KR102572521B1

KR102572521B1 - 등온증폭 및 커피링 현상에 기반한 표적 핵산의 검출용 조성물 및 검출방법

Info

Publication number: KR102572521B1
Application number: KR1020210021858A
Authority: KR
Inventors: 정현정; 강유경
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2021-02-18
Filing date: 2021-02-18
Publication date: 2023-08-30
Also published as: KR20220118115A

Abstract

본 발명은 등온증폭 및 커피링 현상에 기반한 표적 핵산 검출용 플랫폼 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 회전환 증폭을 위한 프로브 및 캡처 DNA 미립구를 포함하는 표적 핵산 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 검출용 키트, 센서 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 picomole 단위의 미량의 표적 핵산에 대해서도 고감도로 표적 핵산만을 특이적으로 검출할 수 있으며 15분 이내로 신속하게 표적 핵산의 검출이 가능하다. 또한, 특별한 장비 없이 휴대용 기기로 촬영된 이미지를 판독 알고리즘으로 분석하여 커피링의 형성 여부를 용이하게 확인할 수 있는바 저렴한 비용으로 간편하게 이용할 수 있어 현장 진단에 이용 가능하므로, 신속한 유전자 검사 플랫폼으로써 조기 병원체 검출 및 효율적인 모니터링을 통해 궁극적으로 감염병 진단 및 환자의 질병 관리를 개선하는데 활용될 수 있다.

Description

등온증폭 및 커피링 현상에 기반한 표적 핵산의 검출용 조성물 및 검출방법 {Composition for detection of target nucleic acid based on isothermal amplification and coffee ring effect, and detection method thereof}

본 발명은 등온증폭 및 커피링 현상에 기반한 표적 핵산 검출용 플랫폼 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 회전환 증폭을 위한 프로브 및 캡처 DNA 미립구를 포함하는 표적 핵산 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 검출용 키트, 센서 및 검출방법에 관한 것이다.

감염성 질환 (infectious diseases)은 전 세계 사망률의 25%를 차지하며 심각한 위협이 되고 있다. 또한, 이에 의한 항생제의 지속적인 남용은 다제 내성 박테리아의 출현과 확산으로 이어졌으며, 향후 수십 년 동안 연간 최대 천만 명의 사망자가 발생할 것으로 예상되고 있다. 따라서 자원이 제한된 환경에서 박테리아 병원체와 이에 대한 내성을 신속하게 식별할 수 있는 간단하고 비용이 저렴한 진단 테스트는 감염의 전파를 예방하고 즉각적이고 표적화된 치료를 실시하는데 큰 이점을 제공할 수 있다. 그러나 현재 임상에서 박테리아의 검출을 위해 실시되는 표준적 방법은 미생물 배양을 기반으로 하며, 이는 많은 시간이 소요되어 박테리아의 종과 내성 유형을 확인하는데 최소 며칠에서 몇 주가 걸린다. 또한, RT-PCR (실시간 중합효소연쇄반응)에 기반한 분자적 검출 방법은 고감도이며 분석 시간을 몇 시간 이내로 단축할 수 있지만, 열 사이클링 및 실시간 형광 검출 모듈을 포함한 고가의 장비가 필요해 현장 진단에 대한 적용에 제한이 있다.

이러한 한계점을 극복하기 위한 진보된 분자적 검출 전략의 추가적인 연구개발은 진단 분석의 단순성과 속도를 개선하여 실용적인 응용 측면에서 잠재적으로 우수한 성능을 보여주었다. 이러한 기술에는 예컨대 형광 강화, 플라스몬 공명 및 자기 검출에 기반한 초고감도 신호를 가진 나노 물질을 이용한 것들이 포함된다. 그러나 이러한 기술은 특수 장비가 필요하고 복합적인 생물학적 시료에 대한 특이성 부족으로 인해 감염에 대한 표준 진단 테스트로 적용하기가 실질적으로 어려운 단점이 있다. 이에, 최근에는 미세유체공학(microfluidics), 웨어러블 장치(wearable devices) 및 모바일 애플리케이션을 기반으로 한 소형 진단 플랫폼이 의료 모니터링 및 가정 테스트에 적용되는데 큰 관심을 끌었다. 그러나 현재의 소형화 플랫폼 기술은 병원체를 검출하기에 민감도가 부족하고 혈당 수치 및 심장 기능과 같은 잘 확립된 진단 수단으로만 제한되어 있다.

한편, 등온 유전자 검사는 기존 RT-PCR 플랫폼에 비해 더욱 간단하며 적은 비용으로 표적을 특이적으로 식별할 수 있는 큰 이점을 갖는다. 이전에는 회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA), 고리 매개 등온증폭 (loop mediated isothermal amplification; LAMP) 및 핵산 서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification; NASBA)과 같은 등온증폭 방법이 비색계 및 형광을 기반으로 하는 다양한 감지 플랫폼과 통합되었다. 비색 검출은 분석 결과를 육안으로 관찰할 수 있고 최소한의 기기가 필요하기 때문에 유리하지만, 이전에 박테리아 표적에 대해서는 견고성이 부족한 부산물 (ex. 이온)의 간접 검출을 기반으로 했다(Chem Commun (Camb). 2014 Nov 28;50(92):14382-5.). 또한 형광을 기반으로 한 검출은 민감도가 높은 반면 광표백(photobleaching problems) 문제와 높은 배경 신호를 나타내 분석의 정확도에 한계가 있다.

커피링 효과(coffee ring effect)는 콜로이드 현탁액이 고체 표면에 떨어질 때 입자상 물질이 고리 패턴으로 침착되어 발생하는 널리 관찰되는 현상이다. 액적의 증발은 증발하는 용매를 보충하기 위해 바깥쪽 방향으로 모세관 흐름을 유도하여 입자를 액적의 가장자리로 가져오고 특징적인 링 패턴을 남기게 된다. 링 패턴의 형성은 입자의 표면 특성을 제어함으로써 용액 환경을 변형시킬 수 있으며, 이는 더욱 강한 입자 간 상호작용을 유도하고 커피링 형성을 억제할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 RCA 기반 등온증폭에 커피링 효과를 접목시켜 표적 핵산의 검출을 위한 분석법을 확립하였고, 다제내성 박테리아인 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)을 대상으로 특이적이고 빠르며 간단한 유전적 검사 방법임을 입증하였다.

본 발명은 종래 표적 핵산에 대한 분자적 검출 방법의 한계점을 극복하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 RCA 기반 등온증폭 반응에 커피링 효과를 접목시킨 분석 방법 (i-CoRi assay)을 개발하였고, 신속하고 간단하면서도 이의 우수한 검출효과를 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 표적 핵산의 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 표적 핵산 검출 센서 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 이용한 표적 핵산의 검출방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하는 프로브(probe); 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA)을 위한 프라이머(primer); 및 캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구를 포함하는, 표적 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 리가아제(ligase) 및 DNA 중합효소를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 프로브는 닉(nick)을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프로브는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 캡처 DNA는 회전환 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 표적은 박테리아, 바이러스 또는 진균일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 표적 핵산의 검출은 커피링의 존재 여부를 확인함으로써 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출 센서를 제공한다.

또한, 본 발명은 분석장치가 입력 이미지를 입력받는 단계; 상기 분석장치가 상기 입력 이미지에 커피링이 있는지 판단하는 단계; 및 상기 분석장치가 상기 커피링 존재 여부로 표적 핵산이 존재하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하되,

상기 입력 이미지는 피검자 유래 생물학적 시료를 상기 키트에 첨가하고 반응시켜 얻어진 반응 용액을 비친수성 표면에 떨어뜨린 후 증발되는 상태에 대한 영상을 포함하는 것이고,

상기 반응 용액은 등온증폭 반응 및 캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구와 표적 핵산의 결합반응이 동시에 일어난 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 분석장치는 상기 입력 이미지에 커피링이 형성되지 않은 경우 표적 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료는 조직, 기관, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 검출방법은 회전환 증폭 기반 등온증폭과 커피링 효과를 통합한 것으로, picomole 단위의 미량의 표적 핵산에 대해서도 고감도로 표적 핵산만을 특이적으로 검출할 수 있으며 15분 이내로 신속하게 표적 핵산의 검출이 가능하다. 또한, 특별한 장비 없이 휴대용 기기로 촬영된 이미지를 판독 알고리즘으로 분석하여 커피링의 형성 여부를 용이하게 확인할 수 있는바 저렴한 비용으로 간편하게 이용할 수 있어 현장 진단에 이용 가능하므로, 신속한 유전자 검사 플랫폼으로써 조기 병원체 검출 및 효율적인 모니터링을 통해 궁극적으로 감염병 진단 및 환자의 질병 관리를 개선하는데 활용될 수 있다.

도 1은 회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA)을 기반으로 한 등온증폭을 커피링 효과와 통합한 본 발명에 따른 i-CoRi 분석 방법을 그림으로 간략히 도시한 것이다.
도 2는 합성 표적 DNA를 이용한 u-CoRi 분석을 실시한 후 커피링 효과를 분석한 결과로서, 도 2a는 메티실린 내성 포도상구균 (MRSA)의 mecA 유전자에 특이적으로 설계된 u-캡처 DNA 미립구를 도시한 것이고, 도 2b는 Qubit 분석을 통해 상기 미립구에 고정된 캡처 DNA 올리고뉴클레오타이드를 정량화한 결과이며, 도 2c는 상기 합성한 mecA 유전자 DNA 또는 음성대조군인 E. coli 16S rRNA의 특정 영역에 대한 DNA를 다양한 농도로 처리한 경우의 커피링 효과를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 MRSA 표적 핵산의 등온증폭을 위한 RCA 프로브의 설계 및 검증 결과를 나타낸 것으로, 도 3a는 MRSA 유래 mecA mRNA의 RCA 반응을 위한 padlock 프로브 (파란색)의 구조를 도시한 것이고, 도 3b는 T4 리가아제 및 합성 DNA (MRSA, E. coli 및 P. aeruginosa)와 상기 MRSA 특이적 padlock 프로브를 첨가한 후 엑소뉴클레아제 1을 처리하여 T4 리가아제에 의한 padlock 프로브의 결찰을 검증한 결과이며, 도 3c는 MRSA 표적 DNA를 이용한 RCA 반응을 검증한 결과이다.
도 4는 합성 표적 DNA를 이용하여 1단계 i-CoRi 분석 방법을 검증한 결과로서, 도 4a는 1단계 i-CoRi 분석 과정을 간략히 도시한 것이고, 도 4b는 Qubit 이중 가닥 DNA 분석을 통해 캡처 DNA와 RCA 반응 산물의 혼성화 정도를 정량화한 결과이며, 도 4c는 RCA 반응 및 혼성화가 완료된 분석 용액을 커버슬립 위에 떨어뜨리고 액적을 증발시킨 후 형성된 커피링 패턴을 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 4d는 각 실험군 및 대조군의 커피링 패턴을 보여주는 현미경 이미지에서 액적의 중앙을 통과하는 횡단선을 따라 회색 값의 강도를 보여주는 히스토그램 결과이다 (파란색 화살표: 흰색 배경에 대한 기준 값; 보라색 화살표: 커피링 신호).
도 5는 MRSA 및 MSSA 박테리아 전체 RNA에 대하여 1단계 i-CoRi 분석을 실시하여 항생제 내성 균을 검출한 결과로서, 도 5a는 각 실험군 및 대조군에 대한 i-CoRi 분석 용액의 액적 증발 후 형성된 링 패턴의 현미경 이미지를 나타낸 것이고, 도 5b는 도 5a의 이미지에서 액적의 중심을 통과하는 횡단선을 따라 회색 값의 강도를 보여주는 히스토그램 결과이다 (파란색 화살표: 흰색 배경에 대한 기준 값; 보라색 화살표: 커피링 신호).
도 6은 1단계 i-CoRi 분석에 의해 형성된 링 패턴을 보여주는 스마트폰 이미지를 나타낸 것으로, 도 6a는 MRSA 표적 DNA에 대한 1단계 i-CoRi 분석 후 각각 마이크로 렌즈가 없는 스마트폰 (Smartphone) 및 마이크로 렌즈가 장착된 스마트폰 (Smartphone + lens) 카메라를 이용해 분석 용액의 액적을 증발시킨 후 촬영한 결과이고, 도 6b는 상기 마이크로 렌즈가 장착된 스마트폰 카메라로 촬영하여 얻은 이미지에서 액적 중앙을 통과하는 횡단 선을 따라 회색 값의 강도를 보여주는 히스토그램 결과를 나타낸 것이다 (빨간색 점선 원: 중앙 부분에서 나타나는 미립구의 조밀한 패킹; 보라색 화살표: 커피링 신호).
도 7은 1단계 i-CoRi 분석을 통해 형성된 커피링 패턴을 본 발명에 따른 디지털 판독 알고리즘으로 분석한 결과를 나타낸 것이다 ((a 및 c) 표적 DNA 및 (b) 박테리아 전체 RNA를 사용한 분석 결과).

본 발명은 우수한 민감도와 특이성으로 신속하고 간편하게 병원체의 검출이 가능한 유전자 검사 플랫폼 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 회전환 증폭 반응 및 캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구와 표적 핵산의 결합반응이 동시에 일어나며, 이를 통해 생성된 반응 용액의 커피링 형성 여부를 통해 표적 핵산을 검출하는 방법으로, 본 발명자들은 본 발명에서 확립한 상기 표적 핵산의 검출방법을 i-CoRi assay로 명명하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하는 프로브 (probe);

회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA)을 위한 프라이머(primer); 및

캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구를 포함하는, 표적 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 검출용 조성물은 리가아제 (ligase) 및 DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "표적 핵산"은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종 (species), 아종 (subspecies), 또는 변종 (variant) 유래의 유전자 염기서열 또는 동일한 종 내 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 핵산은 genomic DNA, mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA, 및 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 표적은 바람직하게 박테리아 (Bacteria), 바이러스 (Virus) 또는 진균 (Fungus)일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 박테리아는 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)일 수 있고, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로브 (Probe)"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 프로브는 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 검출하고자 하는 표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하여 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있으며, 표적 핵산과 상보적으로 결합하는 부위에 닉 (nick)을 포함한다. 표적 핵산이 프로브와 상보적으로 결합하면 상기 프로브의 열려있는 부분인 닉의 5' 말단과 3' 말단이 인접하게 되고, 연결 효소 (ligase)에 의해 연결되어 환형을 이루게 된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "상보적인"은 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리가아제는 바람직하게 T4 리가아제일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니며 상기 T4 리가아제와 같이 상기 프로브의 닉 부분을 연결하는 기능을 갖는 것이라면 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 메티실린 내성 포도상구균 (MRSA)의 mecA 유전자의 mRNA를 표적하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머 (primer)"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로서, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 표적 핵산이 프로브에 결합하면 프로브가 연결되어 환형의 주형을 형성하게 되고 DNA 중합효소가 상기 프라이머를 기시점으로 하여 회전환 증폭이 유도될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA)"이란 롤링 서클 메커니즘을 통한 원형 핵산 주형을 증폭하는 핵산 증폭 반응을 의미한다. 회전환 증폭 반응은 원형의, 흔히 단일 가닥인 핵산 주형에 대한 프라이머의 혼성화에 의해 개시된다. 다음으로, 핵산 중합효소는 원형 핵산 주형 주위로 계속하여 진행함으로써 원형 핵산 주형에 혼성화된 프라이머를 확장하여 핵산 주형의 서열을 반복하여 복제한다. 회전환 증폭은 원형 핵산 주형 서열의 탠덤 (tandem) 반복 유닛을 포함하는 콘카테머를 통상적으로 생성한다. 회전환 증폭은 선형 증폭 동역학을 나타내는 선형 RCA (LRCA)(예컨대, 단일 특이적 프라이머를 사용한 RCA)일 수 있거나, 또는 지수형 증폭 동역학을 나타내는 지수형 RCA (ERCA)일 수 있다. 회전환 증폭은 또한, 과분지된 콘카테머를 생성하도록 복수의 프라이머를 사용하여 수행될 수도 있다(복수회 프라이밍된 롤링 서클 증폭 또는 MPRCA). 예컨대, 이중 프라이밍된 RCA에서, 하나의 프라이머는 선형 RCA에서와 같이 원형 핵산 주형에 상보적일 수 있는 반면, 다른 프라이머는 RCA 생성물의 탠덤 반복 유닛 핵산 서열에 상보적일 수 있다. 회전환 증폭은 이에 적합한 DNA 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 회전환 증폭을 통해 생성된 산물은 하나 이상의 표적 핵산 서열 및 공간적 구조적 여유가 있는 반복 서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 DNA일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 회전환 증폭에 적합한 phi29 DNA 중합효소일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니며 상기 프로브의 핵산서열을 주형으로 하여 회전환 증폭을 수행할 수 있는 기능을 갖는 것이라면 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 미립구 (microbead)는 바람직하게는 폴리스티렌 (Polystyrene) 미립구로써 표면에 하나 이상의 캡처 DNA가 결합되어 있다. 상기 캡처 DNA는 상기 회전환 증폭 결과 생성되는 긴 단일 가닥의 DNA 내 표적 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출센서를 제공한다. 상기 검출용 조성물을 이용하여 표적 핵산을 검출할 수 있는 센서 기술이라면 모든 기술을 이용할 수 있으며, 특별히 센서기술의 종류나 특성에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 센서 시스템은 키트(Kit)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 검출용 조성물과 함께 버퍼 (buffer), DNA 중합효소 보조인자 (DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트 (dNTP)와 같은 표적 핵산 증폭 반응 (예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 분석장치가 입력 이미지를 입력받는 단계; 상기 분석장치가 상기 입력 이미지에 커피링이 있는지 판단하는 단계; 및 상기 분석장치가 상기 커피링 존재 여부로 표적 핵산이 존재하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하되,

본 발명에서 사용되는 용어, "커피링 효과 (coffee ring effect)"란 미세입자를 포함한 액적이 증발할 때 바깥쪽 방향으로 모세관 흐름이 유도되어 입자가 액적의 가장자리로 이동함으로써 특징적인 링 패턴이 형성되는 것을 말한다.

상기 생물학적 시료 내에 표적 핵산이 존재하는 경우, 표적 핵산과 본 발명의 표적 핵산에 특이적인 프로브의 상보적 결합에 의해 프로브의 닉 부분이 리가아제 효소에 의해 연결되어 환형의 주형이 형성되고, 이를 주형으로 회전환 증폭이 일어나 반복적이고 긴 단일 가닥의 DNA 증폭이 유도된다. dNTP가 충분히 공급되는 한 무한적으로 반복적 서열의 증폭을 유도되며, 상기 프로브와 상보적인 서열로 이루어진 증폭 산물은 새로이 형성되는 산물에 의해 밀려 주형이 되는 프로브에서 떨어져나가 결과적으로 미립구의 표면에 결합되어 있는 캡처 DNA와 상보적 결합을 형성할 수 있는 긴 반복 서열의 단일가닥을 형성한다. 이러한 긴 단일가닥 DNA 내 반복적으로 존재하는 표적 핵산서열과 캡처 DNA의 상보적 결합에 의해 미립구의 응집이 유도된다.

본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체외로 분리된 조직, 기관, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 상기 조직은 예컨대 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함될 수 있고, 상기 기관은 예컨대 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함될 수 있으나, 상기 시료의 범위가 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 촬영된 이미지는 커피링 형성 여부의 판독에 이용되며 이의 판독 결과를 통해 표적 핵산을 포함하는 병원체의 존재 또는 감염 여부가 결정될 수 있다.

이하, 전술한 알고리즘을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 분석장치에 대하여 설명한다. 분석장치는 입력되는 이미지(입력 이미지)를 기준으로 커피링 형성 여부를 판단할 수 있다. 입력 이미지 생성 과정은 전술한 바와 같다. 카메라 장치 또는 이미지 센서로 일정한 실험적 프로세스로 얻어진 결과에 대한 이미지(i-CoRi 분석 결과 이미지)를 획득할 수 있다. 해당 이미지는 스마트폰과 같은 휴대 단말로도 획득할 수 있음을 설명하였다.

표적 핵산의 검출방법은 피검자 유래 생물학적 시료를 키트에 첨가하여 반응시키는 단계, 반응 용액을 비친수성 표면에 한방울 떨어뜨리고 증발시키는 단계, 증발된 상태에 대한 입력 이미지를 생성하는 단계 및 입력 이미지를 분석하여 커피링 형성 여부를 판독하는 단계를 포함할 수 있다. 분석장치는 입력 이미지를 분석하여 커피링 형성 여부를 판독한다.

분석장치는 스마트기기, PC, 네트워크상의 서버 등과 같이 다양한 형태 중 어느 하나일 수 있다. 분석장치는 저장장치, 메모리, 연산장치, 인터페이스 장치, 통신 장치 및 출력장치를 포함할 수 있다.

저장장치는 전술한 입력 이미지를 처리하는 알고리즘 프로그램 내지 코드를 저장한다. 또한, 저장장치는 분석 결과에 대한 정보를 저장할 수 있다.

메모리는 분석장치가 입력 이미지를 분석 하는 과정에서 발생하는 임시 데이터를 저장할 수 있다.

인터페이스 장치는 사용자 또는 별도의 물리적 객체로부터 일정한 명령 내지 정보를 입력받는 장치이다. 인터페이스 장치는 외부 입력장치로부터 입력 이미지를 입력받을 수 있다.

통신 장치는 네트워크를 통해 일정한 정보를 수신하고 전송하는 구성을 의미한다. 통신 장치는 외부 객체로부터 입력 이미지를 수신할 수 있다. 또한, 통신 장치는 분석 결과를 외부 객체에 송신할 수 있다.

통신 장치 내지 인터페이스 장치는 외부로부터 일정한 데이터 내지 명령을 전달받는 장치이다. 통신 장치 내지 인터페이스 장치를 입력장치라고 명명할 수도 있다.

연산장치는 저장장치에 저장된 프로그램을 이용하여 입력되는 입력 이미지를 분석한다. 연산장치는 입력 이미지에서 커피링이 포함되는지를 판단한다. 연산 장치는 데이터를 처리하고, 일정한 연산을 처리하는 프로세서, AP, 프로그램이 임베디드된 칩과 같은 장치일 수 있다.

출력 장치는 입력 이미지를 분석 과정에 필요한 인터페이스 화면을 출력할 수 있다. 또한, 출력 장치는 입력 이미지를 분석한 결과를 화면에 출력할 수 있다.

또한, 상술한 바와 같은 이미지 분석 방법, 표적 핵심 검출 방법은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 실행가능한 알고리즘을 포함하는 프로그램(또는 어플리케이션)으로 구현될 수 있다. 상기 프로그램은 일시적 또는 비일시적 판독 가능 매체(non-transitory computer readable medium)에 저장되어 제공될 수 있다.

비일시적 판독 가능 매체란 레지스터, 캐쉬, 메모리 등과 같이 짧은 순간 동안 데이터를 저장하는 매체가 아니라 반영구적으로 데이터를 저장하며, 기기에 의해 판독(reading)이 가능한 매체를 의미한다. 구체적으로는, 상술한 다양한 어플리케이션 또는 프로그램들은 CD, DVD, 하드 디스크, 블루레이 디스크, USB, 메모리카드, ROM (read-only memory), PROM (programmable read only memory), EPROM(Erasable PROM, EPROM) 또는 EEPROM(Electrically EPROM) 또는 플래시 메모리 등과 같은 비일시적 판독 가능 매체에 저장되어 제공될 수 있다.

일시적 판독 가능 매체는 스태틱 램(Static RAM，SRAM), 다이내믹 램(Dynamic RAM，DRAM), 싱크로너스 디램 (Synchronous DRAM，SDRAM), 2배속 SDRAM(Double Data Rate SDRAM，DDR SDRAM), 증강형 SDRAM(Enhanced SDRAM，ESDRAM), 동기화 DRAM(Synclink DRAM，SLDRAM) 및 직접 램버스 램(Direct Rambus RAM，DRRAM) 과 같은 다양한 RAM을 의미한다.

본 발명의 일실시예에서는, MRSA에서 추출한 전체 RNA 시료에 대하여 본 발명에 따른 i-CoRi 분석을 실시해 우수한 검출 특이성 및 민감도를 확인하였고, 반응 용액을 떨어뜨려 액적을 증발시킨 다음 스마트폰 카메라를 이용해 이미지를 얻고 상기 판독 알고리즘에 따라 분석하여 일반적으로 사용되는 모바일 장치로 i-CoRi 분석 데이터를 기록하고 육안으로 관찰하여 결과를 판독할 수 있음을 확인하였다 (실시예 5 내지 7 참조). 이를 통해, 본 발명에 따른 i-CoRi 분석 방법은 우수한 검출 효과와 더불어 커피링 패턴을 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 쉽게 판독할 수 있는바, 이는 매우 유용하고 실질적으로 실행 가능한 플랫폼임을 입증하는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 캡처 DNA-미립구(capture DNA microbeads)의 설계 및 제작

폴리스티렌 미립구 (Polystyrene microbeads) (Polybead® Amino Microspheres, 3.00 μm)는 Polysciences에서 제공받았고, u-Capture DNA 및 i-capture DNA 미립구는 10mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)이 포함된 인산완충액(PBS)에 99.7μg의 설포숙시니미딜 4-(N- 말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (sulfo-SMCC, Thermo Scientific)와 함께 1mg의 미립구를 첨가하여 제조하였다. 이후 4℃에서 12시간 동안 미립구를 활성화시키고, PBS로 3회 세척하였다. 다음으로, 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) 유래 mecA 유전자의 특정 영역을 표적하는 티올-변형된 캡처 DNA 미립구 올리고뉴클레오티드(20 nmol, Macrogen)를 설계하였으며, PBS 존재하에 125mM DTT(dithiothreitol)를 2시간 동안 처리한 후 illustra Microspin G-25 컬럼(GE Healthcare)을 이용해 여과하였다. 이어서 캡처 DNA 올리고뉴클레오티드를 활성화된 미립구에 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 캡처 DNA는 0.04% Tween 20이 포함된 PBS로 미립구를 2회 세척하여 제거하였다. 미립구에 접합된 캡처 DNA의 양은 Qubit ssDNA 정량 키트 (Invitrogen)를 사용하여 정량화하였고 Qubit 3.0 Fluorometer (Invitrogen)를 사용하여 검출하였다. DNA 농도는 Qubit ssDNA 표준 용액을 사용하여 검량선을 기반으로 계산하였다.

1-2. RCA 프로브 설계 및 표적 DNA 증폭 검증

본 실시예에서 사용한 회전환 증폭(RCA)을 위한 padlock probe DNA, 프라이머(primer) 및 합성 표적 DNA는 모두 Macrogen에서 합성하였다. RCA padlock probe DNA는 MRSA 유래 mecA 유전자의 특정 영역을 표적하도록 설계되었으며, NUPACK 열역학 분석 소프트웨어를 이용해 분석하여 비특이적인 혼성화, 의도하지 않은 2차 구조 형성 및 표적 인식 간섭을 최소화하였다. MRSA 표적 DNA에 대한 padlock probe의 특이적 결찰을 위해 padlock probe DNA (1.6μM)에 표적 DNA (몰비 1 : 2) 또는 세균의 총 RNA (3μg)를 첨가하고, 1.3 mM DTT 및 1mM ATP의 존재하에 23℃에서 30분 동안 T4 리가아제 (ligase) (13.3 units/μl, New England BioLabs)를 처리하였다. 표적 DNA 또는 RNA와의 특이적 결합에 의해 padlock probe가 결찰된 후에는, 65℃에서 15분 동안 배양하여 T4 리가아제를 비활성시키고 4℃로 옮겨 식혔다. 또한 표적 특이적 프로브의 결찰을 검증하기 위해, 상기 식힌 용액에 1.3mM DTT 및 1mM의 ATP의 존재하에 37℃에서 2 units/μl 엑소뉴클레아제 1 (exonuclease 1)을 처리하고 30분 동안 배양한 후, 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)을 수행하여 분석하였다.

다음으로 RCA 반응을 위해, phi29 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 4mM DTT, 10mM MgCl₂, pH7.5)에 결찰된 padlock probe DNA (1.28 pmoles, 642nM)를 용해시키고, 25 mM dNTP mix, 20 units NxGen®phi29 DNA 중합효소, 및 0.05 unit 피로포스파타아제 (pyrophosphatase) (Lucigen Incorporation)를 첨가한 후 합성된 표적의 경우 37℃, 박테리아 총 RNA의 경우 25℃에서 30분 동안 배양하였다. RNA 산물은 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석으로 확인하였다.

1-3. 박테리아 배양 및 RNA 추출

메티실린 내성 포도상구균 (MRSA) 균주 CCARM 3798 및 3803은 서울여자대학교 (Seoul, Korea)의 항균제 내성 미생물 배양 컬렉션에서 제공받아 표적 병원균으로 사용하였다. 메티실린 민감성 포도상구균 (Methicillin-sensitive S. aureus; MSSA) 균주 KCTC 3881은 한국생명공학연구원 (KRIBB)의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에서 제공받아 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 균주들을 배양하기 위해, MRSA의 경우에는 옥사실린(oxacillin)이 함유되고 MSSA의 경우에는 항생제가 없는 각 TSB (tryptic soy broth) (BD Biosciences)에 접종하고, 진탕 배양기를 이용해 37℃에서 중간 지수 성장기까지 부유배양하였다. 배양 후 박테리아의 성장 및 농도는 Nanophotometer P330 (Implen)을 이용하여 600nm의 흡광도에서 광학 밀도를 측정하여 확인하였다. 측정결과, OD 값이 0.45 - 0.6 범위에 도달하면 4℃에서 6,200 g로 원심분리하여 세균 펠렛을 얻고 PBS로 세척하였다. 이후 박테리아에 TRIzol™ (Invitrogen)을 처리하여 RNA를 추출하였으며, 최종적으로 추출된 RNA의 농도는 Nanophotometer P330을 이용해 측정하였다.

1-4. u-CoRi 및 i-CoRi 커피링 분석

RCA 과정을 제외한 비변형 커피링 (u-CoRi) 분석을 위해 정해진 농도에서 합성 DNA가 존재하는 PBS에 u-캡처 DNA 미립구 (2.4 x 10⁵/μl)를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 혼성화를 유도하였다.

2단계 등온 커피링 (i-CoRi) 분석의 경우에는 원형의 padlock probe DNA (643 nM), RCA 프라이머 (5μM), NxGen®phi29 DNA 중합효소 (2U/μl) 및 dNTP (25mM)를 phi29 반응 버퍼 (50mM Tris-HCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 4mM DTT, 10mM MgCl₂, 0.0025U/μl 파이로포스파타아제, pH 7.5)와 혼합하고 표적 DNA의 경우 37℃ 또는 세균 총 RNA의 경우 25℃에서 30분 동안 배양한 다음, i-캡처 DNA 미립구 (2.4 x10⁵/μl)와 30분 동안 배양하였다.

1단계 i-CoRi 분석의 경우에는, i-캡처 DNA 미립구 (2.4 x10⁵/μl), 원형 padlock probe, RCA 프라이머, phi29 DNA 중합효소 및 dNTP를 모두 phi29 반응 완충액에 혼합하고, 표적 DNA의 경우 37℃ 또는 세균 총 RNA의 경우 25℃에서 30분 동안 배양하여 RCA 반응과 미립구 혼성화가 동시에 일어나도록 하였다. 다음으로 분석 용액에 마이크로원심분리기 (GMC-260, DAIHAN)를 사용하여 20초 동안 약한 중력을 가하고 0.04% Tween 20이 함유된 새로운 PBS에 재현탁하였다. 이어서 분석 용액을 커버 슬립 표면에 떨어뜨리고. 주변 조건 하에서 5분 동안 증발시켰으며, 모든 분석은 중복수행하였다.

나아가, Qubit dsDNA 시약을 이용하여 캡처 DNA 미립구와 표적 DNA간의 혼성화를 정량하고 ubit 3.0 Fluorometer (Invitrogen)를 이용해 측정하였다. DNA 양은 Qubit dsDNA 표준 용액을 이용해 검량선을 기반으로 계산하였다. 증발 후에 커버슬립상의 커피링 형성 여부는 도립 현미경 (Nikon Eclipse Ti-E)을 이용해 관찰하였고 CCD 카메라로 이미지를 캡처하였다. 또한, 커피링 이미지는 스마트폰 카메라 (iPhone 8) 또는 휴대용 마이크로 렌즈 (60X Clip-On Microscope Magnifier Universal Lens, KINGMAS)를 이용해 얻었다. 링 패턴의 픽셀 강도 값에 대한 히스토그램은 Image J를 사용하여 분석하였다.

1-5. 판독을 위한 이미지 처리 알고리즘

본 발명자들은 상기 분석을 통해 형성된 커피링 패턴의 자동적 디지털 판독을 위해 Ubuntu 18.04 LTS 및 QTcreator 5.12.2를 사용하여 이미지 분석 알고리즘을 개발하였다. Linux 환경의 C++ 이미지 처리 라이브러리에는 중립 네트워크인 OpenCV 4.0.0을 사용하였다. 이미지 처리 전에 모든 입력 이미지는 균일한 검출 성능 (500 x 500 픽셀)을 위해 크기를 조정하였다. 알고리즘은 1) 원본 이미지를 크기를 조정해 흐리게 처리하여 신호 수준을 보정하고, 2) CMO (close-minus-open) 이미지를 획득하여 주변 배경 신호와 관련된 미립구 패턴을 증폭시키고, 3) 강조 및 캐닝하여 임계 값에 따라 이미지를 확인하였다. 최종 판독 결과, 커피링 패턴이 감지되어 '음성'으로 판별되면 이미지에 파란색 링이 나타나고, 커피링 형성이 억제되어 결과가 '양성'으로 판단되면 링이 없는 것으로 확인되었다.

1-6. 통계분석

모든 정량적 측정에 대해서는 통계 분석을 중복으로 수행하였다. 모든 정량적 데이터 값은 평균 ± 표준으로 표시하였다. Student's t 검정을 사용해 p 값을 측정하여 통계적 유의성을 결정하였으며, p 값이 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 간주하였다(n.s > 0.05, ^* p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).

실시예 2. 커피링 현상 억제에 의한 표적 DNA의 검출

본 발명자들은 항생제 내성균을 검출하기 위한 신속하고 간단한 진단 분석법을 개발하기 위해 일상적으로 나타나는 현상인 커피링 현상을 적용해보고자 하였다. 이를 위해, 특정 캡처 DNA 올리고 뉴클레오타이드와 표적 핵산의 상보적 결합 시 미립구의 응집을 유도하는 미립구 기반 다가 혼성화 분석을 설계하였다. 소수성 표면상에 미립구가 침착되면 표적 핵산의 존재 여부에 따라 뚜렷한 공간적 패턴이 생성된다. MRSA 표적 DNA와 해당 캡처 DNA의 특이적 결합은 미립구의 이동을 억제하고 커피링의 형성을 억제하여 병원균에 대해 양성으로 판별되는 테스트 결과로 이어진다.

본 발명자들은 먼저 표적 핵산 검출을 위한 비-변형 커피링 (u-CoRi) 분석의 유용성을 입증하기 위해, MRSA의 합성 DNA를 이와 상보적인 캡처 DNA가 고정된 미립구 (u-캡처 DNA 미립구)와 혼합하고 침착 패턴을 조사하였다. 보다 구체적으로, 도 2a에 도시한 바와 같이 MRSA 유래 항생제 내성 유전자인 mecA의 mRNA 내 특정 영역을 선정하고, 표적 mRNA 염기서열의 5' 및 3' 말단에 혼성화하는 두 개의 서로 다른 캡처 DNA를 설계하였다. MRSA를 표적하는 u-캡처 DNA 미립구는 2개의 캡처 DNA 올리고뉴클레오티드 각각에 의한 폴리스티렌 미립구의 기능화를 통해 제조되었으며, 결과적으로 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 ~8.04fg의 캡처 DNA가 표면에 고정된 미립구가 제조되었다. 이후 MRSA의 합성 표적 DNA와 미립구 현탁액을 첨가하고 커버슬립에 떨어뜨린 다음 증발시키면, 공간적 패턴을 육안으로 확인할 수 있다.

상기 방법으로 현미경을 통해 침착 패턴을 관찰한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 표적 DNA가 125nM 농도 이상으로 처리된 경우 커피링 현상이 분명하게 억제되는 것으로 나타났다. 즉, 표적 DNA와 미립구를 혼합 및 배양 시 각 표적 DNA 가닥은 두 개의 서로 다른 u-캡처 DNA 미립구에 혼성화되고 미립구에 있는 캡처 DNA의 다가원성은 응집을 유도한다. 결과적으로, 미립구가 액적 주변으로 이동하는 것을 저해하여 특징적인 링 패턴의 형성이 억제된다. 한편, E. coli 16S rRNA의 특정 영역 유래 대조군 DNA를 추가한 경우에는 모든 농도에서 온전한 링 패턴의 형성이 명확하게 나타났으며, 이는 캡처 DNA와 표적 DNA의 상보적 결합에 의한 분석의 특이성을 입증하는 결과이다. 더욱이, 구체적으로 확대된 이미지를 살펴보면 MRSA 표적 DNA의 경우 중심에서 조밀하게 패킹된 미립구가 관찰되며 125nM 이상의 농도에서 커피링의 억제를 확인할 수 있고, 이에 반해 E. coli 대조군 DNA는 모든 농도에서 밀도가 일관성게 관찰되었다. 액적의 주변에서는 E. coli 대조군 DNA의 경우 두껍고 조밀한 미립구의 고리가 나타난 반면에, MRSA 표적 DNA의 경우에는 125nM 이상의 농도 범위에서 미립구가 흩어져 링 패턴을 관찰하기 어려웠으며, 최고 농도의 표적 DNA ~2500nM)에서 커피링의 부분적인 회복이 관찰되었다.

나아가 본 발명자들은 u-CoRi 분석의 검출 범위를 결정하기 위해, 매우 높은 농도의 MRSA 표적 DNA를 u-캡처 DNA 미립구에 첨가하고 링 패턴으로의 침착 여부를 관찰하였다. 그 결과 20mM의 표적 DNA 최고 농도에서 커피링 패턴이 거의 완전히 회복된 것으로 나타났다. 이는 미립구에 고정된 캡처 DNA 수에 비해 표적 DNA의 몰농도 과잉 때문일 수 있으며, 오히려 캡처 DNA에 대한 포화 결합에 의해 교차 결합이 방해된다. 따라서 이러한 결과에 따르면 검출 가능한 농도 범위는 캡처 DNA에 대하여 표적 DNA의 농도가 약 2배 정도인 것으로 나타났다. 또한, 이중 가닥 Qubit 분석을 이용하여 표적 DNA와 u-캡처 DNA 미립구의 혼성화 정도를 정량화하였으며, 표적 DNA 농도가 증가함에 따라 혼성화된 이중 가닥 DNA의 양이 비례적으로 증가함을 확인하였다. 혼성화된 DNA의 총량은 200nM에서 미립구 mg 당 0.065pg이었는데, 이는 고농도 (2mM에서 0.466pg/mg, 20mM에서 4.483pg/mg)보다 훨씬 낮았지만 가장 강력한 커피링 형성 억제를 나타냈다. 상기 결과처럼 병원균의 검출 및 감염 진단을 위해 대부분의 경우에는 증폭 후에도 거의 20mM 수준에 도달하지 않는 미량의 표적을 가진 표본이 포함되는 것으로 보고되어 있다.

실시예 3. 등온증폭을 위한 MRSA 표적용 RCA 프로브의 설계 및 검증

MRSA 검출을 위해 상기 실시예 2의 u-CoRi 분석에 사용된 mecA의 특정 mRNA 서열에 대하여 RCA를 위한 padlock DNA 프로브를 설계하였다. 상기 padlock 프로브는 도 3a에 도시된 바와 같이 표적 mRNA 또는 DNA가 상보적으로 결합하면 T4 리가아제에 의해 원형 형태로 연결된다. MRSA의 검출 용도로 설계된 padlock 프로브는 NUPACK 열역학 분석 소프트웨어를 이용하여 분석 및 최적화되어 표적 인식을 방해하지 않고 비특이적인 혼성화 및 의도하지 않은 2차 구조 형성을 최소화하였다. padlock 프로브가 T4 리가아제에 의해 결찰 (ligation)되는 경우, RCA 프라이머 및 phi29 중합효소는 단방향 복제를 통해 각 가닥 내에서 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 긴 가닥의 DNA를 생성하게 된다. 본 실시예에서 MRSA용 padlock 프로브의 결찰 여부는 먼저 MRSA용 padlock 프로브 DNA의 양단에 상보적으로 결합하는 합성 표적 DNA와 결찰 반응을 수행한 후 결찰된 padlock 프로브를 엑소뉴클레아제 I으로 처리하여 검증하였다. 엑소뉴클레아제 I 처리 후 겔 전기영동을 실시한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 MRSA 표적 DNA를 첨가했을 때 원형화된 padlock 프로브 DNA가 손상되지 않았음을 알 수 있었다. 이에 반해, 음성대조군인 E. coli 및 P. aeruginosa 16S rRNA DNA를 각각 첨가한 경우에는 분해된 DNA 산물의 번짐이 관찰되었다. 이는 padlock 프로브 DNA 말단에 있는 3'-하이드록실(hydroxyl) 그룹의 노출에 의한 분해에 민감하기 때문이다.

다음으로 RCA에 의한 등온증폭 여부를 검증하기 위해 phi29 중합효소와 RCA 프라이머를 첨가하고 결찰된 padlock 프로브 DNA를 사용하여 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 RCA 용액을 주위 온도에서 30분 동안 배양하고 전기영동을 수행한 결과 겔 상단에 강렬한 밴드가 나타나는 것을 통해 MRSA에 대한 RCA 산물로써 긴 단일 가닥 DNA가 생성된 것을 확인하였다. 반면에 음성 대조군 E. coli 및 P. aeruginosa에 대해 RCA 반응을 수행한 경우에는 증폭 산물이 생성되지 않았다. 상기 결과를 통해 확인한 RCA 과정을 통한 표적 핵산의 특정 분자적 증폭은 커피링 분석과 통합될 경우 상이한 RNA 서열의 복잡한 혼합물을 포함하는 박테리아 샘플을 진단할 경우 높은 선택성과 민감도를 달성할 수 있다. 또한, 등온증폭에 의한 긴 가닥의 표적 DNA 합성은 증폭된 각 DNA 가닥이 캡처 DNA 미립구 (i-capture DNA 미립구)에 대한 다중 결합 부위를 제공하여 커피링의 더욱 강력한 억제를 위한 미립구의 가교 밀도를 증가시킬 수 있다. 마지막으로, RCA 산물의 단일 가닥 특성은 LAMP와 같은 다른 등온증폭 절차를 사용할 때 필요한 DNA 변성에 대한 추가 단계를 배제하여 분석을 더욱 단순화할 수 있는 장점이 있다.

실시예 4. MRSA 검출을 위한 i-CoRi 분석 방법의 확립

본 발명자들은 MRSA의 검출을 위해 등온증폭 및 커피링 형성 분석을 통합하여 도 4a에 도시된 바와 같은 1-스텝 i-Cori 분석 (1-step i-CoRi assay) 방법을 확립하고자 하였다. 구체적으로, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 단일 캡처 DNA를 설계하고 미립구(i-캡처 DNA 미립구)에 고정하여 MRSA 표적 DNA의 존재 하에 RCA 산물이 특이적으로 생성되고, 생성된 단일 가닥 DNA 내 반복된 상보적 서열에 상기 미립구에 고정된 캡처 DNA와 혼성화 되도록 하였다. 본 i-CoRi 분석에 이용된 프로브 및 표적 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.

Type of probe or target	Length (bases)	서열 (5’ -> 3’)	서열번호
Padlock probe DNA for MRSA (mecA)	115	ACCTGAGCCATATTGCCAATTCGAGTTCGAATTGGACCCTACTTACCCATTCTTACCCTACACCTTCACCCTCACCCTCATAACTTAACCCGGAACCGGACTCGTGGATAGCAGT	1
RCA primer	25	AAAAAGGGTAAGAATGGGTAAGTAG	2
RCA amplicon for MRSA	115	ACTGCTATCCACGAGTCCGGTTCCGGGTTAAGTTATGAGGGTGAGGGTGAAGGTGTAGGGTAAGAATGGGTAAGTAGGGTCCAATTCGAACTCGAATTGGCAATATGGCTCAGGT	3
Capture DNA for MRSA	25	AAAAATCACCCTCACCCTCATAACT	4
Target sequence for MRSA (mecA)^a	65	TGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTCAT	5
E. coli control (16S rRNA)^b	69	GGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCC	6
P. aeruginosa control (16S rRNA)^c	72	GGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATATCCTTGCGGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGT	7

a, b, c: u-CoRi 분석을 위한 합성 표적 DNA로 사용되는 동일한 표적 서열; 뿐만 아니라 i-CoRi 분석을 위한 표적 DNA 및 박테리아 mRNA (T> U).

먼저, 1-스텝 i-Cori 분석 방법을 확립하기 전에 표적 DNA의 존재 하에 RCA 반응을 수행한 후 커피링 형성을 위해 i-capture DNA 미립구를 순차적으로 추가하는 2단계 절차를 시도하였다(2단계 i-CoRi 분석). RCA 산물과 i-캡처 DNA 미립구의 혼성화는 Qubit 분석을 이용하여 미립구상의 이중 가닥 DNA를 정량화하여 결정하였다. 측정 결과, 더 적은 양의 분석 용액 (총 20ml 중 2ml)을 이용하면 대조군 (E. coli의 경우 0.32ng/미립구)에 비해 평균값 (MRSA의 경우 1.34ng/미립구)이 4.15배 더 높은 것으로 나타났으나, 통계적으로 유의하지는 않았다. 전체 분석 용액 (총 2ml 중 2ml)을 이용한 경우에는 음성 대조군인 E. coli (1.10ng / 미립구)에 비해 MRSA의 경우 1.62배 더 높은 혼성화 정도 (1.78ng/미립구)를 보였으며, 이는 통계적으로 유의하였다. 또한, 음성 대조군은 E. coli의 경우 62%, P. aeruginosa의 경우 55%로 높은 비특이적 신호를 나타냈다. 나아가 2단계 i-CoRi 분석에 의한 미립구의 침착을 현미경으로 관찰한 결과, MRSA 표적 DNA에 대하여 커피링 형성이 억제된 것을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 결과를 기반으로, RCA 반응과 커피링 기반 분석을 통합하여 한 단계 절차로 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 MRSA에 대하여 훨씬 더 높은 혼성화 증가가 감지되었으며 (3.95pg/미립구), 이는 음성 대조군인 E. coli 보다 4.2배 더 높은 것으로 나타났다(0.93 pg/미립구). 또한, 상기 2단계 분석에서와 달리 1단계 i-CoRi 분석에서 통계적 유의성이 향상되었다. 이러한 1-단계 i-CoRi 분석을 위한 i-캡처 DNA 미립구의 결합에서 더 높은 효율성은 증폭 중에 부분적으로 형성된 단일 가닥 RCA 산물과 캡처 DNA의 즉각적인 혼성화 때문일 수 있다. 2단계 i-CoRi 분석의 경우, 혼성화 과정 전에 RCA를 통해 미리 생성된 긴 단일 가닥 DNA가 i-캡처 DNA 미립구와의 혼성화를 방해할 수 있는 2차 구조를 형성할 가능성이 더 높다. 1-단계 i-CoRi 분석에 의한 미립구의 침착을 현미경으로 관찰한 결과, 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이 MRSA 표적 DNA의 경우 커피링 효과의 현저한 억제로 인해 중심에서 0.75mm의 거리 내 액적의 내부 부분에서 미립구가 조밀하게 패킹되어 있음을 확인하였다. 음성대조군인 E. coli 및 P. aeruginosa DNA의 경우에는, 액적 전체 영역에 흩어져있는 미립구와 함께 주변에서 링 패턴이 명확하게 관찰되었다. 액적 주변을 면밀히 관찰한 결과 MRSA의 경우 미립구가 거의 존재하지 않는 것으로 나타난 반면 (mm² 당 1개 미립구 미만), 음성대조군의 경우 미립구가 훨씬 더 높은 밀도로 나타났다 (E. coli의 경우 mm² 당 미립구 31개, P. aeruginosa의 경우 mm² 당 미립구 27개). 또한, 1 단계 i-CoRi 분석을 통해 단지 2.6 pmol의 표적 DNA를 이용하여 커피링의 명확한 형성 억제를 통해 미량의 표적 핵산을 검출할 수 있음을 입증했다. 더욱이, 현미경 이미지에서 액적 중앙을 가로 지르는 수평선을 따라 회색 값 강도의 히스토그램을 생성하면 분석 결과를 정량적으로 기록하고 분석할 수 있다. MRSA 표적 DNA의 경우, 도 4d에서 볼 수 있는 바와 같이 조밀하게 패킹된 미립구의 존재로 인해 액적 중앙 근처의 국부적인 범위에서 회색 값 (흰색 배경 신호에 대해 보정됨)이 급격히 낮게 나타났고 (15.3%), 액적의 나머지 부분에서는 > 52.1%의 중간 값이 나타났다. 음성 대조군 DNA인 E. coli 및 P. aeruginosa의 경우에는, 각각 액적의 전체 영역에 걸쳐 회색 값이 32.6-47.8%으로 나타났으며, 14.9% 및 15.3%의 급격한 낮은 값을 나타내는 부분에서 커피링 형성을 확인하였다.

실시예 5. 박테리아 핵산에 대하여 i-CoRi 분석을 통한 MRSA 내성 검출

본 발명자들은 배양된 MRSA에서 전체 RNA를 추출해 박테리아 샘플을 제조하고, 이를 이용해 항균 저항성 검출을 위한 1단계 i-CoRi 분석의 실행 가능성을 검증하였다. 구체적으로, mecA 유전자에 대한 padlock 프로브를 사용하여 MRSA 전체 RNA에 대해 결찰 및 RCA 반응을 수행하고 겔 전기영동으로 분석하였다. 그 결과, mecA mRNA가 포함된 MRSA 전체 RNA에 대해서만 긴 DNA 가닥이 합성되어 표적 의존적인 padlock 프로브의 결찰에 이어 RCA 반응이 유도된 것을 알 수 있었다. 이에 반해, 음성 대조군인 MSSA 유래 전체 RNA 샘플에 대해서는 상기 padlock 프로브의 결찰 및 RCA 반응이 유도되지 않아 어떠한 RCA 산물도 생성하지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 박테리아 전체 RNA와의 RCA 반응을 검증 한 후 i-capture DNA 미립구를 사용하여 1-step i-CoRi 분석을 수행하고 침착 패턴을 확인하였다.

미립구의 패턴을 현미경으로 관찰한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 MRSA 전체 RNA의 경우에는 음성대조군인 MSSA와 비교해 커피링 형성이 현저하게 억제된 것으로 나타났다. 이러한 효과는 MRSA 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 RCA 산물인 긴 단일 가닥 DNA에 의한 것이며, 상기 생성된 단일 가닥 DNA는 i-캡처 DNA 미립구에 결합하여 가교가 발생하고 액적 내에서 외부 모세관 흐름에 의한 이동을 저해한다. 액적 주변의 확대된 이미지는 MSSA 전체 RNA의 경우 온전하게 링이 형성된 것과 비교하여 MRSA 전체 RNA의 경우 링 패턴이 현저히 얇은 것을 명확하게 보여준다. 단, 커피링의 형성 억제 효과는 합성 표적 DNA를 사용하여 1단계 i-CoRi 분석을 실시한 결과에 비해 상기 세균의 전체 RNA를 사용하였을 때 상대적으로 약하게 나타났는데, 이것은 i-캡처 DNA 미립구에 대한 비특이적인 결합으로 상기 미립구와 표적의 혼성화를 방해할 수 있는 다른 유전자가 박테리아 RNA 전 사체의 이종 혼합물의 존재하기 때문일 수 있다. 따라서 혼합된 샘플 조건은 입자와 액체-고체 계면 간의 상호작용의 변화에 의해 증발 중 미립구의 침착에도 영향을 미칠 수 있다.

나아가 상기 결과 이미지의 회색 값에 대한 히스토그램 분석 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 MRSA 전체 RNA의 경우 액적 내부 전체에 간헐적으로 감소된 강도 값 (흰색 배경 신호의 최대 70.6 %)의 급격한 스파이크가 나타났지만 상대적으로 부드러운 감소 값 (<33.7 %)이 중앙에 나타나고 점차 바깥쪽으로 갈수록 강도가 증가했다. MSSA 대조군의 경우에는 주변부에서 55.7%의 깊은 하향 스파이크가 나타났고, 반면에 MRSA의 경우 변동은 20.4% 이내로 유지되었다. 이러한 결과는 1단계 i-CoRi 분석이 박테리아 유래 핵산을 포함한 복잡한 샘플에 적용될 수 있음을 보여주며, 진단을 위한 분석의 범용 가능성을 시사하는 것이다.

실시예 6. 스마트폰 카메라 및 분석을 이용한 이미지 획득

본 발명자들은 모바일 장치를 사용하여 결과를 기록할 수 있음을 입증하기 위해 스마트폰 카메라 (iPhone 8)를 사용하여 1단계 i-CoRi 분석 결과 이미지를 수집하고 분석하였다. 구체적으로, 비변형 스마트폰 카메라 또는 클립 온 현미경 돋보기 범용 렌즈(clip-on microscope magnifier universal lens)가 지원되는 스마트폰을 사용하여 분석 결과 이미지를 캡처하였다. 그 결과, 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이 확대경 렌즈를 사용하거나 사용하지 않고 획득한 이미지는 스마트폰 디스플레이에서 원본 이미지로 명확하게 시각화할 수 있으며 MRSA 표적 DNA의 패턴은 음성 대조군 DNA인 E. coli 및 P. aeruginosa의 패턴과 구별되었다. 또한, 확대경 렌즈를 사용하는 목적은 더 높은 해상도의 이미지를 얻기 위한 것이었지만 관찰 결과 비변형 휴대폰을 사용하는 것에 비해 단지 이미지의 품질이 약간 향상된 것으로 판단되었다. 상기 확대 렌즈가 적용되거나 적용되지 않은 두 가지 방법을 사용하여 스마트폰 이미지를 관찰한 결과, 현미경 이미지에서 관찰된 것과 전반적으로 유사한 패턴이 나타났지만 다양한 배경 및 획득 모드로 인해 패턴의 색상 속성 및 강도가 변화하였다. 그러나 중요한 것은 실제 링 패턴이 더 약해 보였지만 여전히 액적 내부 영역과 액적 외부 영역의 대비에 의해 간접적으로 쉽게 구별될 수 있다는 것이다. 나아가 이미지 분석을 통해 침착된 미립구 패턴의 히스토그램도 얻었으며, 도 6b에 나타낸 바와 같이 MRSA 샘플의 경우 외부 영역에 비해 액적의 내부 코어 영역에서 회색 값이 지속적으로 증가된 수준 (4.5 배 증가)을 나타내었다. 음성 대조군인 E. coli 및 P. aeruginosa의 경우에는 액적의 바깥 부분에 대비해 내부 코어 영역에서 중간 회색 값 (<1.33 배)을 나타냈다. E. coli와 P. aeruginosa의 경우 주변부에서는 고리 패턴의 특징인 급격하고 국부적인 증가가 나타났지만 MRSA의 경우에는 배경과 유사한 수준으로 나타났다. 비록 현미경 이미지에 비해 스마트폰 이미지의 해상도가 낮아 실제 패턴과의 불일치가 관찰되었지만 1단계 i-CoRi 분석에서 미립구의 공간 패턴을 명확하게 시각화하고 MRSA와 음성 대조군을 구별할 수 있음을 확인하였다. 일반적으로 사용되는 모바일 장치로 i-CoRi 분석 데이터를 기록하고 육안으로 관찰할 수 있는 가능성은 일반적으로 사용되는 진단 테스트로서 본 발명의 분석 방법을 광범위하게 적용할 수 있는 큰 이점을 제공한다. 단, 이미지 수집에 사용되는 장치에 따라 기록된 패턴의 변화로 인해 의사 결정 과정에서 편견 없이 결과를 해석하기위한 자동 판독 시스템이 필요하다.

실시예 7. 시각화된 링 패턴의 간단한 판독을 통한 진단

본 발명에 따른 1단계 i-CoRi 분석을 강하고 표준화된 진단 방법으로써 일반적으로 이용하기 위해서는, 분석을 통해 형성된 커피링 패턴을 해석하기 위한 간단한 판독 인터페이스가 실질적인 적용 가능성을 크게 향상시킨다. 따라서 본 발명자들은 현미경 또는 표준 저품질 이미지의 시각화된 링 패턴을 체계적으로 처리하기 위해 간단한 판독 알고리즘을 개발하였다. 먼저 도 7의 (a)에 나타낸 바와 같이 알고리즘 개발을 위해 MRSA 표적 DNA를 사용하여 1단계 i-CoRi 분석 결과에서 얻어진 현미경 이미지를 순차적으로 처리하여 커피링의 유무를 구별하기 위한 임계값을 결정하였다. 보다 구체적으로, 원본 이미지를 흐리게 처리 (Blurred)하여 신호를 보정하고 대비를 높이기 위해 강조한 다음 (Emphasized), 병원균의 존재 여부를 양성 또는 음성으로 최종 판독하기 위해 캐닝하여 (Canned) 보정된 링 패턴을 결정하였다.

이에, 박테리아 전체 RNA 샘플에 대해 i-CoRi 분석을 실시하여 얻어진 이미지를 상기 확립된 판독 알고리즘에 적용하였다. 그 결과, 도 7의 (b)에서 볼 수 있는 바와 같이 MRSA 샘플의 경우 링이 없는 것을 통해 양성으로, E. coli 샘플의 경우에는 링의 존재를 확인함으로써 음성으로 명확하게 판독되었다. 나아가 본 발명자들은 i-CoRi 분석 결과를 스마트폰 카메라로 촬영하여 얻은 이미지를 상기 판독 알고리즘에 적용하였다. 그 결과, 도 7의 (c)에 나타낸 바와 같이 MRSA 샘플의 경우 최종 판독 결과 양성으로 감지하고 E. coli 샘플의 경우에는 음성으로 감지할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 1단계 i-CoRi 분석을 실시하고 커피링 패턴을 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 쉽게 판독하여 진단 결정을 내릴 수 있음을 보여주는 것이다. 상기에서 확인한 바와 같이 모바일 장치에서 얻은 표준 품질 이미지에서도 결과를 판독할 수 있는 능력은 i-CoRi 분석의 적용 범위을 넓히는데 큰 이점을 제공할 수 있다. 감염 진단에는 자원이 부족한 환경 (예: 농촌지역, 가정)에서 병원체를 빠르게 검출해야하는 상황이 있을 수 있으므로 본 발명은 매우 유용하고 실질적으로 실행 가능한 플랫폼을 제시하는 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Composition for detection of target nucleic acid based on isothermal amplification and coffee ring effect, and detection method thereof <130> PD20-233 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Padlock probe DNA for MRSA (mecA) <400> 1 acctgagcca tattgccaat tcgagttcga attggaccct acttacccat tcttacccta 60 caccttcacc ctcaccctca taacttaacc cggaaccgga ctcgtggata gcagt 115 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCA primer <400> 2 aaaaagggta agaatgggta agtag 25 <210> 3 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCA amplicon for MRSA <400> 3 actgctatcc acgagtccgg ttccgggtta agttatgagg gtgagggtga aggtgtaggg 60 taagaatggg taagtagggt ccaattcgaa ctcgaattgg caatatggct caggt 115 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Capture DNA for MRSA <400> 4 aaaaatcacc ctcaccctca taact 25 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence for MRSA (mecA) <400> 5 tggctcaggt actgctatcc accctcaaac aggtgaatta ttagcacttg taagcacacc 60 ttcat 65 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli control (16S rRNA) <400> 6 ggaggaaggg agtaaagtta atacctttgc tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg 60 gctaactcc 69 <210> 7 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. aeruginosa control (16S rRNA) <400> 7 ggaggaaggg cagtaagcta atatccttgc ggttttgacg ttaccaacag aataagcacc 60 ggctaacttc gt 72

Claims

표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하는 프로브 (probe);
회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA)을 위한 프라이머 (primer); 및
캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구를 포함하는, 표적 핵산 검출용 조성물로서,
상기 표적 핵산의 농도는 10^-13mol 내지 10^-9mol인, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 리가아제 (ligase) 및 DNA 중합효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 닉 (nick)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 캡처 DNA는 회전환 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적은 박테리아, 바이러스 또는 진균인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 박테리아는 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적 핵산의 검출은 커피링의 존재 여부를 확인함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출용 키트.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출 센서.
분석장치가 입력 이미지를 입력받는 단계;
상기 분석장치가 상기 입력 이미지에 커피링이 있는지 판단하는 단계; 및
상기 분석장치가 상기 커피링 존재 여부로 표적 핵산이 존재하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하되,
상기 입력 이미지는 피검자 유래 생물학적 시료를 제11항의 키트에 첨가하고 반응시켜 얻어진 반응 용액을 비친수성 표면에 떨어뜨린 후 증발되는 상태에 대한 영상을 포함하는 것이고,
상기 반응 용액은 등온증폭 반응 및 캡처 DNA가 표면에 결합된 미립구와 표적 핵산의 결합반응이 동시에 일어난 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 검출방법.
제13항에 있어서,
상기 분석장치는 상기 입력 이미지에 커피링이 형성되지 않은 경우 표적 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 검출방법.
제13항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 기관, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 검출방법.