JP6997775B2 - ローリングサークル増幅産物を処理する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年10月27日に出願された仮出願第62/413,762号の利益を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
図示した実施形態では、次のステップは、RCA産物が膜上にある間にそれらを検出することを含む。いくつかの実施形態では、このステップではRCA産物の画像14を生成することができる。明らかなように、検出は、任意の適切な蛍光検出器、例えば蛍光顕微鏡、スキャナーを使用して、高解像度CMOSまたはCCD検出器を使用して、またはPMTなどを使用して行うことができる。最後に、膜の領域内の標識化RCA産物の量を、例えば、個々に解像されたRCA産物をカウントすることによって、または総シグナルを測定することによってなどにより判定する。この判定により、サンプル2における標識化RCA産物4の数の推定値が得られる。RCA産物は濾過ステップの前または後に標識化することができる。
組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、(a)多孔質キャピラリー膜(例えば多孔質陽極酸化アルミニウム膜)、(b)膜上の複数の蛍光標識化RCA産物(例えば少なくとも1,000、少なくとも5,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000、少なくとも500,000、または少なくとも1Mの標識化RCA産物、(c)蛍光標識化RCA産物を封入する固体(例えば硬化シリコーン)の層、を含むことができる。この固体層は、いくつかの実施形態では、透明であることができ、上記したように、膜を湿潤させて透明にすることができる。標識化RCA産物は、例えば少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1,000、少なくとも5,000、または少なくとも10,000/mm2の密度で、無作為に、膜の表面全体に分布させることができる。いくつかの実施形態では、固体は、少なくとも膜の孔の入口を通って浸透することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、膜の表面上に蛍光標識化RCA産物の少なくとも2つの集団を含むことができ、ここで、蛍光標識化RCA産物の異なる集団は区別可能に標識化される。この組成物に関するさらなる詳細およびバリエーションは本開示の方法のセクションに記載してある。
本開示により、上記したように本方法を実施するためのキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも、(a)蛍光標識化RCA産物を生成するための試薬(すなわち、選択されたフラグメントを配列特異的な仕方で環状化し、次いで環状化産物のローリングサークル増幅を行うための試薬、例えば、1つ以上の制限酵素、リガーゼ、および産物を環状化するためのスプリントとして機能し得る1つ以上のオリゴヌクレオチド、環状化産物をRCAによって増幅するための鎖置換ポリメラーゼ、RCA産物を標識化するための1つ以上の標識化オリゴヌクレオチドなど)、(b)多孔質キャピラリー膜、例えば多孔質陽極酸化アルミニウム膜、(c)硬化性ポリマー、例えばシリコーン、を含有することができる。キットは、さらに、硬化性湿潤剤とは別の容器に硬化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、硬化性ポリマーおよび硬化剤は、混合先端を有する二重バレルシリンジの異なるバレル中に存在することができる。いくつかの実施形態では、キットは、希釈剤、例えばシリコーンオイルも含むことができる。
多重検出方法
材料および方法
装置:20nmの孔を有する酸化アルミニウム膜を、特注製造された96ウェルプレート超構造に結合させた。
結果を図2にまとめた。実験に含まれる全91試料の1画像当たりの平均カウントは、1画像当たり3000から5000をわずかに超える範囲であった。ヒストグラムは、0:100比率の混合物(最終22複製)中の550チャネルと647チャネル間のカウントの割合の差を明確に示しているが、図のみから0、5、および10%試料の割合差を見分けるのは、さらに難しい。図3は、細胞株混合物組成物に対する2つのチャネルに関するカウント間の比のプロットである。このグラフでは、傾向が明確に示されており、入力細胞株DNA試料の割合に従うカウントにおける相対比シフトを例示している。
実施形態1.ローリングサークル増幅(RCA)産物を含む膜を処理する方法は、
(a)膜中または膜上にある蛍光標識化RCA産物を含む多孔質キャピラリー膜を得ることと、
(b)硬化性ポリマーを膜上に堆積させることと、
(c)硬化性ポリマーを硬化させてRCA産物を固体中に封入することと、を含む。
膜を通してRCA産物を濾過して、膜中または膜上にあるRCA産物を生成することと、
濾過の前または後にRCA産物を蛍光標識化することと、によって作製する、先行する実施形態のいずれかの方法。
(d)膜の領域内にある個々の標識化RCA産物の数を定量化し、それによって試料中の標識化RCA産物の数の推定値を提供する、先行する実施形態のいずれかの方法。
(a)蛍光標識化RCA産物を生成するための試薬と、
(b)多孔質キャピラリー膜と、
(c)硬化性ポリマーと、を含むキット。
(a)多孔質キャピラリー膜と、
(b)膜上の複数の蛍光標識化RCA産物と、
(c)蛍光標識化RCA産物を封入する固体層と、を含む組成物。
Claims (20)
- ローリングサークル増幅(RCA)産物を含む膜を処理するための方法であって、
(a)前記膜中または前記膜上にある蛍光標識化RCA産物を含む多孔質キャピラリー膜を得ることと、
(b)硬化性ポリマーを前記膜上に堆積させることと、
(c)前記硬化性ポリマーを硬化させて前記RCA産物を固体中に封入することと、を含む、方法。 - ステップ(c)で生成された前記固体が、透明である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の前記硬化性ポリマーが、硬化剤を含む、請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(b)の前記硬化性ポリマーが、粘度を下げるために希釈剤を含む、請求項1~3のいずれかに記載の方法。
- 前記膜が、陽極酸化アルミニウム膜であり、(c)の固体が、前記膜を透明にする湿潤特性を有する、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 前記硬化性ポリマーが、シリコーンである、請求項5に記載の方法。
- 前記シリコーンが、硬化剤と、場合によってはシリコーンオイル希釈剤と混合される、請求項6に記載の方法。
- 前記硬化ステップ(c)が、外部刺激によって開始される、請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 前記外部刺激が、熱、湿気、または光である、請求項8に記載の方法。
- 前記蛍光標識化RCA産物が、
前記膜を通して前記RCA産物を濾過して、前記膜中または前記膜上にあるRCA産物を生成することと、
前記濾過の前または後に前記RCA産物を蛍光標識化することと、によって作製される、請求項1~9のいずれかに記載の方法。 - 前記方法が、さらに、
(d)前記膜の領域内に存在する個々の標識化RCA産物の数を定量化し、それによって試料中の前記標識化RCA産物の数の推定値を提供する、請求項1~10のいずれかに記載の方法。 - (a)蛍光標識化RCA産物を生成するための試薬と、
(b)多孔質キャピラリー膜と、
(c)硬化性ポリマーと、を含む、キット。 - 前記キットが、さらに硬化剤を含み、前記硬化剤が、前記硬化性ポリマーと同じ容器内にある、請求項12に記載のキット。
- 前記キットが、さらに硬化剤を含み、前記硬化剤および前記硬化性ポリマーが、異なる容器内にある、請求項12に記載のキット。
- 前記硬化性ポリマーが、シリコーンである、請求項12~14のいずれかに記載のキット。
- 前記多孔質キャピラリー膜が、陽極酸化アルミニウムフィルターである、請求項12~15のいずれかに記載のキット。
- (a)多孔質キャピラリー膜と、
(b)前記膜上の複数の蛍光標識化RCA産物と、
(c)前記蛍光標識化RCA産物を封入する固体の層と、を含む、組成物。 - 前記固体が、前記膜の孔を通って浸透する、請求項17に記載の組成物。
- 前記膜が、酸化アルミニウムフィルターである、請求項17または18に記載の組成物。
- 前記固体が、架橋シリコーンである、請求項17~19のいずれかに記載の組成物。
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