CN102660547B

CN102660547B - 一种皮质醇激素核酸适体及其应用

Info

Publication number: CN102660547B
Application number: CN201210154177.8A
Authority: CN
Inventors: 钱令嘉; 弓景波; 张岭
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: CN102660547A

Abstract

本发明公开了属于糖皮质激素检测技术领域的一种皮质醇激素核酸适体及其应用。该核酸适体包括序列表中SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列及其互补序列，以及这些序列的碱基被甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后的序列。本发明的皮质醇激素核酸适体本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本，具有比抗体更高的亲和性和特异性，便于标记且可以在不同部位有选择性的标记，重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。

Description

一种皮质醇激素核酸适体及其应用

技术领域

本发明属于糖皮质激素检测技术领域，具体涉及一种皮质醇激素核酸适体及其应用。

背景技术

糖皮质激素（GC）是人体重要的激素, 调节多种生理功能,其异常常导致多种疾病的发生, 生物样品中糖皮质激素主要为皮质醇和皮质酮, 其皮质醇为主要成份, 皮质醇的检测方法包括薄层色谱法（TCL），气相色谱（GC），高效液相色谱法（HPLC）,气-质普连用法（GC-MS）,液质谱联用法（LC-MS）,毛细管电泳法等。这些方法虽具有较高的灵敏性和特异性，但需要复杂的净化提纯步骤和较贵重的仪器设备，不易推广使用。

单克隆抗体或多克隆抗体的ELISA检测技术具有简单快速灵敏的特点，可同时检测大量样品，采用先进的竞争酶联免疫吸附法检测盒（ROMER美国）和Stat Fax303酶标读数仪（美国），联合分析皮质醇激素。然而，皮质醇作为小分子物质，其免疫原性低，抗体制备较为困难。一般常需要与蛋白大分子偶联后进行免疫，而偶联方法常较难，偶联后常封闭其结构特征；在抗体筛选中需要大量克隆才能获得高特异和高亲和力抗体，在后续的检测中其方法建立难，其检测的干扰因素较多，目前，基于抗体的检测技术存在固有的局限性，如：①不同厂家、不同抗体、不同批次生产抗体效价的不同；②抗体在保存、使用时有严格条件，诸如：温度、pH值、渗透压的限制；③在进行反应时，有很多干扰因素的存在。现在，科学家不约而同的把注意力聚焦到分子生物学新技术在生物检测的应用上。

SELEX 技术（系统进化指数富集技术）是90年代初研制的一种新的组合化学技术。其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在20～40bp左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的靶标特异单链寡核苷酸称为核酸适体(也成为核酸适配体、核酸适配子)，核酸适体具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d. 稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种高特异性、高亲和力的皮质醇核酸适体替代抗体在皮质醇激素检测中应用。

本发明的目的还在于提供一种利用上述皮质醇核酸适体进行皮质醇激素检测方法。

一种皮质醇激素核酸适体，该核酸适体包括：

（1）序列表中SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；

（2）与序列表SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列互补杂交的核苷酸序列；

（3）序列表中SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列中任何位置的碱基被甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后的序列，置换碱基的个数为1-10个；

（4）序列表SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列互补杂交的核苷酸序列中任何位置的碱基被甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后的序列，置换碱基的个数为1-10个。

一种皮质醇激素检测方法，在皮质醇激素核酸适体上标记可检测标记物，将皮质醇激素核酸适体与其互补序列退火组装在一起，加入样品，当样品中皮质醇激素存在的情况下，破坏皮质醇激素核酸适体与其互补序列的结合，通过检测分离后的可检测标记物的信号而获得皮质醇激素浓度。

所述可检测标记物为荧光素、胶体金、量子点、上转换磷光颗粒或酶标亲和素。

所述检测的方法为荧光偏振、共振能量转移、等离子共振技术（SPR）、电化学（电位\电流\电容检测模式）。

一种皮质醇激素检测方法，将皮质醇激素核酸适体与其互补序列退火组装在一起，加入磁珠，混匀，加入样品，采用磁铁磁分离方法分离磁珠，以分离磁珠后的剩余溶液为模板，进行实时定量PCR，检测皮质醇激素的浓度。

一种皮质醇激素检测方法，其特征在于，将皮质醇激素核酸适体胶体金混合在一起，加入靶标，再加入盐，胶体金聚集显色，吸收波长改变，检测吸收波长的变化程度与皮质醇激素的浓度成线性相关，达到检测的目的。

本发明的有益效果：具有简便、快速、经济等特点：1）本发明的皮质醇激素核酸适体本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2）具有比抗体更高的亲和性和特异性；3）便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4）重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感；5）检测方法灵活，易于优化；6）试剂盒使用方法简单。

附图说明

图1 为胶体金聚集显色法检测皮质醇激素的原理示意图。

图2 为皮质醇特异核酸适体与皮质醇特异结合的线性相关性图。

图3 为Apta-PCR检测皮质醇激素原理示意图。

图4 为Apta-PCR检测皮质醇的扩增曲线及浓度-Ct效应曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 皮质醇激素核酸适体的筛选

初始文库为两端固定，中心35个碱基的随机序列，（5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCG（N35）ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’），DNA合成仪合成，HPLC纯化，溶于100 μl SHMCK缓冲液中，偶联引物磁珠（M-P3）用SHMCK洗3次，置于400μl体系中，加入上述文库和10nmol引物P2（5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCG-3’），三组分混匀进行杂交组装反应：94℃ 1 min，45℃ 30min，室温反应6h，4℃过夜，洗涤后，靶标皮质醇加入到500 μl SHMCK体系中孵育；取磁分离上清液分装250 μl×2，乙醇沉淀过夜，去上清，完全干燥沉淀物，干燥物用ddH₂O溶解后合并混匀。以此为模板，进行PCR，在PCR体系中，下游引物的P2（5’-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’），5’端标记有生物素进行PCR扩增得到3’端带有生物素的dsDNA文库dsDNA产物经分离纯化后，与链亲和素磁珠结合，此时dsDNA通过生物素与磁珠上的链亲和素结合，然后用0.1mol/L的NaOH使dsDNA变性解链，生物素标记的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，而生物素未标记的一条链解离出来，经乙醇沉淀，溶于SHMCK缓冲液中，测定光密度值作为下一轮筛选的ssDNA文库。到第3轮后，直接取靶标皮质醇竞争后的液体直接作为模板进行PCR扩增制备次级文库。筛选条件见表1，共筛选12轮。将筛选的核酸适体PCR成dsDNA，装入T载体，克隆、测序；筛选到的皮质醇激素核酸适体核苷酸序列如表2所示。

表1 　皮质醇每轮筛选条件

表2

实施例2 胶体金聚集显色法检测皮质醇激素的方法

检测原理：皮质醇特异核酸适体作为单链DNA 可以包裹胶体金颗粒，使胶体金稳定性增加，在加入盐时，胶体金不聚集；当靶标存在时，靶标皮质醇与特异核酸适体结合，核酸适体从胶体金颗粒上解离，胶体金稳定性性减弱，加入盐时，胶体金聚集，其最大吸收波长发生改变，颜色有红变紫，其变化的程度与靶标浓度成正比，由此检测皮质醇浓度（如图1所示）。

操作步骤：

在150ul体系中，20nM浓度的核酸适体（SEQ ID.5）与不同浓度（0、10uM、20uM、40uM、80uM、160uM、3200uM、640uM浓度梯度）的靶标孵育，加入50ul 100nM胶体金，孵育15min后，加入0.1M NaCl，胶体金由红色变成紫色的程度越高，与皮质醇的浓度成正比；反应完毕后，测定其吸光度的改变，可反应靶标浓度信息达到检测目的。

如图2所示，随着皮质醇浓度增加，胶体金发生聚集，吸收波长发生改变，A650nm/A520nm的鱼皮质醇浓度成正相关，结果表明，皮质醇核酸适体具有与皮质醇特异结合的特性。

实施例3 Apta-PCR检测皮质醇激素的方法

检测原理：如图3所示, 将特异核酸适体捕获在磁珠上, 加入靶标,靶标与核酸适体作用，引起构象变化，从磁珠上解离下来,磁分离，用解离下的核酸适体作为模板，进行real-time-PCR检测，解离下的核酸适体的量与靶标浓度成正相关，与Ct值成负相关, 从而达到检测的目的。

操作步骤：

核酸适体互补序列的固定化磁珠1mg，与合成的SEQ ID.5 1nmol（5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGGGCACGAGGGTATGTTCTATGGGTGGAGGGTGGATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’）核酸适体退火组装，洗涤后，加入不同浓度（0, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10, 50, 250,1250, 6250nmol/L写出具体浓度梯度）的靶标皮质醇，孵育，磁分离，取2μl溶液作为模板，以两端固定序列作为引物，实时Apta-PCR法检测皮质醇诱导核酸适体SEQ ID.5从磁珠上解离的情况。PCR仪为 Applied Biosystems 7500 Fast real-time PCR system。

结果如图4所示，随着皮质醇浓度的增加，核酸适体含量增加，Ct值越小，呈剂量效应关系。表明皮质醇与核酸适体SEQ ID.5特异性亲和。

Claims

1.一种皮质醇激素核酸适体，其特征在于，该核酸适体为：序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。