CN114487401A - 一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。将样品液、磁性捕获复合体‑哑铃型探针、RCA‑发光体系、缓冲液滴加到微流控芯片上，通过阀门和外界磁场的控制，实现可蜡样芽孢杆菌的分离、富集与检测；其中蜡样芽孢杆菌的适配体是通过全细胞筛选、裁剪获得，具有高亲和性和特异性。同时该传感器具有功能齐全，简单便携，可在1小时内完成检测，无需扩大培养等优点。

Description

一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，本发明涉及一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。
背景技术
蜡样芽孢杆菌是一种可以产生中生芽孢的革兰氏阳性菌。常在蔬菜、乳制品以及肉制品等富含蛋白质的食物中被检出，可以产生肠毒素、呕吐毒素等毒素，从而引发食物中毒事件。蜡样芽孢杆菌的内生芽孢在经过适当的热处理后会萌发，同时热处理又可以消灭其他微生物，在无竞争的情况下芽孢萌发，蜡样芽孢杆菌可以更好地繁殖。蜡样芽孢杆菌的芽孢具有疏水性，可以黏附上皮细胞，易引起人体肠道感染，也可引起局部组织和全身性感染。因此针对蜡样芽胞杆菌的快检方法亟待开发与应用。
目前，检测蜡样芽胞杆菌的主要方法有较为传统的平板培养法、分子生物学法、免疫法以及物化法等。平板培养法耗时长，操作起来较麻烦；分子生物学法对人员操作和仪器设备的要求较高，无法实现恒温检测；免疫法中不仅抗体价格昂贵而且亲和力较低，稳定性和结合能力还易受到pH值或温度变化的影响；拉曼/表面增强拉曼散射法、红外光谱法、分光光度法、质谱分析等也可实现直接检测，数据准确、检测限低，但是检测成本较高、设备庞大，并不适合现场检测。
核酸适配体是一类单链寡核苷酸，可形成高级结构与靶标物质结合，具有较强的亲和力和结合特异性。相比于抗体，核酸适配体在检测和治疗工作中更具优势，通过筛选、优化获得的核酸适配体作为一种小型的生物传感元件，可以在致病菌的检测中发挥巨大作用：与靶菌结合后，可产生构象变化，变化可引发扩增、发光等一系列反应，通过核酸适配体的变化或其引起的其他物化生变化来反映靶菌数量。在不同检测设备下，最初的靶菌数量信息可以通过核酸适配体的变化形成光电信号，从输出设备中传递出相应信号。
微流控芯片指的是通过微米级流道、腔室搭建起来的微反应实验室，借助液相与流道之间的表面张力、阻力等物理因素控制流体流动、混合反应的一类芯片装置。微流控芯片可与PCR等技术联用用于致病菌的检测。目前，微流控芯片已被用于国家标准微生物高通量检测工作中。
发明内容
本发明的目的是一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。为蜡样芽孢杆菌的基于核酸适配体的检测工作提供研究依据，解决检测中存在的抗体、基因组依赖性高，耗时长，操作繁琐，特异性低，灵敏度低、无法现场检测等问题。
一方面，本发明提供一种蜡样芽孢杆菌检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器，其特征在于，由暗箱、微流控芯片及控制装置组成。
所述暗箱是由箱体、暗箱顶盖、紫外灯珠隔板及紫外灯珠组成，其中暗箱顶盖上留有采集窗。
所述微流控芯片包括识别元件、转化元件以及信号输出元件。
所述识别元件是指连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，其中蜡样芽孢杆菌适配体通过全细胞筛选、裁剪获得；既可以识别菌体又可以实现电磁分离，其中适配体序列如SEQ ID NO：1所示。
所述转化元件是通过探针将蜡样芽孢杆菌信号转化为核酸信号；
所述信号转化元件是哑铃型探针和滚环扩增引物组成，其中哑铃型探针作为扩增模板，滚环扩增引物作为扩增引物，其中哑铃型探针序列如SEQ ID NO：3所示，滚环扩增引物序列如SEQ ID NO：5所示。
所述信号输出元件即通过智能手机拍摄微流控芯片的反应腔，并根据获得的RGB值和标准曲线推知靶菌浓度；
所述微流控芯片是由上样板、流道板及底部玻璃板组成；
所述微流控芯片的上样板上包括用于上样待测液体的样品的上样口、用于上样适配体功能化磁珠的上样口、用于上样RCA-发光体系的上样口、用于上样1×BB缓冲液的上样口及用于放置海绵的废液出样口；在上样时，可一次性将待测样品、磁性捕获复合体-哑铃型探针、缓冲液以及RCA-发光体系沿对应上样口加入对应腔内；
所述微流控芯片的流道板上包括用于储存各进样试剂的待测样品进样腔、磁珠进样腔、RCA-发光体系进样腔、1×BB缓冲液进样腔、反应腔用于放置海绵的废液腔及连接各腔体结构的微流道；
所述控制装置是控制微流控芯片内液体流动的装置，实现一次性上样检测。
所述控制装置包括顶盖、四个定位螺母、四个螺杆、四个触点、电磁铁、芯片底座、卡扣及芯片更换滑块组成；
所述顶盖上留有用于固定定位螺母及电磁铁的安装孔以及用于方便进样的与下方微流控芯片对应的进样孔。
另一方面，本发明提出的微流控芯片生物传感器识别元件是通过全细胞筛选和裁剪获得的蜡样芽孢杆菌适配体。
所述全细胞筛选的具体过程为：
(a) 取1-2 nmol随机文库，90-95℃变性 5-10 min，立即至于冰上，放置5-10min，在已处理的文库中加入500-600 μL菌悬液，以及过量的 tRNA 和BSA。30-37℃ 100-120 rpm 振荡培养45- 90min。
(b) 孵育后6000-8000 rpm，4℃离心5-10 min，与目标菌体相结合的 ssDNA 随着菌体被沉降下来，而未与目标菌体结合的ssDNA 则在上清中，尽量倒掉上清，用 1×BB 清洗2-3遍沉淀，去除结合能力较弱的ssDNA。
(c) 加入80-100μL 1×TE缓冲液重悬结合 ssDNA 文库的菌体，90-95℃加热5-10min，立即置于冰上5-10 min，使得结合在菌体表面的适配体因变性从菌体表面脱离。
(d) 将悬液置于冷冻离心机中 4℃，10000-12000rpm，离心5-10min，吸取上清液保存，记为M，并以此为模板进行大量PCR扩增，为下一轮筛选用的文库做准备。具体加入量如表3所示。PCR反应条件为：95-98℃预变性4min，95-98℃变性10s，55-60℃退火20s，72℃延伸20 s，72℃再延伸2 min，反应循环数设置范围10-18。
(e) 收集各管的 PCR 产物，使用 PCR 产物纯化试剂盒清除无关试剂，取纯化后样品，加入 0.1倍体积的 Lambda核酸外切酶缓冲液和 Lambda外切酶混合均匀（如50 μL反应体系，加入 5μL Lambda核酸外切酶），于 35-37℃反应 30-40min，之后 75℃水浴 10-15min。
(f) 向350-500 μL菌悬液中加入50-100pmoL每一轮的酶切纯化产物在室温下孵育45-60min，经6000-8000rpm于4℃离心5-10min后洗涤重悬于1mL 1×BB中，将混合液转移至流式管内，全程注意避光。使用流式细胞仪分别测定每一轮菌悬液的荧光强度值。保存数据，使用FlowJo软件对数据分析。
(g) 最终将筛选获得的产物进行测序，获得适配体序列。
所述裁剪的具体过程为：
根据同源性分析、二级结构预测以及最小自由能将获得适配体序列进行分类，再根据最小自由能最低原则选出潜在适配体，最后使用流式细胞仪进行亲和性、特异性与解离常数的测定，确定最适适配体序列。
所述的适配体如下所示：
SEQ ID NO：1：5’-TAACGAAGTACCCTCGGGGCGG-3’;
SEQ ID NO：2：5’- ATGGGCTACTGGAGCATCTG -3’;
另一方面，本发明提出了微流控芯片生物传感器识别元件是指连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，其中蜡样芽孢杆菌适配体通过全细胞筛选、裁剪获得；
具体的，磁性捕获复合体是通过5~10mg/mL直径为200nm的链霉亲和素修饰的磁珠与0.1~1μM的5’端修饰生物素的捕获适配体在室温下振荡孵育获得。
该元件需要在外接电磁铁（P15、15 DC12 V）通电的情况下，20-30℃恒温孵育5-15min识别靶标菌；
具体地，反应条件为25℃ 10min；
另一方面，本发明提出的微流控芯片生物传感器信号转化元件指的是由蜡样芽孢杆菌特异性适配体、小檗碱发光核酸适配体、切刻内切酶Nb.BbvCl识别特定序列以及滚环扩增引物结合区域组成的哑铃型探针。
具体的哑铃型探针序列为：
5’-TGAGGACATTAACGAAGTACCCTCGGGGCGGCCGTCCTCAGCAACATAATTTAAATATTTTATGTTGC-3’。
其中滚环扩增反应的最适条件为35℃ 30 min。
另一方面，本发明提供了一种上述微流控芯片生物传感器检测蜡样芽孢杆菌的检测方法。
本发明传感器的检测分析原理：在微流控芯片的毛细作用下，待测样品与磁性捕获复合体、哑铃型探针沿流道进入反应腔进行充分混合，磁性捕获复合体中的蜡样芽孢杆菌适配体与哑铃型探针中的蜡样芽孢杆菌适配体可以识别并结合待测样品中的蜡样芽孢杆菌，在反应腔处电磁铁产生的磁场的帮助下，连有磁珠的捕获适配体可将靶菌细胞进行分离和富集，缓冲液沿流道进入反应腔，充分清洗后，沿出口流出，包含了扩增引物、Phi29DNA聚合酶、小檗碱的反应体系沿流道进入反应腔内，在恒温加热下，扩增引物可与结合在靶菌细胞表面哑铃型探针互补却对，在Phi29 DNA聚合酶的作用下引发RCA反应，产生大量小檗碱发光核酸适配体重复单元，随扩增进行，切刻内切酶Nb.BbvCl识别重复单元间的切割位点，将重复单元逐一切下，使得小檗碱发光核酸适配体游离于产物之外，结合反应腔内的小檗碱发光，使用手机软件拍摄反应腔即可得到荧光信号的RGB值，通过RGB值和标准曲线可推知靶菌浓度。
具体检测方法如下：
步骤一：将微流控芯片安装到控制装置中，并关闭各阀门；
步骤二：将样品液、磁性捕获复合体-哑铃型探针、RCA-发光体系、缓冲液滴加到微流控芯片上；
步骤三：在废液池处安装好吸水海绵；
步骤四：打开进样阀门，释放磁性捕获复合体-哑铃型探针和样品液于反应腔中，外加磁场打开，使其充分混匀；
步骤五：保持磁场，打开出液阀门，流出废液，后关闭出液阀门；
步骤六：打开缓冲液进样阀门，释放缓冲液于反应腔中，在磁场作用下充分混合，关闭缓冲液进样阀门；
步骤七：，重复步骤五；
步骤八：打开反应液进样阀门，释放RCA-发光体系流入反应腔，30~37 ℃反应30 ~60min；
步骤九：取下电磁铁；
步骤十：打开紫外灯珠，从暗箱顶的采集窗对准微流控芯片上的反应腔拍摄，并随机记录三点处的R、G、B值，根据R值-菌液浓度的标准曲线推知样品中的靶菌浓度。
另一方面，本发明还提供了一种利用前述传感器对蜡样芽孢杆菌进行定量检测的方法，包括如下步骤：
SI：制作标准曲线：
将菌液使用0.9%生理盐水进行10倍梯度稀释，构建具有不同菌液浓度的样品，与前述检测步骤相同；
以蜡样芽孢杆菌菌液浓度的对数为横坐标，样品荧光信号中的R值为纵坐标，绘制标准曲线；
SII：按照前述检测方法对样品进行检测，将获得的待测样品的荧光信号中的R值代入标准曲线，计算得到样品中靶菌的含量，实现对蜡样芽孢杆菌的定量检测；
SIII：确定线性范围为1.59×102-1.59×107 CFU/mL，y =15.21x + 43.57，R2 =0.8847，检测限为9.27 CFU/mL，从而可实现对蜡样芽孢杆菌的定量检测。
另一方面，本发明提出一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控检测方法，采用如前所述的微流控芯片生物传感器实现蜡样芽孢杆菌的检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过提出一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器及检测方法，以实现食品样品中蜡样芽孢杆菌的灵敏、高效的现场检测。本发明将一条蜡样芽孢杆菌特异性适配体与磁珠结合形成捕获复合体，将另一条特异性适配体与小檗碱发光核酸适配体、扩增引物结合序列、切刻内切酶识别序列等功能序列连接形成自连性哑铃型锁式探针，上述两部分捕获元件同时与靶菌接触后，可在扩增引物存在的情况下引发滚换扩增反应，在切刻内切酶的作用下产生大量游离的小檗碱发光核酸适配体，结合小檗碱后可发出较强荧光信号，上述过程均在微流控芯片生物传感设备中进行，一次上样，可在1小时内用手机软件输出结果。
（一）本发明将上样、混样、分离、反应等操作和涉及的仪器——电磁铁、紫外光源等集成在一台微流控芯片生物传感器上，可实现一次性上样，无需后续加样；
（二）本发明在靶菌捕获中使用到的两条核酸适配体均由蜡样芽孢杆菌全细胞筛选、裁剪优化得到，经过了多轮反向筛选和功能验证，能快速识别并高效结合不同生长时期的靶菌，提高了生物传感器的捕获能力；
（三）本发明的RCA扩增步骤中将蜡样芽孢杆菌适配体、扩增引物结合序列、小檗碱发光适配体序列以及切刻内切酶识别序列整合为一个哑铃型探针，一方面可直接自连成环，避免了连接引物的使用，提高了检测效率；另一方面可将生物信号以核酸的形式不断放大，同时将荧光信号的序列不断释放，避免了提纯与扩大培养等操作，提高了检测的效率；
（四）本发明的检测结果可直接通过肉眼或手机软件观察，将蜡样芽孢杆菌的生物信号可转换为荧光的颜色信号（R、G、B值）输出；
（五）本发明可在1小时内实现免扩菌的高灵敏检测，检测范围为1.59×102-1.59×107 CFU/mL，最低检测限为9.27 CFU/mL；
（六）本发明具有一定的菌种特异性，可区分蜡样芽孢杆菌同菌群的苏云金芽孢杆菌。
附图说明
图1为微流控传感器的组成图。
图2为荧光观察装置示意图。
图3为微流控芯片的组成图。
图4为液体流动控制装置顶盖的组成图。
图5为装置安装固定及各部分组装示意图。
图6为全细胞核酸适配体体外筛选及分析结果图：A图为13轮筛选后所得20条适配体序列比对结果；B图为同源树及系统发育树；C图为7个家族分类图；D为7条家族候选适配体的菌种特异性分析结果；E图为7条家族候选适配体的亲和性分析；F图为7条家族候选适配体的解离常数测定结果。
图7为核酸适配体裁剪优化分析结果图：A图为候选适配体13-18及13-24的裁剪位点图；B图为裁剪适配体及适配体组的亲和力分析；C图为裁剪适配体的解离常数测定结果；D图为裁剪适配体的菌种特异性分析结果。
图8为适配体功能化磁珠的用量优化：A图为功能化磁珠示意图；B-F图分别为不同浓度下的捕获适配体与等量磁珠连接后上清液的A260随时间变化的结果。
图9为微流控传感器的使用流程图。
图10为传感器检测特异性结果及线性范围：A图为传感器的标准曲线及检测范围测定结果；B图为传感器的菌种特异性结果。
图11为传感器对于真实样品检测的结果图。
附图标记：
1-暗箱，101-箱体，102-暗箱顶盖，103-灯珠隔板，104-灯珠，105-阵列孔，106-隔板安装槽，107-采集口，108-箱体固定块；2-微流控芯片，201-上样板，202-流道板，203-底部玻璃板，204-样品上样口，205-磁性捕获复合体-哑铃型探针上样口，206-RCA-发光体系上样口，207-缓冲液上样口，208-废液出样口，209-待测样品进样腔体，210-磁性捕获复合体-哑铃型探针进样腔，211-RCA-发光体系进样腔，212-缓冲液进样腔，213-反应腔，214-废液池，215-微流道；3-控制装置，301-顶盖，302-定位螺母，303-螺杆，304-触点，305-电磁铁，306-芯片底座，307-卡扣，308-芯片底座固定滑块，309-螺母安装孔位，310-电磁铁安装口，311-顶盖缺口，312-芯片底座位点，313-微流控芯片安装槽，314-底窗，315-待测样品进样阀门，316-缓冲液进样阀门，317-RCA-发光体系进样阀门，318-出液阀门。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中涉及到的试剂配制：
（1）1×BB 缓冲液：50mmol/L Tris-HCl （pH 7.4）, 5mmol/L KCl, 100mmol/LNaCl, 1 mmol/L MgCl2。
（2）1×TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.4。
（3）1mM 小檗碱溶液：使用分析天平称取10.091g小檗碱粉末，加入到30 mL预热（40℃）的超纯水中充分混匀，放置于室温下10 min后转移至4℃冰箱中存储。
（4）所有序列需经过4000rpm离心1min后，使用1×TE充分溶解至100μM后保存在4℃备用。
实施例1 微流控芯片生物传感器的组成、安装说明及各零件用途
微流控芯片传感器组成如图1所示，包括用于观察荧光的观察暗箱1、用于检测蜡样芽孢杆菌的微流控芯片2及用于控制微流控芯片中液体流动的毛细微阀控制装置3。将安装好微流控芯片2的微流控芯片毛细微阀控制装置3插入荧光采集暗箱1。
用于观察荧光的观察暗箱1如图2示，由箱体101、暗箱顶盖102、灯珠隔板103及灯珠104构成。将灯珠104安装在灯珠隔板103上预留的9×9的阵列孔105中，焊接构成产生足够荧光强度的灯珠阵列104。将安装好灯珠阵列104的灯珠隔板103安装进暗箱箱体101上预留的隔板安装槽106完成荧光采集暗箱1的装配。实验过程中加样、旋动阀门时去掉暗箱顶盖102，混样分离完毕后，将电磁铁取下，盖上观察暗箱1的暗箱顶盖102，开启暗箱底部安装的荧光灯珠阵列104，将手机摄像头对准暗箱顶盖102上预留的采集口107，采集荧光图像。
用于检测蜡样芽孢杆菌的微流控芯片2如图3所示，由上样板201、流道板202底部玻璃板203构成。微流控芯片的上样板201上包括用于上样待测液体的样品的上样口204、用于上样磁性捕获复合体-哑铃型探针的上样口205、用于上样RCA-发光体系的上样口206、用于上样1×BB缓冲液的上样口207及用于放置海绵的废液出样口208；上样板201材料为PVA薄膜，通过激光切割获得。微流控芯片的流道板202上包括用于储存各进样试剂待测样品进样腔体209、磁性捕获复合体-哑铃型探针进样腔210、RCA-发光体系进样腔211、1×BB缓冲液进样腔212、反应腔213以及用于放置海绵的废液池214及链接各腔体结构的宽度为600μm的微流道215；流道板202材料为具有双面粘性的BSA压敏胶，通过激光切割对流道板上的图案化结构进行加工。底部玻璃板203为病理级载玻片，表面具有优秀的亲水能力。通过具有双面粘性的流道层将微流控芯片上样板与底部玻璃板相连接，组装制备成完整的微流控芯片2，使用亲水处理剂对微流控芯片2内部流道215进行亲水处理，以产生足够用于样品进样的毛细力。
用于控制微流控芯片中液体流动的控制装置3，其顶盖301上的孔位通过过盈配合将四个定位螺母302安装至顶盖上预留的螺母安装孔位309，分别将四个螺杆303旋入定位螺母302中后再在螺杆303末端固定上触点304，最后将电磁铁305也通过过盈配合安装至顶盖上的电磁铁安装口310（图4和图5）。
微流控芯片生物传感器的组装过程如图5所示，装配好的顶盖301上的缺口311与芯片底座306上的位点312对准后配合安装，然后将卡扣307从芯片底座固定滑块308端，将顶盖301后半部分与芯片底座306固定。将微流控芯片2对准芯片更换滑块308上的微流控芯片安装槽313，然后整体滑入芯片底座306中，将安装好微流控芯片2的控制装置3插入观察暗箱1中，暗箱体的固定块108会与顶盖上的固定缺口319将顶盖301与芯片底座306固定。如图5所示手动旋紧各螺杆303，使流道截止；当螺杆303旋松后，流道形变恢复后开启。依次旋动阀门315、316、317、318可控制液体流动。
实施例2 微流控芯片生物传感器中识别元件的筛选
通过全细胞筛选技术获得蜡样芽孢杆菌核酸适配体，进而实现本申请中蜡样芽孢杆菌的特异性识别。实验过程中用到的核酸序列见表1。具体全细胞筛选过程为：(a) 取合成的随机文库 1nmol，95℃变性 5min，立即置于冰上，放置5min，在已处理的文库中加入600μL菌悬液，以及过量的 tRNA 和BSA。35℃ 120rpm 振荡培90min。(b)孵育后8000rpm，4℃离心5min，与目标菌体相结合的 ssDNA 随着菌体被沉降下来，而未与目标菌体结合的ssDNA 则在上清中，尽量倒掉上清，用 1×BB 清洗2遍沉淀，去除结合能力较弱的ssDNA。(c) 加入100μL 1×TE缓冲液重悬结合 ssDNA 文库的菌体，95℃加热5min，立即置于冰上5min，使得结合在菌体表面的适配体因变性从菌体表面脱离。(d) 将悬液置于冷冻离心机中 4℃，12000rpm，离心5min，吸取上清液保存，记为M，并以此为模板进行大量 PCR 扩增，为下一轮筛选用的文库做准备。具体加入量如表2所示，上游引物（SEQ ID NO：8）5’修饰FAM基团，下游引物（SEQ ID NO：9）5’修饰磷酸基团，便于Lambda外切酶识别、切割。PCR 反应条件为：98℃预变性4min，98℃变性10s，59℃退火20s，72℃延伸20s，72℃再延伸2min，反应循环数设置为16。(e) 收集各管的 PCR 产物，使用 PCR 产物纯化试剂盒清除无关试剂，取纯化后样品，加入 0.1倍体积的 Lambda核酸外切酶缓冲液和 Lambda外切酶混合均匀（50μL反应体系，加入 5μL Lambda核酸外切酶），37℃反应30min，之后 75℃水浴15min。(f) 向350μL菌悬液中加入100pmoL每一轮的酶切纯化产物在室温下孵育45min，经8000rpm于4℃离心5 min后洗涤重悬于1mL 1×BB中，将混合液转移至流式管内，全程注意避光。使用流式细胞仪分别测定每一轮菌悬液的荧光强度值。保存数据，使用FlowJo软件对数据分析。（g）最终将筛选13轮的产物测序，测序结果见图6-A、B。
根据同源性分析、二级结构预测以及最小自由能可将这20条序列分为7大家族，如图6-C所示，再次根据最小自由能最低原则选出7条代表家族的候选适配体，将靶菌与候选适配体混合孵育（条件同上（f））后，使用流式细胞仪进行亲和性、特异性与解离常数的测定，结果如图6-D、E、F所示。在亲和性分析中，13-18（SEQ ID NO：6）与13-24（SEQ ID NO：7）序列的平均荧光强度较高，说明二者亲和性较强；在特异性分析中，13-18以及13-24对蜡样芽孢杆菌的特异性较高；在解离常数测定中，13-24以及13-18的Kd值较低，其中，13-18适配体的Kd值最低，说明13-18-蜡样芽孢杆菌复合物较为稳定。选择13-18及13-24序列继续后续优化分析。
表1 传感器检测中涉及到的核酸序列
Figure 719387DEST_PATH_IMAGE001
表2 qPCR体系
Figure 105369DEST_PATH_IMAGE002
实施例3 微流控芯片生物传感器中识别元件的裁剪优化
在实施例2结果的基础上进行裁剪优化，使用IDT预测优选适配体的二级结构，选择最小自由能最低的预测结果进行后续裁断操作，在发夹结构两侧预留2-3 nt的末端，将裁剪后的适配体称为裁剪适配体。再对裁剪适配体进行二次裁剪，二次裁剪的目的是将裁剪适配体中完整的茎环结构拆开细分，以此对参与互作的适配体核心序列进行精确定位，将二次裁剪的适配体称为次级裁剪适配体。使用IDT网站对裁剪适配体与次级裁剪适配体的二级结构进行预测，选择切割长度适宜与最小自由能较低的序列合成。多次裁剪仍重复上述操作。
向1.5 mL 棕色离心管中加入100pmol裁剪适配体序列，95℃变性5min，置于冰上放置5min，与350μL蜡样芽孢杆菌混合，混合液在35℃，120rpm的摇床中孵育45min，之后经过4℃，8000rpm，离心5min，使用1×BB清洗一次后，取1mL 1×BB重悬管底的菌体，转移至流式管内，轻轻振荡，打散细胞团。使用流式细胞仪进行分析。
结果如图7-A所示，根据茎环存在位置，将13-18适配体先后裁剪为13-18-1，13-18-2以及13-18-1a和13-18-1b四条裁剪适配体序列，将13-24适配体裁剪为13-24-1、13-24-2两条裁剪适配体。使用流式细胞仪对靶菌和裁剪适配体进行亲和性、特异性以及解离常数的测定。在亲和性分析中，如图7-B所示，13-18-1和13-18-2的结合能力最强，且二者同时作用时的结合能力更强；在特异性分析中，如图7-C所示，13-18-1和13-18-2两条裁剪适配体的菌种特异性与13-18相差不大，保持得较好；在解离常数测定中，如图7-D所示，13-18-1的Kd值最小，13-18-2次之，说明13-18-1的结合亲和力最强。
故选择13-18-1（SEQ ID NO：1）和13-18-2（SEQ ID NO：2）作为传感器中捕获蜡样芽孢杆菌的特异性适配体。
实施例4微流控芯片生物传感器中识别元件的构建
将上述优化获得的适配体13-18-1序列（SEQ ID NO：1）连接到磁珠上：取10 μL 5mg/mL直径为200nm的链霉亲和素修饰的磁珠与10 μL 1 μM的5’端修饰生物素的捕获适配体13-18-1（SEQ ID NO：1）在小离心管内进行混合，随后在室温下振荡（转速为120 rpm）孵育30min，过程中可查看孵育情况1次，人为颠倒离心管，避免磁珠长时间振荡出现的沉淀挂壁等现象。使用1×BB清洗复合体一次，磁分离后，使用1×BB重悬复合体，置于4℃冰箱中备用。如图8可知1μM为捕获适配体的最佳连接浓度。
实施例5 微流控芯片生物传感器中信号转换元件的构建
将上述获得的信号适配体13-18-2序列（SEQ ID NO：2）作为信号转换元件——哑铃型锁式探针的一部分，与小檗碱发光核酸适配体（SEQ ID NO：4）、切刻内切酶Nb.BbvCl识别特定序列以及滚环扩增引物结合区域共同完成信号转换：自成环后的哑铃型探针首先依靠特异性适配体的亲和力捕获样品中的靶菌，随后结合扩增引物（SEQ ID NO：4），在Phi 29DNA聚合酶的作用下进行RCA反应，产生大量的重复的小檗碱发光核酸适配体单位，随扩增进行，切刻内切酶Nb.BbvCl识别夹在重复单位之间的结合序列，结合后进行切割，使小檗碱发光核酸适配体从产物中游离出来，结合小檗碱后发出荧光信号。
哑铃型探针需要提前自成环，各组分用量及部分操作如下表3所示，大量制备，75℃加热15 min，灭活连接酶后，保存在4℃。
表3信号适配体体系外连接各组分用量及操作
Figure 353948DEST_PATH_IMAGE003
反应涉及到的RCA-发光体系需要提前配置，并冷冻干燥，保存在通风干燥环境中，使用时加入40 μL ddH2O充分混匀即可使用，成分及用量如下表4所示。
表4 RCA冻干体系试剂加入量
Figure 217999DEST_PATH_IMAGE004
实施例6微流控芯片传感器的使用方法
微流控芯片传感器的使用方法如图9所示:
（1）将制备好的微流控芯片2插入装置内，按照实施例1描述组装装置；
（2）旋动关闭各阀门的螺杆303，使触点304接触上样板，停止液体流动，即关闭315、316、317、318四个阀门；
（3）使用一次性滴管按刻度依次将样品液、磁性捕获复合体-哑铃型探针、RCA-发光体系、缓冲液从上样板201的上样口204、205、206、207中加入到芯片对应的位置209、210、211、212；
（4）在废液池214处安装好吸水海绵；
（5）旋动打开进样阀门315使得磁性捕获复合体-哑铃型探针与样品液进入反应腔213混合，关闭进样阀门315，外加磁场打开，样品与磁珠充分混匀10 min；
（6）打开出液阀门318，保持磁场，废液体在海绵作用下流出反应腔213，关闭出液阀门318；
（7）打开缓冲液阀门316，缓冲液流入反应腔213，缓冲液与磁珠-样品混合物充分混合，关闭缓冲液阀门316；
（8）重复步骤6；
（9）打开反应阀门317，RCA-发光体系RCA-发光体系流入反应腔213， 35 ℃反应30min；
（10）取下电磁铁305；
（10）打开紫外光，从暗箱1顶盖102上的采集窗107观察结果，打开智能手机“实时取色器”软件，点击“实时去色”模块，同时打开手机后置摄像头，从采集窗107对准微流控芯片2上的反应腔213拍摄，并随机记录三点处的R、G、B值，根据R值-菌液浓度的标准曲线推知样品中的靶菌浓度。
实施例7 微流控芯片对蜡样芽孢杆菌检测特异性的影响
使用大肠杆菌O157:H7（ATCC23889）、志贺氏菌（CICC21535）、鼠伤寒沙门氏菌LT2（CICC10420）、金黄色葡萄球菌（BNCC238481）、单增李斯特菌（CICC21633）、枯草芽孢杆菌（CICC10002）以及苏云金芽孢杆菌（中国农业大学动物医学院10060）作为非特异性菌种，蜡样芽孢杆菌（CICC21261）作为特异性菌种，并将上述菌混合后制成混合菌样。将菌液4℃，12000 rpm 离心5 min，去除培养基，加入1×BB清洗2遍菌细胞，重悬。
由图10 B和D结果可以看出，蜡样芽孢杆菌组以及含有蜡样芽孢杆菌的菌种混合组均发出较强的荧光，而非特异性菌种组存在一定的荧光，但与靶菌组差异显著，将R值作图可得到图10 D，结果说明传感器具有一定的菌种特异性。
实施例8 微流控芯片对蜡样芽孢杆菌检测的线性范围
将对数期与衰退期的菌细胞液按一定比例（1：4）混合均匀，将混合菌液4℃，12000rpm 离心5 min，去除培养基，加入1×BB清洗2遍菌细胞，重悬，使用灭菌后的0.9%生理盐水对对数期和衰退期混合得到的蜡样芽孢杆菌菌液进行梯度稀释，得到稀释倍数依次为0倍-106的菌液，使用本传感器进行检测，使用手机软件“实时取色器”检测反应腔荧光的R值，将R值与稀释后菌落数一一对应作图，确定本传感器的有效检测范围以及最低检测限。
由图10A结果可以看出，随稀释倍数升高，菌液浓度依次降低，芯片中反应腔所发出的荧光的R值、G值逐渐下降，其中R值变化显著，B值变化不显著。将R、G、B值分别对菌液浓度作图，得到线性拟合曲线，结果如图10-C所示，相比于G值与B值，R值部分在舍去100点后得到的拟合曲线的斜率（Slope）较大，说明不同浓度菌液对应发出的荧光强度的R值差异较大，变化显著，进一步得到最佳检测范围为1.59×102-1.59×107 CFU/mL。因此后续取R值进行分析。根据R值拟合曲线得到公式，在已知空白对照组R值=47的情况下，使用公式（1）（s是空白组的标准差，slope是标准曲线的斜率），可得本传感器的最低检测限为9.27 CFU/mL。
Figure 750480DEST_PATH_IMAGE005
公式（1）
实施例9 微流控芯片对真实食品样品内蜡样芽孢杆菌的检测
为了得到能够在不同实际检测环境（或样品）的高效适配体，取常见易受蜡样芽孢杆菌污染的样品进行灭菌，加入0.9%生理盐水以1：9的比例充分混匀，并按照表5对实际样品进行处理，各实际样品稀释液放入4℃冰箱保存备用，用时加入一定量去除培养基的纯菌液：
表5模拟不同检测环境的配方表
Figure 776205DEST_PATH_IMAGE006
由图11结果可以看出，相比于空白对照组，实验组的反应腔均出现荧光，但受到食品成分影响，牛奶、火腿肠以及米饭组的荧光R值均低于纯菌液组，其中牛奶组的加标回收率最高，为51%。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taacgaagta ccctcggggc gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggctact ggagcatctg 20
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaggacatt aacgaagtac cctcggggcg gccgtcctca gcaacataat ttaaatattt 60
tatgttgc 68
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaatgtcct ca 12
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacataaaat atttaaatta tgt 23
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcacagagg tcagatgggc tactggagca tctggtaacg aagtaccctc ggggcgg 57
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcacagagg tcagatgatc gagggcgcag accgaacccg cgtgcgcagt acaagggc 58
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcagcacag aggtcagatg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttcacggta gcacgcatag 20

Claims (10)

1.一种蜡样芽孢杆菌检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器，其特征在于，由暗箱、微流控芯片及控制装置组成；
所述暗箱是由箱体、暗箱顶盖、紫外灯珠隔板及紫外灯珠组成；
所述微流控芯片包括识别元件、转化元件以及信号输出元件；
所述识别元件是指连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，其中蜡样芽孢杆菌适配体通过全细胞筛选、裁剪获得；
所述转化元件是通过探针将蜡样芽孢杆菌信号转化为核酸信号；
所述信号输出元件即通过智能手机拍摄微流控芯片的反应腔，并根据获得的RGB值和标准曲线推知靶菌浓度；
所述控制装置是控制微流控芯片内液体流动的装置，实现一次性上样检测。
2.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述微流控芯片是由上样板、流道板及底部玻璃板组成；
所述微流控芯片的上样板上包括用于上样待测液体的样品的上样口、用于上样适配体功能化磁珠的上样口、用于上样RCA-发光体系的上样口、用于上样1×BB缓冲液的上样口及用于放置海绵的废液出样口；在上样时，可一次性将待测样品、磁性捕获复合体-哑铃型探针、缓冲液以及RCA-发光体系沿对应上样口加入对应腔内；
所述微流控芯片的流道板上包括用于储存各进样试剂的待测样品进样腔、磁珠进样腔、RCA-发光体系进样腔、1×BB缓冲液进样腔、反应腔用于放置海绵的废液腔及连接各腔体结构的微流道。
3.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述控制装置包括顶盖、四个定位螺母、四个螺杆、四个触点、电磁铁、芯片底座、卡扣及芯片更换滑块组成；
所述顶盖上留有用于固定定位螺母及电磁铁的安装孔以及用于方便进样的与下方微流控芯片对应的进样孔。
4.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述识别元件是连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，既可以识别菌体又可以实现电磁分离；
所述适配体序列如SEQ ID NO：1所示。
5.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述信号转化元件是哑铃型探针和滚环扩增引物组成，其中哑铃型探针作为扩增模板，滚环扩增引物作为扩增引物；
所述哑铃型探针序列如SEQ ID NO：3所示；
所述滚环扩增引物序列如SEQ ID NO：5所示。
6.一种蜡样芽孢杆菌检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的微流控芯片生物传感器实现检测，具体检测步骤为：
步骤一：将微流控芯片安装到控制装置中，并关闭各阀门；
步骤二：将样品液、磁性捕获复合体-哑铃型探针、RCA-发光体系、缓冲液滴加到微流控芯片上；
步骤三：在废液池处安装好吸水海绵；
步骤四：打开进样阀门，释放磁性捕获复合体-哑铃型探针和样品液于反应腔中，外加磁场打开，使其充分混匀；
步骤五：保持磁场，打开出液阀门，流出废液，后关闭出液阀门；
步骤六：打开缓冲液进样阀门，释放缓冲液于反应腔中，在磁场作用下充分混合，关闭缓冲液进样阀门；
步骤七：，重复步骤五；
步骤八：打开反应液进样阀门，释放RCA-发光体系流入反应腔，30~37 ℃反应30 ~60min；
步骤九：取下电磁铁；
步骤十：打开紫外灯珠，从暗箱顶的采集窗对准微流控芯片上的反应腔拍摄，并随机记录三点处的R、G、B值，根据R值-菌液浓度的标准曲线推知样品中的靶菌浓度。
7.如权利要求6所述的检测方法在蜡样芽孢杆菌检测试剂盒中的应用。
8.如权利要求6所述的检测方法在食品安全蜡样芽孢杆菌检测中的应用。
9.如权利要求1-8中任一项所述的微流控芯片在蜡样芽孢杆菌检测中的应用。
10.如权利要求1-9中任一项所述的微流控芯片生物传感器在蜡样芽孢杆菌检测中的应用。
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