CN112111560A - Dna纳米球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种DNA纳米球及其制备方法和应用。所述DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质。通过利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物对环状单链DNA进行滚环扩增，或者利用具有胡斯坦面结构的物质对环状单链DNA进行滚环扩增，能够获得该DNA纳米球。通过本发明所提供的方法制备DNA纳米球，用于测序具有降低的重复序列比例和提高的测序质量。

Description

DNA纳米球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种DNA纳米球及其制备方法和应用。

背景技术

DNA nanoball sequencing(DNA nanoball，DNB测序)，是一种高通量测序技术，可以用于测定生命体全基因组序列的排列与组成。该技术核心在于将基因组DNA片段环化成单链环状DNA后，通过滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)技术，使环状单链DNA形成由首尾相连的多个拷贝的单链DNA，并在溶液中自由折叠成纳米球结构，即DNA纳米球(DNB)。DNA纳米球由于自身所带负电荷的相互排斥，可减少DNB个体之间的相互作用，使DNB个体间相互独立。基于DNA nanoball的矩阵列测序技术使得每个矩阵点的DNB具有至少几百个拷贝数，这些拷贝聚集在一起产生强烈的信号，由此可以测序获得DNB的测序结果。

然而，针对DNB测序技术的测序质量还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种DNA纳米球及其制备方法和应用。

评价不同测序技术的一个重要的指标就是Duplicate值(Dup值)的大小。在二代测序中，Dup值特指测序所得到的重复序列的比例。评价是否为重复序列，需要满足两个条件：1)reads比对到基因组的位置与碱基是否完全一致，2)是比对到参考基因组的方向是否完全一致。同时满足这两点一致的时候，就被认为是duplicate。在研究过程中，发现产生dup的原因主要有：第一种是样品dup，一些物种基因组结构本身比较复杂，存在多处重复序列，使样品在构建文库前本身就形成了dup；第二种是文库dup，产生的原因是在构建文库过程中，一些相同片段的序列被扩增；第三种是光学dup，产生的主要原因是同一个大的DNB的reads被误识别成不同的DNB的时候，此时他们距离应该很近本来是一组数据，但是却产生了多组数据；第四种是由于DNB的形态结构或大小导致，使邻近的DNB区域被占据，从而产生了多组数据。其中第一种dup的产生是固定的，与样品的物种来源有关。第二种dup可以通过控制文库建库方法。第三种和第四种dup，在不考虑成本的情况下，可以通过提高测序仪光学成像设备适当地改善和调节DNB的大小和形态结构；但是在大规模测序或者说在高通量测序的过程中，测序成本的控制对于测序的生产应用很重要，由此，如何在控制合适成本的前提下，例如基于当前的光学系统，降低测序过程中产生的Dup值，提高测序的质量至关重要。

本发明的发明人针对在DNA纳米球高通量测序的研究过程中发现：为了能够降低测序过程中所产生的Dup值，通常通过缩短RCA时间来达到相应的目的。但是这种处理方式同时也会带来很多缺点，例如第一，缩短RCA的时间，会影响DNB的测序质量，尤其是矩阵密度高的测序芯片。扩增时间短，尽管可以有效的降低dup值，但会导致DNB的拷贝数降低，使碱基的有效信号值降低。第二，缩短RCA的时间，所获得的纳米球无法满足需要的测序读长。读长较长的测序需要较长片段的文库，缩短滚环扩增时间后，DNB拷贝数无法满足测序需求。因此，如何既能保证纳米球的拷贝数，又不会使得建库测序过程中所产生的Dup值过高来满足精准测序的要求，至关重要。

在研究的过程中，发明人注意到：具有胡斯坦面结构的物质，例如三聚氰酸(Cyanuric Acid)，三聚氰胺(Melamine)，螺环亚氨基乙内酰脲(Spiroiminodihydantoin)，胍基乙内酰脲(Guanidinehydantoin)，草尿酸(oxaluric acid)或恶唑酮(oxazolone)、氨基糖苷类分子等及其类似物，作为一种多功能交联剂能够在碱基之间产生范德华力，能共存于DNA碱基对中，从而使得DNA分子诱导折叠形成更加稳定的DNA复合体结构。为此，本发明的发明人创造性的发现，可以将多个引物和具有胡斯坦面(hoogsteen faces)结构的物质应用到RCA的扩增过程中，获得拷贝数增加的，且结构更佳紧密的DNB分子。即在RCA扩增过程中，通过设计多个引物位点，使得一个环状DNA模板同时产生多个长链RCA产物，而且在添加剂具有胡斯坦面结构的物质的作用下，该产物一边合成一边折叠，形成一个含有至少双倍量拷贝数的DNB复合体。

为此，本发明提供了一种DNA纳米球的制备方法，通过该方法所制备的DNA纳米球，其在相同的RCA时间内，一方面可获得原有技术两倍的拷贝数，另一方面可维持该RCA时间内的DNB大小不变，从而可以解决因RCA时间或DNB大小所产生的dup问题。同时可解决因缩短RCA时间导致的拷贝数降低，导致测序质量下降快的问题。另外，还可以解决因信号不够，无法满足长读长测序技术的问题。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种DNA纳米球的制备方法，包括：基于环状单链DNA进行滚环扩增，以便获得所述DNA纳米球；其中，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行所述滚环扩增，或者利用具有胡斯坦面结构的物质进行所述滚环扩增。以环状单链DNA为模板，利用两个以上的扩增引物进行滚环扩增，可以同时产生多个长链RCA产物，从而可以在相同的RCA时间内，获得原有技术至少两倍的拷贝数；同时在扩增的过程中加入具有胡斯坦面结构的物质，该物质使得所形成的DNB结构更佳紧凑规整，使得测序过程中每个DNB被捕捉的荧光信号更加集中，进一步削弱矩阵芯片上DNB间的相互干扰，提高信噪比，实现高密度矩阵芯片的高通量测序技术，降低测序成本。而且即便是利用同一扩增引物，在扩增的过程中，添加具有胡斯坦面结构的物质相较于未添加该物质进行滚环扩增，该物质能够使得形成的DNB结构紧凑规整，也能够应用于高密度的矩阵芯片，获得更高测序通量，降低测序成本。

根据本发明的实施例，以上所述DNA纳米球的制备方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述具有胡斯坦面结构的物质选自下列中的至少一种：三聚氰酸(Cyanuric Acid)，三聚氰胺(Melamine)，螺环亚氨基乙内酰脲(Spiroiminodihydantoin)，胍基乙内酰脲(Guanidine hydantoin)，草尿酸(oxaluric acid)或恶唑酮(oxazolone)、氨基糖苷类分子以及它们的类似物。

在本发明的一些实施例中，所述氨基糖苷类分子为聚赖氨酸(PLL)或妥布霉素(tobramycin)。

在本发明的一些实施例中，在相同的滚环扩增时间内，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球用于测序具有提高的测序质量。

在本发明的一些实施例中，在相同的滚环扩增时间内，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球的拷贝数至少增加了一倍。

在本发明的一些实施例中，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球用于测序具有降低的重复序列比例。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种DNA纳米球，所述DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质。本发明提供的DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质，其结构更佳紧密，利用这些DNA纳米球进行测序，可以改善测序过程中信号弥散的问题，使得测序过程中每个DNB被捕捉的荧光信号更加集中，从而可以提高信噪比，满足高通量测序的要求。同时，本发明所提供的DNA纳米球，在测序过程中的碱基荧光信号下降率低，可以提高测序质量，增加测序读长。

根据本发明的实施例，以上所述DNA纳米球可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述DNA纳米球通过本发明第一方面任一实施例所述的制备方法获得。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种芯片，所述芯片上固定有本发明第二方面任一实施例所述的DNA纳米球。将DNA纳米球固定在芯片上，然后可以借助于例如探针技术，对芯片上的DNA纳米球进行识别，从而获得DNA纳米球的核酸信息。例如，可以将所获得的DNA纳米球可以采用高密度DNA纳米芯片技术加到芯片上的网状小孔内，每个小孔只能容纳一个DNA纳米球，即当一个DNB结合到芯片上的小孔后，会排斥其他DNB的结合。然后可以利用cPAL(组合探针锚定连接法)或cPAS(联合探针锚定聚合技术)对测序芯片进行测序。例如，利用四种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基，每次可以读取10个连续碱基且每次测序是相互独立的，即测序结果不受前一个碱基测序结果的影响，因此不会发生错误累积的现象，测序结果精准性高。在测序时，可以加入固定序列与接头互补配对，然后DNA连接酶将四种不同颜色标记的探针结合到模板的相应碱基上，通过对荧光基团的成像来判断碱基类型。这种非连续、非连锁联合探针锚定连接技术来读取碱基可以大大减少探针和酶的浓度。

在本发明的一些实施例中，所述DNA纳米球通过网状小孔或者六甲基二硅氮烷固定在所述芯片上。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种基于DNA样本的测序方法，包括：将所述DNA样本进行片段化处理，末端修复，以便获得经修复的DNA片段；基于所述经修复的DNA片段，连接测序接头，进行环化处理，以便获得环状单链DNA；基于所述环状单链DNA，根据本发明第一方面任一实施例的方法制备DNA纳米球；将所述DNA纳米球固定到芯片上，测序，以便获得所述DNA样本的测序结果。

根据本发明的实施例，以上基于DNA样本的测序方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述DNA样本为全基因组DNA。

在本发明的一些实施例中，所述测序为利用MGISEQ测序平台或者BGISEQ测序平台。例如可以利用BGISEQ-500基于联合探针锚定聚合技术对DNA纳米球进行测序，从而获得DNA样本的测序信息。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种提高测序质量的方法，该方法根据本发明第四方面所述的测序方法对DNA样本进行测序。

根据本发明的第六方面，本发明提供了具有胡斯坦面结构的物质在制备DNA纳米球领域中的用途。在制备DNA纳米球的过程中，加入具有胡斯坦面结构的物质，能够获得形态结构更加紧密的DNB，使测序信号更加集中，邻近DNB间的相互干扰降低，提高测序质量。

本发明所取得的有益效果主要在于：首先，对于相同RCA时间的DNB，本发明获得的DNB测序dup率比原有技术产生的测序dup低。其二，本发明中使用了具有胡斯坦面结构的物质，可获得形态结构更紧密的DNB，改善当前技术中信号弥散的问题，可使测序过程中每个DNB被捕捉的荧光信号更加集中，可进一步削弱矩阵芯片上DNB间的相互干扰，提高信噪比，可实现高密度矩阵芯片上测序技术，达到更高通量，减少测序成本的目的。其三，由本发明扩增所产生的DNB，在测序过程中的碱基荧光信号下降率比原有技术低，可提高测序质量，以及增加测序读长。此外，本发明中的具有胡斯坦面结构的物质，可通过范德华力与氢键与测序芯片表面氨基修饰区域结合，使芯片表面形成一层小分子体交联剂矩阵表面，这种矩阵表面对DNB有强烈的吸附作用，促进DNB与测序芯片的结合效率，进一步提高测序芯片的使用率。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的具有胡斯坦面结构的物质与碱基结合的示意图。

图2是根据本发明的实施例提供的利用两种扩增引物进行滚环扩增的示意图。

图3是根据本发明的实施例提供的利用三种扩增引物进行滚环扩增的示意图。

图4是根据本发明的实施例提供的酶标仪荧光信号强度检测结果。

图5是根据本发明的实施例提供的PCR free文库单末端SE50测序质量趋势图。

图6是根据本发明的实施例提供的不同处理组的测序结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

具有胡斯坦面(hoogsteen faces)结构的物质作为一种多功能交联剂产生范德华力，共存于DNA碱基对中(Dherin C，Etal.International journal of radiationbiology,2004)。具有胡斯坦面结构的物质能够与DNA分子中的碱基结合，从而形成不同的折叠类型，如图1所示，其中图1中左图显示的是DNA分子之间的一种不对称折叠方式，图1中右图显示的是DNA分子之间的对称的折叠方式。以右图为例，假设120nt的单链核苷酸，内部Z字折叠成三股链，每股为40nt，或者一个120nt的单链核苷酸通过和其他核苷酸交联，形成每股均为120nt的DNA三链结构。需要说明的是，通常DNA纳米球是超长链，DNA纳米球间的相互排斥作用比较大，所以DNA纳米球和DNA纳米球之间偶联或者交联的概率很小。所以在利用具有胡斯坦面结构的物质和DNA分子的碱基结合时，通常是具有胡斯坦面结构的物质引起DNA分子内部交联，而不会影响到最终形成的DNA纳米球之间的偶联或者交联。

在制备DNA纳米球的过程中，利用具有胡斯坦面结构的物质以环状单链DNA为模板进行滚环扩增，所获得的DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质，结构紧密，用于DNA纳米球测序，其可以提高测序质量，降低重复序列的比例。当然，可以利用一个扩增引物进行滚环扩增，也可以利用两个以上的扩增引物进行滚环扩增，相比较于利用一个扩增引物进行滚环扩增，利用两个以上的扩增引物进行滚环扩增可以同时产生多个长链RCA产物，从而可以在相同的RCA时间内，获得至少两倍的拷贝数。其中，在制备DNA纳米球的过程中，可以添加一种具有胡斯坦面结构的物质，也可以添加两种以上的具有胡斯坦面结构的物质，为了更形象的描述该过程，以两个扩增引物和添加有具有胡斯坦面结构的物质为例进行滚环扩增的示意图如图2所示。利用两个扩增引物，可以以环状单链DNA为模板，同时产生多个长链RCA产物，在具有胡斯坦面结构的物质的作用下，该产物一边合成一边折叠，形成一个含有双倍量拷贝数的DNB复合体。通过本发明方法制备的DNA纳米球适用于单端测序、双端测序等，任何适用于DNA纳米球的测序平台均可以应用本发明的方法，对于测序平台没有严格的要求。

为此，本发明提供了一种DNA纳米球的制备方法，包括：基于环状单链DNA进行滚环扩增，以便获得所述DNA纳米球；其中利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行所述滚环扩增，或者利用具有胡斯坦面结构的物质进行所述滚环扩增。

在滚环扩增的过程中，理论上来说，在相同的扩增时间内，随着扩增引物的成倍增加，DNA纳米球拷贝数也相应的成倍。但是当扩增引物为3个的时候，基本上没有成倍数关系了。而且单引物滚环扩增在1h以内，由于底物浓度(dNTP)大大过量，所以基本上是线性增长，但时间长了后，底物浓度降低，影响到拷贝数的倍数关系。因此，在本发明的至少一些实施方式中，所述扩增引物为两个或者三个。无论是否添加具有胡斯坦面结构的物质，在相同的时间内，随着扩增引物的成倍增加，在扩增引物在3个以上时，DNB拷贝数不会再表现出成倍数增加的影响。不受理论限制的影响，推测可能的原因是，随着滚环扩增的进行，拷贝数受到底物浓度以及体系不是最优的影响。例如，将RCA体积降低或者增大，里面各种酶、文库等浓度不变，得到的DNB浓度和现在体系的浓度也会非常不一样。再例如，现在体系不变，把所有浓度等比例增加，所得到的DNB浓度也不是等比例增加的，有可能还会降低。

在本发明的至少一些实施方式中，所述滚环扩增的时间为20～40分钟。由此可以获得具有至少几百个拷贝数的DNA纳米球，用于测序，能够提高测序的质量。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1利用本发明技术制备的DNB进行浓度检测。

本实验测试所用的DNA样品为YH人类基因组，参照MGIEasy通用DNA文库制备试剂盒和使用说明书构建环状DNA文库。Circle DNA投入量为40fmol，参考BGISEQ-500DNB样品制备与装载试剂盒及使用说明书，制备RCA时间分别10min，20min，30min的DNB。

以利用BGISEQ-500DNB样本制备与装载作为对照，即以环状单链DNA仅有一个扩增位点进行扩增，即利用单引物(S-primer)进行扩增。采用本发明技术所提到的DNB制备方法进行双引物扩增或者三引物扩增，即针对环状单链DNA，设计两个RCA扩增位点或者三个扩增位点，获得DNB产物，如图3所示。其中接头为BGISEQ-500测序所用到的接头，同时该接头也用于RCA扩增位点的结合。同时在双引物扩增(Di-primers)和三引物扩增(Tri-primers)的过程中，添加了具有胡斯坦面结构的物质三聚氰酸(Cyanuric Acid)，其终浓度为500μM。实验中，单引物扩增位点为图3中引物3结合位置；双引物扩增位点为图3中引物1和引物2的结合位置；三引物扩增位点对应图3中引物1、引物2和引物3的结合位置。每种引物的使用终浓度为0.25μM。

表1接头和引物信息

利用ssDNA Qubit定量检测试剂对上述所制备的DNB进行浓度检测，记做C1。同时，考虑到所制备得到的DNB中的双链或者多链折叠的结构可能会使得浓度定量的结果虚高，因此，对于所制备的DNB进行热变性处理，获得单链浓度再进行一次浓度检测，获得的检测结果会更加精准一些。即将上述所制备的DNB在高温95摄氏度下加热5分钟后，立刻至于冰上，并进行浓度定量检测，记做C2。实验结果如下表2所示。

表2 Cyanuric Acid DNB浓度定量结果表

从表2可以看出，利用多引物扩增位点和具有胡斯坦面结构的物质三聚氰酸进行滚环扩增，相比较于单引物扩增位点，可以显著提高RCA产物。其中，利用双引物扩增位点和三聚氰酸可提高DNB浓度约1倍，而利用三引物扩增位点和三聚氰酸也可以提高DNB的浓度1倍以上。DNB浓度越高，RCA效率越高，其拷贝数则越多。

同时，将上述利用不同条件所获得的DNB产物(即未进行热变性的DNB产物)用含有Cy3染料标记的oligo进行杂交(该oligo是上述引物1的互补链，Cy3标记是oligo的3’末端)，使DNB产物被标记上荧光染料后，利用酶标仪进行荧光信号强度检测。实验结果如图4所示，其中图4中横坐标为DNB的RCA时间，纵坐标为荧光信号的强度值。图4中每个RCA时间内的三个柱形图分别对应单引物、双引物和三引物扩增。从图4可以看出，与ssDNA Qubit定量检测试剂检测结果一致，利用双引物和三引物进行扩增，所获得的DNB拷贝数多，荧光信号强度越大。而且相较于利用双引物进行扩增，利用三引物扩增所获得的DNB拷贝数增加不大。

实施例2利用具有胡斯坦面结构的物质进行DNB制备

参照实施例1中给出的方法，利用不同的具有胡斯坦面结构的物质分别和单引物、双引物三引物进行在滚环扩增体系中加入表格中所提到的具有胡斯坦面结构的物质制备DNB，扩增时间确定为10分钟，同时参照实施例1提供的方法对制备得到的DNB进行浓度检测，即为C1和C2。其结果如表3所示。需要说明的是，与实施例1不同的是，本实施例在利用单引物进行滚环扩增时，也同时添加了具有胡斯坦面结构的物质。

表3其他小分子添加剂DNB浓度定量结果表

从表3可以看出，利用多引物扩增位点和具有斯胡坦面结构的物质可以显著提高RCA产物的量。

实施例3利用本发明技术制备YH基因组PCR free文库样本DNB并初步进行单末端SE50测序。

本实验测试所用的DNA样品为YH人类基因组，文库制备方法由华大基因文库研发小组提供的未进行PCR扩增的环状DNA文库，文库插入片段主带约300bp。其中实验组利用本发明技术，对该YH PCR free文库样本制备成DNB结构，制备试剂参考实施例1中的双引物扩增条件(即采用双引物扩增，并添加三聚氰酸)，RCA时间确定为25min。制备流程参照BGI的DNB样品制备与装载使用说明书。设立对照组，对照组按照原技术(BGISEQ-500DNB样本制备试剂盒，即实施例中所述的单引物RCA扩增)制备DNB，RCA时间也为25min。本实验上机流程参照基因测序仪(BGISEQ-500)使用说明书，在BGISEQ-500平台上进行单末端SE50测序验证。

实验结果见图5和表4。图5中横坐标均代表循环数，其中图5中A图分成四小段，如图所示，各小段横坐标分别代表碱基A、C、G和T的循环数，图5中B图分成两小段，前一小段对应Bic值，后一小段对应fit值。图5显示，本发明技术具有比对照具有较高的SNR，Bic，Fit以及ESR值。该类数据指标越高，表示DNB的测序质量越高。SNR和fit值又间接反应了DNB相互间的信号互串与集中度。可以说，本技术可以降低相邻DNB间的信号互串与噪声信号。

注：Bic指可用于被basecall软件识别的DNB比例；Fit反映相邻DNB的信号互串与信号分布集中情况，信号越集中，其fit值越高，越离散，fit值越低；SNR即信噪比，即有效信号强度与噪声信号的比值，信号越集中，SNR越高；ESR即有效DNB比例，是在Bic值的基础上通过Q20阈值过滤掉无效DNB后的比例。

表4两种DNB制备方法的单末端SE50测序质量与dup率的比较

	Mapped Rate	Mismatch Rate	Dup Rate
				对照组	95.73％	0.37％	10.25％
实验组	97.76％	0.28％	6.57％

注：Mapped Rate指完全比对到参考序列的所占的序列百分比；Mismatch Rate指错配比率；Dup Rate是指重复序列比率。

表4中数据为比对率和错误率，以及重复率。比对率越高，错误率越低，则测序可信度越高。从该数据可发现，本发明技术不会对测序准确度产生负影响。相反，由于本技术可以降低相邻DNB间的信号互串与噪声信号，使cPAS技术中产生的dup值得以降低。

实施例4利用本发明技术制备的DNB进行高密度矩阵测序芯片双末端PE100测序的dup值比较

设立实验组，利用本发明技术制备DNB，测试文库为YH基因组样品(H300，参照MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装和使用说明书构建插入片段主带片段大小约300bp的WGS环状DNA文库)。制备试剂参考实施例1中的双引物扩增条件(即利用双引物，并添加三聚氰酸进行滚环扩增)，RCA时间为20分钟，并设置两个重复实验。同时设立对照组，对照组也设置两个重复实验，对照组按照原技术(BGISEQ-500DNB制备试剂与制备流程)制备的DNB，RCA时间为20分钟。本实验采用BGISEQ平台的测序芯片。本实验所得测序结果是基于华大基因新研发的测序仪BGISEQ-500测序平台。

实验结果如下表所示。本发明技术制备的DNB，在测序深度，覆盖度等方面无负效应。Dup值显著低于对照组，与实施例3中PCR free文库一致。

表5两种DNB制备方法在高密度矩阵芯片上的PE100测序质量比较

注：其中对照组1和对照组2代表两个重复实验，实验组1和实验组2代表两个重复实验。Clean read1/2Q30指过滤后，一链(二链)的Q30值；Clean reads指的是过滤后的序列数量；Mapping Rate指可比对到参考序列的百分比；Mismatch Rate指错配比率；Averagesequencing depth(×)即测序深度；Coverage值测序覆盖度。

实施例5利用本技术中包含胡斯坦面结构的物质与多引物分别制备DNB的比较分析

利用本发明技术，即在滚环扩增的过程中添加具有胡斯坦面结构的物质，或者在滚环过程中的扩增中使用双引物并添加具有胡斯坦面结构的物质，用来分别制备DNB，测试文库为YH基因组样品(H300，参照MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装和使用说明书构建插入片段主带片段大小约300bp的环状DNA文库)。在滚环扩增的过程中，分别根据条件不同，设置双引物组(即仅利用双引物进行滚环扩增)，三聚氰酸组(即利用添加三聚氰酸和单引物进行滚环扩增)，双引物+三聚氰酸组(同时利用双引物和三聚氰酸进行滚环扩增)，RCA时间均设置为15分钟。设立对照组，即当前BGISEQ-500DNB制备技术。对照组按照原技术(BGISEQ-500DNB制备试剂与制备流程)制备的DNB，RCA时间为15分钟。本实验中所使用的具有胡斯坦面结构物质三聚氰酸(Cyanuric Acid)，使用浓度为200μM。本实验所得测序结果是基于华大基因新研发的测序仪BGISEQ-500测序平台。

实验结果如图6所示，采用双引物进行滚环扩增，能显著增加信号值，本技术使用到了双引物故而信号有显著提升，与现有技术相比提高了约100％；但是双引物并不能降低dup值，反而由于同等时间内DNB变大，使dup比对照略微偏高，fit值也有轻微的下降。在三聚氰酸组中，荧光信号与对照物没有显著的变化，但是dup和fit都有较好的改善，dup值降低了30％-40％，Bic和ESR也略有提升。而同时利用双引物和三聚氰酸所制备的DNB测试组中，信号强度比对照提升将近1倍，fit与对照组也无显著差异，dup显著低于对照组。(本实验结果图显示的dup是将原dup值放大了10000倍，例如：对照组中dup图中显示869，实际值为8.69％；本实验结果图中，信号(signal)和dup率(Dup Rate)对应的左边Y轴值，ESR，BIC和Fit等对应的是右边Y轴坐标)。

根据以上实验结果可以看出，多引物主要是用于提高DNB的拷贝数，cyanuricacid等物质则是dup降低的主要作用力。二者结合起来，对长读长测序质量理论上将会有一定的提升作用。

在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大智造科技有限公司

<120> DNA纳米球及其制备方法和应用

<130> PIDC3191594

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头

<400> 1

aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aatacggttg cacaactcct tggctcacag 60

aacgacatgg ctacgatccg actt 84

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1

<400> 2

cggatcgtag ccatgtcg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物2

<400> 3

ccgcttggcc tccgactt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物3

<400> 4

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Claims (10)

1.一种DNA纳米球的制备方法，其特征在于，包括：

基于环状单链DNA进行滚环扩增，以便获得所述DNA纳米球；

其中，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行所述滚环扩增，

或者利用具有胡斯坦面结构的物质进行所述滚环扩增。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述具有胡斯坦面结构的物质选自下列中的至少一种：

三聚氰酸(Cyanuric Acid)，三聚氰胺(Melamine)，螺环亚氨基乙内酰脲(spiroiminodihydamoin)，胍基乙内酰脲(Guanidinehydantoin)，草尿酸(oxaluric acid)或恶唑酮(oxazolone)、氨基糖苷类分子以及它们的类似物；

任选地，所述氨基糖苷类分子为聚赖氨酸(PLL)或妥布霉素(tobramycin)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在相同的滚环扩增时间内，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球用于测序具有提高的测序质量。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在相同的滚环扩增时间内，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球的拷贝数至少增加了一倍。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，相较于一个扩增引物，利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物进行滚环扩增，所述DNA纳米球用于测序具有降低的重复序列比例。

6.一种DNA纳米球，其特征在于，所述DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质；

任选地，所述DNA纳米球通过权利要求1～5中任一项所述的制备方法获得。

7.一种芯片，其特征在于，所述芯片上固定有权利要求6所述的DNA纳米球；

任选地，所述DNA纳米球通过网状小孔或者六甲基二硅氮烷固定在所述芯片上。

8.一种基于DNA样本的测序方法，其特征在于，包括：

将所述DNA样本进行片段化处理，末端修复，以便获得经修复的DNA片段；

基于所述经修复的DNA片段，连接测序接头，进行环化处理，以便获得环状单链DNA；

基于所述环状单链DNA，根据权利要求1～5所述的制备方法制备DNA纳米球；

将所述DNA纳米球固定到芯片上，测序，以便获得所述DNA样本的测序结果；

任选地，所述DNA样本为全基因组DNA。

9.一种提高测序质量的方法，其特征在于，根据权利要求8所述的测序方法对DNA样本进行测序。

10.具有胡斯坦面结构的物质在制备DNA纳米球领域中的用途。

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