CN102827929A

CN102827929A - 一种核酸检测方法

Info

Publication number: CN102827929A
Application number: CN2012102719320A
Authority: CN
Inventors: 姚波; 林彩琴
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN102827929B

Abstract

本发明公开了一种核酸检测方法，包括：(1)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；(2)将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；(3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；(4)滚环扩增完成后，往滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；(5)肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。本发明方法所需实验装置简单，仅需要移液器、恒温加热器即可完成整个检测，与常规方法相比，成本大为降低。

Description

一种核酸检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物分子检测技术，尤其涉及一种核酸检测方法。

背景技术

基于核酸检测的分子诊断技术除血液学、病理学、免疫学和微生物学之外的一项崭新的疾病诊断技术，目前正在越来越广泛地用于临床，为疾病的预防、预测、诊断、治疗提供信息和决策依据。实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是应用最为广泛的核酸检测技术之一，具有高灵敏度和高特异性等特点，可弥补传统生理和免疫诊断技术在灵敏度和检测时间方面的不足。

但是，目前商品化qPCR仪通常都包括两个重要部件，循环温度控制系统和荧光检测系统，导致仪器体积庞大，价格昂贵，且不方便携带和移动。而且绝大多数qPCR和qRT-PCR技术都用到荧光探针，也很大程度上提高了检测成本。上述原因导致大多数分子诊断技术只能够在经济发达、交通便利的中心城市和发达国家的医院、医疗机构中使用，不能够普及到广大农村、偏远地区和发展中国家的大多数地区。而正是在这些国家和地区，每年有更多的穷人和儿童因为医疗卫生条件差、食品短缺、环境恶劣等自然和人为因素，得不到及时诊断和治疗，患上甚至死于各种疾病，尤其是传染性疾病。因此，开发体积小，成本低，灵敏度高，特异性好的新型检测技术具有无比重要的意义。

围绕这一目标，全世界的科学家多年来为之做出了不懈的努力，也取得了一些令人振奋的成果。例如将传统PCR仪器微型化、集成化的micro-PCR芯片实验室(Lab-on-a-chip)技术、纸芯片技术、试纸条传感器和显色技术等。其中，芯片实验室虽然可以将传统PCR仪的部分结构(例如循环温控系统、样品盘、检测器等)微型化，但是将整个PCR系统微型化仍然面临很多问题，而且芯片系统的成本目前还比较高。纸芯片和试纸条技术目前仅限于蛋白检测和免疫分析，而且灵敏度也不高。

由美国西北大学Mirkin教授课题组早年提出的纳米金修饰探针聚集的方法，虽然可以达到很高的灵敏度，该方法虽然可以识别特异序列，但是目标分子必须是短的单链核酸，通常只有20-30个碱基，不适合基因分析。此外，该方法还受限于溶液盐浓度、金属离子的种类和浓度等条件，特别是酶溶液中经常用到的还原剂二硫苏糖醇(DTT)容易引起纳米金的聚集，不利于其广泛应用。

最近，美国弗吉尼亚大学Landers教授课题组发表了一项利用旋转磁场引起磁珠聚集的非标记核酸检测技术，该方法只适用于非特异性核酸分析(例如总DNA、基因组DNA含量等)。而他们设计的特异序列分析方案基于纳米金修饰探针聚集的方法类似，同样存在前述问题，而且，由于磁珠体积通常是微米级(而纳米金颗粒一般只有几十纳米)，庞大的体积不利于探针杂交引起聚集的效果。因此，该技术不能够满足大多数基因分析的要求，不具有广泛适用性。

中国专利申请200810027652.9公开了基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，该方法利用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针与转基因物种的靶基因杂交后在DNA连接酶的作用下形成环化单链探针，该探针在恒温条件下被生物素复制引物滚动复制和支链扩增，产生含有多个串连重复片段的生物素化滚环扩增产物，扩增产物与钌标记的DNA探针杂交，再通过链霉亲和素包被的磁珠分离、电化学发光检测，判断转基因的有无。该专利公开的方法最终需要通过仪器来检测目标核酸是否存在，系统复杂，且操作不够简便。

发明内容

本发明提供了一种核酸检测方法，解决了传统方法最终需要通过检测仪器识别目标分子，操作复杂的问题。

一种核酸检测方法，包括：

(1)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；

(2)将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；

(3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；

(4)滚环扩增完成后，往滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；

(5)肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。

所述目标核酸分子为DNA、mRNA或microRNA，所述目标核酸分子在待测的DNA或RNA中拷贝数不低于107。

所述待测的DNA或RNA浓度和总量较小，一般在1～100ng范围内。

所述待测的DNA或RNA一般是指从生物体中提取的总DNA或总RNA，其中RNA需要逆转录为DNA，否则锁式探针无法与目标核酸分子配对，因此加入连接体系的是其逆转录产物。所述生物体可以是病毒、细菌、植物、动物，可以是单细胞、多细胞或者组织，提取方式可以参照现有公开的核酸提取方法。

从细胞中提取的DNA一般为双链结构，因此先用限制性内切酶(如Alu I和Hinf I)酶切处理，获得短的双链DNA，再经外切酶(如Exo III)处理，获得单链DNA。

RNA的逆转录产物经核酸酶降解后，可以获得单链的DNA，因此不需要进行上述的酶切处理。

所述的预处理就是将提取的双链DNA分解成短的单链DNA，将逆转录产物与单链DNA杂交的RNA模板利用核酸酶降解。

所述锁式探针是指两个末端可以与靶目标序列毗邻互补的核苷酸序列，在连接酶作用下可以环化，得到滚环探针，该滚环探针即为连接产物，作为步骤(3)中滚环扩增的模板。

所述连接酶只要能够将锁式探针两个末端连接即可，但连接酶的连接效率和对序列的识别能力直接影响检测的灵敏度和特异性，它可以是TaqDNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、Thermus thermophilus(Tth)连接酶、T4DNA连接酶、T4RNA连接酶或E.coli DNA连接酶，优选为TaqDNA连接酶、Ampligase DNA连接酶或Thermus thermophilus(Tth)连接酶；最优选为Taq DNA连接酶，该连接酶反应温度较高，不易与突变序列杂交形成双链。

锁式探针长度影响连接效率，也影响滚环扩增的时间，其长度优选为40～200bp，更优选为60～100bp。

所述扩增引物的长度10～40bp，更优选为20～30bp。

理论上，滚环扩增时间越长，聚集显色效果越明显，滚环扩增时间太短，肉眼无法观测到，得到假阴性的结果。所述滚环扩增的时间为至少60分钟，更优选为至少120分钟。

所述磁珠是为超顺磁性纳米微球，它基本由内部的磁核、中间的高分子材料以及外部包裹层组成，直径大致在100nm～10μm。磁核由Fe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料组成，高分子材料构成保护层，可以选用如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、多糖、球蛋白和牛血清蛋白等。包裹层为修饰基团或结合物，本发明磁珠外表面修饰的为可与滚环扩增产物结合的羧基、氨基或抗生物素蛋白，优选抗生物素蛋白修饰磁珠。

所述磁珠的形状可以为正球形、椭球形和棒状等，也可以具有粗糙表面。优选磁性强、不规则形状和具有粗糙表面的磁珠。

所述磁珠也可以为市售商品，可以是美国invitrogen公司生产的

MyOne^TM Streptavidin C1磁珠，或是中国天津贝思乐公司生产的Affimag PSC系列磁珠。

与现有技术相比较，本发明有益效果为：

(1)本发明方法所需实验装置简单，仅需要移液器、恒温加热器即可完成整个检测，与常规方法相比，成本大为降低，特别适用于缺少昂贵临床设备的基层医疗机构、偏远地区和经济不发达地区。

(2)本发明方法还具有普遍适用性，既可以检测DNA，也可以检测RNA，而且操作方便，对实验员专业技术要求不高。

附图说明

图1为本发明方法的原理图。

图2(A)为实施例1利用三种连接酶(T4DNA连接酶、E.coli DNA连接酶和Taq DNA连接酶)连接得到滚环探针，再以三种滚环探针为模板分别进行滚环扩增，扩增产物凝胶电泳图谱，其中1，2利用T4DNA连接酶产物；3，4利用E.coli DNA连接酶产物；5，6利用Taq DNA连接酶产物，1，3，5是空白对照，2，4，6为样品。

图2(B)为实施例1利用三种连接酶(T4DNA连接酶、E.coli DNA连接酶和Taq DNA连接酶)连接得到滚环探针，再以三种滚环探针为模板分别进行滚环扩增，扩增产物被磁珠聚集后晾干在滤纸上的示意图。

图3实施例2不同反应时间滚环扩增产物比较结果；(a)为扩增产物磁珠聚集后在滤纸上的显示图，从左到右，反应时间为0分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟；(b)为扩增产物0.6％琼脂糖凝胶电泳图；(c)为(a)中灰度值分析结果(每个实验重复3次)。

图4为实施例3不同拷贝(10⁶～10¹⁰)模板核酸分子加入连接体系中，最终滚环扩增的产物比较结果；(a)为扩增产物磁珠聚集显示结果图；(b)为扩增产物0.6％琼脂糖凝胶电泳图；(c)为根据(a)中灰度值分析结果(每个实验重复3次)；(d)为目标分子拷贝数与磁珠聚集灰度值之间的关系曲线。

图5为实施例4细胞HPV基因检测结果，每个反应体系加入基因组DNA分另为978pg/μL(HeLa-1)、175pg/μL(HeLa-2)和1.08ng/μL(Huh-7)；(a)为各反应体系最终滚环扩增产物磁珠聚集显色结果图；(b)为(a)中灰度分析结果图。

图6为实施例5细胞HPVmRNA检测结果，(a)两种体系滚环扩增产物的凝胶电泳结果(1，HeLa；2，Huh-7)；(b)两种体系滚环扩增产物磁珠聚集显色结果(1，HeLa；2，Huh-7)。

具体实施方式

实施例1 连接酶选择

目标分子：ACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAG。

1、根据上述目标分子设计如下锁式探针(padlock)和扩增引物。

锁式探针(5’端带有磷酸基团)：

PO₃-GTTTTCTTCCTCGCTAAGTCTAAGAAAGTAGGATAGGACAGATAGCCATCTATTTCATC。

引物：TTTCTTAGACTTAGCG。

2、向10μL连接体系中加入锁式探针，目标核酸分子，连接酶和反应缓冲液，在相应温度下反应1小时。

本实施例分别使用了三种连接酶，连接体系配方及连接反应条件分别具体如下：

1)Taq DNA连接酶

10μL连接体系中含20mM Tris-HCl(pH 7.6)、25mM KAc、10mMMg(Ac)₂、10mM DTT、1mM NAD、0.1％Triton X-100、20U thermophilicTaq DNA连接酶(New England BioLabs，吉泰生物，中国)、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL(10⁸拷贝)目标分子，在45℃下反应1小时，再加热到65℃保温20min使酶失活。

2)T4DNA连接酶

10μL连接体系中含66mM Tris-HCl(pH 7.6)、6.6mM MnCl₂、0.1mM ATP、10mM DTT、350U T4DNA连接酶(TAKARA，Dalian，China)、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL(10⁸拷贝)目标分子，在16℃下反应1小时，再加热到65℃保温20min使酶失活。

3)E.coli DNA连接酶

10μL连接体系中含30mM Tris-HCl(pH 8.0)、4mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、1.2mM EDTA、0.1mM NAD、50μg/mL BSA、30U E.coli DNA连接酶、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL(10⁸拷贝)目标分子，在16℃下反应1小时，再加热到65℃保温20min使酶失活。

3、以连接产物为模板，利用上述合成的引物进行滚环扩增，扩增体系和扩增反应条件如下：

扩增体系10μL：含50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、200μg/mL BSA、400μM dNTP、2.5U phi29polymerase、50nM引物和0.5μL连接产物。

反应条件：在30℃下反应4h。

4、磁珠(贝思乐，天津，中国)在使用前进行离心清洗，并用水稀释，4℃保存。往10μL滚环扩增产物中加1μL磁珠(约1.6×10⁶个磁珠)，用移液器将磁珠与滚环扩增产物混匀，室温静置2min，用一块磁铁聚集磁珠，再用移液器轻轻吹打聚集的磁珠，如此的聚集和吹打操作重复2～3次，最后将溶液全部转移到直径为5mm的圆形滤纸上，用相机(尼康，日本)拍照采集图像，并进一步对图像进行数据分析。另取10μL滚环扩增产物用0.6％琼脂糖凝胶进行分离，SYBR Green染料染色。结果如下图2所示：

从图2中可以看出，三种连接酶均可以实现连接和滚环扩增，但是T4DNA连接酶和E.coli连接酶的空白呈现阳性，而Taq DNA连接酶的空白保持阴性，样品呈现阳性，而且从凝胶和磁珠聚集的结果看，Taq DNA连接酶的产率也最高。

DNA连接酶的连接效率和对序列的识别能力直接影响该检测方法的灵敏度和特异性，T4DNA连接酶的连接效率比较高，而且成本较低，但是由于其反应温度仅为16℃，在该温度条件下，不完全匹配序列(例如突变序列)往往也会与锁式探针杂交成双链，如果突变位点恰好不在连接位点的话，那么也会被连接，造成非特异性连接，导致高背景。Taq DNA连接酶的反应温度比较高(高于45℃)，高于突变序列的杂交Tm，在此条件下突变序列不会与锁式探针杂交成双链，因此背景比较低。实施例2滚环扩增时间优化

目标分子：ACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAG

1、根据目标分子设计合成锁式探针和引物，具体如下：

锁式探针：

PO3-GTTTTCTTCCTCGCTAAGTCTAAGAAAGTAGGATAGGACAGATAGCCATCTATTTCATC。

引物：TTTCTTAGACTTAGCG。

2、将锁式探针、目标核酸分子、连接酶和反应缓冲液混合，进行连接反应，反应体系配方和反应条件如下：

10μL连接体系：20mM Tris-HCl(pH 7.6)、25mM KAc、10mMMg(Ac)₂、10mM DTT、1mM NAD、0.1％Triton X-100、20U thermophilicTaq DNA连接酶、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL(10⁸拷贝)目标分子。

反应条件：在45℃下反应1小时。

扩增体系10μL：含50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、200μg/mL BSA、400μM dNTP、2.5U phi29polymerase、50nM primer1和1μL连接产物。

反应条件：在30℃下分别反应0分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。

4、磁珠聚集显色方法同实施例1，具体结果如图3所示：

从图3可以看出，随着反应时间延长，产物的长度和产量也随之增加，有利于磁珠聚集显色，因此，在保证空白不会出现阳性结果的前提下，尽量延长滚环扩增反应时间有利于提高检测的灵敏度。

实施例3 灵敏度分析

本实施例操作方法同实施例2，反应时间选择为4小时，所不同的是目标分子拷贝数分别为10⁶～10¹⁰，结果如图4所示，可以看出：本方法最低可检测10⁷拷贝(相当于17amol)目标分子。此外还发现，目标分子拷贝数在一定的范围内，和磁珠聚集量成线性关系，且磁珠的聚集和分散结果存在明显差别，极易判断。

实施例4 HPV基因检测

以人乳头瘤病毒(HPV)基因为研究对象，利用本发明方法对细胞系中的HPV基因进行了检测。

1、基因组提取和处理

利用商品化提取试剂盒TIANamp GenomicDNA Kit(天根生化科技(北京)有限公司，北京)提取HeLa细胞和Huh7细胞的基因组，最终获得的TE提取液由紫外-可见分光光度计(SP-752TM，上海光谱仪器有限公司，上海)测定其在260nm波长下的吸光度，换算得出相应的基因组DNA浓度和总量。

首先，提取所得的基因组DNA需经限制性内切酶Alu I和HinfI处理，获得短的双链DNA，再经外切酶Exo III处理，获得单链靶向序列。

10μL限制性内切酶反应液：10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、1mM Dithiothreitol(DTT)、50mM NaCl、2.5U Alu I(TAKARA，Dalian，China)、2.5U Hinf I(TAKARA，Dalian，China)和5μL基因组DNA提取液，在37℃下反应2h，再加热到65℃保温20min使酶失活。

往上述产物中加10μL外切酶混合液，最终得20μL外切酶反应液，其中含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl₂、10mM 2-mercaptoethanol、60U Exo III(TAKARA，Dalian，China)，在37℃下反应2h，再加热到85℃保温20min使酶失活。

2、设计锁式探针和引物，具体为：

锁式探针：

PO₃-GTTTTCTTCCTCGCTAAGTCTAAGAAAGTAGGATAGGACAGATAGCCATCTATTTCATC。

引物：TTTCTTAGACTTAGCG。

3、将处理后的基因组、锁式探针、连接酶、缓冲液混合进行连接反应，具体如下：

10μL连接体系：66mM Tris-HCl(pH 7.6)、6.6mM MnCl₂、0.1mMATP、10mM DTT、350U T4DNA ligase(TAKARA，Dalian，China)、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL(10⁸拷贝)目标分子。

在16℃下反应1小时，再加热到65℃保温20min使酶失活。

4、滚环扩增和聚集显色同实施例1，结果如图5所示：

HeLa细胞为人宫颈癌细胞，已被证明带有HPV病毒基因，而Huh-7细胞为人肝癌细胞系，理论上不存在HPV基因，结果显示HeLa细胞呈阳性，Huh-7细胞呈阴性，与预期结果一致，证明本方法可以用于实际样品的基因分析。

实施例5 HPVmRNA分析

以人乳头瘤病毒(HPV)的mRNA为研究对象，利用本发明方法对细胞系中的HPV mRNA进行了检测。

1、总RNA的提取和处理

参照厂家提供的说明书，使用TRNzol试剂(Cat#DP405-02，天根，中国，北京)对HeLa细胞、Huh-7细胞提取总RNA样本。最终获得的提取液由紫外-可见分光光度计(SP-752TM，上海光谱仪器有限公司，上海)测定其在280nm波长下的吸光度，换算得出相应的总RNA的浓度和总量。

2、设计锁式探针和引物，具体为：

滚环扩增引物：CCAAAGAAAGTAGGAT

逆转录引物：GTCGTTGGAGTCTTTCCTGTCGT

锁式探针：

PO₃-GTGCTGCAACCGAGCTGCAGCTATCCTACTTTCTTTGGCACTAGAGGCCAGTGCCATTC

3、采用逆转录引物对总RNA进行逆转录反应，具体如下：

10μL逆转录反应体系含有：1μL总RNA样本、500nM 5’-磷酸化逆转录引物、20U PrimeScriptTM反转录酶(TAKARA，中国，大连)、50μMdNTPs和1×反应缓冲液(pH 8.3，50mM Tris-HCl，75mM KCl和3mMMgCl₂)。

将该体系在42℃下保温30min，然后在-20℃下放置20min，解冻后加入2.5U核糖核酸酶H(Fermentas，中国，深圳)并在37℃处理20min，以降解RNA-DNA杂交链中的mRNA。

4、将逆转录产物、锁式探针、连接酶、缓冲液混合进行连接反应，具体如下：

10μL连接体系：20mM Tris-HCl(pH 7.6)、25mM KAc、10mMMg(Ac)₂、10mM DTT、1mM NAD、0.1％Triton X-100、20U thermophilicTaq DNA连接酶、500nM磷酸化的锁式探针和2.5μL逆转率产物或是它的稀释液。

反应条件：在45℃下反应1h。

5、滚环扩增和聚集显色同实施例1，具体结果如图6所示，可以看出具体检测结果与实际情况一致。

Claims

1.一种核酸检测方法，包括：

(1)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；

(3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；

2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述连接酶为Taq DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、Thermus thermophilus连接酶、T4DNA连接酶、T4RNA连接酶或E.coli DNA连接酶。

3.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述连接酶为Taq DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶或Thermus thermophilus连接酶。

4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述滚环扩增的时间为至少60分钟。

5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于，所述滚环扩增的时间为至少120分钟。

6.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述锁式探针长度为40～200bp。

7.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物的长度10～40bp。

8.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述磁珠外表面修饰羧基、氨基或抗生物素蛋白。

9.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述磁珠直径为100nm～10μm。