CN112391486B - 一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。该沙门氏菌快速检测试剂盒包含如下组分：集成管、纳米金增强的LAMP扩增体系、以及负染检测的相关试剂。本发明将纳米金增强的LAMP恒温扩增和负染可视化技术结合起来，实现了对沙门氏菌的闭管检测，具有三重防污染、快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。

Description

一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
沙门氏菌是革兰氏阴性、兼性厌氧型微生物，最适生长温度是37℃，在20℃以上即可大量繁殖，且在低温条件下可以存活3~4个月。它是最常见的食源性致病菌，常存在于人畜肠道内，为人畜共患病原体。据统计，我国内陆地区在细菌性食物中毒中沙门氏菌位于首位。目前沙门氏菌检测的金标准为生化特性检测，即发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇产气；不发酵乳糖、蔗糖；不产生吲哚、V-P反应阴性；不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。但是该方法耗时耗力，对于沙门氏菌的现场快速检测需求难于满足。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，鉴定沙门氏菌的方法扩展到免疫学方法和分子生物学方法。最为常见的分子生物学方法中以PCR和LAMP扩增为主，针对沙门氏菌的特异性基因组进行引物设计，实现沙门氏菌的快速检测。随着科学水平的不断发展，人们的生活水平不断提高，因此针对于食品病原菌的快速检测也提出了更高的要求，即能够实现现场、快速、高灵敏、强特异、低成本等特点。
其中LAMP扩增是一种成熟的等温扩增技术，该技术利用内引物、外引物与聚合酶结合，在恒温条件下进行等温扩增反应，非常适合于目前对于沙门氏菌检测的要求。但是该方法的扩增效率与易污染一直都是该技术方法开发的难题。由于LAMP引物设计的特殊性，该反应自身就具有高扩增效率，但是靶标不存在时也能扩增出假阳性的现象，即扩增效率与假阳性现象紧密相关。目前针对于纳米材料对于核酸扩增技术的影响研究越来越多，但是还没有相关文献报道纳米材料对于LAMP扩增效率的影响。且LAMP易污染问题除了注意操作环境、引物设计外没有更好的解决办法。
基于此，本申请提供一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。闭管检测实现了沙门氏菌的三重防污染检测，即通过集成管的螺口密封，石蜡油液封以及CuSO4实现；提升LAMP扩增效率通过增加纳米金实现；可视化通过CuSO4与阴性样品混合负染生成环形聚集物实现。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。本发明将纳米金增强的LAMP恒温扩增和CuSO4负染可视化结合起来，实现了对沙门氏菌的闭管检测，具有三重防污染、快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种沙门氏菌检测试剂盒，包括如下组分：集成管、纳米金增强的LAMP扩增体系以及负染检测相关试剂；
集成管为自制螺口管，有管身和管盖组成；负染检测相关试剂提前风干于集成管管盖内侧。
纳米金增强的LAMP扩增体系包括如下组分：LAMP扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、缓冲液、Bst DNA聚合酶、纳米金、石蜡油及水；
其中LAMP扩增引物包括：
inv A-F3引物：序列如SEQ ID NO：1；
inv A-B3引物：序列如SEQ ID NO：2；
FIP引物：序列如SEQ ID NO：3；
BIP引物：序列如SEQ ID NO：4；
负染检测相关试剂为0.1M CuSO4溶液，提前取5μL CuSO4溶滴加在集成管管盖上风干。
当反应结束后，上下颠倒集成管，将CuSO4与扩增产物混匀，通过环形聚集物的产生与否判断目标基因组的存在与否。
本发明以沙门氏菌为研究对象，利用纳米金增强的LAMP恒温扩增和CuSO4负染可视化结合起来，实现了对沙门氏菌的闭管检测，具有三重防污染、快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。
本发明还提供了一种沙门氏菌的检测方法，采用上述纳米金增强LAMP对沙门氏菌的DNA进行扩增，利用负染可视化技术对扩增产物进行检测。
该检测方法的反应体系如下：
inv A-F3 0.2 μM
inv A B3 0.2 μM
FIP-inv 1.6 μM
BIP-inv 1.6 μM
纳米金 0.05 nM
dNTPs 0.4 mM
Bst DNA聚合酶 9.6 U
模板DNA或待测样本 1 μL
缓冲液 1×
甜菜碱 0.5 mM
MgSO4 3mM
水 补足至20μL
石蜡油 10 μL
作为优选，扩增的反应程序为64℃下反应30 min。
在本发明中，对扩增产物进行检测的判定方法为：上下颠倒集成管，将CuSO4溶解到LAMP扩增体系中，溶液出现环形聚集物，则无沙门氏菌；溶液无环形聚集物，则存在沙门氏菌。
本发明提供了一种沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法。该沙门氏菌检测试剂盒包括如下组分：纳米金增强的LAMP恒温扩增体系和集成管内CuSO4负染技术；LAMP恒温扩增引物包括如下序列：inv A-F3引物：序列如SEQ ID NO：1；inv A-B3引物：序列如SEQ ID NO：2；FIP引物：序列如SEQ ID NO：3；BIP引物：序列如SEQ ID NO：4。
本发明具有的技术效果为：
(1) 本发明首次利用纳米金增强LAMP扩增效率，将LAMP扩增反应缩短至30min。
(2) 利用集成管将纳米金增强的LAMP反应体系与CuSO4负染可视化检测技术相结合，实现了沙门氏菌的快速、闭管、可视化、三重防污染检测。
(3) 本发明提供利用纳米金增强LAMP扩增检测沙门氏菌inv特异基因的特异性引物，具有表2所示的序列，引物具有良好特异性。
(4) 本发明通过利用纳米金增强的LAMP恒温扩增和CuSO4负染可视化结合起来进行分析，可准确判定样品DNA提取液中是含有沙门氏菌，该方法快速，简单，可在35min内读取检测结果，结果易于观察，适用于基层食品监督检验使用。
(5) 在本发明的快速检测方法中，纳米金增强的LAMP扩增反应可在恒定温度下完成，因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。
(6) 本发明的快速检测方法通过集成管良好的密封、石蜡油的液封以及闭管负染技术实现了LAMP扩增反应的三重防污染，提高了检测的准确性。
附图说明
图1 沙门氏菌基因组跑胶图。
图2 纳米金的TEM图。
图3 LAMP扩增体系的温度优化， Lane 1-2, 60℃; Lane 3-4, 61℃; Lane 5-6,62℃; Lane 7-8, 63℃; Lane 9-10, 64℃; Lane 11-12, 65℃; and Lane 13-14, 66℃，M：2000 marker。
图4 LAMP扩增体系中内外引物比例， Lane 1-2, 1:0.5; Lane 3-4, 1:1; Lane5-6, 1:2; Lane 7-8, 1:5; and Lane 9-10, 1:8，M：2000 marker。
图5 LAMP扩增体系中MgSO4浓度优化， Lane 1-2, 0 mM; Lane 3-4, 1.2 mM;Lane 5-6, 1.8 mM; Lane 7-8, 2.4 mM; and Lane 9-10, 3.0 mM，M：2000 marker。
图6 LAMP扩增体系中Bst 2.0 DNA polymerase 浓度优化， Lane 1-2, 3.2 U;Lane 3-4, 4.8 U; Lane 5-6, 6.4 U; Lane 7-8, 8 U; Lane 9-10, 9.6 U; and Lane11-12, 11.2 U，M：2000 marker。
图7 LAMP扩增体系中甜菜碱浓度优化，Lane 1-2, 0 mM; Lane 3-4, 0.2 mM;Lane 5-6, 0.5 mM; Lane 7-8, 0.6 mM; Lane 9-10, 1.0 mM; and Lane 11-12, 1.5mM，M：2000 marker。
图8 LAMP扩增体系中dNTPs浓度优化，Lane 1-2, 0.2 mM; Lane 3-4, 0.3 mM;Lane 5-6, 0.4 mM; Lane 7-8, 0.5 mM; and Lane 9-10, 0.6 mM，M：2000 marker。
图9 LAMP扩增体系中纳米金浓度优化. Lane 1-2, 0 μL; Lane 3-4, 0.5μL;Lane 5-6, 1μL; Lane 7-8, 2μL; and Lane 9-10, 10μL，M：2000 marker。
图10 LAMP反应时间与纳米金增强的LAMP反应时间对比，A： Lane 1-2, 20 min;Lane 3-4, 30 min; Lane 5-6, 40 min; Lane 7-8, 50 min; and Lane 9-10, 60 min；B：Lane 1-2,20 min; Lane 3-4, 25 min; Lane 5-6, 30 min; Lane 7-8, 35 min; andLane 9-10, 40 min，M：2000 marker。
图11 A-C为集成管的组成，D为滴加了CuSO4的集成管管盖。
图12 罗丹明101体积变化。before为反应之前的体积，after为反应之后的体积。
图13 石蜡油对LAMP扩增体系的影响。Lane 1-2, 阳性样品; Lane 3-4, 10 μL石蜡油; Lane 5-6, 15 μL石蜡油; Lane 7-8, 20 μL石蜡油; Lane 9-10, 阴性样品。
图14 实验原理图。
图15 反应产物的SEM图. A-B示阳性样品; C-D 是阴性样品; E和 F分别对应阴阳性样品的能谱图.
图16 特异性验证。A图为纳米金增强的负染可视化检测方法特异性，1-2为阴性对照，3-4为志贺氏菌，5-6为芽孢杆菌，7-8为大肠埃希氏菌，9-10为阪崎杆菌，11-12为金黄色葡萄菌，13-14为副溶血性弧菌，15-16为产气荚膜梭菌，17-18为沙门氏菌；B图为琼脂糖凝胶电泳。
具体实施方式
本发明公开了一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的是提供用于检测沙门氏菌特异基因(inv)为靶基因的纳米金增强LAMP闭管可视化快速检测方法。
本发明采用的技术方案是：将纳米金增强的LAMP扩增体系与集成管负染显色结合起来检测沙门氏菌特异基因，该检测方法包括菌种培养、模板DNA提取、LAMP引物设计、LAMP防污染体系建立、特异性分析。
本发明的适用范围：各领域沙门氏菌的快速检测。
本发明的操作方法：集成管中的LAMP防污染反应产物与盖上的CuSO4粉末上下颠倒混匀，CuSO4与阴性样品混合后，溶液上部迅速生成环形聚集物，1 min之内读取检测结果。
本发明的结果判定：待反应之后观察环形聚集物，若环形聚集物出现，说明无沙门氏菌；若溶液中无环形聚集物，说明存在沙门氏菌。
本发明提供的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 沙门氏菌基因组的提取。
按照全式金有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌CVCC542的模板DNA，通过琼脂糖凝胶电泳（图1）和nanodrop确定提取基因组的质量（表1）。
表1 沙门氏菌基因组含量
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ng 57 41 38 40 45 43 36 50 64 21
实施例2 纳米金的合成。
所有纳米金合成的玻璃容器用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，进行硅化处理，然后用蒸馏水冲净后干燥备用。取1mL的1wt% HAuCl4，190mL的蒸馏水，和9mL的1wt%的柠檬酸溶液于圆底烧瓶中煮沸，颜色从淡黄色到暗红色，整个反应回流持续10min，然后4℃储存备用。A JEM-1400 Plus, Jeol Ltd., Tokyo, Japan投射电镜表征合成的纳米金（图2）。
结果表明合成的纳米金呈现均匀的分散状，且粒径大约在17 nm左右，根据吸光度和朗博比尔定律计算纳米金的浓度为5 nM。
实施例3 LAMP反应优化。
LAMP扩增体系包括inv A-F3、inv A-B3、inv A-FIP、inv A-BIP、dNTPs、MgSO4、BstDNA polymerase、10×Isothermal Buffer、甜菜碱、纳米金、H2O。其中LAMP扩增体系的引物序列如表2所述，LAMP扩增体系如表3所示。
表2 引物序列
name length Sequence（5’-3’）
inv A-F3 19-mer (F3:19-mer) GCGAAGCGTACTGGAAAGG
inv A-B3 19-mer (B3:19-mer) TCAACAATGCGGGGATCTG
inv A-FIP 42-mer（F1c:22-mer F2:20-mer） ATGATGCCGGCAATAGCGTCACAAAGCCAGCTTTACGGTTCC
inv A-BIP 39-mer（B1c:20-mer B2:19-mer ） GTGGGGATGACTCGCCATGGACCATCACCAATGGTCAGC
表3 LAMP反应体系
反应体系组成 加入体积 最终浓度
10×Isothermal Buffer 2.5 μL 1×
10 μM inv A-FIP/inv A-BIP 4.0 μL 1.6 μM
10 μM inv A-F3/ inv A-B3 0.5 μL 0.2 μM
5mM betain 2.5 μL 0.5 mM
100mM MgSO<sub>4</sub> 0.75 μL 3 mM
2.5mM dNTPs 4 μL 0.4 mM
Bst DNA Polymerase 1.2 μL 9.6 U
5nM纳米金 0.25 μL 0.05nM
Target DNA 1.0 μL /
ddH<sub>2</sub>O 3.8 μL
1．LAMP扩增体系的温度优化
首先优化LAMP扩增体系的最适温度，分别选择60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃和66℃作为反应温度。结果如图3所示，表明最适反应温度为64℃。
2．LAMP扩增体系中内外引物比例
其次优化LAMP扩增体系中内外引物比例，分别选择1:0，1:1，1:2，1:5和1:8的比例进行优化。结果如图4所示，表明最优的内外引物比例为1：8。
3．LAMP扩增体系中MgSO4浓度优化
接下来优化LAMP扩增体系中MgSO4浓度， 分别选择0 mM, 1.2 mM, 1.8 mM, 2.4mM和3.0 Mm的浓度进行优化。结果如图5所示，表明最优的MgSO4浓度为3mM。
4．LAMP扩增体系中Bst 2.0 DNA polymerase 浓度优化
优化LAMP扩增体系中Bst 2.0 DNA polymerase 浓度，分别选择3.2 U, 4.8 U,6.4 U, 8 U, 9.6 U和11.2 U的浓度进行优化。结果如图6所示，表明最优的Bst 2.0 DNApolymerase 浓度为9.6 U。
5．LAMP扩增体系中甜菜碱浓度优化
优化LAMP扩增体系中甜菜碱浓度，分别选择0 mM, 0.2, 0.5 mM, 0.6 mM, 1.0mM和1.5 mM的浓度进行优化。结果如图7所示，表明最优的甜菜碱浓度为0.5 mM。
6．LAMP扩增体系中dNTPs浓度优化
优化LAMP扩增体系中dNTPs浓度，分别选择0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM和0.6 mM的浓度进行优化。结果如图8所示，表明最优的dNTPs浓度为0.4 mM。
7．LAMP扩增体系中纳米金浓度优化
优化LAMP扩增体系中纳米金浓度，分别选择0 μL, 0.5μL, 1μL, 2μL和10μL。结果如图9所示，表明最优的纳米金浓度为0.05 nM。
8．LAMP反应时间与纳米金增强的LAMP反应时间对比
测定纳米金增强的LAMP反应时间与普通LAMP反应时间，确定纳米金增强效果。其中普通LAMP反应时间选择20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min；纳米金增强的LAMP反应时间选择20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min。实验结果如图10所示，表明纳米金增强的LAMP扩增体系的反应时间缩短至30min。
实施例4 集成管防污染测试。
集成管的构成如图11所示，由管身和管盖两部分组成，且管盖上滴加5 μL 0.1 M的CuSO4风干备用。为了证明集成管的密封性，将50 μL的罗丹明101加入到集成管中，并在70℃ 水浴锅中放置40 min，观察罗丹明的体积变化（图12）。其次在LAMP扩增体系上验证增加石蜡油防污染而不影响LAMP正常扩增，结果如图13所示。结果显示罗丹明101的体积反应前后基本没有变化，且石蜡油能够有效的抑制污染，且不影响LAMP扩增效率。
实施例5 反应原理。
将纳米金增强的LAMP扩增体系与集成管负染显色结合起来检测沙门氏菌特异基因，如图为具体原理（图14）。如图所示集成管的管身包括纳米金增强的LAMP扩增体系和石蜡油，管盖包括风干的CuSO4，整个反应体系在64℃ 30 min，80℃ 5 min的反应过后，上下颠倒集成管，混匀CuSO4和纳米金增强的LAMP扩增体系，在1 min 内完成读数。沙门氏菌存在时不会出现环形聚集物，而不存在沙门氏菌时则会出现环形聚集物，进而完成沙门氏菌的负染可视化检测（图14A）。其中纳米金增强的LAMP扩增体系包括LAMP扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、缓冲液、Bst DNA聚合酶、纳米金、石蜡油及水，整个扩增过程如图14B所示。
实施例6 负染可视化环形聚集物的分析。
将阴性样品和阳性样品通过真空冷冻冻干，通过扫描电镜（SEM）表征，结果如图15所示。结果表明阳性样品的焦磷酸镁沉淀呈现纳米花的形状，阴性样品呈现微小的纳米颗粒，且能谱图表明阴性样品中无Mg元素的存在。
实施例7 纳米金增强的LAMP扩增负染可视化检测方法的特异性分析。
选取6株常见传染性致病菌菌株，分别提取志贺氏菌、芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌及沙门氏菌的基因组DNA，分别作为纳米金增强LAMP反应的模板，根据实验得到的最优反应体系和反应条件，进行反应并观察环形聚集物的产生。
结果表明，只有沙门氏菌无环形聚集物生成，而其他菌种明显出现环形聚集物，构建的此生物传感器对沙门氏菌检测具有较好特异性（图16）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法
<130> MP1910669
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcgaagcgta ctggaaagg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcaacaatgc ggggatctg 19
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgatgccgg caatagcgtc acaaagccag ctttacggtt cc 42
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtggggatga ctcgccatgg accatcacca atggtcagc 39

Claims (6)

1.一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒用于非疾病诊断目的的沙门氏菌闭管快速可视化检测方法，其特征在于，所述试剂盒包含集成管、纳米金增强的LAMP扩增体系及相关试剂；
所述集成管为自制螺口管，有管身和管盖组成；且管盖内侧包含有风干的负染检测试剂；
所述纳米金增强的LAMP扩增体系包括LAMP扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、缓冲液、BstDNA聚合酶、纳米金、石蜡油及水；
其中LAMP扩增引物包括：
inv A-F3引物：序列如SEQ ID NO：1；
inv A-B3引物：序列如SEQ ID NO：2；
FIP引物：序列如SEQ ID NO：3；
BIP引物：序列如SEQ ID NO：4；
所述负染检测试剂为0.1 M CuSO4溶液；
所述方法采用前述纳米金增强LAMP扩增体系对沙门氏菌基因组进行扩增，然后直接使用集成管对扩增产物进行检测，所述扩增产物在集成管中上下颠倒几次，将CuSO4与LAMP扩增体系混匀，1min内观察溶液的变化：溶液上部出现环形聚集物，则无沙门氏菌；无环形聚集物，则含有沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的反应体系如下：
Figure 435981DEST_PATH_IMAGE002
4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为60-68℃ 10-50 min，70-90℃ 1-15 min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为64℃ 30 min，80℃ 5 min。
6.权利要求1-5任一所述的检测方法在食品安全检测中的应用。
CN202110078752.XA 2021-01-21 2021-01-21 一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法 Active CN112391486B (zh)

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