ES2867299T3 - Procedimiento para procesar productos de amplificación en círculo rodante - Google Patents

Procedimiento para procesar productos de amplificación en círculo rodante Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para procesar una membrana que comprende productos de amplificación en círculo rodante (RCA), que comprende: (a) obtener una membrana porosa de capilaridad que comprende productos de RCA marcados fluorescentemente que están dentro o sobre la membrana; (b) depositar un polímero curable sobre la membrana; y (c) curar el polímero curable en un sólido para encapsular los productos de RCA.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para procesar productos de amplificación en círculo rodante
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Pueden implementarse algunas pruebas diagnósticas basadas en ácidos nucleicos hibridando sondas para una muestra de ácido nucleico, circularizando sondas que hibriden a una secuencia diana, amplificando las sondas circularizadas utilizando amplificación en círculo rodante (RCA del inglés rolling-circle amplification) y cuantificando el número de productos de RCA.
En dichos procedimientos, los productos de RCA pueden cuantificarse de una diversidad de maneras diferentes. Por ejemplo, los productos de RCA pueden, en teoría, cuantificarse marcando los productos de RCA, depositando la muestra sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio y contando el número de productos marcados en el portaobjetos. Sin embargo, simplemente colocar una solución que contenga productos de RCA marcados sobre un portaobjetos de vidrio, permitir que los productos de RCA marcados se difundan en la superficie y después contar el número de productos de RCA marcados que se han unido al portaobjetos lleva varias horas y no todos los productos de RCA marcados alcanzan el portaobjetos y se recuentan. Estos problemas pueden resolverse en gran medida filtrando los productos de RCA a través de un filtro y después contando el número de productos de RCA marcados que han sido capturados por el filtro. Sin embargo, implementar dicho procedimiento de una manera consistente puede suponer un desafío en algunos casos debido a que muchos marcadores fluorescentes pueden degradarse rápidamente cuando están en contacto con el aire. Además, los productos de RCA pueden desplazarse si el filtro está húmedo. Estos desafíos pueden hacer difícil implementar dichos procedimientos con un rendimiento alto, en particular cuando la muestra tiene que moverse físicamente (por ejemplo, invertirse o girarse), el análisis no puede realizarse siempre inmediatamente o es necesario reanalizar una muestra.
Se cree que la presente divulgación proporciona una solución a estos problemas.
SUMARIO
La presente invención proporciona, entre otras cosas, un procedimiento para procesar una membrana que comprende productos de amplificación en círculo rodante (RCA). En algunas realizaciones, este procedimiento puede comprender: (a) obtener una membrana porosa de capilaridad que comprenda productos de RCA marcados fluorescentemente que estén dentro o sobre la membrana; (b) depositar un polímero curable sobre la membrana; y (c) curar el polímero curable para encapsular los productos de RCA en un sólido. En algunas realizaciones, el polímero curable puede ser una silicona y puede ser transparente en su forma sólida. También se proporcionan un kit para realizar el procedimiento y una composición hecha mediante el procedimiento.
Por tanto, según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para procesar una membrana que comprende productos de amplificación en círculo rodante (RCA), que comprende:
(a) obtener una membrana porosa de capilaridad que comprende productos de RCA marcados fluorescentemente que están dentro o sobre la membrana;
(b) depositar un polímero curable sobre la membrana; y
(c) curar el polímero curable en un sólido para encapsular los productos de RCA.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende:
(a) reactivos para producir productos de RCA marcados fluorescentemente;
(b) una membrana porosa de capilaridad; y
(c) un polímero curable.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende:
(a) una membrana porosa de capilaridad;
(b) una pluralidad de productos de RCA marcados fluorescentemente en la membrana;
(c) una capa de sólido que encapsula los productos de RCA marcados fluorescentemente, en el que el sólido es un polímero curable.
Se cree que encapsular los productos de RCA en un sólido (en vez de utilizar un líquido o ningún líquido) "fija" los productos de RCA, es decir, mantiene en su lugar los productos de RCA, en el filtro y también evita que los productos de RCA marcados fluorescentemente se oxiden (es decir, degraden) por el aire exterior. Por tanto, al encapsular los productos de RCA en un sólido, un filtro que comprende productos de RCA marcados puede moverse rápidamente en múltiples direcciones (por ejemplo, invertirse, fijarse o transportarse) y/o almacenarse durante un periodo prolongado de tiempo (por ejemplo, durante semanas, meses o incluso años). Por lo tanto, el presente procedimiento puede facilitar el análisis de productos de RCA en un flujo de trabajo que implica un movimiento rápido multidireccional del filtro antes del análisis (por ejemplo, por un robot) o en un flujo de trabajo en el que los productos de RCA no siempre pueden cuantificarse inmediatamente. Además, el presente procedimiento puede utilizarse en un flujo de trabajo en el que puede ser necesario reanalizar un filtro después de un periodo prolongado de tiempo.
Estas y otras características y ventajas potenciales pueden hacerse evidentes a la vista de la siguiente descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
El técnico experto entenderá que los dibujos, que se describen más adelante, tienen únicamente fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La figura 1 ilustra esquemáticamente algunas de las etapas del presente procedimiento.
La figura 2 es un histograma que muestra algunos de los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 1.
La figura 3 es un gráfico de las proporciones entre los recuentos para dos canales en relación a la composición de la mezcla de líneas celulares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0011] Antes de que se describan las diversas realizaciones, debe entenderse que las enseñanzas de las presente divulgación no se limitan a las realizaciones particulares descritas y, como tales, por supuesto, pueden variar. Debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no está destinada a ser limitante, puesto que el alcance de las presentes enseñanzas estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Los encabezados de sección utilizados en el presente documento tienen únicamente propósitos de organización y no deben interpretarse como limitantes de ningún modo de la materia objeto descrita. Aunque las presentes enseñanzas se describen junto con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas estén limitadas a dichas realizaciones. Al contrario, las presentes enseñanzas abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la materia.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos y utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que es tendido comúnmente por alguien con una habilidad habitual en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Aunque en la práctica o el ensayo de las presentes enseñanzas también pueden utilizarse cualquiera de los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, ahora se describen algunos procedimientos y materiales ejemplares.
La cita de cualquier publicación es para si divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretase como una admisión de que las presentes reivindicaciones no tienen derecho a anticiparse a dicho publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que puede ser necesario que se confirmen de un modo independiente.
Como será evidente para los expertos en la materia al leer la presente divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene componentes discretos y características que pueden separarse fácilmente de, o combinarse con, las características de cualquiera de las varias otras realizaciones sin alejarse del alcance o espíritu de las presentes enseñanzas. Cualquier procedimiento enumerado puede realizarse en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Antes de describir las realizaciones ejemplares con mayor detalle, se exponen los siguientes significados para ilustrar el significado y el alcance de los términos utilizados en la descripción.
Debe indicarse que, según se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un cebador" se refiere a uno o más cebadores, es decir, un sólido cebador y múltiples cebadores. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares, junto con la enumeración de elementos reivindicados o utilización de una limitación "negativa".
Según se utiliza en el presente documento, el término "filtrar" se refiere al acto de mover un líquido que contiene analitos (por ejemplo, amplificación en productos de círculo rodante) a través de un filtro, de modo que algunos de los analitos sean retenidos por el filtro. Al filtrar, al menos un poco del líquido se transfiere desde un lado del filtro al otro. Según se utiliza en el presente documento, la expresión "amplificación en círculo rodante" o "RCA" se refiere a una amplificación isotérmica que genera copias concatemerizadas lineales de un patrón de ácido nucleico circular utilizando una polimerasa de desplazamiento de cadena. La RCA es bien conocida en las técnicas de biología molecular y se describe en una diversidad de publicaciones incluyendo, pero sin limitación, Lizardi et al (Nat. Genet.
1998 19:225-232), Schweitzer et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 97:10113-10119), Wiltshire et al (Clin. Chem. 2000 46:1990-1993) y Schweitzer et al (Curr. Opin. Biotech 2001 12:21-27).
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de amplificación en círculo rodante" se refiere a los productos concatemerizados de una reacción de amplificación en círculo rodante. Según se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de amplificación en círculo rodante marcados fluorescentemente" se refiere a productos de amplificación en círculo rodante que se han marcado fluorescentemente, por ejemplo, hibridando un oligonucleótido marcado fluorescentemente con los productos de amplificación en círculo rodante u otros medios (por ejemplo, incorporando un nucleótido fluorescente en el producto durante la amplificación).
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "membrana porosa de capilaridad" se refiere a una membrana que tiene capilares individuales empaquetados de una forma relativamente densa que abarcan el espesor de la membrana, es decir, que van de un lado de la membrana al otro, permitiendo de este modo el paso de líquidos, pero no de partículas, de un lado de la membrana al otro. Los ejemplos de membranas de capilaridad porosa incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, membranas de óxido de aluminio anódico (véanse más adelante), membranas de vidrio nanoacanaladas, membranas con pistas grabadas y politetrafluoroetileno. Las membranas de vidrio nanoacanaladas están hechas de vidrio y tienen una alta densidad de canales uniformes con diámetros de 15 micrómetros a 15 nanómetros (véase, por ejemplo, Tonucci et al., Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959: 59-71; Pearson et al., Science 1995270: 68-70 y Tonucci et al., Science 1992258: 783-785, así como las Patentes de Estados Unidos 5.306.661; 5.332.681; 5.976.444; 6.087.274; 6.376.096; 6.483.640; y 6.599.616). Las membranas con pistas grabadas están hechas de un polímero transparente (por ejemplo, policarbonato, tereftalato de polietileno o poliimida y similares) que contiene poros que tienen un diámetro en el intervalo de 0,01 pm a 30 pm que se han hecho mediante una combinación de un bombardeo de partículas cargadas (o irradiación) y grabado químico. Otras membranas porosas de interés incluyen, pero sin limitación, fluoropolímeros amorfos, tal como NAFION™, TEFLON AF™, FEFlOn FEIP™ y CYTOP™ (Du-Pont Fluoroproducts, Fayetteville, NC). Como se reconocerá, una membrana porosa de capilaridad puede tener una superficie (por ejemplo, un recubrimiento o una superficie modificada químicamente) que es diferente del material del que está hecha la membrana. Por ejemplo, la superficie de una membrana porosa de capilaridad puede tener características de carga alteradas o características de hidrofobicidad o hidrofilicidad alteradas. En algunas realizaciones, la superficie puede estar recubierta con amino salino, polilisina u otro compuesto para proporcionar una carga positiva que ayuda a mantener los productos de RCA en la superficie. Alternativamente o además, la superficie puede tener una capa fina de un metal (por ejemplo, titanio, oro) depositada en la misma, que puede unirse a otros agentes que modifican las propiedades superficiales del filtro.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "membrana de óxido de aluminio anódico" se refiere a una estructura de membrana nanoporosa regular y autoorganizada que se produce cuando se anodiza A1 en ciertos medios ácidos. El diámetro interior de los poros en la membrana, la distancia entre los centros de poros adyacentes en la membrana y la distancia entre los bordes de poros adyacentes en la membrana pueden controlarse mediante el voltaje de la deposición, el tipo de ácido y otros parámetros. Una membrana de óxido de aluminio anódico es virtualmente transparente cuando está húmeda. La membrana de óxido de aluminio anódico, sus propiedades y cómo preparar dichas membranas se analizan con detalle en una diversidad de publicaciones, incluyendo, pero sin limitación: Li et al (Chem. Mater 1998 10: 2470-2480), Santos et al (Trends on Analytical Chemistry 201344: 25-38), Ingham et al (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) y Poinern et al. (Materials 2011 4: 487-526). Las membranas de óxido de aluminio anódico están disponibles en el mercado con el nombre comercial ANOPORE™ de, por ejemplo, SPI Supplies (West Chester, PA) y de otros proveedores, tales como Sykera Technologies Inc. (Longmont, CO) y Sigma- Aldrich (St. Louis, MO) y pueden adquirirse con un anillo de soporte.
Según se utiliza en el presente documento, el término "área", en el contexto de un área de una membrana o un área de una imagen, se refiere a un área contigua o no contigua. Por ejemplo, si un procedimiento implica determinar la cantidad de productos de RCA marcados en un área, por ejemplo, contando el número de productos de RCA marcados en un área, el área en la que se cuantifican los productos de RCA puede ser un solo espacio contiguo o múltiples espacios no contiguos.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "formación de imágenes" se refiere a un proceso mediante el cual se detectan señales ópticas de la superficie de un objeto y se almacenan como datos en asociación con una ubicación (es decir, un "píxel"). A partir de estos datos puede reconstruirse una imagen digital del objeto. Pueden formarse imágenes de un área de una membrana utilizando una sola imagen o una o más imágenes.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de RCA marcados individuales" se refiere a moléculas de RCA individuales que están marcadas.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "determinar la cantidad" se refiere a un procedimiento en el que se cuentan productos de RCA resueltos individualmente así como a procedimientos que incluyen medir una señal agregada desde múltiples productos de RCA. En procedimientos que implican medir la intensidad de una señal de agregado, no es necesario resolver los productos de RCA individuales. La cantidad de productos de RCA pueden expresarse utilizando cualquier unidad adecuada. En algunos casos, la cantidad de productos de RCA puede expresarse como el número de productos de RCA resueltos individualmente que se ha contado.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "contar" se refiere a determinar el número de objetos individuales en una colección mayor. En algunas realizaciones, "contar" requiere detectar señales separadas de objetos individuales en una pluralidad (no una señal colectiva de la pluralidad de objetos) y después determinar cuántos objetos hay en la pluralidad contando las señales individuales. En el contexto de los presentes procedimientos, el "recuento" puede realizarse determinando el número de señales individuales en una matriz de señales.
Según se utiliza en el presente documento, el término "transparente" se refiere a un estado en el que un objeto es ópticamente transparente en la longitud de onda que se está usando. Para microscopia de fluorescencia, "transparente" significa que el objeto será transparente para uno o ambos de los espectros de excitación y emisión de un fluoróforo. Como se describirá con mayor detalle más adelante, ciertas membranas son transparentes únicamente cuando se han humedecido. Dichas membranas se consideran membranas transparentes incluso aunque la forma seca de esas membranas no sea transparente.
Según se utiliza en el presente documento, el térmico "curable", en el contexto de un polímero curable, se refiere a un polímero líquido que puede hacerse sólido (es decir, "curarse") mediante una reacción de reticulación. En algunos casos, un polímero curable puede hacerse sólido mediante adición de un agente de curado (por ejemplo, un segundo compuesto que provoca o cataliza el reticulado del polímero). En algunos casos, el curado puede iniciarse mediante un estímulo externo (por ejemplo, calor, humedad o luz UV).
Según se utiliza en el presente documento, el término "sólido" se refiere a la forma sólida de un polímero curable. Un sólido puede estar en forma de un semisólido, tal como un gel o una goma.
A lo largo de la memoria descriptiva pueden aparecer otros significados de estos y otros térmicos.
Antes de describir el presente procedimiento con mayor detalle, se reconoce que el presente procedimiento puede implementarse utilizando cualquier tipo de soporte de captura que pueda actuar como filtro para productos de RCA. Dichos soportes de captura deben tener una señal de nivel de fondo cero a las longitudes de onda usadas en los análisis y un tamaño de poro suficiente para permitir un flujo de fluido rápido a través del líquido y capturar los productos de RCA. Los soportes de captura adecuados pueden estar hechos de materiales porosos orgánicos o inorgánicos, incluyendo sólidos, tales como metales porosos, cerámicos, películas homogéneas (por ejemplo, polímeros) y sólidos heterogéneos (mezclas poliméricas, cristales mixtos). Las membranas cerámicas porosas pueden estar hechas de materiales inorgánicos (tales como óxidos de aluminio, titanio, circonio, carburo de silicio recristalizado). Véase, por ejemplo, el PamChip vendido por Pamgene (Países Bajos), Wu et al, Nucleic Acids Res. 200432: e123 y Anthony et al Biotechniques. (2003) 34:1082-6, 1088-9. Las membranas de polímero poroso ejemplares pueden estar hechas de acetato de celulosa, nitrocelulosa, ésteres de celulosa (CA, CN y CE), polisulfona (PS), poliéter sulfona (PES), poliacrilonitrilo (PAN), poliamida, poliimida, polietileno y polipropileno (PE y P p ) , politetrafluoroetileno (PTFE), fluoruro de polivinilideno (PVDF) y cloruro de polivinilo (PVC). La descripción que sigue a continuación ilustra una implementación en la que se utiliza una membrana porosa de capilaridad. Las membranas porosas de capilaridad son un ejemplo de un soporte de captura que podría utilizarse. La siguiente descripción ilustra el presente procedimiento mediante un ejemplo.
Como se ha resumido anteriormente, la presente divulgación proporciona un procedimiento para procesar una membrana que comprende productos de amplificación en círculo rodante (RCA). En algunas realizaciones, este procedimiento puede comprender: (a) obtener una membrana porosa de capilaridad que comprenda productos de RCA marcados fluorescentemente que estén dentro o sobre la membrana; (b) depositar un polímero curable sobre la membrana; y (c) curar el polímero curable para encapsular los productos de RCA en un sólido.
En algunos casos, el sólido producido en el apartado (c) es transparente. En estas realizaciones, la forma sólida del agente humectante puede tener un índice de refracción que sea compatible con la membrana. Por ejemplo, si se utiliza una membrana de óxido de aluminio anódico (que tiene un índice de refracción de aproximadamente 1,72), entones la forma sólida del agente humectante puede tener un índice de refracción en el intervalo de 1,2 a 1,8, por ejemplo, de 1,30 a 1,6. Típicamente, las siliconas tienen un índice de refracción de aproximadamente 1,4 y son compatibles con membranas de óxido de aluminio anódico. En algunas realizaciones, el polímero curable no debe encogerse cuando se cura.
Los polímeros curables incluyen siliconas, epoxis, así como una diversidad de plásticos, muchos de los cuales son transparentes. El polímero curable puede formularse en una diversidad de modos diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polímero curable puede comprender un agente de curación, por ejemplo, un catalizador para reticular el polímero u otro compuesto que haga que el polímero se reticule. En algunas realizaciones, el polímero curable también puede contener un diluyente. En estar realizaciones, el diluyente puede reducir la viscosidad del polímero curable, permitiendo de este modo que fluya a través de la membrana para producir una capa, por ejemplo, de 1 mm a 1 cm de espesor, por ejemplo, de 1 mm a 5 mm de espesor. Idealmente, el polímero curable puede tener una viscosidad en el intervalo de 500 a 1200 mPa seg., aunque, en algunas circunstancias pueden utilizarse polímeros que tengan una viscosidad fuera de este intervalo. En algunos casos, la viscosidad del polímero curable puede ajustarse de modo que el polímero curable, en forma líquida, se asiente en la parte superior y/o entre en los poros del filtro, pero se drene a través de los poros del filtro. En algunos casos, la etapa de curado puede iniciarse mediante un estímulo externo, por ejemplo, calor, humedad o luz (por ejemplo, luz UV) que hace que el polímero se reticule y se solidifique. El curado del polímero curable encapsula la RCA en un sólido en un lado de la membrana.
En algunas realizaciones, la membrana es una membrana de óxido de aluminio anódico. En estas realizaciones, el sólido del apartado (c) puede actuar como agente humectante que haga transparente la membrana. En estar realizaciones, las propiedades humectantes del sólido pueden proporcionarse mediante del propio polímero reticulado o un diluyente, por ejemplo, un aceite o disolvente, que está atrapado en o reticulado con el sólido. Si se utiliza un diluyente (por ejemplo, un aceite), entonces el diluyente puede filtrarse potencialmente a través de la membrana a lo largo del tiempo, lo que potencialmente puede interferir con la formación de imágenes y/o autofoco después de que la muestra se haya almacenado. Como tal, los diluyentes son menos adecuados para algunas aplicaciones. En estar realizaciones, el polímero curable puede ser una silicona. La silicona puede curarse rápidamente sin encogerse y sin liberar sustancias que puedan afectar a los productos de RCA o a la fluorescencia.
La silicona puede curarse de una diversidad de maneras diferentes. En algunas realizaciones, la silicona puede curarse en una reacción catalizada por platino en la que los grupos SiH del agente reticulante reaccionan con los grupos vinilo de un polímero para formar una red tridimensional. En otra realización, la silicona puede curarse mediante curado con peróxido. A temperaturas elevadas, los peróxidos se descomponen para formar radicales altamente reactivos que reticulan químicamente las cadenas de polímeros. En otras realizaciones, la silicona también puede curarse mediante curado por condensación, en el que los grupos hidroxilo terminales del polímero reaccionan con un agente de curación de siloxano, liberando pequeños compuestos volátiles, tales como alcohol, ácido acético y amina. La silicona también puede curarse utilizando un catalizador de estaño. Se conocen otros modos de curar silicona. En estar realizaciones, el polímero curable depositado en la membrana puede contener silicona y un agente de curación (por ejemplo, un catalizador de platino o estaño, peróxido o un siloxano) y un diluyente opcional (por ejemplo, un aceite de silicona). En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender mezclar el polímero curable (por ejemplo, una silicona) con un agente de curación (por ejemplo, un catalizador de platino o estaño, peróxido o un siloxano) y, opcionalmente, un diluyente antes de depositar el polímero curable en la membrana.
En algunas realizaciones, el sólido puede estar hecho de uno o dos componentes de silicona "RTV" (es decir, silicona de vulcanización a temperatura ambiente), que está hecha de polímeros reactivos basados en aceite combinados con cargas minerales de refuerzo. Existen dos tipos de silicona de vulcanización a temperatura ambiente: RTV-1 (un sistema de un componente) se endurece debido a la acción de la humedad atmosférica, un catalizador y un acetoxisilano. El acetoxisilano, cuando se expone a condiciones de humedad, formará ácido acético. El proceso de curado comienza en la superficie externa y avanza a través de su núcleo. El producto se envasa en cartuchos herméticos y está en forma de fluido o de pasta. La silicona RTV-1 tiene buenas características de adhesión, elasticidad y durabilidad. La dureza Shore puede variarse entre 18 y 60. El alargamiento a rotura puede variar del 150 % hasta el 700 %. Tienen una excelente resistencia al envejecimiento debido a una resistencia superior a la radiación UV y a la climatología. RTV-2 es un producto de dos componentes que, cuando se mezclan, se curan a temperatura ambiente para dar un elastómero sólido, un gel o una espuma flexible. RTV-2 permanece flexible de -80 °C a 250 °C. La rotura sucede a temperaturas por encima de 350 °C, dejando un depósito de sílice inerte que es no inflamable y no combustible. Las siliconas RTV pueden curarse con un catalizador que consiste en un compuesto de platino o estaño, tal como dilaurato de dibutilestaño.
SILGEL® 612 A/B y ELASTOSIL® RT 601 A/B (Wacker, Munich, GE) son ejemplos de polímeros curables que pueden utilizarse en el procedimiento. SILGEL® 612 A/B es una goma de silicona RTV-2 vertible, curable por adición, que se vulcaniza a temperatura ambiente a un gel de silicona muy suave. ELASTOSIL® RT 601 A/B es una goma de silicona RTV-2 vertible, curable por adición. Si se utiliza el producto ELASTOSIL®, puede diluirse (por ejemplo, 50:50, v:v) en un aceite de silicona, por ejemplo, fluido de silicona AK 35, que es un polidimetilsiloxano lineal, no reactivo, con una viscosidad de aprox. 35 mm2/s. Este diluyente puede disminuir la viscosidad del polímero curable. Ambos de estos compuestos, como muchos otros, son transparentes cuando se curan y son capaces de humedecer membranas de aluminio anódicas, haciéndolas de este modo transparentes.
El procedimiento puede realizarse de una diversidad de maneras diferentes, una implementación del cual se ilustra esquemáticamente en la figura 1. Con referencia a la figura 1, algunas realizaciones del procedimiento pueden incluir filtrar una muestra líquida 2 que contiene productos 4 de amplificación en círculo rodante (RCA) marcados fluorescentemente a través de una membrana 6 porosa de capilaridad (por ejemplo, una membrana de óxido de aluminio anódico). La etapa de filtrado concentra los resultados de RCA en productos 8 de RCA que están dentro o sobre la membrana. Después de cualquiera de las etapas de lavado opcionales, la solución que comprende un polímero 10 curable se deposita sobre una membrana porosa de capilaridad y el polímero curable se cura en una forma sólida para encapsular los productos de RCA en un sólido 12. En la realización ilustrada, la siguiente etapa implica detectar los productos de RCA mientras están sobre la membrana. En algunas realizaciones, esta etapa puede producir la imagen 14 de los productos de RCA. Como resultará evidente, la detección puede realizarse utilizando cualquier detector de fluorescencia adecuado, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia, un escáner, utilizando un detector CMOS (del inglés complementar/ metal-oxide-semiconductor (semiconductor complementario de óxido metálico)) o CCD (del inglés charge coupled device (dispositivo de carga acoplada) de alta resolución o utilizando un PMT (del inglés photomultiplier tube (tubo fotomultiplicador) o similares. Finalmente, se determina la cantidad de productos de RCA marcados en el área de la membrana, por ejemplo, contando productos de RCA resueltos individualmente o midiendo una señal de agregado, etc. Esta determinación proporciona una estimación del número de los productos 4 de RCA marcados en la muestra 2. Los productos de RCA pueden marcarse antes o después de la etapa de filtrado.
Como resultará evidente, en cualquier realización, los poros de la membrana de capilaridad deben ser de un tamaño suficiente para evitar que los productos de RCA pasen a través de los poros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el diámetro de poro de la membrana de capilaridad puede ser no más del 50 % del diámetro medio de los productos de RCA, mientras que en algunas realizaciones, puede ser no más del 20 % del diámetro medio de los productos de RCA, y en algunas realizaciones no más del 10 % del diámetro medio de los productos de RCA. Como tal, al filtrar la muestra utilizando la membrana porosa de capilaridad, los productos de RCA deben permanecer en la parte superior de la membrana y no deben entrar por completo ni pasar a través de los poros.
En algunas realizaciones, la muestra puede contener al menos una primera población de productos de RCA y una segunda población de productos de RCA, en donde la primera y la segunda poblaciones de productos de RCA marcados se marcan de un modo distinguible. En estar realizaciones, el procedimiento puede comprender determinar la cantidad de la primera población marcada de productos de RCA y la cantidad de la segunda población marcada de productos de RCA en un área de la membrana.
En algunas realizaciones, una muestra que contiene productos de RCA marcados fluorescentemente se coloca en un recipiente, por ejemplo, un pocillo que contiene la membrana, por ejemplo, como superficie inferior. La muestra se concentra, como se ha descrito anteriormente, aplicando presión que extrae la fase líquida de la muestra a través de la membrana. Esta puede ser una fuerza activa (por ejemplo, una fuerza centrífuga, una presión negativa o una presión positiva) o una fuerza pasiva (por ejemplo, mediante acción capilar (utilizando papel secante, por ejemplo) o evaporación). Los productos de RCA se retienen sobre la superficie de la membrana en forma de una matriz a una densidad de, por ejemplo, al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, al menos 5.000 o al menos 10.000/mm2, después se añade el polímero curable a la membrana y se solidifica. Como se ha indicado anteriormente, el polímero curable puede humedecer la membrana para hacerla transparente, permitiendo de este modo que se detecten los productos de RCA, por ejemplo, que se obtengan imágenes, se transporten y/o almacenen de modo que puedan volver a leerse si se obtiene un resultado positivo. En algunas realizaciones, la matriz puede analizarse desde ambos lados de la membrana, por ejemplo, a través de la membrana. Como resultará evidente, si la membrana se lee desde "arriba", es decir, desde el mismo lado que los productos de RCA, la membrana debe ser transparente. El área analizada puede contener al menos 10, por ejemplo, al menos 100, al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 20.000, al menos 50.000, al menos 100.000 o al menos 200.000 o más productos de RCA.
Si se desea, los productos de RCA pueden marcarse mientras están unidos a la membrana y, en ciertas realizaciones, la membrana puede lavarse, por ejemplo, con agua o un tampón acuoso que contenga sal, después de haberse producido la matriz de productos de RCA marcados y antes del análisis. La etapa de lavado puede reducir el nivel de fondo debido a que las fuentes potenciales de nivel de fondo (por ejemplo, nucleótidos marcados u oligonucleótidos marcados que no se hibridan a un producto de RCA) pueden lavarse a través del filtro y no están asociadas con el filtro en el momento en que se analiza el filtro. Si es necesario, pueden añadirse otros reactivos, por ejemplo, anti decolorantes o reactivos que potencian la fluorescencia o similares, a la membrana antes de depositar el polímero curable para disminuir el nivel de fondo o aumentar la señal o similares. Del mismo modo, si es necesario, los productos de RCA marcados pueden enlazarse (covalentemente o no covalentemente) a la superficie de la membrana antes de depositar el polímero curable si fuera necesario. Los procesos químicos para unir biomoléculas a una superficie son bien conocidos y, en ciertos casos, los productos de RCA pueden fabricarse utilizando un nucleótido modificado o un cebador que tenga un grupo que sea especialmente reactivo con la superficie de la membrana, asegurando de este modo que únicamente los productos de RCA se quedan adheridos a la superficie.
La membrana utilizada puede tener cualquier espesor adecuado, por ejemplo, en el intervalo de 20 pm a 500 pm o de 50 pm a 200 pm, según se desee y, como se ha indicado anteriormente, puede contener una o más estructuras de soporte (por ejemplo, un anillo de soporte) para mantener la integridad de la membrana durante su uso.
Como se ha indicado anteriormente, el presente procedimiento puede utilizarse en protocolos que requieran una cuantificación precisa del número de productos de RCA en una muestra, en particular una muestra que tenga una concentración variable de productos de RCA (por ejemplo, de 10 a 10 M que pueden estar a una concentración relativamente baja, por ejemplo, de 5.000 a 1 M de productos de RCA en un volumen de 50 pl a 200 pl o más) y la resolución estadística requerida para identificar una diferencia únicamente puede alcanzarse contando al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 50.000, al menos 100.000 o al menos 200.000 o más de los productos de RCA. Como se describirá con mayor detalle más adelante, el procedimiento tiene un uso particular en análisis de número de copias y en aplicaciones de ensayos prenatales no invasivos.
Composición
También se proporciona una composición. En algunas realizaciones, la composición puede comprender: (a) una membrana porosa de capilaridad (por ejemplo, una membrana porosa de óxido de aluminio anódico); (b) una pluralidad de productos de RCA marcados fluorescentemente sobre la membrana (por ejemplo, al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 20.000, al menos 50.000, al menos 100.000, al menos 500.000 o al menos 1 M de productos de RCA marcados; y (c) una capa de sólido (por ejemplo, una silicona curada) que encapsula los productos de RCA marcados fluorescentemente. Esta capa de sólido puede ser transparente en algunas realizaciones y, como se ha indicado anteriormente, puede humedecer la membrana para hacerla transparente. Los productos de RCA marcados pueden distribuirse a través de la superficie de la membrana de una manera aleatoria a una densidad de, por ejemplo, al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, al menos 5.000 o al menos 10.000/mm2. En algunas realizaciones, el sólido puede penetrar a través de al menos la entrada de los poros de la membrana. En algunas realizaciones, la composición puede comprender al menos dos poblaciones de productos de RCA marcados fluorescentemente sobre una superficie de la membrana, donde las diferentes poblaciones de productos de RCA marcados fluorescentemente están marcadas de un modo distinguible. Pueden encontrarse detalles adicionales y variaciones de esta composición en la sección de procedimientos de la presente divulgación.
Kits
También se proporcionan por la presente divulgación kits para poner en práctica los procedimientos objeto, como se han descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un kit puede contener al menos: (a) reactivos para producir productos de RCA marcados fluorescentemente (es decir, reactivos para circularizar fragmentos seleccionados de una manera específica de secuencia y después realizar la amplificación en círculo rodante de los productos circularizados, por ejemplo, una o más enzimas de restricción, una ligasa y uno o más oligonucleótidos que pueden actuar como una férula para circularizar los productos, una polimerasa de desplazamiento de cadena para amplificar los productos circularizados mediante RCA, uno o más oligonucleótidos marcados para marcar los productos de RCA, etc.); (b) una membrana porosa de capilaridad, por ejemplo, una membrana porosa de óxido de aluminio anódico; y (c) un polímero curable, por ejemplo, una silicona. El kit puede comprender además un agente de curación en un recipiente separado para el agente humectante curable. En algunas realizaciones, el polímero curable y el agente de curación pueden estar presentes en diferentes cilindros de una jeringa de doble cilindro que tiene una punta mezcladora. En algunas realizaciones, el kit también puede comprender un diluyente, por ejemplo, un aceite de silicona.
Los diversos componentes del kit pueden estar presentes en recipientes separados o ciertos componentes compatibles pueden precombinarse en un solo recipiente, según se desee. Pueden encontrarse detalles adicionales y variaciones de componentes de estos kits en la sección de procedimientos de la presente divulgación.
Además de los componentes mencionados anteriormente, los kits objeto pueden incluir además instrucciones para utilizar los componentes del kit para poner en práctica los procedimientos objeto, es decir, instrucciones para el análisis de muestras.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a aquellas personas con una habilidad habitual en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados.
Ejemplo 1
Procedimientos de detección multiplex
Materiales y procedimientos
Dispositivos: Se unieron membranas de óxido de aluminio con poros de 20 nm a superestructuras de placas de 96 pocillos que se produjeron a medida.
En este experimento multiplex, se utilizaron mezclas de ADN de 2 líneas celulares como material genético de partida. El ADN de la línea celular contenía 2 copias del cromosoma 21 (composición genética normal) o 3 copias del cromosoma 21 (trisomía 21). Se mezcló a Dn extraído de las líneas celulares en las siguientes proporciones 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. Cada mezcla de ADN se digirió en primer lugar utilizando enzimas de restricción, se hibridó y se ligó a un conjunto de sondas, y posteriormente se amplificó enzimáticamente mediante RCA como se ha descrito previamente (véanse las Patentes WO2015083001 y WO2015083002). Se añadieron dos oligonucleótidos de detección específicos de cromosoma (Atto 550 para el cromosoma 18, Atto 647 para el cromosoma 21) a cada muestra y se dejaron hibridar marcando de este modo fluorescentemente los productos de RCA específicos de cromosoma en cada muestra.
T ras el marcado, se añadieron muestras de 100 |jl a placas con fondo de membrana y después las placas se colocaron en un colector de distribución de vacío (N.° de referencia Supelco 66879-U). Las muestras pasaron a través de la membrana de óxido de aluminio en aproximadamente 90 segundos. La placa de fondo de membrana se lavó dos veces con 400 ul de 0,5 x SSC, después se dejó secar. Después se aplicaron trescientos microlitros de Wacker SilGel 612/fijador a cada pocillo para hacerlos transparentes y para fijar los productos de RCA a la membrana.
La obtención de imágenes se realizó en un microscopio Olympus X81 con un objetivo 20X y una cámara Hamamatsu Orca 4.0Lt. La formación de imágenes se realizó organizando en mosaico 10 x 10 imágenes para cubrir todo el fondo de cada pocillo. Las imágenes se analizaron y se contaron los productos de RCA utilizando un software doméstico compilado para tal propósito.
Resultados
Los resultados se resumen en la figura 2. Los recuentos promedio por imagen para la totalidad de las 91 muestras incluidas en el experimento variaron de 3000 a poco más de 5000 recuentos por imagen. Los histogramas muestran claramente una diferencia en la proporción de recuentos entre los canales 550 y 647 en la mezcla de proporción 0:100 (últimas 22 repeticiones), sin embargo es más difícil discernir, únicamente a partir de la figura, las diferencias de proporción en las muestras de 0, 5 y 10 %. La figura 3 es un gráfico de la proporción entre los recuentos para los dos canales frente a la composición de la mezcla de líneas celulares. En esta gráfica se representa claramente la tendencia, ilustrando el cambio de proporción relativa en los recuentos que siguen a la proporción de muestras de ADN de la línea celular de entrada.
Los datos demuestran que la deposición en la membrana de óxido de aluminio da como resultado recuentos aproximadamente 4 veces superiores que cuando se deposita sobre la placa de vidrio durante el mismo intervalo de tiempo de 90 segundos. Si aumentamos el tiempo de incubación a 16 horas para la placa de vidrio, el resultado es un aumento de los productos de RCA que se detectan sobre la placa de vidrio, sin embargo, aún es 2,5 veces inferior al observado a los 90 segundos en el óxido de aluminio.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para procesar una membrana que comprende productos de amplificación en círculo rodante (RCA), que comprende:
(a) obtener una membrana porosa de capilaridad que comprende productos de RCA marcados fluorescentemente que están dentro o sobre la membrana;
(b) depositar un polímero curable sobre la membrana; y
(c) curar el polímero curable en un sólido para encapsular los productos de RCA.
2. El procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el sólido producido en la etapa (c) es transparente.
3. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que el polímero curable de la etapa (b) comprende un agente de curación.
4. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que el polímero curable de la etapa (b) comprende un diluyente para reducir la viscosidad.
5. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que la membrana es una membrana de óxido de aluminio anódico, y en el que el sólido del apartado (c) tiene una propiedad humectante que hace transparente la membrana.
6. El procedimiento, según la reivindicación 5, en el que el polímero curable es una silicona.
7. El procedimiento, según la reivindicación 6, en el que la silicona se mezcla con un agente de curación y, opcionalmente, un diluyente de aceite de silicona.
8. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de curado (c) se inicia mediante un estímulo externo.
9. El procedimiento, según la reivindicación 8, en el que el estímulo externo es calor, humedad o luz.
10. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que los productos de RCA marcados fluorescentemente se hacen:
filtrando los productos de RCA a través de la membrana para producir productos de RCA que están dentro o sobre la membrana; y
marcando fluorescentemente los productos de RCA tanto antes como después del filtrado.
11. El procedimiento, según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento comprende además (d) cuantificar el número de productos individuales de RCA marcados en un área de la membrana, proporcionando de este modo una estimación del número de los productos de RCA marcados en la muestra.
12. Un kit que comprende:
(a) reactivos para producir productos de RCA marcados fluorescentemente;
(b) una membrana porosa de capilaridad; y
(c) un polímero curable.
13. El kit, según la reivindicación 12, en el que el kit comprende además un agente de curación, en el que el agente de curación está en el mismo recipiente que el polímero curable.
14. El kit, según la reivindicación 12, en el que el kit comprende además un agente de curación, en el que el agente de curación y el polímero curable están en recipientes diferentes.
15. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el polímero curable es una silicona.
16. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que la membrana porosa de capilaridad es un filtro de óxido de aluminio anódico.
17. Una composición que comprende:
(a) una membrana porosa de capilaridad;
(b) una pluralidad de productos de RCA marcados fluorescentemente en la membrana;
(c) una capa de sólido que encapsula los productos de RCA marcados fluorescentemente, en el que el sólido es un polímero curable.
18. La composición, según la reivindicación 17, en la que el polímero curado penetra a través de los poros de la membrana porosa de capilaridad.
19. La composición, según las reivindicaciones 17 o 18, en la que la membrana porosa de capilaridad es un filtro de óxido de aluminio.
20. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en la que el polímero curado es una silicona reticulada.
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