Ａｔｔｏ ５５０ 標識化ＲＣＰでは、イメージごとの平均が６，０００〜１０，０００カウントとなり、６４７Ｎ 標識化ＲＣＡ生成物では、６，０００〜９，０００カウントとなった。
このデータは、酸化アルミニウム膜上での沈着の結果、同じ９０秒時間間隔でガラスプレート上に沈着した場合よりおよそ４倍多いカウントとなったことを示している。ガラスプレートでインキュベーション時間を１６時間に増大させた場合、結果は、ガラスプレート上に検出されるＲＣＡ生成物が増大したが、９０秒で酸化アルミニウム上にみられた倍数よりまだ２．５倍少なかった。
実施例２
多重検出方法
材料及び方法
装置：２０ｎｍ孔を有する酸化アルミニウム膜を４ｔｉｔｕｄｅ Ｌｔｄ、ＵＫによって注文生成された９６ウェル−プレート上部構造に結合した。
この多重実験では、遺伝的出発材料として２つの細胞株からのＤＮＡの混合物を用いた。細胞株ＤＮＡは、染色体２１（正常遺伝子構造）の２コピーまたは染色体（トリソミー２１）の３コピーを含有する細胞株のいずれかを含有した。以下の割合１００：０、９５：５、９０：１０、０：１００で、細胞株から抽出されたＤＮＡを混合した。最初に制限酵素を用いてそれぞれのＤＮＡ混合物を消化させ、ハイブリダイズし、プローブセットに連結し、その後、前記に記載のとおり、ＲＣＡによって酵素的に増幅した（ＷＯ２０１５０８３００１及びＷＯ２０１５０８３００２を参照）。２つの染色体特異的検出オリゴヌクレオチド（染色体１８のＡｔｔｏ ５５０、染色体２１のＡｔｔｏ ６４７）をそれぞれの試料に添加し、ハイブリダイズし、こうしてそれぞれの試料中の染色体特異的ＲＣＡ生成物を蛍光標識化した。
標識化後に、１００ｕｌ試料を膜底プレートに添加し、その後、プレートを真空マニホールド（ｍａｎｆｏｌｄ）（Ｓｕｐｌｅｃｏ ｐａｒｔ＃６６８７９−Ｕ）上に置いた。およそ９０秒、試料を酸化アルミニウム膜に通過させた。４００ｕｌ ０．５Ｘ ＳＳＣで、２回、膜底プレートを洗浄し、その後、乾燥させた。その後、３００マイクロリットルの浸潤剤／定着薬をそれぞれのウェルに被着させ、それらを透明にし、ＲＣＡ生成物を膜に固定した。
２０Ｘ対物レンズ付きＯｌｙｍｐｕｓ Ｘ８１顕微鏡及びＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ ４．０ｌｔカメラ上で、イメージングを行った。それぞれのウェルの底全体を覆うように１０ｘ１０イメージをタイリングすることによってイメージングを行った。イメージを分析し、組織内専用ソフトウエアを用いてＲＣＡ生成物をカウントした。
結果
結果は、図４にまとめられている。実験に含まれる全９１試料のイメージごとの平均カウントは、イメージごとのカウントが３０００から５０００をわずかに越える範囲であった。ヒストグラムは、０：１００比混合物（最終２２複製）中の５５０及び６４７チャンネル間のカウントの割合の差を明確に示しているが、図のみから０、５、＆１０％試料の割合差を見分けるのは、さらに難しい。図５は、細胞株混合物組成物に対する２つのチャンネルのカウント間の比の図表である。このグラフでは、傾向が、明確に示されており、インプット細胞株ＤＮＡ試料の割合に従うカウントの相対比シフトを例示している。
このデータは、酸化アルミニウム膜上での沈着の結果、同じ９０秒時間間隔でガラスプレート上に沈着した場合よりおよそ４倍多いカウントとなったことを示している。ガラスプレートでインキュベーション時間を１６時間に増大させた場合、結果は、ガラスプレート上に検出されるＲＣＡ生成物が増大したが、９０秒で酸化アルミニウム上にみられた倍数よりまだ２．５倍少なかった。

Claims (18)

  1. （ａ）多孔性キャピラリー膜を用いてローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過すること、これにより膜上にＲＣＡ生成物のアレーを生成すること；前記試料は、少なくとも標識化ＲＣＡ生成物の第１の集団及び標識化ＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、前記標識化ＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団は、区別できるように標識化される；及び（ｂ）膜のエリア中の前記標識化ＲＣＡ生成物の第１の集団の量及び前記標識化ＲＣＡ生成物の第２の集団の量を測定することを含み、測定ステップ（ｂ）が、前記エリア中の前記第１の集団の標識化ＲＣＡ生成物の数、及び前記エリア中の前記第２の集団の標識化ＲＣＡ生成物の数をカウントすることを含む試料分析の方法。
  2. 測定ステップ（ｂ）が、さらに前記エリアからの総シグナルを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多孔性キャピラリー膜が、多孔性陽極酸化アルミニウム膜である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ステップ（ａ）前に、蛍光標識化オリゴヌクレオチドを前記ＲＣＡ生成物にハイブリダイズすることによって前記ＲＣＡ生成物を区別できるように標識化する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記膜のエリアをイメージングし、１つ以上のイメージを生成し、及び前記１つ以上のイメージ中の個々の標識化ＲＣＡ生成物の数を測定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ステップ（ａ）が、（ｉ）前記多孔性キャピラリー膜上に前記試料を置くこと；及び（ｉｉ）前記膜を通して前記試料を動かす力を加えることによって行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記力が、作用力または受動力である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記作用力が、遠心力、陰圧または陽圧である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記受動力が、キャピラリー作用または蒸発によって加えられる、請求項７に記載の方法。
  10. さらに、ステップ（ａ）及び（ｂ）間に前記多孔性キャピラリー膜を洗浄することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記カウントステップが、膜のエリア中の少なくとも１，０００標識化ＲＣＡ生成物をカウントすることを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記膜中の孔の内部直径が、２ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記膜中の隣接した孔の中心間の平均距離が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記膜中の隣接した孔の縁間の平均距離が、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. さらに、前記試料中の前記第２の集団の標識化ＲＣＡ生成物の数と前記試料中の前記第１の集団の標識化ＲＣＡ生成物の数を比較することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ステップ（ａ）及び（ｂ）の間に、浸潤剤を用いて前記多孔性キャピラリー膜を透明にする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記液体試料が妊娠女性の血液から得られる無細胞ＤＮＡの試料である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 請求項１７に記載の方法を用いることを含む、前記妊娠女性の発育胎児中の染色体異常の検出を補助するための方法。
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