CN111979247B - 一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明首次公开了小分子倍氯米松的核酸适配体，所述适配体序列如SEQ ID NO.1～6任一项所示，或SEQ ID NO.1～6截短后的活性序列。所述适配体的筛选运用多种技术筛选倍氯米松的适配体，如文库固定、磁珠分离、Q‑PCR检测、ePCR扩增、SDS‑PAGE和高通量测序等。经过15轮筛选，共发现6个候选适配体，其中6号对倍氯米松的亲和力和特异性最好，Kd值为0.15±0.02uM。

Description

一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及核酸适配体的筛选和应用技术领域，更具体地，涉及一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用。
背景技术
倍氯米松是一种强效的局部糖皮质激素。外用主要治疗湿疹、过敏性皮炎、神经性皮炎、接触性皮炎、牛皮癣及各种瘙痒症。倍氯米松气雾剂可用于过敏性哮喘、过敏性皮炎等疾病。副作用可引起红斑、丘疹、结痂等。因此，有必要对其质量进行研究。倍氯米松常与其他药物联合使用以进行疾病的临床治疗。Amira等利用质谱技术对倍氯米松的生物利用度进行了评价。这篇文章使用SELEX技术首次筛选到倍氯米松的适配体。
适配体是一种短单链寡核苷酸，具有很强的亲和性和特异性，靶标广泛，如离子、小分子、大分子、病毒、细胞等。目前已经商业化的有两种适配体，一种是用于治疗黄斑变性的Macugen(RNA适配体)，另一种是用于检测赭曲霉素的适配体生物测定法。与抗体相比，适配体具有许多优点，主要体现在稳定性高、低或无免疫原性、易修饰性和低成本的特性。自从Ellington等人报道了第一个DNA适配体以来，适配体引起了越来越多的关注。利用SELEX从含有1014～1015个DNA或RNA序列的文库中获得适配体，主要步骤包括:文库或靶标固定、靶标洗脱、非结合文库分离、结合适配体扩增和单链制备。通常将靶标固定在固体上，如磁性微球、琼脂糖珠、氧化石墨烯等。Na Qiao等,提出通过高效的化学交联方法将靶标蛋白质的氨基酸与磁珠表面活化的羧酸官能团结合以筛选适配体,该方法适用于大分子,因为小分子没有足够官能团以固定于固体表面,并且小分子靶标固定于磁珠表面将会占据的小分子的官能团而降低筛选效率。也有相关报道既不固定靶标也不固定适配体于固体表面，如Chao Zhu等，采用毛细管电泳法对牛乳铁蛋白进行适配体的筛选。洗脱是指在靶标的诱导下使适配体从固体中释放出来。分离是利用磁力或离心法将未结合的适配体与适配靶标复合物分离得到适配靶标复合物。制备单链的技术有很多，如不等长引物PCR、不对称PCR、lambda核酸外切酶消化、琼脂糖凝胶电泳等。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一种亲和力强特异性好的倍氯米松的核酸适配体。
本发明第二个方面的目的，在于提供上述核酸适配体的筛选方法。
本发明第三个方面的目的，在于提供上述核酸适配体在制备倍氯米松传感器中的应用。
本发明第四个方面的目的，在于提供一种倍氯米松检测传感器。
本发明第五个方面的目的，在于提供上述核酸适配体在检测倍氯米松中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种倍氯米松的核酸适配体，所述适配体序列如SEQID NO.1～6任一项所示，或SEQ ID NO.1～6截短后的活性序列。
优选地，根据本发明第一个方面所述的核酸适配体，所述截短后的活性序列3’末端为G碱基。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的核酸适配体，所述适配体序列如SEQ IDNO.7～12所示。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
S1.将ssDNA文库固定于磁珠表面，洗涤，得洗涤液；
S2.磁珠分离：将倍氯米松加入磁珠复合物中，孵育，洗脱，得洗脱液；
S3.qPCR检测：将步骤S1中洗涤液与S2中洗脱液进行qPCR检测；
S4.ePCR扩大文库：将步骤S2中洗脱液的剩余部分进行ePCR，扩大文库；
S5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳制备下一轮的文库；
S6.将富集的文库进行高通量测序；
S7.对测序后序列进行二级结构预测，并检测适配体的亲和力与特异性，筛选出亲和力高特异性强的核酸适配体。
优选地，根据本发明第二个方面所述的方法，步骤S1中将ssDNA文库溶解后，加入接头序列，进行梯度变性，将磁珠与变性混合物孵育后洗涤，得洗脱液。
优选地，根据本发明第二个方面所述的方法，在步骤S2中实施反筛选，以去除非特异性适配体。
优选地，根据本发明第二个方面所述的方法，步骤S2中，在第8轮实施反筛选。
优选地，根据本发明第二个方面所述的方法，步骤S5中，在第13轮收集扩增产物。
利用链霉亲和素-生物素法将适配体固定于磁珠表面进行筛选倍氯米松适配体。众所周知，链霉亲和素-生物素是已知亲和力最高的结合物，Kd值约为1015mol/L，其亲和力至少是抗原与抗体亲和力的1万倍。与ssDNA文库碱基互补的生物素修饰的短寡核苷酸连接链，这将影响ssDNA文库的折叠，在靶标存在的情况下，适配体与目标物结合，并从寡核苷酸连接链中释放适配体。
传统的PCR由于偏好扩增，且扩增周期较长，容易产生副产物，影响高通量测序。通过qPCR的扩增曲线和保留率，进行定性和定量分析。在第13轮，由qPCR扩增曲线发生了变化，有一定程度的上升，表示文库已经富集。qPCR标准曲线如图2A所示，线性相关系数R2为0.9992。通过qPCR扩增，相关系数较大，表明Ct值与模板的对数DNA文库浓度有很好的相关性。根据标准曲线，我们计算从第十轮到第十五轮的保留率，如图2B所示，最高的保留率为第13轮，我们用荧光分光光度计在激发波长397nm、发射波长401nm处检测文库亲和力，结果第13轮的亲和力最高。因此，qPCR可以用于监测文库的富集和终止selex过程。
优选地，根据本发明第二个方面所述的方法，步骤S7中采用荧光光谱法检测适配体的亲和力与特异性。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的核酸适配体在制备氯米松传感器中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种倍氯米松检测传感器，采用序列如SEQ ID NO.7～12所示的核酸适配体作为探针，检测时，核酸适配体与倍氯米松结合后，采用Qd作为信号放大检测倍氯米松的Kd值。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的核酸适配体在检测倍氯米松中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明首次筛选出小分子倍氯米松的核酸适配体，并根据倍氯米松的天然荧光特性，通过荧光光谱对6号进行了表征。本次筛选运用多种技术筛选倍氯米松的适配体，如文库固定、磁珠分离、Q-PCR检测、ePCR扩增、SDS-PAGE和高通量测序等。这些技术可以简单而快速的筛选到适配体，经过15轮筛选，共发现6个候选适配体，其中6号对倍氯米松的亲和力和特异性最好，Kd值为0.15±0.02uM。
本发明通过链霉亲和素修饰磁珠和文库互补的生物素修饰的短核苷酸链，使文库固定在磁珠上。在倍氯米松的存在下，高亲和力的适配体从短核苷酸链连接链释放出，磁力将磁珠拉到底部，上清液中高亲和力的适配体经过扩增作为下一轮筛选文库。然而，传统的聚合酶链反应(PCR)可能会产生副产物，在此，发明人选择使用乳浊液聚合酶链反应(ePCR)可以缓解偏好扩增现象。
本发明使用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,QPCR)和共振瑞利散射(Resonance Rayleigh,RRS)来监测筛选过程，并确定终止selex的最佳循环周期，并采用不等长引物PCR和SDS-PAGE制备ssDNA作为下一轮文库进行筛选倍氯米松。此外，发明人引入反筛选来提高筛选适配体的亲和力，反筛靶标的结构与倍氯米松相似。在筛选结束后，选择富集的适配体进行高通量测序。根据适配体出现频率和富集趋势，选择177个序列用M-fold程序进行二级结构预测，然后利用荧光光谱技术对47个序列进行初始筛选，并根据二级结构、吉布斯自由能和出现频率进行筛选。根据初步筛选，选择亲和力高的6个序列，，用荧光光谱法测定Kd值。
附图说明
图1 SELEX技术流程示意图。
图2 qPCR标准曲线和保留率。(A)qPCR标准曲线；(B)根据qPCR标准曲线，第十轮到第十五轮的保留率。
图3 177个序列的系统发育树分析图。
图4 适配体初步筛选的结果图。
图5 6号适配体的饱和曲线。
图6 m-fold预测的6号适配体的二次结构示意图。
图7 6个候选适配体对倍氯米松的特异性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
倍氯米松的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002485619310000041
丙酸倍氯米松的结构如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002485619310000051
试剂：
小分子筛选试剂盒购自安徽安普拓脉生物科技有限公司(中国合肥)。Taqed引物和反向引物来自Genscript Biotechnology(America)。适配体由Genewiz(美国)合成。2 XEasyPfu PCR SuperMix购自北京TransGen生物科技有限公司(北京，中国)。其他分析纯化学试剂均来自广东省药品检验所。高通量测序由安徽昂普拓脉生物科技有限公司(中国合肥)完成。
仪器：
Q-PCR(QuantStudio7 Flex Thermofisher)；
PCR(veriti Thermofisher)；
超微紫外分光光度计(德国,implen\nanophotometer N60 touch)；
垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳(德国、耶拿)；
荧光光谱荧光分光光度计(RF-5301PC，岛津)。
实施例1核酸适配体的筛选
ssDNA文库由中间40个碱基随机区、两侧分别由20个碱基的引物结合区5’-attggcactccacgcatagg-N(40)-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’的1014～1015个序列组成。
第一轮筛选：
S1.ssDNA文库固定
用DPBS(cacl2 0.1g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,MgCl2·6H2O 0.1g,NaCl 8g，Na2HPO4 1.15g,1L)溶解1OD的ssDNA文库，加入libV1-CS-biotin(正向引物互补配对的接头序列)后，将混合液进行梯度变性，变性后用超微紫外分光光度计进行测定核酸的浓度。磁珠与变性混合物在25℃下孵育1小时。孵育后，用超微紫外法测定上清液以确定文库的固定率，用DPBS洗涤6次。
S2.磁珠分离
300μM倍氯米松加入磁珠复合物中孵育25℃45min后洗脱，得洗涤液以及洗脱液。
在过程中引入反筛选，以去除非特异性适配体；最优选在第8轮实施反筛选过程，降低文库的非特异性。
S3.qPCR检测
洗涤液以及洗脱液通过qPCR以检测文库的富集程度，qPCR扩增条件如下：初始变性为95℃2min，变性95℃0.5min，退火60℃0.5min，延展为72℃0.5min，35个循环。
发明人发现在qPCR扩增的第13轮，qPCR扩增曲线发生了变化，有一定程度的上升，表示文库已经富集。qPCR标准曲线如附图2A所示，线性相关系数R2为0.9992。通过qPCR标准曲线可知，相关系数很大，表明Ct值与模板的对数DNA文库浓度有很好的相关性。
根据标准曲线，发明人计算了从第十轮到第十五轮的保留率，如附图2B所示，第13轮是最高的保留率，发明人用荧光分光光度计在激发波长397nm、发射波长401nm处检测文库亲和力，结果第13轮的亲和力最高，这与qPCR的结果一致，此处未显示数据。因此，qPCR可以用于监测文库的富集和终止SELEX过程。
S4.ePCR扩增
洗脱液的剩余部分与ePCR mix混合，混合后加入乳浊液生成油，扩增以减缓副产物的产生，60W涡悬2min。ePCR其扩增条件为：初始变性95℃3min，变性95℃ 1min，退火60℃1min，延伸72℃ 1min，循环35次。最终延伸至72℃ 10min。ePCR混合产物由正丁醇纯化至70ul，保留5ul。
S5.SDS-PAGE
剩余样品等体积混合2×TBE缓冲液沸水浴10min以变性双链DNA，随后8000r/min离心2min，将上层液电泳45min。然后煮胶溶解DNA以获得单链DNA，得待测序文库。
S6.高通量测序
根据以上监测技术结果，发明人选择第13轮进行高通量测序。
S7.软件预测
根据频率和趋势的丰富程度，筛选出177个序列，利用M-fold软件对177个二级结构序列进行预测。此外，发明人的研究团队使用clustal软件对177个序列进行了同源分析和系统发育树分析，如附图3所示，图中显示适配体之间的相关性较小。随后，发明人根据稳定性(较低的吉布斯自由能)，二级结构有两个以上环，而且在最大环上有7个以上基元的序列和适配体出现的频率，发明人筛选出了其中47个，并合成了47个序列，应用荧光光谱法对上述47个序列进行了初始筛选，筛选结果见附图4。
附图4中散点表示的是：47条序列初始筛选亲和力的大小，从图中可以看出散点较为集中，说明倍氯米松适配体亲和力大小相差不大，附图4中Y轴为各适配体的荧光强度，发明人选取了荧光强度最强的6个候选序列，并对这6个候选序列进行亲和分析，所述6个序列如下表1所示。
0.1～30μM 200μl的6个序列分别在95℃变性5min，恢复至室温，再分别与1μM倍氯米松在25℃孵育45min。通过荧光光谱检测Kd值，激发波长为323nm，发射波长为367nm。根据以下公式，使用1stopt1.0对曲线进行非线性拟合。
F＝a+c*b/(Kd+c)
其中，F为适体复合物的荧光强度，c为所选适配体的浓度，a、b、Kd为公式中的可变参数。
表1 6个高的亲和力的适配体候选序列
Figure BDA0002485619310000071
基于成本以及适配体结构稳定性的考虑，在保持适配体二级结构的情况下，在5’处截短11个碱基，3’处截短10个碱基，得到59个碱基的适配体序列且没有改变二级结构。此外，由于G碱基的稳定性，发明人在3’处保留了碱基G，并进行了初始筛选。
表2 6个高的亲和力的适配体截短序列
Figure BDA0002485619310000072
Figure BDA0002485619310000081
利用链霉亲和素-生物素法将文库固定于磁珠表面进行筛选倍氯米松适配体。众所周知，链霉亲和素-生物素是已知亲和力最高的结合物，Kd值约为1015mol/L，其亲和力至少是抗原与抗体亲和力的1万倍。
与ssDNA文库碱基互补的生物素修饰的短寡核苷酸连接链，这将影响ssDNA文库的折叠，在靶标存在的情况下，适配体与目标物结合，并从寡核苷酸连接链中释放适配体。
传统的PCR由于偏好扩增，且扩增周期较长，容易产生副产物，影响高通量测序。通过ePCR减缓副产物产生的现象，并通过qPCR的扩增曲线和保留率，进行定性和定量分析。
在第13轮，qPCR扩增曲线发生了变化，有一定程度的上升，表示文库已经富集。qPCR标准曲线如图2A所示，线性相关系数R2为0.9992。通过qPCR扩增，相关系数很大，表明Ct值与模板的对数DNA文库浓度有很好的相关性。根据标准曲线，计算从第十轮到第十五轮的保留率，如图2B所示，第13轮是最高的保留率，我们用荧光分光光度计在激发波长397nm、发射波长401nm处检测文库亲和力，结果第13轮的亲和力最高，这与Q-PCR的结果一致，此处未显示数据。因此，qPCR可以用于监测文库的富集和终止SELEX过程。
实施例2核酸适配体的特异性
通过荧光光谱法检测适配体的特异性。
实施例1中1μM截短的寡核苷酸适配体变性后分别与100μM丙酸倍氯米松于25℃孵育45min，孵育后，在激发波长323nm和发射波长367nm处测定复合物的荧光强度。1μM寡核苷酸适配子分别与100μM倍氯米松于25℃孵育45min。孵育后，用荧光光谱法测定复合物的荧光强度。
其中丙酸倍氯米松的结构如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002485619310000091
结果如附图5所示。丙酸倍氯米松(BDP)的结构与倍氯米松相似，基于荧光光谱原理，发明人将BDP的激发波长设为323nm，发射波长设为367nm。
从附图5可以看出，BDP对6个适配体候选者是非特异性的，其中6号对倍氯米松的亲和力最高，对丙酸倍氯米松的非特异性也最好。因此，发明人选择以6号为例对其进一步确认与倍氯米松之间的亲和力。
实施例3核酸适配体用于检测传感器的探究
为进一步验证具有活性的寡核苷酸适配体，使用传感器检测酸适配体的Kd值，以第6号适配体为例。采用Qd作为信号放大检测倍氯米松的Kd值。
将360μl羧基修饰的磁珠(CMB)分别用ddH2O和0.1PB(2.8392g Na2HPO4,2.3996gNaH2PO4,200ml)洗涤之后，108ul PB复悬CMB并加入10mg/ml EDC/NHS在25℃孵育30min。
PB洗涤三次后，氨基修饰的6号与CMB在25℃孵育30min,然后用0.1M 600ul tris于25℃孵育30min为CMB-A。在0.5uM 320ul羧基修饰的量子点(Qd)中加入32ul 10mg/mlEDC/NHS在25℃孵育30min。
然后在10000r/min离心10min，去除上清液，用400ul 0.001M PB复悬Qd，再加入48μl SSB在25℃孵育30min。
Qd-SSB在8000r/min离心5min,吸除上清液,用400ul 0.003tris在25℃孵育30min。Qd-SSB在8000r/min 5min,吸除上清液,4ml 0.1M DPBS复悬Qd-SSB。
吸除CMB-A上清液，加入1300ul Qd-SSB复悬CMB-A，于37℃孵育30min，DPBS洗涤3次，1300ul DPBS复悬CMB-A-SSB-Qd备用。
取0.1μM～10μM浓度梯度的倍氯米松，分别在激发波长450nm、发射波长619nm处进行荧光光谱法测定终液。
结果显示，Kd值为0.22±0.07μM，与之前6号的Kd值相似。因此，6号是倍氯米松较好的适配体，可以进一步用于传感器的研究和检测。基于此制备的传感器，经过进一步优化后可作为检测倍氯米松的便携式传感器以进行现场实时监测，操作简单，不需要大型仪器的使用，省时省力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所）
<120> 一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggcactc cacgcatagg gtgacaccga ggatacccct tggctatgct tgttgacatc 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attggcactc cacgcatagg agccgaacag cagtcatgcc ctatgcactg gttttctgat 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attggcactc cacgcatagg atgatgcacc agccaacttt agtcgcgtcc gtgtcttcgt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attggcactc cacgcatagg gcaaccgaac cggacaacac cttgttccag tgctgcttgg 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
attggcactc cacgcatagg atacgacatg ccacatatcc cgtctgtgct gatgttgtgt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
attggcactc cacgcatagg gtcataccaa gcgtgtccaa taacagctgc ccgtgtgatc 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgcataggg tgacaccgag gatacccctt ggctatgctt gttgacatcc ctatgcgtg 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgcatagga gccgaacagc agtcatgccc tatgcactgg ttttctgatc ctatgcgtg 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgcatagga tgatgcacca gccaacttta gtcgcgtccg tgtcttcgtc ctatgcgtg 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgcataggg caaccgaacc ggacaacacc ttgttccagt gctgcttggc ctatgcgtg 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgcatagga tacgacatgc cacatatccc gtctgtgctg atgttgtgtc ctatgcgtg 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgcataggg tcataccaag cgtgtccaat aacagctgcc cgtgtgatcc ctatgcgtg 59

Claims (8)

1.一种倍氯米松的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQ ID NO.1～12任一项所示。
2.权利要求1所述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
S1. 将ssDNA文库固定于磁珠表面，洗涤，得洗涤液；
S2. 磁珠分离：将倍氯米松加入磁珠复合物中，孵育，洗脱，得洗脱液；
S3. qPCR检测：将步骤S1中洗涤液与S2中洗脱液进行qPCR检测；
S4. ePCR扩大文库：将步骤S2中洗脱液的剩余部分进行ePCR，扩大文库；
S5. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳制备下一轮的文库；
S6. 将富集的文库进行高通量测序；
S7. 对测序后序列进行二级结构预测，并检测适配体的亲和力与特异性，筛选出亲和力高特异性强的核酸适配体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中将ssDNA文库溶解后，加入接头序列，进行梯度变性，将磁珠与变性混合物孵育后洗涤，得洗涤液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S2中实施反筛选过程，以去除非特异性适配体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S7中采用荧光光谱法检测适配体的亲和力与特异性。
6.权利要求1所述核酸适配体在制备倍氯米松传感器中的应用。
7.一种倍氯米松检测传感器，其特征在于，采用序列如SEQ ID NO.7～12所示的核酸适配体作为探针，检测时，核酸适配体与倍氯米松结合后，采用Qd作为信号放大检测倍氯米松的Kd值。
8.权利要求1所述的核酸适配体在检测倍氯米松中的应用。
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