CN107873059A - 利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法，更详细地涉及包括对核酸进行扩增及标记后，利用纳米粒子捕获，来进行离心分离的步骤的核酸检测方法及利用其方法的核酸检测用试剂盒。本发明可通过不包括分离步骤的核酸检测法，能够进一步迅速、简单、敏感、高可靠度地判别与特定疾病相关的阴性、阳性的判断从而有效。

Description

利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法
技术领域
本申请主张于2015年07月13日提出的韩国专利申请第10-2015-0099378号及2015年08月27日提出的韩国专利申请第10-2015-0121109号的优先权，上述申请的说明书整体作为本申请的参考文献。
本发明涉及利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法，更详细地涉及包括对核酸进行扩增及标记后，利用纳米粒子捕获，来进行离心分离的步骤的核酸检测方法及利用其方法的核酸检测用试剂盒。
背景技术
在多领域中超高速核酸检查的必要性逐渐增加。核酸检查最终以通过疾病的早期发现降低总医疗费用的目的来使用，并期待以后用于病原菌检查、基因分型、癌症诊断等的与各种核酸相关的对可用作同时分析、需要、增加和现场检查用的产品的需要急增。为了解决上述问题，需要多进行与基因分型及癌症相关的特异性和敏感度高的脱氧核糖核酸/核糖核酸(DNA/RNA)标记的开发。为了得到广泛利用核酸检查，需要解决的很多问题，但是期待核酸检查支配诊断市场的时代即将到来，这只是时期的问题，为了提前其时期，开发用于低费用的核酸检查的装置和有效的脱氧核糖核酸(DNA)标记成为研究的中心。
核酸检查需要满足分析有效性(analytical validity)，如敏感度、特异性、精密性、准确性等；临床有效性(clinical validity)，如临床敏感度、特异性、阴性预测率(negative predictive value)等；以及有用性(clinical utility)。对核酸检查的对象大致分为两种是来源于感染于人体的微生物的核酸和直接来源于人体的核酸。前者作为诊断是否感染的检查占有检查市场的80％以上。后者为对与疾患的诱发和治疗相关的核酸进行分析的基因检查(genetic test)，市场占有率小于20％，但是展望潜在性价值和市场性非常高。
在各种核酸检测方法中，利用纳米粒子的核酸检测作为可划时代的改善作为利用现有负电荷形态的树脂(带负电荷的聚阴离子(negative charged polyanion))及二氧化硅膜(silica membrane)技术的方法的缺点的低速、高费用方法的下一代技术，竞争性地开发如下系统：制备纳米粒子，并进行可捕获核酸的涂敷处理，来与对象核酸分子选择性地结合，从而检测核酸。作为现有技术，在美国专利US20140100131中作为检测目的基因的方法使用磁性粒子，美国专利US20100009383涉及用于检测生物体分子的方法，可通过利用磁性粒子回收靶物质后，进行离心分离，来检测凝集的靶物质。但是现有的方法存在需要添加脱氧核糖核酸探针或抗体的不便，还需要分离及清洗过程，需要与进一步迅速的核酸检测方法相关的发明。
对此，本发明人通过使用扩增的目标核酸和纳米粒子，来制备凝胶卡，并例证对此进行离心分离后可用肉眼/荧光确认，并确认这种核酸检测方法在检测与特定相关的特定核酸中具有显著的效果。因此，本发明通过不包括分离步骤的核酸检测法，发明了可迅速、简单、敏感、高可靠度地判别与特定疾病相关的阴性、阳性的核酸检测方法及核酸检测用试剂盒。
发明内容
技术问题
本发明提供快速准确检测核酸的试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供用于检测核酸的纳米粒子复合物。
本发明的另一目的在于，提供用于检测纳米粒子复合物的凝胶卡。
本发明的还一目的在于，提供快速、准确地检测核酸的方法。
解决问题的方案
为了解决上述的本发明的问题，本发明提供核酸检测用试剂盒，上述核酸检测用试剂盒包含：引物集，与所要检测的核酸特异性结合；捕获纳米粒子；以及凝胶卡，由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成。
本发明提供可检测的纳米粒子复合物，上述可检测的纳米粒子复合物包含捕获或结合有用于目标核酸检测用分析(assay)的目标核酸的纳米粒子。
本发明提供由用于纳米粒子复合物的玻璃珠(glass bead)成分和凝胶成分依次层叠而成的凝胶卡。
本发明涉及包含捕获或结合有用于目标核酸检测用分析(assay)的目标核酸的纳米粒子的可检测的纳米粒子复合物的用途。
本发明还涉及由用于检测上述纳米粒子复合物的玻璃珠(glass bead)成分和凝胶成分依次层叠而成的凝胶卡的用途。
本发明还提供利用纳米粒子的核酸检测方法，上述利用纳米粒子的核酸检测方法包括：步骤(a)，利用与目标核酸特异性结合的引物集扩增目标核酸；步骤(b)，通过向上述步骤(a)中扩增的核酸添加纳米粒子，来使核酸捕获于纳米粒子或与纳米粒子相结合；步骤(c)，将在上述步骤(b)中核酸捕获于纳米粒子或核酸与纳米粒子相结合而成的复合物放入凝胶卡容器；步骤(d)，对在上述步骤(c)中制备的混合物进行离心分离；以及步骤(e)，与对照组比较凝胶卡容器内沉淀物的位置。
根据本发明的优选再一一实施例，上述步骤(a)的引物集可以为生物素-标记正向引物(biotin-labeled forward primer)和荧光标记逆向引物(fluorescence-labeledreverse primer)。
根据本发明的优选再一一实施例，在上述步骤(a)中，可利用聚合酶链式反应(PCR)或等温扩增反应进行扩增。
上述等温扩增反应可以为选自由依赖解旋酶的扩增(HDA,Helicase-DependentAmplification)、重组酶聚合酶扩增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)、滚环扩增(RCA,Rolling Circle Amplification)、环介导等温扩增(LAMP，Loop mediatedisothermal amplification)、依赖核酸序列的扩增(NASBA，Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification)、转录介导的扩增(TMA，Transcription MediatedAmplification)、核糖核酸的信号介导扩增(SMART，Signal Mediated Amplification ofRNA Technology)、链置换扩增(SDA，Strand Displacement Amplification)、等温多重置换扩增(IMDA，Isothermal Multiple Displacement Amplification)、单引物等温扩增(SPIA，Single Primer Isothermal Amplification)及依赖解旋酶的环形扩增(cHDA，circular Helicase-Dependent Amplification)组成的组中的一种方法进行上述等温扩增反应，优选地，可利用依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、、环介导等温扩增的方法进行，更优选地，可通过依赖解旋酶的扩增或滚环扩增的方法进行。
根据本发明的优选另一一实施例，本发明的纳米粒子可以为选自磁性粒子(magnetic bead)、金(Au)纳米粒子、银(Ag)纳米粒子、铂金(Pt)纳米粒子、量子点(Quantumdot)、上转换纳米粒子(upconversion nanoparticle，UCNP)、石墨烯(graphene)-纳米粒子复合物、染色纳米粒子(color dyed particles)及胶乳(latex)纳米粒组成的组中的一种。
并且，本发明的特征在于，上述纳米粒子的表面利用选自由抗体(例如，如异羟基洋地黄毒苷/抗-异羟基洋地黄毒苷抗体(digoxigenin/anti-digoxigenin antibody)、Cy3/抗-Cy3抗体(Cy3/anti-Cy3antibody)等等价物)、适体(aptamer)及寡聚核苷酸组成的组中的一种进行涂敷处理，上述抗体能够通过抗原-抗体反应与能够捕获核酸的抗生物素蛋白(avidin)、胺(amine)、链霉亲和素(streptavidin)、引物相结合的抗原相结合。
在本发明中，凝胶成分可以为选自由免疫球蛋白G-琼脂糖(IgG-agarose)、琼脂糖(agarose)、琼脂、醋酸纤维素(cellulose acetate)及聚丙烯酰胺(polyacrylamide gel)组成的组中的一种。
本发明的核酸检测方法还可包含对增强子进行处理的步骤，并且无需包含于现有方法的分离过程及清洗过程。
发明的效果
本发明涉及利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法，更详细地涉及包括对核酸进行扩增及标记后，利用纳米粒子捕获，来进行离心分离的步骤的核酸检测方法及利用其方法的核酸检测用试剂盒。本发明可通过不包括分离步骤的核酸检测法，能够进一步迅速、简单、敏感、高可靠度地判别与特定疾病相关的阴性、阳性的判断从而有效。
附图说明
图1为示出本发明的核酸检测方法的示意图。
图2为示出具体表示核酸检测方法的示意图和基于使用利用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)修饰法标记的逆向引物的核酸检测方法的阳性/阴性结果的照片。
图3为表示基于使用利用亚磷酰胺法标记的逆向引物的核酸检测方法的阳性/阴性结果的照片。
图4为表示基于离心分离时间的核酸检测结果的照片。
图5为表示基于是否使用增强子的核酸检测结果的照片。
图6为示出相对于进行人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸检测的结果，可利用肉眼或荧光进行识别的照片。
图7为表示测定基于脱氧核糖核酸浓度的检测敏感度的结果的照片。
图8利用人乳头瘤病毒临床检测体进行本发明的核酸检测法的照片(1～3号管：人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸阴性样品、4～6号管：人乳头瘤病毒(HPV)脱氧核糖核酸阳性样品)。
具体实施方式
如上所述，在诊断与现有的疾病相关的特定核酸的阴性及阳性的情况下，存在通常需要4小时至6小时的长时间，并且降低准确度的问题。因此，难以向阳性患者快速下处方。
并且，在美国公开专利2014-0100131的情况下，相对于检测目的基因的方法使用抗体，作为纳米粒子必须仅使用磁性粒子，并且还包括分离步骤，从而难以快速进行检测。
对此，本发明人通过扩增目标核酸，并且将其与纳米粒子及凝胶成分一同注入于凝胶卡后，进行离心分离的简单的方法，研究了迅速、准确检测疾病相关特定核酸的方法。
如下定义在本发明中使用的术语。
在本发明中“核酸(nucleic acid)”是指任意长度的核苷酸的聚合物，并包含脱氧核糖核酸及核糖核酸(RNA)。
在本发明中“捕获或结合(capture)”是可以为使一种以上的制剂的至少一部分(或与上述制剂相结合的链接部)通过捕集、吸附、静电结合、离子键、共价键、互补的寡聚核苷酸结合、抗原-抗体反应与纳米粒子或其表面相结合或固定于纳米粒子或其表面。
在本发明中“引物”是指寡聚核苷酸可作为在核酸链(模板)中诱导合成互补的引物延伸产物的条件，即，如核苷酸、脱氧核糖核酸聚合酶等聚合剂的存在及适当的温度和pH条件下的合成的起点起到作用。优选地，引物为脱氧核糖核苷酸且为单链。在本发明中利用的引物可包含天然(naturally occurring)脱氧核苷酸(dNMP)(即，腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)及脱氧胸苷酸(dTMP))、修饰核苷酸或非天然核苷酸。并且，引物还可包含核糖核苷酸。引物需要充分地长，从而在聚合剂的存在下可引发延伸产物的合成。可根据多个要素如温度、应用领域及引物的来源(source)确定引物的适当的长度，典型地为15～30核苷酸。短的引物分子需要低于通常温度的温度，从而形成与模板充分稳定的杂交复合物。术语“退火”“引发”是指使寡脱氧核苷酸或核酸并置(apposition)于模板核酸，上述并置通过聚合酶聚合核苷酸，来在模板核酸或其的一部分形成互补的核酸分子。
在本发明中“增强子”是指当判断检测体的阳性及阴性时，有助于对此可准确、明确地进行判断的物质。例如，可以为与核算或引物相结合，来呈现荧光或发色的物质。
在本发明中“凝胶卡(gel card)”是可参考记载于WO1999/050673专利的凝胶柱(gel column)进行定义。在本发明中凝胶卡为由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成的凝胶卡，更优选地，是指将玻璃珠(glass bead)和琼脂糖凝胶依次盛于容器。
本发明提供核酸检测用试剂盒，上述核酸检测用试剂盒包含：引物集(primerset)，与所要检测的核酸特异性结合；捕获纳米粒子(捕获纳米粒子)；以及凝胶卡，由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成。
上述引物集可以为生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物。包含于本发明的核酸检测用试剂盒的引物可以为利用生物素标记的引物，利用生物素标记的引物可更好地捕获于纳米粒子或与纳米粒子相结合，从而容易检测核酸。并且，可利用荧光标记包含于本发明的试剂盒的引物，作为利用荧光标记的引物，利用荧光确认，来通过带的位置可判别是否存在核酸。
在本发明的一实施例中，可根据引物的标记方法，以肉眼区分阴性或阳性，还利用荧光可区分阴性或阳性(参照图6)。
上述引物的荧光标记并不限定于此，可以为选自由Cy3、Cy5、羧基四甲基若丹明(TAMRA)、TEX、TYE、HEX、FAM、TET、JOE、MAX、ROX、VIC、Cy3.5、德克萨斯红(Texas Red)、Cy5.5、TYE、BHQ、Iowa Black RQ及IRDye组成的组中的一种。
并且，上述引物的荧光标记大致分为两种方法，可由N-羟基丁二酰亚胺修饰法或亚磷酰胺法形成。
Cy染色药的标记方法可利用示出于销售制备公司的amersham biosicences的目录“labelling of oligonucleotides with CyDye fluors for fluorescentapplications using the LEAD seeker homogeneous imaging system,amershambiosiecnces,Vol.L6,2000”的方法进行。
在本发明中，其特征在于，若使用利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法进行荧光标记的引物来检测核酸，则阳性检测体在低于阴性检测体的位置形成带；若使用利用亚磷酰胺法进行荧光标记的引物来检测核酸，则阳性检测体在高于阴性检测体的位置形成带。判断为这种差异由引物的荧光标记位置而不同。
在本发明的一实施例中，当使用利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法进行荧光标记的引物来检测核酸时，阳性检测体在下面形成带(参照图2)，当使用利用亚磷酰胺法进行荧光标记的引物来检测核酸时，阳性检测体在上面形成带(参照图3)。
本发明的特征在于，上述纳米粒子为选自由磁性粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂金纳米粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子及胶乳纳米粒子组成的组中的一种。
在本发明中作为纳米粒子使用Dynabead(MyOne链霉亲和素C1(MyOneStreptavidin C1))，除此之外，可使用可进行能够将核酸捕获于表面的处理的磁性粒子、金属粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子及胶乳纳米粒子。优选地，可以为磁性粒子、金属粒子。
本发明的特征在于，上述纳米粒子的表面利用选自由抗体(例如，如异羟基洋地黄毒苷/抗-异羟基洋地黄毒苷抗体(digoxigenin/anti-digoxigenin antibody)、Cy3/抗-Cy3抗体(Cy3/anti-Cy3antibody)等等价物)、适体(aptamer)及寡聚核苷酸组成的组中的一种进行涂敷处理，上述抗体能够通过抗原-抗体反应与能够捕获核酸的抗生物素蛋白、胺、链霉亲和素、引物相结合的抗原相结合。
当扩增目标核酸时，使用包含抗原的引物，若使与上述抗原相关的抗体与纳米粒子的表面相结合，则可通过抗原-抗体反应，纳米粒子捕获目标核酸。
上述产生密度差异的成分起到在下面支撑凝胶成分的作用，在核酸-纳米粒子复合物的密度大于产生密度差异的成分的情况下沉淀，若核酸-纳米粒子复合物的密度小于产生密度差异的成分，则起到如下作用：分离成不沉淀，从而可利用阴性及阳性密度差异来进行判别。由此无需额外的清洗过程或分离过程。
本发明的产生上述密度差异的成分只要是可产生密度差异的物质，就并不限定，其特征在于，为选自由玻璃珠、石英基质、胶体硅(胶体硅)、胶体二氧化硅溶液、聚蔗糖组成的一种，更优选地，可以为玻璃珠。
本发明的特征在于，上述凝胶成分为选自由免疫球蛋白G-琼脂糖、琼脂糖、琼脂、醋酸纤维素及聚丙烯酰胺组成的组中的一种，优选地，成分可以为免疫球蛋白G-琼脂糖或琼脂糖。
在本发明的一实施例中使用免疫球蛋白G-琼脂糖,在10μl至30μl的免疫球蛋白G-琼脂糖中，在判别阳性及阴性中呈现最少的时间及高区分力，优选地，可以为15μl至25μl的量，更优选地，可以为20μl的量。
本发明的核酸检测用试剂盒还可包含作为嵌入剂的增强子。通过还包含增强子，来具有可使阳性和阴性的区分明确的效果，并不限定于此，作为优选的嵌入剂可以为选自由SYBR绿色、溴化乙锭、biotium gelred、biotium gel Green、JOJO类、POPO类、SYTO类、BOBO类、TOTO类、放线菌素、亚德里亚霉素、蒽、苯并芘、碘化丙啶-缠绕剂(propidiumdiiodide-intertwining)、偏端霉素、纺锤菌素、吖啶、补骨脂素、黄连素(berberine)、普鲁黄素(proflavine)、道诺霉素、阿霉素、沙利霉素、花青染料及LDS751组成的组中的一种以上。更优选地，可以为选自由作为嵌入染色药的SYBR绿色、溴化乙锭、biotium gelred、biotium gel Green、JOJO类、POPO类、SYTO类、BOBO类及TOTO类组成的组中的一种。
优选地，本发明的核酸检测用试剂盒为如下原位(in situ)核酸检测用试剂盒：包含：引物集，由生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物构成，并与所要检测的核酸特异性结合；捕获纳米粒子；嵌入剂；以及凝胶卡，由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成。
本发明提供包含捕获或结合有用于核酸检测用分析的目标核酸的纳米粒子。
本发明提供由用于纳米粒子复合物的玻璃珠成分和凝胶成分依次层叠而成的凝胶卡。
由上述玻璃珠成分和凝胶成分层叠而成的凝胶卡呈盛于测试容器内的形态，作为测试容器可使用任意固体容器，并且可加工成不同的各种类型。例如，还可使用试管、微孔板等的任何容器。
本发明人提供利用纳米粒子的核酸检测方法，上述利用纳米粒子的核酸检测方法包括：步骤(a)，利用与目标核酸特异性结合的引物集扩增目标核酸；步骤(b)，通过向上述步骤(a)中扩增的核酸添加纳米粒子，来使核酸捕获于纳米粒子或与纳米粒子相结合；步骤(c)，将在上述步骤(b)中核酸捕获于纳米粒子或核酸与纳米粒子相结合而成的复合物放入凝胶卡容器；步骤(d)，对在上述步骤(c)中制备的混合物进行离心分离；以及步骤(e)，与对照组比较凝胶卡容器内沉淀物的位置。
上述引物集可以为生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物。包含于本发明的核酸检测用试剂盒的引物可以为利用生物素标记的引物，利用生物素标记的引物可更好地捕获于纳米粒子或与纳米粒子相结合，从而容易检测核酸。
更优选地，上述引物集可以为生物素-标记正向引物(biotin-labeled forward引物)和Cy3-标记逆向引物(Cy3-labeled reverse primer)。
可通过标记有生物素的正向引物，可与生物素特异性结合的物质(例如，抗生物素蛋白(avidin)等)涂敷而成的纳米粒子相结合，并通过标记有Cy3的逆向引物在肉眼或荧光下，可确认沉淀物的位置。并且Cy3还起到可进一步明确地区分扩增物的作用。
在本发明一实施例中利用由序列1及序列2表示的引物集或由序列3或序列4表示的引物集检测了人乳头状瘤病毒核酸。
本发明的核酸包含脱氧核糖核酸和核糖核酸(RNA)，脱氧核糖核酸的扩增只要是现有众所周知的扩增方法，就可使用任何物质。优选地，可以为聚合酶链式反应或等温扩增法。并且在核糖核酸的扩增中只要是现有众所周知的扩增方法，就可使用任何物质，优选地，可以为合成互补脱氧核糖核酸后进行扩增的方法，更优选地，可以为逆转录聚合酶链反应(rt-PCR，reverse transcription PCR)方法。
本发明的特征在于，在上述步骤(a)中利用聚合酶链式反应(PCR)或等温扩增反应对核酸进行扩增。
本发明的核酸包含脱氧核糖核酸和核糖核酸，脱氧核糖核酸的扩增只要是众所周知的扩增方法，就可使用任何物质。优选地，可以为聚合酶链式反应或等温扩增法。
本发明的特征在于，上述等温扩增反应利用选自由依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、环介导等温扩增、依赖核酸序列的扩增、转录介导的扩增、核糖核酸的信号介导扩增、链置换扩增、等温多重置换扩增、单引物等温扩增及依赖解旋酶的环形扩增组成的组中的一种方法进行。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)为选择性高迅速的分析方法，但是反应期间需要周期性地改变温度。无温度变化还在等温条件下能够进行脱氧核糖核酸/核糖核酸扩增的技术被称为等温扩增技术。由于等温扩增技术无需改变温度，因此在短时间内能够进行脱氧核糖核酸扩增，从而作为核酸的迅速检测技术其利用度高。典型地，为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)，环介导等温扩增作为利用4-6个引物扩增特定的靶序列(target sequence)的技术，若添加焦磷酸镁(magnesiumpyrophosphate)或SYBR绿色，则扩增后利用眼睛还可进行核酸扩增判定，因此，以后应用于现场用迅速检测技术的可能性非常高。
在依赖核酸序列的扩增和转录介导的扩增的情况下，为通过核糖核酸模板(RNAtemplate)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)后，借助自持(self-sustained)再次反复合成核糖核酸的反应来扩增的方法。在核糖核酸的信号介导扩增的情况下，为作为依赖于靶(target)的方法，无温度变化可通过扩增靶脱氧核糖核酸(target DNA)或核糖核酸，来检测的方法。在链置换扩增的情况下，需要4个引物(primer)，使用限制酶，并应用Hinc的认知碱基序列(GTTGAC)的方法。滚环扩增为通过Φ29脱氧核糖核酸聚合酶(DNA polymerase)以循环的方式延伸引物，来最终将高分子的圆形核酸扩增为长链的方法。因滚环扩增结合地坚固，从而在其他等温扩增技术中，在脱氧核糖核酸诊断中用作重要的基板技术。作为最近受到瞩目的方法，从基因检查起使用于免疫分析法、测序(sequencing)、SNP筛选(SNPscoring)、基因表达分析等。等温多重置换扩增为引物与双链核酸(double-strandednucleic acid)的两侧相结合直接延伸的方法。依赖解旋酶的扩增为通过使用解旋酶(helicase)来分离为单链，因此无需额外的变形时间(denaturation time)，并且在一个温度中可进行全部反应的方法。在单引物等温扩增中，在核糖核酸中合成互补脱氧核糖核酸，并通过核糖核酸酶(RNaseH)去除核糖核酸，并单引物等温扩增用引物结合，借助脱氧核糖核酸聚合酶(polymerase)产生扩增。是通过单引物等温扩增引物和聚合酶的持续扩增反应，在一条互补脱氧核糖核酸中生成多条链的方法。依赖解旋酶的环形扩增作为同时使用依赖解旋酶的脱氧核糖核酸聚合酶和解旋酶的技术，在一个温度条件下进行全部反应的方法。
在本发明的一实施例中，利用依赖解旋酶的扩增及滚环扩增反应进行扩增来检测核酸，环介导等温扩增及滚环扩增反应也适合于现场分子诊断的扩增反应之一，因此，优选地，本发明的等温扩增反应可以为依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增及环介导等温扩增，更优选地，为依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增。
并且，还在核糖核酸的扩增中，只要是现有众所周知的扩增方法，就可使用，优选地，可以为利用将核糖核酸作为模板(template)的依赖核酸序列的扩增反应或合成互补脱氧核糖核酸后进行扩增的逆转录聚合酶链反应(rt-PCR)。
上述纳米粒子只要是可捕获核酸或可使核酸结合的纳米粒子，就不受到限制。只要是可使捕获核酸的物质涂敷或结合的纳米粒子，就可使用任何物质。只是，本申请中，利用密度差异判断特定核酸的阳性或阴性，因此需要煤质的密度存在差异。在本发明的一实施例中作为煤质使用玻璃珠，由于玻璃珠的煤质密度为1.04g/μl，因此只要是具有大于其密度的粒子，就均可使用。但是还可通过利用其它密度的煤质或小于煤质的密度的小粒子来适用。
优选地，本发明的纳米粒子可以为磁性粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂金纳米粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子或胶乳纳米粒子。
在本发明的一实施例中，在本发明中作为纳米粒子使用Dynabead(MyOne链霉亲和素C1)，除此之外，可使用可进行能够将核酸捕获于表面的处理的磁性粒子、金属粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子或胶乳纳米粒子。优选地，可以为磁性粒子、金属粒子。
本发明的上述纳米粒子的表面可利用选自由抗体(例如，如异羟基洋地黄毒苷/抗-异羟基洋地黄毒苷抗体、Cy3/抗-Cy3抗体及其等价物)、适体及寡聚核苷酸组成的组中的一种进行涂敷处理，上述抗体能够通过抗原-抗体反应与能够捕获核酸的抗生物素蛋白、胺、链霉亲和素、引物相结合的抗原相结合。
当扩增目标核酸时，使用包含抗原的引物，若使与上述抗原相关的抗体与纳米粒子的表面相结合，则可通过抗原-抗体反应，纳米粒子捕获目标核酸。
本发明的上述凝胶成分可以为选自由免疫球蛋白G-琼脂糖、琼脂糖、琼脂、醋酸纤维素及聚丙烯酰胺组成的组中的一种。
在本发明的一实施例中使用免疫球蛋白G-琼脂糖,在10μl至30μl的免疫球蛋白G-琼脂糖中，在判别阳性及阴性中呈现最少的时间及高区分力，优选地，可以为15μl至25μl的量，更优选地，可以为20μl的量。
在本发明的上述步骤(c)中，还可处理嵌入剂(intercalating agent)的增强子。
为了使阳性及阴性的区分明确，在本发明中还可处理增强子，增强子可以为嵌入剂，嵌入剂可以为选自由SYBR绿色、溴化乙锭、biotium gelred、biotium gel Green、JOJO类、POPO类、SYTO类、BOBO类、TOTO类、放线菌素、亚德里亚霉素、蒽、苯并芘、碘化丙啶-缠绕剂、偏端霉素、纺锤菌素、吖啶、补骨脂素、黄连素、普鲁黄素、道诺霉素、阿霉素、沙利霉素、花青染料及LDS751组成的组中的一种以上，更优选地，可以为选自由作为嵌入染色药的SYBR绿色、溴化乙锭、biotium gelred、biotium gel Green、JOJO类、POPO类、SYTO类、BOBO类及TOTO类组成的组中的一种。
在本发明的一实施例中，在扩增的核酸中混合作为增强子的GelRed(10000X、Biotium)和纳米粒子，并处理于凝胶卡。其结果如图5所示，在处理增强子的情况下，可确认使阳性和阴性的区分显著的效果。
另一方面，除了嵌入剂之外，可将荧光染料与引物相结合来，将其用作增强子。荧光染料只要是可与引物相结合的染料，就均可使用，作为荧光染料的例，有Cy3、Cy5、羧基四甲基若丹明、TEX、TYE、HEX、FAM、TET、JOE、MAX、ROX、VIC、Cy3.5、德克萨斯红、Cy5.5、TYE、BHQ、Iowa Black RQ、IRDye类及其等价物。
在上述与对照组比较容器内沉淀物的未知的步骤中，在使用利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法进行荧光标记的引物的情况下，若容器内沉淀物位于阴性对照组的下侧，则若沉淀物位于与阳性、阴性对照组类似的位置，则可判断为阴性。图2作为表示本发明的示意图，若在检测体内包含目标核酸，则目标核酸捕获于纳米粒子后，通过利用密度差异的离心分析，核酸位于下侧。相反地，若不包含目标核酸，则不与纳米粒子相结合，从而密度相对低，因此沉淀物位于管的中央部。
相反地，在使用利用亚磷酰胺法进行荧光标记的引物的情况下，若容器内沉淀物位于阴性对照组的下侧，则若沉淀物位于与阳性、阴性对照组类似的位置，则可判断为阳性。在图3表示与此相关的实验结果。
本发明的特征在于，在上述步骤(d)之前不包括额外的分离过程及清洗过程。
在作为现有技术的美国公开专利2014-0100131的情况下，作为与用于检测目的基因的方法相关的别名，使用磁性粒子和捕获(capture)抗体，并通过分离步骤来检测目的基因。并且，在作为现有技术的美国公开专利2010-0009383中，还使用磁性粒子和捕获抗体，并只有通过分离步骤，才可检测目的生物分子。相反地，在本发明中无粒子的限制，可不使用抗体，无需分离及清洗步骤，从而可进一步容易、简单、快速检测目标核酸。
本发明的特征在于，在上述步骤(a)中，通过对利用分别不同颜色的荧光标记的两种以上的引物进行处理，来多重确认是否存在核酸。
在扩增合算的步骤中，通过对利用分别呈现不同颜色的荧光标记的两种以上的引物进行处理，来可多重确认是否存在核酸。因此，可通过一次实验，来判别是否存在多重核酸,并通过上述可节减时间和费用，因此是有效的核酸检测方法。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例只用于更详细地说明本发明，并解释为本发明的范围并不限制于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例1
从试样提取及扩增基因脱氧核糖核酸(genomic DNA)
在从宫颈检测体提取基因脱氧核糖核酸的情况下，利用核酸提取试剂盒按照制备公司的指示提取核酸，并向食品医药品安全处及国家生物标准和控制研究所(NIBSC，National Institute for Biological Standards and Control)申请预售来准备了人乳头状瘤病毒(HPV)脱氧核糖核酸标准品。
表1
引物信息
利用上述表1的聚合酶链式反应引物集获得了各个试样的扩增产物。本发明的引物集以除了聚合酶链式反应扩增之外，还能进行等温扩增(优选地，依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增)的方式制备，并参考现有众所周知的文献来进行变形(Virol J.2010Aug19；7:194)。
表2
聚合酶链式反应反应组成液
聚合酶链式反应成份(Components of PCR) 体积(Volume)
正向引物/逆向引物(10pmole/μl) 1μl
HotStarTaq plus反应混合液(HotStarTaq plus Master Mix) 10μl
模板脱氧核糖核酸(Template DNA)(1ng/μl) 5μl
去离子水(Deionized water) 4μl
合计(Total) 20μl
表3
重组酶聚合酶扩增反应组成液
聚合酶链式反应成份 体积
正向/逆向引物(10pmole/μl) 3μl
重泡胀缓冲液(rehydration buffer) 29.5μl
模板脱氧核糖核酸(1ng/μl) 5μl
去离子水 11.5μl
Mg2+ 1μl
合计 50μl
表4
重组酶聚合酶扩增反应组成液
1)聚合酶链式反应
聚合酶链式反应反应组成液如上述表2，扩增条件为95℃中10分钟、(在95℃的温度下30秒钟、在55℃的温度下30秒钟、在72℃的温度下30秒钟)作为一个循环，反复40次来扩增。
2)滚环扩增TwistMF基本试剂盒(TwistDx、Cambridge、UK)
重组酶聚合酶扩增反应组成液如上述表3，并利用记载于上述表1的引物集及TwistMF基本试剂盒(英国剑桥TwistDx公司(TwistDx,Cambridge,UK))，在37℃的温度下等温扩增了40分钟。
3)依赖解旋酶的扩增
依赖解旋酶的扩增反应组成液如上述表4，并利用记载于上述表1的引物集及IsoAmp III万能tHDA试剂盒(Biohelix)，在65℃的温度下等温扩增了60分钟。
实施例2
确认基于电泳的扩增产物
利用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶，通过Mupid-a(Advance、Japan)电泳装置对聚合酶链式反应产物进行了分析。将1.5g的琼脂糖放入三角烧瓶(250μl)，并填满100μl的0.5×TBE(tris boric acid EDTA)缓冲溶液后，在微波炉中溶解2分钟至3分钟，然后将溶液导入凝胶容器来凝固30分钟左右。确认凝胶完全凝固，并收取凝胶。将收取的凝胶放入电泳装置，并利用0.5×TBE缓冲液填满。并且，混合4μl的聚合酶链式反应产物和0.8μl的6×溴酚蓝(BPB，bromo phenol blue)dye来每次装载4μl，并在100V的条件下电泳了25分钟。然后取出凝胶利用EtBr(溴化乙锭(ethidium bromide))染色10分钟，再次利用蒸馏水对未与脱氧核糖核酸相结合的EtBr进行10分钟的清洗。最后，将琼脂糖凝胶放置于紫外线(UV)透照器(transilluminator)，并确认了是否进行聚合酶链式反应扩增。
对聚合酶链式反应扩增产物进行电泳，结果，确认了136bp的带，并从记载于上述实施例1的方法可确认正常的扩增目的脱氧核糖核酸(未图示结果)。
实施例3
3-1.纳米粒子及凝胶卡的准备
纳米粒子只要是可捕获核酸，且大于煤质的密度的粒子，就理论上均可使用。
在本实施例3中为了捕获核酸分子，作为纳米粒子使用了Dynabead(MyOne链霉亲和素C1)。因上述Dynabead的表面经链霉亲和素处理，因此生物素(biotin)与标记的引物相结合。并且，作为凝胶卡购买多特异性Ortho BioVue系统(polyspecific Ortho BioVueSystem)(美国新泽西州奥托临床诊断公司(Ortho Clinical Diagnostics,NJ,USA))的产品而使用。
3-2.利用通过N-羟基丁二酰亚胺修饰法标记的引物的核酸检测
利用由记载于上述表1的序列1及序列2组成的引物集，通过等温扩增从人乳头瘤病毒检测体扩增了人乳头状瘤病毒(HPV)核酸。在由序列2表示的引物的末端标记有Cy3的荧光物质，作为标记方法利用N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)修饰法进行了标记。可如以下化学式1表示利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法标记的引物。
化学式1：
混合4μl的扩增的核酸和4μl的Dynabead后放入凝胶卡，并在37℃的温度下，反应5分钟后，进行了2分钟至4分钟的离心分离。图2为以示意图的方式表示上述过程，其结果如图2所示，在检测到核酸(阳性)的凝胶卡中，可观察聚合酶链式反应产物在下侧形成带，在未检测到核酸(阴性)的凝胶卡中，在上侧形成带。
3-3.利用通过亚磷酰胺法的标记的引物的核酸检测
利用由记载于上述表1的序列3或序列4组成的引物集，通过等温扩增从人乳头瘤病毒检测体扩增了人乳头状瘤病毒核酸。在由序列4表示的引物的末端标记有Cy3的荧光物质，标记方法利用亚磷酰胺法进行。可如以下化学式2表示利用亚磷酰胺法标记的引物。
化学式2：
混合4μl的扩增的核酸和4μl的Dynabead后放入凝胶卡，并在37℃的温度下，反应5分钟后，进行了离心分离。此时，观察了第二分钟、第十分钟及第分钟分别下降的程度。其结果，如图3所示，可观察在作为相当于阴性的检测体的1号管中带下降，并在作为相当于阳性的检测体的2号管中在上侧形成带。
由此，在本发明的利用纳米粒子的核酸检测方法中，还利用临床检测体可快速、敏感地检测核酸，并可根据荧光标记方法容易变更阴性和阳性判断方式。
实施例4
核酸检测方法的最优化
1)离心分离速度
为了测定对核酸检测最优的离心分离速度，根据上述实施例3-2的方法对凝胶卡处理核酸和纳米粒子。之后，分别以100rpm、200rpm、400rpm、600rpm、800rmp、1200rpm及1600rmp进行了2分钟的离心分离。
其结果，确认在检测人乳头状瘤病毒脱氧核糖核酸136bp中，600rpm至1200rpm为在检测核酸中最优的离心分离速度，确认了更优选地，800rpm×2分钟(约55g)为最优选(未图示结果)。
作为离心分离速度，可根据所要检测的核酸的长度或使用的纳米粒子的大小/密度进行最优化，来可调节g-force。
2)离心分离时间
为了测定对核酸检测最优的离心分离速度，根据上述实施例3-2的方法对凝胶卡处理核酸和纳米粒子。离心分离速度设定为800rpm(约55g)，并以1分钟间隔分别观察到8分钟。
其结果，如图3所示(仅示出2分钟、4分钟、6分钟)，确认了如下：利用最初两分钟的离心分离，也可区分阳性及阴性，当进行2分钟至6分钟的离心分离时可区分，在将离心分离进行6分钟以上的情况下，阳性及阴性区分不明确。
本发明的离心分离时间可根据纳米粒子的大小、密度、反应量、煤质的浓度、离心力等进行调节。
3)核酸的量
通过上述实施例1扩增核酸后，对在实施例3中准备的凝胶卡处理2μl至6μl的在所生成的反应混合液(master mix)中扩增的产物，来检测了核酸。若处理过少的核酸，则与纳米粒子结合的核酸少，从而用于判断阳性及阴性的带不明显，从而难以区分。
在利用本发明的凝胶卡的核酸检测中，可根据反应的纳米粒子的种类和量调节扩增的产物的量，并还可利用整个反应混合液。
4)琼脂糖的量
为了测定对核酸检测最优的凝胶内琼脂糖(agarose)的量，向分别层叠有5μl、10μl、20μl、30μl、40μl及50μl的琼脂糖(抗-小鼠免疫球蛋白G琼脂糖(anti-mouse IgGagarose))的凝胶卡内处理了利用上述上述实施例1的方法获得的聚合酶链式反应扩增产物和纳米粒子。
其结果，在10μl至30μl的琼脂糖中，对判别阳性及阴性呈现了最少的时间及高的区分力。更优选地，可以为包含20μl的琼脂糖的凝胶卡(未图示结果)。
5)添加增强子
在阳性及阴性判定中，为了更明确地区分可添加增强子。
第一、在利用实施例1的方法扩增的核酸中，作为增强子混合1μl的(10000×、Biotium)1/100和纳米粒子，并处理于凝胶卡。其结果，如图4所示，在处理增强子的情况下，可确认阳性和阴性区分更显著的效果(参照图5)
第二、作为增强子在引物连接作为荧光的Cy3来扩增核酸后，混合纳米粒子和扩增产物来处理于凝胶卡。在上述情况下，不仅利用肉眼可判断阳性及阴性，而且在荧光下还可进行观测，并且呈现的检测结果更明显(参照图6)。
实施例5
核酸检测敏感度测定
对标准人乳头状瘤病毒16脱氧核糖核酸(HPV16 DNA standard)(WHOInternational Standard 1st WHO International Standard for HumanPapillomavirus(HPV)Type 16 DNA、107拷贝数(copies)/μl)进行稀释，来制备102、103、104及105copies/μl后，利用聚合酶链式反应进行了扩增。
通过实施例2的方法观察扩增的产物是否稀释好，并在图7的A部分中示出了结果。混合4μl的它们扩增的产物和4μl的Dynabead，并放入于追加20μl的抗-小鼠免疫球蛋白G琼脂糖1/50的凝胶卡，在37℃的温度下，反应5分钟后进行了离心分离。此时，观察了第二分钟、第四分钟及第六分钟分别下降的程度(图7的B部分)。
其结果，如图7所示，在102拷贝数/μl至105拷贝数/μl中确认了均可进行核酸的阳性及阴性判定。即，仅102拷贝数/μl的核酸可进行核酸检测。
实施例6
在人乳头状瘤病毒临床检测体中的核酸检测
为了确认在人乳头状瘤病毒临床检测体中，还是否特应性地检测核酸，利用为了子宫癌筛选检查要求人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸检查的检测体进行检查剩余的检测体，进行了核酸检测。人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸阳性及阴性检测体在进行Loches Cobas 4800人乳头瘤病毒测试(Cobas 4800 HPV test)的检测体中分别选定3个。
如记载于上述实施例的方法，针对于共6个的检测体，利用由记载于上述表1的序列1及序列2形成的引物集，通过等温扩增从人乳头瘤病毒检测体扩增了人乳头状瘤病毒。在由序列2表示的引物的5’末端标记有Cy3的荧光物质，并作为标记方法利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法进行了标记。
然后，混合4μl的扩增的产物和4μl的Dynabead，并放入于追加20μl的抗-小鼠免疫球蛋白G琼脂糖1/50的凝胶卡，在37℃的温度下，反应5分钟后进行了离心分离。此时，观察了第二分钟、第四分钟及第六分钟分别下降的程度。
其结果，如图8所示，在作为相当于阴性的检测体的1号至3号管中确认在上侧形成带，在作为相当于阳性的检测体的4号至6号管中可确认在下侧形成带。由此可确认利用临床检测体，还可快速、灵敏地检测核酸。
产业上的可利用性
本发明可通过不包括分离步骤的核酸检测法进一步迅速、简单、敏感、可靠度高地判断与特定疾病相关的阴性、阳性的判断，从而产业上的利用可能性高。
序列表
<110> 国立癌症中心
<120> 利用纳米粒子的核酸检测用试剂盒及核酸检测方法
<130> P18JM1WN00023KR
<150> KR 10-2015-0121109
<151> 2015-08-27
<150> KR 10-2015-0099378
<151> 2015-07-13
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HPV正向引物1
<400> 1
ttgttggggt aaccaactat ttgttactgt t 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HPV逆向引物1
<400> 2
cctccccatg tctgaggtac tccttaaag 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HPV正向引物2
<400> 3
tgtcagaacc atatggcgac agctt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HPV逆向引物2
<400> 4
ttcaccaaca gcaccagccc tatta 25

Claims (23)

1.一种核酸检测用试剂盒，其特征在于，包含：
引物集，与所要检测的核酸特异性结合；
捕获纳米粒子；以及
凝胶卡，由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成。
2.根据权利要求1所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述引物集为生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物。
3.根据权利要求2所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述荧光标记逆向引物通过N-羟基丁二酰亚胺修饰法或亚磷酰胺法进行荧光标记。
4.根据权利要求2所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述荧光标记利用选自由Cy3、Cy5、羧基四甲基若丹明、TEX、TYE、HEX、FAM、TET、JOE、MAX、ROX、VIC、Cy3.5、德克萨斯红、Cy5.5、TYE、BHQ、Iowa black RQ及IRDye组成的组中的一种进行标记。
5.根据权利要求3所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，
若使用利用N-羟基丁二酰亚胺修饰法进行荧光标记的引物来检测核酸，则阳性检测体在低于阴性检测体的位置形成带；
若使用利用亚磷酰胺法进行荧光标记的引物来检测核酸，则阳性检测体在高于阴性检测体的位置形成带。
6.根据权利要求1所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述纳米粒子为选自由磁性粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂金纳米粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子及胶乳纳米粒子组成的组中的一种。
7.根据权利要求1所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述产生密度差异的成分为选自由玻璃珠、石英基质、胶体硅、胶体二氧化硅溶液及聚蔗糖组成的组中的一种。
8.根据权利要求1所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述凝胶成分为选自由免疫球蛋白G-琼脂糖、琼脂糖、琼脂、醋酸纤维素及聚丙烯酰胺组成的组中的一种。
9.根据权利要求1所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，还包含嵌入剂的增强子。
10.根据权利要求9所述的核酸检测用试剂盒，其特征在于，上述嵌入剂为选自由SYBR绿色、溴化乙锭、biotium gelred、biotium gel Green、JOJO类、POPO类、SYTO类、BOBO类、TOTO类、放线菌素、亚德里亚霉素、蒽、苯并芘、碘化丙啶-缠绕剂、偏端霉素、纺锤菌素、吖啶、补骨脂素、黄连素、普鲁黄素、道诺霉素、阿霉素、沙利霉素、花青染料及LDS751组成的组中的一种以上。
11.一种原位核酸检测用试剂盒，其特征在于，包含：
引物集，由生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物构成，并与所要检测的核酸特异性结合；
捕获纳米粒子；
嵌入剂；以及
凝胶卡，由产生密度差异的成分和凝胶成分依次层叠而成。
12.一种能够检测的纳米粒子复合物，其特征在于，包含捕获或结合有用于核酸检测用分析的目标核酸的纳米粒子。
13.一种凝胶卡，其特征在于，由用于检测根据权利要求12所述的纳米粒子复合物的玻璃珠成分和凝胶成分依次层叠而成。
14.一种利用纳米粒子的核酸检测方法，其特征在于，包括：
步骤a，利用与目标核酸特异性结合的引物集扩增目标核酸；
步骤b，通过向上述步骤a中扩增的核酸添加纳米粒子，来使核酸捕获于纳米粒子或与纳米粒子相结合；
步骤c，将在上述步骤b中核酸捕获于纳米粒子或核酸与纳米粒子相结合而成的复合物放入凝胶卡容器。
步骤d，对在上述步骤c中制备的混合物进行离心分离；以及
步骤e，与对照组比较凝胶卡容器内沉淀物的位置。
15.根据权利要求14所述的利用纳米粒子的核酸检测方法，其特征在于，上述步骤a的引物集为生物素-标记正向引物和荧光标记逆向引物。
16.根据权利要求14所述的利用纳米粒子的核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤a中利用聚合酶链式反应或等温扩增反应扩增核酸。
17.根据权利要求16所述的核酸测定方法，其特征在于，上述等温扩增反应利用选自由依赖解旋酶的扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、环介导等温扩增、依赖核酸序列的扩增、转录介导的扩增、核糖核酸的信号介导扩增、链置换扩增、等温多重置换扩增、单引物等温扩增及依赖解旋酶的环形扩增组成的组中的一种方法进行。
18.根据权利要求14所述的核酸测定方法，其特征在于，上述纳米粒子为选自由磁性粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂金纳米粒子、量子点、上转换纳米粒子、石墨烯-纳米粒子复合物、染色纳米粒子及胶乳纳米粒子组成的组中的一种。
19.根据权利要求18所述的核酸检测方法，其特征在于，上述纳米粒子的表面利用选自由抗体、适体及寡聚核苷酸组成的组中的一种进行涂敷处理，上述抗体能够通过抗原-抗体反应与能够捕获核酸的抗生物素蛋白、胺、链霉亲和素及引物相结合的抗原相结合。
20.根据权利要求14所述的核酸检测方法，其特征在于，上述凝胶成分为选自由免疫球蛋白G-琼脂糖、琼脂糖、琼脂、醋酸纤维素及聚丙烯酰胺组成的组中的一种。
21.根据权利要求14所述的核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤c中，还对嵌入剂的增强子进行处理。
22.根据权利要求14所述的核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤d之前不包括额外的分离过程或清洗过程。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤a中，通过对利用互不相同的荧光标记的两种以上的引物集进行处理，来多重确认是否存在核酸。
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