CN116355908B - 一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测β‑乳球蛋白的磁性适配体生物传感器，包括：一、检测β‑乳球蛋白的磁性适配体生物传感器的构建策略；二、检测β‑乳球蛋白的磁性适配体生物传感器序列；三、检测β‑乳球蛋白的磁性适配体生物传感器条件优化；四、β‑乳球蛋白的检测。设计原理是利用捕获探针与信号探针夹心识别β‑乳球蛋白后双适配体构象改变，荧光染料SYBR Green I由结合态转变为游离态诱导了荧光信号变化，同时该信号变化与靶标浓度呈现线性关系，根据荧光变化差值对靶标进行定量检测。该生物传感器最终实现了β‑乳球蛋白快速、低成本、强特异性和高灵敏度的荧光检测。

Description

一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器。
背景技术
食物过敏是一个备受各国政府及公众关注的健康问题，联合国粮农组织(FAO)认定，牛乳为八大类主要过敏食物之一，牛乳蛋白过敏可引发过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、腹泻、胃肠出血等症状。这种过敏反应会威胁婴幼儿健康，甚至导致其死亡。食物过敏尚无特效疗法，若确诊过敏，只有通过完全避食预防。故食品中过敏源成分的标识与检测对于保障过敏消费群体的安全具有重要意义。
据调查，约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏，同时β-乳球蛋白也是婴幼儿最主要的过敏原之一。因此，β-乳球蛋白可以作为一种检测食品中是否含牛乳蛋白的一种有效标志物。目前，对于β-乳球蛋白的检测主要包括液相色谱法和免疫学法。市面上唯一一款快检试剂盒即ELISA试剂盒虽有操作便捷、灵敏度高等特点，但无法检测加工处理后的过敏原，且成本高、耗时久(至少需要4 h)，并不能满足快速检测的需求。
生物传感器被认为是最有前途的分析工具之一。已有一些基于生物传感器的分析方法被报道用于β-乳球蛋白的检测，包括表面等离子体共振、电化学和荧光。其中，基于荧光的生物测定法因其反应快、成本低、使用简单以及灵敏度高而优于其他方法。然而，尽管拥有出色的光学性能，但由于缺乏选择性，荧光检测法的发展受到限制。为了克服这一缺点，本发明将核酸适配体引入荧光生物传感器中。
核酸适配体是指通过指数富集(SELEX)体外筛选获得的一组随机核酸序列，具有亲和度高、成本低、稳定性好、易于合成和修饰等优点。2017年，Shimaa Eissa等使用SELEX方法首次使用琼脂糖珠筛选58 mer β-乳球蛋白的高亲和核酸配体，并以此构建了石墨烯电化学生物传感器。但电化学生物传感器检测的最大缺点是信号输出不稳定，平台搭建复杂。且以往基于SGI的荧光生物传感器研究缺乏样品预处理步骤，这可能导致信号被复杂样品中的其他基质干扰从而降低分析的灵敏度和特异性。
本发明基于β-乳球蛋白生物传感器序列在引入检测靶标前后发生构象变化，SYBRGreen I从适配体中释放出来诱导了荧光信号的变化，进而实现β-乳球蛋白的检测。该检测将牛血清白蛋白和适配体修饰的氨基功能化磁珠作为捕获探针，荧光染料SYBR Green I嵌入的适配体2作为信号探针，荧光强度作为响应信号，最终实现了β-乳球蛋白低成本、超灵敏、强特异性、快速便携检测。
发明内容
基于此，本发明提供一种用于β-乳球蛋白的磁性捕获探针设计方法，以及β-乳球蛋白磁性双适配体生物传感器。
一方面，本申请提供了一种β-乳球蛋白的磁性捕获探针设计方法。
所述的β-乳球蛋白的磁性捕获探针是指用牛血清白蛋白和氨基修饰的适配体共孵育在氨基功能化磁珠表面，使其具有降低非特异性吸附和捕获更多靶标的功能。
具体的，首先将氨基修饰的磁珠活化；然后加入牛血清白蛋白和氨基修饰的适配体在缓冲液体系下孵育：
具体的，氨基修饰的适配体序列如下：
G4：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG-3’ ，如SEQ ID NO.5所示；
2G4：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG-3’ ，如SEQ ID NO.6所示；
5T-G4：5’- TTTTTGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG-3’ ，如SEQ ID NO.7所示；
所述的磁性捕获探针可在实际样品中特异性捕获β-乳球蛋白。
另一方面，本申请提供了一种夹心识别β-乳球蛋白免标记信号探针的设计。
所述的夹心识别β-乳球蛋白免标记信号探针的设计是指SYBR Green I嵌入发卡结构的适配体2，基于SYBR Green I结合态与游离态变化诱导荧光信号变化。
具体的，将SYBR Green I与适配体2孵育结合；
具体的，适配体2序列如下：
st-A：5’-GCAGTACCCACCCACCAGCCCCAACATCATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
st-B：5’-CGGACCGCCCATCCG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
st-BC：5’-CGACGATCGGACCGCCCATCCGTGTGTG-3’，如SEQ ID NO.10所示；
R-st-A：5’-AGTACCCACCCACCAGCCCCAACATCAT-3’，如SEQ ID NO.11所示；
C-st-A：5’-ACCGCCCATCCG-3’，如SEQ ID NO.12所示；
M-st-B：5’-CCCACCGCCCATCCG-3’，如SEQ ID NO.13所示；
L-st-B：5’-CGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
2L-st-B：5’-CGGACCGCCCATCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.2所示；
2L-5T-st-B：5’-CGGACCGCCCATTTTTTCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
2L-10T-st-B：5’-CGGACCGCCCATTTTTTTTTTTCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
另一方面，本发明公开了一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器，包括：一、检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器的构建策略；二、检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器序列；三、检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器条件优化；四、β-乳球蛋白的检测；
所述β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器的构建策略是利用捕获探针与信号探针夹心识别β-乳球蛋白后双适配体构象改变，利用捕获探针与信号探针夹心识别β-乳球蛋白后双适配体构象改变，荧光染料SYBR Green I由结合态转变为游离态诱导了荧光信号变化，同时该信号变化与靶标浓度呈现线性关系，根据荧光变化差值对靶标进行定量检测；
所述的捕获探针指牛血清白蛋白和氨基修饰的适配体共孵育修饰在氨基功能化磁珠使其具有降低非特异性吸附和结合更多的靶标的功能；构建条件为：0.01 mg氨基功能化磁珠，磁珠氨基修饰的适配体1碱基的寡核苷酸数目为27-54 nt，牛血清白蛋白浓度为0.001-10 μg·mL-1，氨基修饰的适配体1浓度为0.01-1 μmol·L-1，孵育时间为10-150min；此时缓冲液体系为10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH8.4；
优选的，磁性纳米探针构建条件为：氨基修饰的适配体1碱基的寡核苷酸数目为54nt，牛血清白蛋白浓度为1 μg·mL-1，氨基修饰的适配体1浓度为1 μmol·L-1；
所述的夹心识别β-乳球蛋白免标记信号探针的设计是指SYBR Green I嵌入发卡结构的适配体2，基于SYBR Green I结合态与游离态变化诱导荧光信号变化。
所述检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器序列，生物传感器的序列为：5’-CGGACCGCCCATTTTTTTTTTTCGGACCGCCCAT-3’ ，如SEQ ID NO.4所示。
所述β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器反应条件优化包括缓冲液体系Na+和Mg2 +浓度和孵育时间。
所述的β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器反应条件优化为10 mmol·L-1 Tris-HCl中增加0-160 mmol·L-1 Na+和0-20 mmol·L-1 Mg2+，孵育时间为5-30 min；
优选的，β-乳球蛋白生物传感器的反应条件及成分是10 mmol·L-1 Tris-HCl, pH7.5, 和10 mmol·L-1 MgCl2，孵育时间为30 min。
所述的β-乳球蛋白的检测是基于β-乳球蛋白的磁性适配体在靶标存在时发生构象变化，进而影响SYBR Green I从结合态转变为游离态，使得荧光信号呈现梯度变化，实现β-乳球蛋白的检测。
另一方面，证明β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器对β-乳球蛋白的灵敏度和选择性。
选用牛奶中的乳蛋白或过敏原对β-乳球蛋白生物传感器的选择性进行评估。首先，将0.01 mg磁性纳米探针与0.1 mg·mL-1 100 μL 牛血清白蛋白、酪蛋白、乳铁蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白在37℃下震荡孵育40 min，利用缓冲液洗涤（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）以除去未接合的β-乳球蛋白。其次，将100μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针。最后，取94 μL 含β-乳球蛋白的磁性捕获探针混合液与6 μL信号探针在37℃下震荡孵育30 min。利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。将β-乳球蛋白荧光值变化值代入线性回归方程中，计算出β-乳球蛋白的线性检测范围。同时，基于相应蛋白荧光值变化可判断出其他蛋白的荧光值变化小于β-乳球蛋白，以此证明该β-乳球蛋白生物传感器具有较好的选择性。
另一方面，β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器对含有β-乳球蛋白的实际样品检测，具体操作如下：
选用鲜奶作为液体样品。首先，将鲜奶在40℃ 孵育30 min后离心20 min （6000rpm），随后冰浴冷却15 min。去除凝乳后，加入HCl调节pH至4.7。然后，将含有β-乳球蛋白的上清液从酪蛋白和牛血清白蛋白沉淀中离心分离出来。随后将乳清样品用NaOH中和至pH7.4，稀释20倍后分别在牛奶样品中添加1 μg·mL-1、10 μg·mL-1和100 μg·mL-1 β-乳球蛋白。取100 μL制备好的样品与0.01 mg磁性纳米探针在37℃下震荡孵育40 min，利用缓冲液洗涤（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）以除去未结合的β-乳球蛋白。其次，将100 μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针。最后，取94 μL含蛋白和捕获探针混合液与6 μL信号探针在37℃下震荡孵育30 min。利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。将β-乳球蛋白加入前后荧光值的变化值代入标准曲线，计算得到待测样品中β-乳球蛋白的含量，实现对β-乳球蛋白的定量检测。
另一方面，涉及该生物传感器在β-乳球蛋白检测方法开发中的应用，以及在β-乳球蛋白食品安全检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明合成了一种新型纳米磁珠MB@BSA@Apt，可提高捕获靶标效率，提高稳定性，降低非特异性干扰。
2、本发明对β-乳球蛋白的适配体进行了优化裁剪，得到了效果更佳、成本更低的适配体。
3、本发明基于磁性双适配体变构调节构建了免标记荧光生物传感器，实现了对β-乳球蛋白的简便、快速、低成本、高特异性和超灵敏检测。
4、本发明提出的β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器可在1 h内实现牛奶或奶粉中β-乳球蛋白的检测，线性检测范围是10 ng·mL-1~1 mg·mL-1，最低检测限是8.06 ng·mL-1。满足实际检测的需求。
附图说明
图1为β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器原理图。（A）磁性纳米探针的制备。（B）生物传感器的原理。
图2为纳米捕获探针（MB@BSA@Apt1）的紫外、电位和电势表征结果图。（A）260 nm和280 nm条件下适配体1(2G4)，牛血清白蛋白（BSA）和上清液的紫外吸收光谱图。（B）260 nm和280 nm条件下磁珠（MB）与MB@BSA@Apt1的紫外吸收光谱图。（C）MB的纳米颗粒尺寸分布柱状图。（D）MB@BSA@Apt1的纳米颗粒尺寸分布柱状图。（E）MB、MB@BSA和MB@BSA@Apt1的电位值。
图3为适配体2的筛选和表征图。（A）β-乳球蛋白原始适配体。（B）L-st-B裁剪的适配体。（D）2L-st-B裁剪的适配体。（E）2L-5T-st-B裁剪的适配体。（C）和（F）裁剪后各适配体之间的Ct比较。
图4为β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器不同条件下的荧光发射光谱。（A）SYBRGreen I。（B）β-乳球蛋白。（C）SYBR Green I + β-乳球蛋白。（D）SYBR Green I + 适配体2。（E）SYBR Green I +适配体2+ β-乳球蛋白。SYBR Green I：5×；β-乳球蛋白：1mg·mL-1；适配体2（2L-5T-st-B）：1 μmol·L-1。
图5为β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器检测β-乳球蛋白的标准曲线图。
图6为β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器选择性验证的结果图。
图7为β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的适配体环长度、Na+浓度、Mg2+浓度以及孵育时间在内的参数优化结果图。（A）Na+浓度优化结果图。（B）Mg2+浓度优化结果图。（C）孵育时间优化结果图。（D）适配体环长度优化结果图。（E）最佳适配体2L-10T-st-B的结合亲和力曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1. β-乳球蛋白磁性纳米探针设计
1.构建磁性纳米探针
由于实际样品中存在多种物质，为了降低其他物质的干扰，同时尽可能多地捕获实际样品中的目标物质，因此设计了一个磁性纳米探针特异性捕获样品中的β-乳球蛋白。具体操作是，利用牛血清白蛋白与氨基修饰的适配体1和氨基功能化磁珠共同孵育。
通过实时荧光定量PCR方法对牛血清白蛋白浓度、适配体1浓度和共孵育时间进行优化。首先，在0.01 mg·mL-1 100 μL氨基修饰的磁珠中加入 1 mg·mL-1 2 μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 2.5 mg·mL-1 5 μL N-羟基琥珀酰亚胺震荡孵育30 min。随后，25 mmol·L-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（pH 6）洗涤3次。随后加入0.001-10 μg·mL-1牛血清白蛋白，0.01-1 mmol·L-1适配体1在10-150 min，37℃下共孵育。利用缓冲液（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）洗涤3次以除去未结合的牛血清白蛋白和适配体序列1。在0.01 mg·mL-1 3 μL纳米探针中加入10mmol·L-1 1.5 μL上下游引物，30 μL 2×TransStart Green qPCR SuperMix和24 μL去离子水。PCR反应条件为：95℃ 5 min；40个循环95℃ 15 s, 50℃ 30 s, 72℃ 30 s。重复三次平行试验。通过Ct值来判断适配体1最佳结合条件。
通过紫外分光光度计验证了纳米探针是否成功合成。首先，在0.01 mg·mL-1 100μL氨基修饰的磁珠中加入 1 mg·mL-1 2 μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 2.5 mg·mL-1 5 μL N-羟基琥珀酰亚胺震荡孵育30 min。随后，25 mmol·L-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（pH 6）洗涤3次。随后，加入1 μg·mL-1 30 μL牛血清白蛋白溶液和1mmol·L-1 30 μL 适配体1序列在37℃下震荡共孵育30 min。利用缓冲液（10 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）洗涤3次以除去未接合的牛血清白蛋白和适配体序列1。最后，分别对1 μg·mL-1牛血清白蛋白溶液、1 mmol·L-1适配体1序列溶液、制备纳米探针的上清液、0.01 mg·mL-1氨基磁珠和0.01 mg·mL-1磁性纳米探针在260 nm和280 nm处测量吸光度。通过比较吸光度变化反映牛血清白蛋白和适配体1是否成功修饰在氨基磁珠表面。
通过马尔文粒径仪对磁性纳米探针的粒径和电位进行评估。首先，在0.01 mg·mL-1 100 μL氨基修饰的磁珠中加入 1 mg·mL-1 2 μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 2.5 mg·mL-1 5 μL N-羟基琥珀酰亚胺震荡孵育30 min。随后，25 mmol·L-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（pH 6）洗涤3次。随后，加入1 μg·mL-1 30 μL牛血清白蛋白溶液和1 mmol·L-1 30 μL 适配体1序列在37℃下震荡共孵育30 min。利用缓冲液（10mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）洗涤3次以除去未结合的牛血清白蛋白和适配体序列1。将氨基磁珠和磁性纳米探针用去离子水稀释至0.0001mg·mL-1。通过对比氨基磁珠与磁性纳米探针的粒径和电位变化来判断牛血清白蛋白和适配体1是否成功修饰在氨基磁珠表面。
实验中用到的适配体1序列如下：
FR-G4（SEQ ID NO.14）：5’- GGGGTTGGGGTATGATTATCCGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTATGTATGGGGTTATCC-3’
FR-2G4（SEQ ID NO.15）：5’- GGGGTTGGGGTATGATTATCCGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTATGTATGGGGTTATCC-3’
FR-5T-G4（SEQ ID NO.16）：5’- GGGGTTGGGGTATGATTATCCTTTTTGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTATGTATGGGGTTATCC-3’；
Forward primer1（SEQ ID NO.17）：5’- GGGGTTGGGGTATGATTATCC-3’
Reverse primer1（SEQ ID NO.18）：5’- GGATAACCCCATACATACCCC-3’
（注：加粗碱基为上下游引物碱基）
如图2所示，通过测量紫外（图2A和B）、尺寸（图2C和D）和Zeta电位（图2E），验证了BSA和2G4在MB表面的成功修饰。如图2A所示，在MB表面修饰BSA和Apt1后，上清液分别在260nm和280 nm处吸收值降低。如图2B所示，与MBs相比，MB@BSA@Apt1在260 nm和280 nm处有一个较高的吸收峰。这一结果更直观地表明，MB@BSA@Apt1的表面被BSA和Apt1修饰。用马尔文颗粒测定仪测量发现，MB@BSA@Apt1的平均尺寸为435.7 nm，未修饰的MB平均尺寸为418.8nm，表明BSA和Apt1修饰增加了MB的尺寸。此外，MB的表面显示出明显的正电荷。当缓冲液pH=7.5超过BSA的等电点（pI 4.6）时，BSA表面带负电，在MB表面的BSA修饰后，负电荷增加。同样地，Apt1表面也显示出负电荷。因此，在Apt1和BSA之间的共价键之后，MB表面的负电荷增加。因此，与MB@BSA和MB相比，在成功地将BSA和Apt1修饰在MB表面后，明显地出现了更多的负电荷。
2.构建信号探针
对β-乳球蛋白适配体2进行裁剪，通过实时荧光定量PCR方法验证最佳的裁剪策略。具体步骤如下：首先将1.0 mg·mL-1 50 μL β-乳球蛋白（0.1 mmol·L-1 NaHCO3, 0.5mol·L-1 NaCl, pH 8.3）与2.0 mg·mL-1 50 μL氨基化磁珠在室温下震荡孵育4 h，随后用孵育缓冲液洗涤3次以除去未结合的β-乳球蛋白。β-乳球蛋白修饰的磁珠可保存在50mmol·L-1 pH 7.5 Tris-HCl，4℃以备后续应用。50 μL 1 μmol·L-1 适配体2序列加热90℃ 10 min，在4℃冷却 5 min后与50 μL β-乳球蛋白在结合缓冲液条件（50 mmol·L-1Tris, pH 7.5, 150 mmol·L-1 NaCl, and 2 mmol·L-1 MgCl2）下混合孵育2 h。随后结合缓冲液洗涤β-乳球蛋白磁珠以除去未结合的适配体2。最后利用qPCR进行扩增，体系内包括3 μL 0.01 mg·mL-1 β-乳球蛋白磁珠, 10 µL 2×TransStart Green qPCR SuperMix和6μL 10 μmol·L-1上下游引物序列。扩增条件为94℃ 3 min；40个循环94℃ 15 s，55℃ 30s；72℃ 20 s。通过Ct值来判断裁剪的最佳适配体2序列。
实验中用到的适配体2序列如下：
FR-Org-β-LG（SEQ ID NO.19）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGACGATCGGACCGCAGTACCCACCCACCAGCCCCAACATCATGCCCATCCGTGTGTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-st-A（SEQ ID NO.20）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGTACCCACCCACCAGCCCCAACATCATGCAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-st-B（SEQ ID NO.21）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGGACCGCCCATCCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-st-BC（SEQ ID NO.22）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGACGATCGGACCGCCCATCCGTGTGTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-C-st-A（SEQ ID NO.23）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTAGTACCCACCCACCAGCCCCAACATCATAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-R-st-B（SEQ ID NO.24）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTACCGCCCATCCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-M-st-B（SEQ ID NO.25）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCCCACCGCCCATCCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-L-st-B（SEQ ID NO.26）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGGACCGCCCATAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-2L-st-B（SEQ ID NO.27）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGGACCGCCCATCGGACCGCCCATAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
FR-2L-5T-st-B（SEQ ID NO.28）：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCGGACCGCCCATTTTTTCGGACCGCCCATAGATAGTAAGTGCAATCT-3’
Forward primer2（SEQ ID NO.29）：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
Reverse primer2（SEQ ID NO.30）：5’-AGATTGCACTTACTATCT-3’
（注：加粗碱基为上下游引物碱基）
如图3所示，L-st-B（缩短为12个核苷酸；图3B）的亲和力优于原始β-LG（图3A）诱导体。然而，其他裁剪的序列亲和性降低（图3C）。这一结果表明，org-β-LG中的Loop2和左边的茎对于蛋白质目标的识别至关重要。
此外，为了提高亲和力，本研究还测试了一个二价合体（2L-st-B，含有24个核苷酸（图3D））和一个通过在连接的中间加入5个T碱基而得到的合体（2L-5T-st-B，含有29个核苷酸（图3E））。二价适配体显示出比单价适配体（L-st-B）（图3F）和增加了5个T-碱基的适配体更高的亲和力。这可能是由于较长的环形区域形成了一个不稳定的发夹结构，使目标更容易与茎部所在的基点结合。
实施例2. β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的检测性能评估
1.β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的检测原理
用于β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器如图1所示。如图1A所示，牛血清白蛋白和适配体1共孵育修饰在氨基功能化磁珠表面以构建磁性纳米捕获探针。这种纳米材料提供了几个优点。(1) 亲和力得到了提高。使用适配体1和磁珠构建的纳米探针在适配体与靶标成功结合后增强了结构稳定性。因此，它更有利于诱导剂与靶标的结合。(2) 减少了非特异性干扰。牛血清白蛋白修饰的纳米探针减少了对非特异性目标的吸附。(3) 灵敏度提高。由于牛血清白蛋白为适配体1的结合提供了更多的羧基位点，更多的β-乳球蛋白可以被捕获。如图1B所示，纳米探针表面的适配体1在K+和Na+缓冲液中构象变为G-四联体。另一侧，SYBRGreen I可以嵌入发卡结构的适配体2作为信号探针。在β-乳球蛋白存在时，双适配体可夹心捕获β-乳球蛋白。双适配体的构象都发生改变，从而将SYBR Green I从信号探针中释放出来诱导荧光信号的变化。基于此原理，体系中β-乳球蛋白的浓度梯度变化会导致溶液体系呈现荧光信号梯度，即在一定的范围内β-乳球蛋白浓度越高，荧光信号值越低。
如图4所示，当样品中只有SYBR Green I或β-乳球蛋白时，荧光信号接近于0。当样品含有含SYBR Green I和β-乳球蛋白时，荧光信号增强，背景值相对较低，甚至可以忽略。当样品含有2L-5T-st-B或SYBR Green I时，产生明显的高荧光信号，但在存在2L-5T-st-B、SYBR Green I和β-乳球蛋白时，荧光信号会降低。这些结果表明SYBR Green I可以插入发卡结构DNA核苷酸中，但不能插入单链核苷酸中并且裁剪的适配体对β-乳球蛋白显示出优异的亲和力。
2.β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的灵敏度评估
利用磁性捕获探针和信号探针对已知浓度的β-乳球蛋白进行检测，依据溶液荧光值的变化制作标准曲线。
首先将0.01 mg磁性纳米探针与0-1 mg·mL-1 100 μL 牛血清白蛋白在37℃下震荡孵育40 min，利用缓冲液洗涤（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）以除去未接合的β-乳球蛋白。其次，将100 μmol·L-1 2L-10T-st-B与100×SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针。最后，取94 μL含蛋白和捕获探针混合液与6 μL信号探针在37℃下震荡孵育30 min，此时的缓冲液体系为10m mol·L-1 Tris-HCl, pH 7.5, and 10 mmol·L-1 MgCl2。利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。基于加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值绘制标准曲线。
如图5所示，β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器在10 ng·mL-1-1 mg·mL-1范围内具有良好的线性关系（R2=0.9801），线性回归方程为F-F0 = 37.676 logcβ-LG + 209.987，检出限低至8.06 ng·mL-1。
3.β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的选择性评估
选用牛奶中的乳蛋白或过敏原对β-乳球蛋白生物传感器的选择性进行评估。首先，将0.01 mg磁性纳米探针与0.1 mg·mL-1 100 μL 牛血清白蛋白、酪蛋白、乳铁蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白在37℃下震荡孵育40 min，利用缓冲液洗涤（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）以除去未结合的β-乳球蛋白。其次，将100μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针。最后，取94 μL 含β-乳球蛋白的磁性捕获探针混合液与6 μL信号探针在37℃ 下震荡孵育30 min。利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。基于相应蛋白荧光值变化可判断出其他蛋白的荧光值变化小于β-乳球蛋白，以此证明该β-乳球蛋白生物传感器具有较好的选择性。
如图6所示，将吸光度变化值代入线性回归方程中，计算出的相应蛋白质浓度远小于β-乳球蛋白组的检测浓度，表明该β-乳球蛋白生物传感器具有较好的选择性。
实施例3. β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的检测条件优化
优化了信号探针识别β-乳球蛋白的适配体2序列长度、孵育液包括Na+和Mg2+浓度以及孵育时间。将1 μL 100 μmol·L-1 适配体2与5 μL 100× SYBR Green I室温混合孵育5 min以制备成信号探针。0.01 mg磁性纳米探针与0.1 mg·mL-1 100 μL β-乳球蛋白在缓冲液体系（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）中37℃震荡孵育40 min，并利用上述缓冲液体系进行洗涤以除去未结合的β-乳球蛋白。随后，对β-乳球蛋白-磁性捕获探针与信号探针夹心捕获的缓冲液体系进行优化，其中Na+引入0-160mmol·L-1（图7A），Mg2+引入0-20 mmol·L-1（图7B）；夹心孵育时间为5-30 min（图7C）适配体2序列长度进行优化（图7D）。最后，利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。基于不同条件体系下荧光值变化来判断最优的检测条件。
实验中用到的适配体2如下：
2L-st-B：5’- CGGACCGCCCATCGGACCGCCCAT -3’，如SEQ ID NO.2所示；
2L-5T-st-B：5’- CGGACCGCCCATTTTTTCGGACCGCCCAT -3’ ，如SEQ ID NO.3所示；
2L-10T-st-B：5’- CGGACCGCCCATTTTTTTTTTTCGGACCGCCCAT -3’ ，如SEQ ID NO.4所示；
如图7所示，通过在二价DNA核苷酸序列的中间位分别添加5个T-碱基和10个T-碱基，得到了具有更高亲和力的适体2。由于Na+影响蛋白质结构，Mg2+影响核酸序列构象，适配体2对β-LG的亲和力只有在适当的Na+和Mg2+浓度下才有可能，故在30分钟的最佳孵育时间内（图7C），最佳Na+和Mg2+浓度分别为0 mmol·L-1（图7A）和10 mmol·L-1（图7B），最佳适配体2序列为2L-10T-st-B (Kd=59.27 nmol·L-1，图7D和7E)。
实施例4. 真实样品中β-乳球蛋白的检测
选用鲜奶作为液体样品。首先，将鲜奶在40℃孵育30 min后离心20 min （6000rpm），随后冰浴冷却15 min。去除凝乳后，加入HCl调节pH至4.7。然后，将含有β-乳球蛋白的上清液从酪蛋白和牛血清白蛋白沉淀中离心分离出来。随后将乳清样品用NaOH中和至pH7.4，稀释20倍后分别在牛奶样品中添加1 μg·mL-1、10 μg·mL-1和100 μg·mL-1 β-乳球蛋白。取100 μL制备好的样品与0.01 mg磁性纳米探针在37℃下震荡孵育40 min，利用缓冲液洗涤（10 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 K+和100 mmol·L-1 Na+，pH 8.4）以除去未结合的β-乳球蛋白。其次，将100 μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针。最后，取94 μL含蛋白和捕获探针混合液，与6 μL信号探针在37℃ 下震荡孵育30 min，此时的缓冲液体系为10 mM Tris-HCl, pH7.5, and 10 mM MgCl2。利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm。将β-乳球蛋白加入前后荧光值的变化值代入标准曲线，计算得到待测样品中β-乳球蛋白的含量，实现对β-乳球蛋白的定量检测。
如表1所示，基于β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的乳制品样品加标回收率比较理想，说明该生物传感器能够实现真实样品中的β-乳球蛋白定量检测。
表1 基于β-乳球蛋白磁性适配体生物传感器的乳制品样品加标实验
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但是本发明不限于上述实施例，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种基于理性裁剪亲和力提高的β-乳球蛋白的适配体，其特征在于，所述适配体的核酸序列选自如下序列：
L-st-B：5’-CGGACCGCCCAT-3’ ，如SEQ ID NO.1所示；
2L-st-B：5’-CGGACCGCCCATCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.2所示；
2L-5T-st-B：5’-CGGACCGCCCATTTTTTCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
2L-10T-st-B：5’-CGGACCGCCCATTTTTTTTTTTCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白的适配体在β-乳球蛋白检测中的应用。
3.一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器，其特征在于，该生物传感器包括氨基功能化的磁珠，以及牛血清白蛋白和适配体1共孵育修饰在所述磁珠表面形成的磁性纳米捕获探针；
还包括SYBR Green I嵌入发卡结构的适配体2，以及结合SYBR Green I的所述适配体2形成所述生物传感器的信号探针；
所述磁性纳米捕获探针的适配体1在K+和Na+缓冲液中形成G-四联体构象；
所述磁性纳米捕获探针与所述信号探针可夹心识别β-乳球蛋白；捕获β-乳球蛋白的所述生物传感器将所述SYBR Green I从所述信号探针中释放，诱导荧光信号的变化，用于检测β-乳球蛋白；
其中，所述适配体1的序列为：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGGGGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG-3’ ，如SEQ ID NO.6所示；
所述适配体2的序列为：5’-CGGACCGCCCATTTTTTTTTTTCGGACCGCCCAT-3’，如SEQ IDNO.4所示。
4. 根据权利要求3所述的磁性适配体生物传感器对β-乳球蛋白进行定量检测的方法，其特征在于，包括标准曲线的建立：将0.01 mg磁性纳米探针与0-1 mg·mL-1 100 μL牛血清白蛋白在37℃下震荡孵育40 min制备磁性纳米捕获探针，利用缓冲液洗涤以除去未接合的β-乳球蛋白；其次，将100 μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针；最后，取94 μL含蛋白和磁性纳米捕获探针混合液与6 μL信号探针在37℃下震荡孵育30 min；利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm；基于加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值绘制标准曲线；以及对β-乳球蛋白的实际样品进行检测：选用鲜奶作为液体样品，将鲜奶在40℃孵育30 min后离心20 min，随后冰浴冷却15 min；去除凝乳后，加入HCl调节pH至4.7；将含有β-乳球蛋白的上清液从酪蛋白和牛血清白蛋白沉淀中离心分离出来；随后将乳清样品用NaOH中和至pH 7.4，稀释20倍后分别在牛奶样品中添加1 μg·mL-1、10 μg·mL-1和100 μg·mL-1 β-乳球蛋白；取100 μL制备好的样品与0.01mg磁性纳米探针在37℃下震荡孵育40 min获得磁性纳米捕获探针，利用缓冲液洗涤以除去未结合的β-乳球蛋白；其次，将100 μmol·L-1 2L-10T-st-B与100× SYBR Green I按照体积比为1：5在室温混合孵育5 min以制备成信号探针；最后，取94 μL含蛋白和磁性纳米捕获探针混合液，与6 μL信号探针在37℃下震荡孵育30 min；利用荧光分光光度计在505 nm至560 nm的范围内记录荧光发射光谱，激发波长为495 nm，使用发射狭缝为10 nm和5 nm；将β-乳球蛋白加入前后荧光值的变化值代入所述标准曲线，计算得到待测样品中β-乳球蛋白的含量，实现对β-乳球蛋白的定量检测；
其中所述2L-10T-st-B的序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1所述的适配体或权利要求3所述的生物传感器在制备β-乳球蛋白检测试剂盒中的应用，或权利要求4所述的方法在β-乳球蛋白食品安全检测中的应用。
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