CN110023505A - 用于处理滚环扩增产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开尤其提供了一种用于处理包含滚环扩增(RCA)产物的膜的方法。在一些实施例中，此方法可包含：(a)获得多孔毛细管膜，其包含在所述膜内或所述膜上的荧光标记的RCA产物；(b)将可固化聚合物沉积在所述膜上；和(c)固化所述可固化聚合物以将所述RCA产物包封在固体中。在一些实施例中，所述可固化聚合物可以是硅氧烷并且在其固体形式下可以为透明的。还提供了用于进行所述方法的试剂盒和由所述方法制得的组合物。

Description

用于处理滚环扩增产物的方法
交叉引用
本申请要求2016年10月27日提交的第62/413,762号临时申请的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
可以通过将探针与核酸样品杂交、使与靶序列杂交的探针环化、使用滚环扩增(RCA)扩增环化的探针和量化RCA产物的数量来实施几种基于核酸的诊断测试。
在这些方法中，RCA产物可以以各种不同方式量化。举例来说，理论上，RCA产物可以通过标记RCA产物、将样品沉积到玻璃载片表面上，以及计数载片上标记的产物的数量来量化。然而，只要将含有标记的RCA产物的溶液放在玻璃载片上，使标记的RCA产物扩散到表面，且然后计数附接到载片上的标记的RCA产物的数量需要几个小时而不是所有标记的RCA产物到达载片并计数。通过过滤器过滤RCA产物且然后计数通过过滤器捕获的标记的RCA产物的数量，可以在很大程度上解决这些问题。然而，在一些情况下以稳健的方式实施这种方法可能是具有挑战性的，因为许多荧光标记在其与空气接触时会迅速降解。此外，如果过滤器被润湿，RCA产物可以四处移动。这些挑战使得难以以高通量方式实施这些方法，特别是当样品必须物理移动(例如，倒置或旋转)时，不能总是立即进行分析，或者需要重新分析样品。
相信本公开提供了一种对这些问题的解决方案。
发明内容
本公开尤其提供了一种用于处理包含滚环扩增(RCA)产物的膜的方法。在一些实施例中，所述方法可包含：(a)获得多孔毛细管膜，其包含在膜内或膜上的荧光标记的RCA产物；(b)将可固化聚合物沉积在膜上；和(c)固化可固化聚合物以将RCA产物包封在固体中。在一些实施例中，可固化聚合物可以是硅氧烷并且在其固体形式下可以为透明的。还提供了用于进行所述方法的一种试剂盒和由所述方法制得的一种组合物。
将RCA产物包封在固体中(与使用液体或不使用液体相反)被认为是“固定”RCA产物，即将RCA产物固定在过滤器上，并且还防止荧光标记的RCA产物被外界空气氧化(即降解)。因此，通过将RCA产物包封在固体中，包含标记的RCA产物的过滤器可以在多个方向上快速移动(例如，倒置、旋转或传输)和/或储存很长一段时间(例如，数周、数月或甚至几年)。因此，本方法可以促进在工作流程中分析RCA产物，所述工作流程涉及在分析(例如，通过机器人)之前或在其中RCA产物不能总是立即量化的工作流程中快速多向移动过滤器。另外，本方法可以在其中可能需要在很长一段时间之后重新分析过滤器的工作流程中使用。
鉴于以下描述，这些和其它潜在特征和优点可能变得显而易见。
附图说明
所属领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图并非旨在以任何方式限制本教示的范围。
图1示意性地示出了本方法的一些步骤。
图2为显示实例1中描述的一些实验结果的直方图。
图3为相对于细胞系混合物组成的两个通道的计数之间的比率的图。
具体实施方式
在描述各种实施例之前，应理解，本公开的教示不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以改变。还应了解，本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不旨在为限制性的，因为本教示的范围仅由所附权利要求书限制。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，并且不应理解为以任何方式限制所描述的主题。虽然结合各种实施例描述本发明教示，但是并不旨在将本发明教示限制于这类实施例。相反，如所属领域技术人员将理解的，本教示涵盖各种替代方案、修改以及等效物。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料也可用于实施或测试本教示，但是现在描述例示性方法和材料。
对任何公开案的引用是针对申请日之前的其公开内容，并且不应解释为承认本权利要求书无权先于依靠先前发明的这个公开案。此外，所提供的公开案日期可以不同于可能需要独立确认的实际公开案日期。
如所属领域的技术人员在阅读本发明之后将显而易见，本文中所描述和说明的个别实施例中的每一个具有离散组件和特征，其可以在不脱离本教示的范围或精神的情况下，容易地与其它若干实施例中的任一个的特征分离或与其组合。任何所述方法均可以所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来进行。
本文提及的所有专利和公开案，包括在此类专利和公开案中公开的所有序列，都明确地以引用的方式并入。
在更详细地描述例示性实施例之前，阐述以下含义以说明说明书中使用的术语的含义和范围。
应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一(a/an)”以及“所述”包括多个指示物。举例来说，术语“引物”是指一种或多种引物，即单一引物和多种引物。还应注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的要素。这样，本陈述旨在用作使用这种排除性术语，如结合权利要求要素而叙述的“唯一”、“仅仅”等，或使用“否定”限制的前置基础。
如本文所用，术语“过滤”是指将含有分析物(例如，滚环扩增产物)的液体移动通过过滤器以使得一些分析物被过滤器保留的动作。在过滤中，至少一些液体从过滤器的一侧转移到另一侧。
如本文所用，术语“滚环扩增”或“RCA”是指使用链置换聚合酶产生环状核酸模板的线性多联拷贝的等温扩增。RCA在分子生物学领域中为众所周知的，并且在各种公开案中有所描述，包括但不限于Lizardi等人(《自然遗传学(Nat.Genet.)》1998 19:225-232)、Schweitzer等人(《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》2000 97:10113-10119)、Wiltshire等人(《临床化学(Clin.Chem.)》2000 46:1990-1993)和Schweitzer等人(《生物技术当前观点(Curr.Opin.Biotech)》2001 12:21-27)，其以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“滚环扩增产物”是指滚环扩增反应的多联产物。如本文所用，术语“荧光标记的滚环扩增产物”是指通过例如将荧光标记的寡核苷酸与滚环扩增产物杂交或其它方式(例如，在扩增期间通过将萤光核苷酸并入产物中)而荧光标记的滚环扩增产物。
如本文所用，术语“多孔毛细管膜”是指具有相对密集的单个毛细管的膜，所述毛细管跨越膜的厚度，即从膜的一侧到另一侧，从而允许液体而不是粒子，从膜的一侧通向另一侧。多孔毛细管膜的实例包括但不限于例如阳极氧化铝膜(参见下文)、纳米通道玻璃膜、轨道蚀刻膜和聚四氟乙烯。纳米通道玻璃膜由玻璃制成并具有高密度的均匀通道，其中直径为15微米至15纳米(参见，例如，Tonucci等人，《在纳米光子学II中的发展，AIP会议论文集(Advances in Nanophotonics II，AIP Conference Proceedings)》，2007 959:59-71；Pearson等人，《科学(Science)》1995 270:68-70和Tonucci等人，《科学(Science)》1992258:783-785以及美国专利5,306,661；5,332,681；5,976,444；6,087,274；6,376,096；6,483,640；和6,599,616，其以引用的方式并入)。轨道蚀刻膜由透明聚合物(例如，聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯或聚酰亚胺等)制成，所述聚合物含有直径在0.01μm至30μm范围内的孔，这些孔氏通过带电粒子轰击(或照射)和化学蚀刻的组合制成。其它所关注的多孔膜包括但不限于无定形含氟聚合物，例如NAFIONTM、TEFLON AFTM、FEFLON FEIPTM和CYTOPTM(DuPont Fluoroproducts，费耶特维尔(Fayetteville)，北卡罗来纳州(NC))。如将认识到的，多孔毛细管膜可以具有表面(例如，涂层或化学改性的表面)，其与制造膜的材料不同。例如，多孔毛细管膜的表面可具有改变的电荷特征或改变的疏水性或亲水性特征。在一些实施例中，表面可以涂有氨基硅烷、聚赖氨酸或另一种化合物，以提供有助于将RCA产物保留在表面上的正电荷。替代地或另外地，表面可以具有沉积在其中的金属(例如，钛、金)的薄层，其可以与改变过滤器的表面特性的其它试剂连接。
如本文所用，术语“阳极氧化铝膜”是指当Al在某些酸性介质中阳极氧化时所产生的规则的、自组织的纳米多孔膜结构。膜中孔的内径、膜中相邻孔的中心之间的距离以及膜中相邻孔的边缘之间的距离可以由沉积的电压、酸的类型和其它参数控制。阳极氧化铝膜在润湿时几乎为透明的。阳极氧化铝膜、其特性以及如何制造这种膜在各种公开案中有详细的综述，所述公开案包括但不限于：Li等人(《化学材料(Chem.Mater)》1998 10:2470-2480)、Santos等人(《分析化学的趋势(Trends on Analytical Chemistry)》2013 44:25-38)、Ingham等人(《生物技术进展(Biotechnology Advances)》30 2012 1089-1099)和Poinern等人(《材料(Materials)》2011 4:487-526)，对于那些教示，其以引用的方式并入本文中。阳极氧化铝膜以商品名ANOPORETM市购自SPI Supplies(西切斯特(West Chester)，宾夕法尼亚州(PA))和其它供应商如Sykera Technologies Inc.(Longmont，CO)和西格玛-阿尔德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))并且可以用支撑环购买。
如本文所用，术语“区域”在膜的区域或图像区域的上下文中是指连续或非连续区域。举例来说，如果方法涉及确定区域中标记的RCA产物的量，例如，计数区域中标记的RCA产物的数量，则RCA产物被量化的区域可以为单个、连续空间或多个非连续空间。
如本文所用，术语“成像”是指检测来自物体表面的光信号并将其作为与位置(即“像素”)相关联的数据储存的过程。可以从此数据重建物体的数字图像。可以使用单个图像或一个或多个图像对膜的区域进行成像。
如本文所用，术语“单个标记的RCA产物”是指标记的单个RCA分子。
如本文所用，术语“确定量”是指其中计数单独解析的RCA产物的方法以及包括测量来自多种RCA产物的聚合信号的方法。在涉及测量聚合信号强度的方法中，不需要解析各个RCA产物。RCA产物的量可以使用任何合适的单位表示。在一些情况下，RCA产物的量可以表示为已计数的单独解析的RCA产物的数量。
如本文所用，术语“计数”是指确定更大集合中的单个物体的数量。在一些实施例中，“计数”需要检测来自多个中的各个物体的单独信号(不是来自多个物体的集合信号)，并且然后通过对各个单独信号进行计数来确定多个中有多少个物体。在本方法的上下文中，可以通过确定信号阵列中的各个信号的数量来进行“计数”。
如本文所用，术语“透明”是指物体在所使用的波长下为光学透明的状态。对于荧光显微术，“透明”意指物体对荧光团的激发和发射光谱中的一个或两个为透明的。如下文将更详细地描述，某些膜仅在其被润湿时才为透明的。这种膜被认为是透明膜，即使这些膜的干燥形式可能不透明。
如本文所用，术语“可固化”在可固化聚合物的上下文中是指可通过交联反应制成固体(即“固化”)的液体聚合物。在一些情况下，可通过添加固化剂(例如，引起或催化聚合物交联的第二化合物)使可固化聚合物变成固体。在一些情况下，可以通过外部刺激(例如，热、湿度或紫外光)来引发固化。
如本文所用，术语“固体”是指可固化聚合物的固体形式。固体可以为半固体形式，例如凝胶或橡胶。
在整个说明书中可能出现这些和其它术语的其它含义。
在更详细地描述本方法之前，应认识到，本方法可以使用可以用作RCA产物的过滤器的任何类型的捕获支撑物来实施。这种捕获支撑物应在分析中使用的波长处具有低背景信号，并且孔径足以允许液体和捕获RCA产物的快速流体流过。合适的捕获支撑物可由多孔有机或无机材料制成，包括固体如多孔金属、陶瓷、均质膜(例如聚合物)和异质固体(聚合物混合物、混合玻璃)。多孔陶瓷膜可以由无机材料(如氧化铝、二氧化钛、氧化锆、再结晶碳化硅)制成。参见，例如，由Pamgene(荷兰(Netherlands))出售的PamChip、Wu等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2004 32:e123和Anthony等人《生物技术(Biotechniques.)》(2003)34:1082-6,1088-9。例示性多孔聚合物膜可以由以下制成：乙酸纤维素、硝化纤维素、纤维素酯(CA、CN和CE)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯和聚丙烯(PE和PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)和聚氯乙烯(PVC)。下文的描述说明了使用多孔毛细管膜的实施方案。多孔毛细管膜是可以使用的捕获支撑物的一个实例。以下描述通过实例说明本方法。
如上所概括，本公开提供了一种用于处理包含滚环扩增(RCA)产物的膜的方法。在一些实施例中，此方法可包含：(a)获得多孔毛细管膜，其包含在所述膜内或所述膜上的荧光标记的RCA产物；(b)将可固化聚合物沉积在所述膜上；和(c)固化所述可固化聚合物以将所述RCA产物包封在固体中。
在一些情况下，(c)中产生的固体为透明的。在这些实施例中，固体形式的润湿剂可具有与膜相容的折射率。举例来说，如果使用阳极氧化铝膜(其具有约1.72的折射率)，则固体形式的润湿剂可具有在1.2至1.8，例如1.30至1.6范围内的折射率。硅氧烷通常具有约1.4的折射率并且与阳极氧化铝膜相容。在一些实施例中，可固化聚合物在其固化时不应收缩。
可固化聚合物包括硅氧烷、环氧树脂以及各种其它塑胶，其中许多为透明的。可固化聚合物可以以各种不同方式调配。举例来说，在一些实施例中，可固化聚合物可包含固化剂，例如用于交联聚合物的催化剂或使聚合物交联的另一种化合物。在一些实施例中，可固化聚合物可还含有稀释剂。在这些实施例中，稀释剂可降低可固化聚合物的粘度，从而使其流过膜以产生例如1mm至1cm厚，例如1mm至5mm厚的层。理想地，可固化聚合物可以具有5001200mPa sec的粘度，尽管在一些情况下可以使用粘度在此范围之外的聚合物。在一些情况下，可以调节可固化聚合物的粘度，使得液体形式的可固化聚合物位于过滤器的孔的顶部和/或进入过滤器的孔，但是确实通过过滤器的孔排出。在一些情况下，固化步骤可以通过外部刺激(例如，热、潮湿或光(例如，紫外光))引发，其导致聚合物交联和固化。固化可固化聚合物将RCA包封在膜的一侧的固体中。
在一些实施例中，膜为阳极氧化铝膜。在这些实施例中，(c)的固体可以用作使膜透明的润湿剂。在这些实施例中，固体的润湿特性可以由交联聚合物本身或在固体中捕获或交联的稀释剂(例如油或溶剂)提供。如果使用稀释剂(例如油)，则稀释剂可能随着时间的推移潜在地通过膜泄漏，这可能在样品被储存之后干扰成像和/或自动聚焦。因此，稀释剂不太适合于某些应用。在这些实施例中，可固化聚合物可以为硅氧烷。硅氧烷可以快速固化而不会收缩，且不会释放可能影响RCA产物或荧光的物质。
硅氧烷可以以各种不同方式固化。在一些实施例中，硅氧烷可以在铂催化反应中固化，其中交联剂的Si-H基团与聚合物的乙烯基反应形成三维网络。在另一个实施例中，硅氧烷可通过过氧化物固化来固化。在高温下，过氧化物分解形成高反应性自由基，使聚合物链发生化学交联。在其它实施例中，硅氧烷还可以通过缩合-固化来固化，其中聚合物的末端羟基与硅氧烷固化剂反应，释放小的挥发性化合物，例如醇、乙酸和胺。硅氧烷也可以使用锡催化剂固化。其它用于固化硅氧烷的方法为已知的。在这些实施例中，沉积在膜上的可固化聚合物可含有硅氧烷和固化剂(例如铂或锡催化剂、过氧化物或硅氧烷)和任选的稀释剂(例如硅氧烷油)。在一些实施例中，所述方法可包含在将可固化聚合物沉积在膜上之前将可固化聚合物(例如硅氧烷)与固化剂(例如铂或锡催化剂、过氧化物或硅氧烷)和任选的稀释剂混合。
在一些实施例中，固体可以由一种或两种组分“RTV”硅氧烷(即室温硫化硅氧烷)制成，其由反应性基于油的聚合物与强化矿物填充剂组合制成。有两种类型的室温硫化硅氧烷：由于大气湿度、催化剂和乙酰氧基硅烷的作用而硬化的RTV-1(单组分系统)。当乙酰氧基硅烷暴露在潮湿的环境中时，将形成乙酸。固化过程从外表面开始并进入其核心。所述产物在密封盒中封装，并呈流体或糊状物形式。RTV-1硅氧烷具有良好的粘附性、弹性和耐久性特征。肖氏硬度可在18和60之间变化。断裂伸长率可在150％至700％范围内。由于优良的抗紫外线辐射和耐候性，其具有优异的耐老化性。RTV-2为一种双组分产物，混合后，在室温下固化成固体弹性体、凝胶或柔性泡沫。RTV-2在-80℃至+250℃内保持灵活性。在高于350℃的温度下发生分解，留下不易燃且不可燃的惰性二氧化硅沉积物。RTV硅氧烷可用催化剂固化，所述催化剂由以下组成：铂或锡化合物，如二月桂酸二丁基锡。
612A/B和RT 601A/B(Wacker，Munich，GE)为可在所述方法中使用的可固化聚合物的实例。612A/B为可倾倒的，加成固化的RTV-2硅氧烷橡胶，其在室温下硫化为非常软的硅氧烷凝胶。RT 601A/B为可倾倒的，加成固化的RTV-2硅氧烷橡胶。如果使用产物，则其可在硅氧烷油中稀释(例如，50:50，v:v)，例如，AK 35硅流体，其为一种线性、非反应性的聚二甲基硅氧烷，其粘度约35mm2/s。此稀释剂可降低可固化聚合物的粘度。与许多其它化合物一样，这两种化合物在固化时为透明的，并且能够润湿阳极铝膜，从而使其透明。
所述方法可以以多种不同方式进行，其一种实施方案示意性地示于图1中。参考图1，所述方法的一些实施例可包括通过多孔毛细管膜6(例如，阳极氧化铝膜)过滤含有荧光标记的滚环扩增(RCA)产物4的液体样品2。过滤步骤将RCA结果浓缩在膜内或膜上的RCA产物8中。在任何任选的洗涤步骤之后，将包含可固化聚合物10的溶液沉积在多孔毛细管膜上，并且将可固化聚合物固化成固体形式以将RCA产物包封在固体12中。在所示实施例中，下一步骤涉及当RCA产物在膜上时对其进行检测。在一些实施例中，此步骤可以产生RCA产物的图像14。显而易见的是，可以使用任何合适的荧光检测器，例如荧光显微镜、扫描仪、使用高解析度CMOS或CCD检测器或使用PMT等来进行检测。最后，确定膜区域中标记的RCA产物的量，例如通过计数单独解析的RCA产物，或通过测量聚合信号等。此测定提供了样品2中标记的RCA产物4的数量的估计。可以在过滤步骤之前或之后标记的RCA产物。
显而易见的是，在任何实施例中，毛细管膜的孔应具有足够的尺寸，以防止RCA产物通过孔。举例来说，在实施例中，毛细管膜的孔径可以不超过RCA产物的中值直径的50％，而在一些实施例中，其可以不超过RCA产物的中值直径的20％，且在一些实施例中，不超过RCA产物的中值直径的10％。因此，在使用多孔毛细管膜过滤样品时，RCA产物应保留在膜的顶部，并且不应完全进入或通过孔。
在一些实施例中，样品可含有至少第一群RCA产物和第二群RCA产物，其中第一和第二群标记的RCA产物可区别地标记。在这些实施例中，所述方法可包含确定膜区域中第一群标记的RCA产物的量和第二群标记的RCA产物的量。
在一些实施例中，将含有荧光标记的RCA产物的样品放入容器中，例如，含有膜的孔，例如，作为底表面。如上所述，通过施加将样品的液相抽出通过膜的压力来浓缩样品。这可能为一个主动力(例如，离心力、负压或正压)或被动力(例如，通过毛细管作用(使用吸墨纸，例如)或蒸发)。RCA产物在例如至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少5,000或至少10,000/mm2的密度下以阵列的形式保留在膜的表面上，然后将可固化聚合物添加到膜中并固化。如上所述，可固化聚合物可润湿膜以使其透明，由此使得RCA产物将被检测，例如，成像、传输和/或储存，因此如果获得肯定结果则其可被重新读取。在一些实施例中，可以从膜的任一侧分析阵列，例如通过膜。显而易见的是，如果从“上方”读取膜，即从与RCA产物相同的一侧读取膜，则膜应为透明的。分析区域可含有至少10，例如，至少100、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少50,000、至少100,000，或至少200,000或更多RCA产物。
如果需要，RCA产物可以在其与膜结合时进行标记，并且在某些实施例中，在产生标记的RCA产物阵列之后并且在分析之前，可以例如用水或含有盐的水性缓冲液洗涤膜。此洗涤步骤可以降低背景，因为潜在的背景来源(例如，未与RCA产物杂交的标记的核苷酸或标记的寡核苷酸)可以通过过滤器洗涤，并且在分析过滤器时不与过滤器相关联。如果需要，可以在沉积可固化聚合物之前将其它试剂(例如抗褪色剂或增强荧光的试剂等)添加到膜中以降低背景或增加信号等。同样，如果需要，可以在沉积可固化聚合物之前将标记的RCA产物(共价或非共价)结合到膜表面。用于将生物分子连接到表面的化学反应为众所周知的，并且在某些情况下，RCA产物可以使用改性核苷酸或具有与膜表面特异性反应的基团的引物制造，从而确保仅RCA产物附接到表面上。
使用的膜可具有任何合适的厚度，例如按需要在20m至500m或50m至200m的范围内，并且如上所述可含有一种或多种支撑结构(例如支撑环)以在使用期间维护膜的完整性。
如上所述，本方法可用于需要精确量化样品中RCA产物数量的方案中，特别是具有可变浓度的RCA产物的样品(例如，10至10M，可以在相对低的浓度下例如，5,000至1M RCA产物，体积为50l至200l或更多)，并且只有通过计数至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少50,000、至少100,000或至少200,000或更多的RCA产物才能达到识别差异所需的统计解析度。如下文将更详细地描述，所述方法特别用于拷贝数分析和非侵入性产前测试应用。
组合物
还提供了一种组合物。在一些实施例中，所述组合物可包含：(a)多孔毛细管膜(例如，多孔阳极氧化铝膜)；(b)膜上的多个荧光标记的RCA产物(例如，至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000，或至少1M标记的RCA产物；和(c)包封荧光标记的RCA产物的一层固体(例如，固化的硅氧烷)。在一些实施例中，此层固体可以为透明的，并且如上所述，可以润湿膜以使其透明。标记的RCA产物可以在例如至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少5,000或至少10,000/mm2的密度下以随机方式分布在膜的表面上。在一些实施例中，固体可以至少穿透膜的孔的入口。在一些实施例中，组合物可包含膜的表面上的至少两个群的荧光标记的RCA产物，其中不同群的荧光标记的RCA产物可区别标记。此组合物的进一步细节和变化可以在本公开的方法部分中找到。
试剂盒
本公开还提供了用于实施如上所述的主题方法的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒可以至少含有：(a)用于产生荧光标记的RCA产物的试剂；(即，用于以序列特异性方式环化所选片段且然后对环化产物进行滚环扩增的试剂，例如一种或多种限制酶、连接酶和一种或多种可用作夹板使产物环化的寡核苷酸、用于通过RCA扩增环化产物的链置换聚合酶、用于标记RCA产物的一种或多种标记的寡核苷酸等)(b)多孔毛细管膜，例如多孔阳极氧化铝膜；(c)可固化聚合物，例如硅氧烷。所述试剂盒还可以在与可固化润湿剂分开的容器中包含固化剂。在一些实施例中，可固化聚合物和固化剂可以存在于具有混合尖端的双管注射器的不同桶中。在一些实施例中，试剂盒还可包含稀释剂，例如硅氧烷油。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容性组分可以根据需要预组合到单个容器中。此试剂盒的组分的进一步细节和变化可以在本公开的方法部分中找到。
除了上述组分之外，本试剂盒还可包括使用试剂盒的组分来实施本方法的说明书，即样品分析说明书。
实例
提出以下实例以便向所属领域的一般技术人员完整地公开且描述如何制造和使用本发明，并且并不旨在限制本发明人视为其发明的范围，也不旨在表示下文实验为所进行的全部或唯一实验。
实例1
多路检测方法
材料和方法
装置：具有20nm孔的氧化铝膜结合到定制产生的96孔板超结构上。
在此多路实验中，来自2个细胞系的DNA的混合物用作遗传起始材料。细胞系DNA含有2个拷贝的21号染色体(正常基因组成)或3个拷贝的21号染色体(21三体症)。从细胞系中萃取的DNA以下列比例混合：100:0、95:5、90:10、0:100。首先使用限制酶消化每种DNA混合物，杂交并连接到探针组，然后如先前所述(参见WO2015083001和WO2015083002)通过RCA酶促扩增。将两种染色体特异性检测寡核苷酸(染色体18的Atto 550、染色体21的Atto 647)添加到每个样品中并使其杂交，从而荧光标记每个样品中的染色体特异性RCA产物。
标记后，将100μl样品添加到膜底板中，然后将板放在真空歧管(Supleco部件号66879-U)上。样品在约90秒内通过氧化铝膜。将膜底板用400ul 0.5X SSC洗涤两次，然后使其干燥。然后将300微升Wacker silgel 612/固定剂施加到每个孔中以使其透明并将RCA产物固定到膜上。
在具有20X物镜和Hamamatsu Orca 4.0lt照相机的Olympus X81显微镜上进行成像。通过平铺10×10图像以覆盖每个孔的整个底部来完成成像。分析图像并使用内部专用软件计数RCA产物。
结果
结果概括在图2中。实验中包括的所有91个样品的每一图像的平均计数范围为每一图像的3000至略多于5000个计数。直方图清楚地显示了0:100比率混合物中550和647通道之间的计数比例的差异(最后22个重复)，但是仅从图来看，更难以辨别0、5和10％样品中的比例差异。图3为相对于细胞系混合物组成的两个通道的计数之间的比率的图。在此图中，清楚地表示趋势，例示了计数的相对比率变化随输入细胞系DNA样品的比例而变。
数据表明，在相同的90秒时间间隔内，沉积在氧化铝膜上的结果约为沉积在玻璃板上的计数的4倍。如果我们将玻璃板的培育时间增加到16小时，结果是在玻璃板上检测到RCA产物的增加，然而仍然比在氧化铝上90秒处观察到的少2.5倍。
实施例
实施例1.一种用于处理包含滚环扩增(RCA)产物的膜的方法，其包含：
(a)获得多孔毛细管膜，其包含在膜内或膜上的荧光标记的RCA产物；
(b)将可固化聚合物沉积在膜上；和
(c)固化可固化聚合物以将RCA产物包封在固体中。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中步骤(c)中产生的固体为透明的。
实施例3.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤(b)的可固化聚合物包含固化剂。
实施例4.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤(b)的可固化聚合物包含稀释剂以降低粘度。
实施例5.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中膜为阳极氧化铝膜，并且其中(c)的固体具有润湿特性，使得膜为透明的。
实施例6.根据实施例5所述的方法，其中可固化聚合物为硅氧烷。
实施例7.根据实施例6所述的方法，其中硅氧烷与固化剂以及任选地硅氧烷油稀释剂混合。
实施例8.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中固化步骤(c)通过外部刺激引发。
实施例9.根据实施例8所述的方法，其中外部刺激为热、潮湿或光。
实施例10.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中荧光标记的RCA产物通过以下制得：
通过膜过滤RCA产物以产生膜内或膜上的RCA产物；和
在过滤之前或之后对RCA产物进行荧光标记。
实施例11.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述方法还包含
(d)量化膜区域中单个标记的RCA产物的数量，从而提供样品中标记的RCA产物数量的估计值。
实施例12.一种试剂盒，其包含：
(a)用于产生荧光标记的RCA产物的试剂；
(b)多孔毛细管膜；和
(c)可固化聚合物。
实施例13.根据实施例12所述的试剂盒，其中试剂盒还包含固化剂，其中固化剂与可固化聚合物在相同的容器中。
实施例14.根据实施例12所述的试剂盒，其中试剂盒还包含固化剂，其中固化剂与可固化聚合物在不同容器中。
实施例15.根据实施例12至14中任一项所述的试剂盒，其中可固化聚合物为硅氧烷。
实施例16.根据实施例12至15中任一项所述的试剂盒，其中多孔毛细管膜为阳极氧化铝过滤器。
实施例17.一种组合物，其包含：
(a)多孔毛细管膜；
(b)在膜上的多个荧光标记的RCA产物；
(c)包封荧光标记的RCA产物的一层固体。
实施例18.根据实施例17所述的组合物，其中固体润湿剂穿透过滤器的孔。
实施例19.根据实施例17或18所述的组合物，其中过滤器为氧化铝过滤器。
实施例20.根据实施例17至19中任一项所述的组合物，其中固体润湿剂为交联硅氧烷。

Claims (20)

1.一种用于处理包含滚环扩增(RCA)产物的膜的方法，其包含：
(a)获得多孔毛细管膜，其包含在所述膜内或所述膜上的荧光标记的RCA产物；
(b)将可固化聚合物沉积在所述膜上；和
(c)固化所述可固化聚合物以将所述RCA产物包封在固体中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中产生的所述固体为透明的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述可固化聚合物包含固化剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述可固化聚合物包含稀释剂以降低粘度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜为阳极氧化铝膜，并且其中(c)的所述固体具有润湿特性，使得所述膜为透明的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述可固化聚合物为硅氧烷。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述硅氧烷与固化剂以及任选地硅氧烷油稀释剂混合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固化步骤(c)通过外部刺激引发。
9.根据权利要求8所述方法，其中所述外部刺激为热、潮湿或光。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的RCA产物通过以下制得：
通过所述膜过滤所述RCA产物以产生所述膜内或所述膜上的RCA产物；和
在所述过滤之前或之后对所述RCA产物进行荧光标记。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包含
(d)量化所述膜区域中单个标记的RCA产物的数量，从而提供所述样品中所述标记的RCA产物数量的估计值。
12.一种试剂盒，其包含：
(a)用于产生荧光标记的RCA产物的试剂；
(b)多孔毛细管膜；和
(c)可固化聚合物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含固化剂，其中所述固化剂与所述可固化聚合物在相同的容器中。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含固化剂，其中所述固化剂与所述可固化聚合物在不同的容器中。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒，其中所述可固化聚合物为硅氧烷。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的试剂盒，其中所述多孔毛细管膜为阳极氧化铝过滤器。
17.一种组合物，其包含：
(a)多孔毛细管膜；
(b)在所述膜上的多个荧光标记的RCA产物；
(c)包封所述荧光标记的RCA产物的一层固体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述固体润湿剂穿透所述过滤器的所述孔。
19.根据权利要求17或18所述的组合物，其中所述过滤器为氧化铝过滤器。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述固体润湿剂为交联硅氧烷。
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JULIA KHANDURINA 等: "Microfabricated Porous Membrane Structure for Sample Concentration and Electrophoretic Analysis", 《ANAL. CHEM.》 *
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