CN103975062A

CN103975062A - 核酸扩增方法

Info

Publication number: CN103975062A
Application number: CN201280059861.6A
Authority: CN
Inventors: 矢泽义昭; 横井崇秀; 植松千宗
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: US20140342922A1; US9714449B2; EP2792743A1; JP2013123380A; WO2013088935A1; JP6093498B2; CN103975062B; EP2792743A4; EP2792743B1

Abstract

提供一种核酸扩增方法及手段，其能够减少扩增模板DNA所需工夫和时间，同时解决目前扩增方法存在的问题，并提供一种利用上述核酸扩增方法及手段的碱基序列确定方法及手段。一种核酸扩增方法，其包含将包含能够形成折返结构的接头DNA链的双链接头(20)连接于包含靶DNA序列(1)的双链DNA(1)、(2)，调制由包含切口(5)的双链DNA构成的环状DNA模板的工序，以及在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口(5)为起点进行3’末端延伸反应，从而形成形状为该靶DNA序列(1)和该能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA而串联地连接多个的串联体(29)的工序，该串联体(29)包含最适合进行碱基序列解析的多个靶DNA序列(1)，并且具有通过该折返结构折叠成球状的形状。

Description

核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及一种用于扩增靶DNA序列从而形成串联体(concatemer)的方法及试剂盒。此外，本发明涉及一种用于使用前述形成的串联体确定碱基序列的方法、试剂盒及装置。

背景技术

近年来，开发出了通过超并行碱基序列测定进行的快速且高灵敏度的碱基序列确定方法(非专利文献1)，随着使用该方法的装置的普及，在一周内对植物、真菌、动物、细菌及病毒的全基因组进行解析成为可能。如此得到的碱基序列信息是现今药品开发、医疗、农业各领域不可或缺的资源。毫无疑问，基因序列信息的应用领域在今后会进一步扩大。预计今后会要求进一步提高通量及精度。此外还认为如表达解析这种要求正确的定量性的领域也会不断成熟。

超并行碱基序列测定中，将数百万到数十亿个单克隆DNA片段簇配置于流路基板上，通过并行读取各个簇的核酸片段的碱基序列，实现了高通量。其中，作为形成多个簇并将其配置于流路基板上的手段，使用(a)在模板DNA的一端固定于流路基板上的状态下进行PCR、(b)将乳液PCR(emPCR)产物固定于固体珠、(c)通过环状DNA上的等温扩增形成DNA纳米球等方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第7910354号

专利文献2：日本特表2011-509095号公报(WO2009/089384)

专利文献3：美国专利第5712124号

专利文献4：美国专利第6235502号

专利文献5：美国专利申请公开第2009/0270273号

专利文献6：日本特开2011-58号公报

非专利文献

非专利文献1：J.Shendure and H.Ji，“Next-generation DNA sequencing”，Nature biotechnology第26卷第1135-1145页、2008年

非专利文献2：M.L.Metzker，“Sequencing technologies-the nextgeneration”，Nature Reviews Genatics第11卷第31-46页、2010年

发明内容

发明要解决的问题

超并行碱基序列测定对解析通量及精度的提高有较大贡献，但用于将多个簇配置于流路基板上所需的时间和工夫已成为谋求通量和精度的提高时的障碍。需要进行技术开发以进一步提高定量性。超并行碱基序列测定中，将多个聚集有单克隆DNA片段的簇配置于流路基板，并行读取各个簇的序列。非专利文献2公开了几个有关使簇形成于流路基板上的方法的例子。下面对此前所提出的具有代表性的簇形成法(a)～(c)进行探讨。

(a)是在流路基板上进行扩增，单克隆的扩增产物原位固定于基板上的狭小区域内，因此比较容易形成单克隆簇，但是作为簇形成基础的单克隆DNA片段随机地固定于流路基板上，因此很难将簇以高密度进行配置。(b)方法通过乳液PCR(emPCR)将DNA片段固定化于固体珠上，但是难点在于需要工夫和时间来处理乳液和筛查DNA片段固定化失败的磁珠。(c)方法通过RCA(滚环扩增，Rolling Circle Amplification)形成DNA纳米球(DNA nanoball：DNB)并将其固定于流路基板上，能够花费较少的工夫得到高密度的簇(例如专利文献1和5)。

(a)、(b)、(c)共同的问题在于，3种方法均存在使用相对于模板DNA过量的引物的扩增过程。PCR和RCA中，通常以引物3’端作为扩增过程中碱基延伸的起点(例如专利文献1、5及6)。超并行碱基序列测定中，为了以多个DNA片段为模板进行扩增，需要向溶液中导入必需的充分量的引物。由此，部分引物之间暂时性结合，从而产生了意料之外的扩增产物，导致作为测定对象的DNA文库质量下降。此外，模板扩增用引物一般设计为使其与扩增对象DNA片段的规定区域或者附加在扩增对象DNA片段上且序列已知的接头的规定区域杂交(例如专利文献6)，但是一般而言，扩增对象区域的碱基序列是序列未知的，与接头相邻的序列结构是不可预测的。扩增的初期反应即扩增对象DNA片段的热变性过程受碱基序列结构的热稳定性的影响，因此引物的杂交效率会因包含具有不同序列的扩增对象DNA片段而改变，扩增后的DNA片段的频率分布与模板的频率分布会有所不同。这尤其在定量性蔚为重要的表达解析的场合是一种不希望的特性。

专利文献2作为现有的核酸扩增方法的一个例子，提供了一种使用环状DNA为模板，以引物为起点的连续扩增方法。这里导入的切口的目的在于，使从切口开始的延伸反应在形成于环状DNA的其它位置的另一切口位置停止，并非连续对靶DNA序列进行扩增。关于专利文献4也同样，虽然在环状DNA结构中导入了切口，但并非以切口为起点进行连续的扩增。专利文献3公开了一种利用切口起点扩增的扩增方法，但其也未提供连续扩增的方法。

如上所述，超并行碱基序列测定中，将由多个簇构成的解析对象DNA文库配置于流路基板上所需的时间和工夫已成为谋求通量和精度的进一步提高时的障碍。此外，为提高定量性，需要进行技术开发，以使不同模板间的扩增效率一致。

因此，本发明的课题是提供一种方法及手段，以减少模板DNA扩增所需工夫和时间，同时，排除目前的扩增方法中因引物之间的结合产生的意料之外的扩增产物和因引物杂交效率的偏差产生的各扩增对象DNA的频率分布的变动，简便且快速地对具有未知或者已知序列的模板DNA进行扩增，并提供一种利用前者的碱基序列确定方法及手段。

用于解决问题的手段

本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过将能够形成折返结构的接头连接(ligate)于模板DNA作为环状DNA模板，不使用引物，以切口为起点进行延伸反应，能够形成最适合进行碱基序列解析的多个串联体，并且发现该串联体通过折返结构进行折叠而形成最适合进行碱基序列解析的球状形状，从而完成了本发明。

即，本发明包含如下方案。

[1]一种核酸扩增方法，其特征在于，包含：

(a)将包含能够形成折返结构的接头DNA链的双链接头连接于包含靶DNA序列的双链DNA，调制由包含切口的双链DNA构成的环状DNA模板的工序；

(b)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口为起点进行3’末端延伸反应，从而形成形状为该靶DNA序列和该能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA串联连接多个的串联体的工序；

该串联体具有通过该折返结构进行了折叠的形状。

[2]根据[1]所述的方法，

前述双链接头具有包含第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的接头DNA链，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列，通过该接头DNA链和与之互补的接头DNA链结合而形成双链。

[3]根据[2]所述的方法，

前述双链接头具有接头DNA链，所述接头DNA链从5’末端向3’末端按照第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的顺序构成、或者按照第1DNA序列、第3DNA序列及第2DNA序列的顺序构成、或者按照第2DNA序列、第1DNA序列及第3DNA序列的顺序构成。

[4]根据[1]所述的方法，

前述双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链与第2接头DNA链结合而形成双链；

第1接头DNA链从5’末端向3’末端具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列；

第2接头DNA链从5’末端向3’末端具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列；

前述方法包含：

(b1)在前述环状DNA模板中，于第1接头DNA链上的第1DNA序列的5’末端形成第1切口、于第2接头DNA链上的第3互补序列的5’末端形成第2切口的工序；

(b2)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以第1切口为起点，3’末端延伸至第2接头DNA链上的第2切口位置，形成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链后停止延伸反应，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b3)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列互补的DNA序列延伸，接着，生成与第2接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b4)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列相同的DNA序列延伸，接着，生成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b5)重复工序(b3)和(b4)，从而形成形状为靶DNA序列、第1接头DNA链、与靶DNA序列互补的DNA序列及第2接头DNA链串联连接多个的串联体的工序。

[5]一种碱基序列确定方法，其特征在于，包含：

将通过[1]～[4]中任一项所述的方法形成的1个或者多个串联体固定于流路基板上的工序；

将引物结合于各个该串联体的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列上的工序；

将包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记的探针依次连接于该引物末端的工序；

基于前述标记，检测连接的探针，从而确定靶DNA序列的碱基序列的工序。

[5-2]根据[5]所述的方法，其进一步包含通过[1]～[4]中任一项所述的方法形成1个或者多个串联体的工序。

[5-3]根据[5]所述的方法，除能够形成折返结构的序列之外的序列为第2序列。

[6]一种用于实施[1]～[5]中任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，包含双链接头，该双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链和第2接头DNA链结合而形成双链；

其中，

第1接头DNA链具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列；

第2接头DNA链具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列；

第1接头DNA链及第2接头DNA链中的一条链或者两条链上包含切口或者具有能够形成切口的序列。

[7]根据[6]所述的试剂盒，切口包含于或形成于第1接头DNA链的第2DNA序列的3’末端或者5’末端和/或第2接头DNA链的第2互补序列的3’末端或者5’末端。

[8]根据[6]所述的试剂盒，切口包含于或形成于第1接头DNA链的第1DNA序列的5’末端和/或第2接头DNA链的第3互补序列的5’末端。

[9]根据[6]～[8]中任一项所述的试剂盒，第1接头DNA链从5’末端向3’末端具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列。

[9-2]根据[6]～[9]中任一项所述的试剂盒，双链接头具有平滑末端或者突出末端。

[9-3]根据[6]～[9]中任一项所述的试剂盒，能够形成切口的序列为切口酶的识别位点。

[10]根据[6]～[9]中任一项所述的试剂盒，进一步包含特异性结合于第2DNA序列的引物和/或特异性结合于第2互补序列的引物。

[11]一种碱基序列确定装置，其特征在于，具备：

固定有通过[1]～[4]中任一项所述的方法形成的1个或者多个串联体的流路基板；

供给引物的单元和供给探针的单元，所述引物结合于前述串联体中包含的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列，所述探针包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记；

检测前述标记的单元。

[12]根据[11]所述的装置，周期性配置有柱状结构的流路基板中，该柱状结构的上表面各配置有1个前述串联体。

[13]根据[12]所述的装置，周期性配置的柱状结构的断面直径及柱状结构的配置周期在串联体投影于任意平面时的最大外形尺寸的0.5倍到3倍的范围内。

[14]根据[12]或者[13]所述的装置，周期性配置的柱状结构的侧面及流路基板的表面为疏水性，对于水的接触角为90度以上。

[14-2]根据[11]～[14]中任一项所述的装置，进一步具备实施[1]～[4]中任一项所述的方法形成1个或者多个串联体的单元。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2011-272117号说明书和/或附图记载的内容。

发明的效果

根据本发明，提供一种核酸扩增方法及试剂盒。本核酸扩增方法及试剂盒不仅能够简便且高效地进行核酸扩增，还排除了源自此前使用的引物的人工假象(artifact)的产生，同时，可以实现维持扩增对象DNA分子丰度比的核酸扩增。从而节省工夫和时间，提高通量和精度。此外，根据本核酸扩增方法及试剂盒，能够形成包含最适合用来进行碱基序列确定的数量的靶DNA序列并且为最适合形状的串联体，因此，本发明对于简便且高通量地进行碱基序列确定是有用的。

附图说明

图1为表示核酸扩增反应的一个例子的图。

图2为表示核酸扩增反应的模板的构成例子的图。

图3为表示核酸扩增反应的环状DNA模板的形成方法的例子的图。

图4为表示核酸扩增反应的环状DNA模板的形成方法的例子的图。

图5为表示核酸扩增反应的另一例子的图。

图6为表示核酸扩增反应的环状DNA模板的序列的例子的图。

图7为表示核酸扩增反应的环状DNA模板的形成的例子的图。

图8为表示核酸扩增反应的结果的图。

图9为表示将核酸扩增反应应用于碱基序列确定的例子的图。

图10为表示将核酸扩增反应产物固定在碱基序列确定装置的基板上的方法的一个例子的图。

图11为表示将核酸扩增反应产物固定在碱基序列确定装置的基板上的方法的另一例子的图。

图12为表示串联体向形成有微细柱的基板上的固定的图。

图13为表示使用核酸扩增反应的产物来确定靶DNA序列的碱基序列的方法的例子的图。

具体实施方式

下面对本发明详细地进行说明。

本发明提供一种用于扩增靶DNA序列的方法及手段。本发明中，为了获得数量及形状适合于此后进行的碱基序列确定的扩增产物，在环状双链模板中引入了切口和能够形成折返结构的接头。从而能够形成包含数量适合于碱基序列确定的靶DNA序列且形状适合于碱基序列确定的串联体。

首先，调制包含靶DNA序列的双链DNA。包含靶DNA序列的双链DNA只要是包含欲进行扩增或序列确定的序列的DNA就没有特别限定，可以设为基因组DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA等。其来源也没有特别限定，可以使用来源于生物体(例如细胞、组织、液体等)及合成(例如cDNA文库等DNA文库等)的任意供给源的双链DNA。为生物体供给源的情况，该生物体也没有特别限定，可以使用来源于脊椎动物(例如哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类、两栖类等)、无脊椎动物(例如昆虫、线虫、甲壳类等)、原生生物、植物、真菌、细菌、病毒等任意生物体的供给源。

双链DNA可以通过本技术领域公知的方法调制。例如，由细胞调制双链DNA的情况下，可以使用蛋白酶K之类的蛋白水解酶、硫氰酸胍及盐酸胍等离液盐、吐温及SDS等表面活性剂或者市售的细胞溶解用试剂使细胞溶解，使其中所含的核酸，即基因组DNA和RNA溶出。基因组DNA也可以通过物理切断或限制酶酶切等进行片段化。调制cDNA的情况下，可以利用DNA酶(DNase)将通过细胞溶解溶出的核酸中的DNA分解，获得作为核酸只包含RNA的试样，再使用包含聚T序列的DNA探针仅捕捉mRNA后，使用反转录酶进行反转录反应，从而由mRNA合成cDNA。或者也可以以如上所述调制的DNA或RNA、DNA文库为模板进行扩增反应，调制双链DNA。多个厂商出售用于进行DNA调制的试剂盒，能够简便地对目标双链DNA进行精制。

双链DNA可以包含单种DNA，或者也可以包含多种DNA。即，双链DNA可以包含同样的靶DNA序列，也可以包含不同的序列。例如，双链DNA可以设为DNA库、cDNA文库等。例如，本发明中可以将由多种mRNA制得的cDNA文库中所含的多种cDNA作为双链DNA，均匀地进行扩增。

接着，将双链接头连接(ligate)在包含靶DNA序列的双链DNA上。本发明中，“双链接头”是指为了调制环状DNA模板而与包含靶DNA序列的双链DNA相连接的DNA。双链接头只要包含能够形成折返结构的接头DNA链，就可以设为任意长度的具有任意序列的双链接头。双链接头的结构是1个接头DNA链和与之互补的接头DNA链结合而形成的双链。

本发明中，“折返结构”是指，接头DNA链(单链)上的某序列和与之互补的序列结合从而单链扩增产物在接头DNA链部分折返的状态。因此，能够形成折返结构的接头DNA链包含某序列和与之互补的序列。优选接头DNA链包含某序列和与之互补的序列(形成茎部分)以及不与两序列互补的其他序列(形成发夹部分或环部分)，从而形成本技术领域公知的“发夹”或“茎环”，形成折返结构。

例如，双链接头中的一条接头DNA链具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列时，第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列，即第1DNA序列和第3DNA序列互补。这里，本技术领域公知：即使形成折返结构的两条序列并非完全(100％)互补也能够形成该结构。因此，第1DNA序列与第3DNA序列具有两序列能够结合程度的互补性，例如至少80％的碱基互补，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％、99％或者100％的碱基互补。另外，能够形成折返结构的序列(例如第1及第3DNA序列)具有适合形成折返结构的长度，例如10～100碱基、优选15～50碱基。此外，接头DNA链中的第1～第3DNA序列的配置没有特别限定，本领域技术人员可以适当配置。例如，接头DNA链可以从5’末端向3’末端按照第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的顺序构成，也可以按照第1DNA序列、第3DNA序列及第2DNA序列的顺序构成，或者也可以按照第2DNA序列、第1DNA序列及第3DNA序列的顺序构成(例如参照图2)。优选接头DNA链从5’末端向3’末端按照第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的顺序构成，通过第1和第3DNA序列夹着第2DNA序列形成折返结构，形成发夹或茎环结构。

在优选的实施方式中，双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链与第2接头DNA链结合而形成双链；第1接头DNA链从5’末端向3’末端具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列；第2接头DNA链从5’末端向3’末端具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列。

关于双链接头中能够形成折返结构的接头DNA链的具体序列及长度，本领域技术人员可以根据欲扩增的靶DNA序列的长度及种类、扩增后的串联体的用途等适当设计。除上述能够形成折返结构的接头DNA链及不与两序列互补的其他序列(发夹部分或环部分)之外，双链接头也可以包含例如用于与双链DNA连接的限制酶识别序列。双链接头的调制可以通过公知的DNA合成方法或者委托给商业性的DNA合成委托机构来进行。

将双链接头连接于包含靶DNA序列的双链DNA的方法也没有特别限定。例如，可以将双链接头作为一个盒(Cassette)进行调制，将其与双链DNA连接，作为环状DNA模板(例如参照图3)。另外一种方法是，可以使分割开的双链接头的两段序列结合于双链DNA的两末端后，将该两段序列连接，从而形成环状DNA模板(例如参照图4)。连接可以通过本技术领域中公知的方法进行，例如通过使用限制酶、连接酶的方法。此时，双链DNA与双链接头的连接部分可以具有突出末端或者具有平滑末端。

使如上获得的环状DNA模板包含切口(切断部)。“切口”是指双链DNA的一条链中相邻碱基间的键被切断的位置。切口可以设置在环状DNA模板的一条链或者两条链的任意位置。例如，在将切口设置在环状DNA模板的一条链上的情况下，通过后述3’末端延伸(扩增)反应，靶DNA序列或者其互补序列被扩增，形成多个靶DNA序列串联连接或者多个其互补序列串联连接的串联体。而在将切口设置在环状DNA模板的两条链的情况下，通过后述3’末端延伸(扩增)反应，靶DNA序列及其互补序列两者均被扩增。

切口优选设置在双链接头上。双链接头上的切口位置没有特别限定，可以在双链接头的一条链的5’末端或3’末端或者链上，也可以在双链接头的两条链的5’末端、3’末端或者链上的任意位置(例如参照图2)。设置切口的方法也没有特别限定，可以通过本技术领域中公知的方法进行。例如有(i)将预先设置有切口的双链接头连接于双链DNA的方法，(ii)对双链接头的一条接头DNA链的5’端进行去磷酸化的方法，(iii)识别某一识别序列并将双链中的一条链切断的切口酶(例如N.BstNBI等)识别配置在双链接头上的该识别序列，使其生成切口的方法。例如，在双链接头中，在接头DNA链的任意位置或者5’末端预先设定有切口或者设定有能够被切口酶识别的碱基序列。优选切口包含于或者形成于第1接头DNA链的第1DNA序列的5’末端和/或第2接头DNA链的第3互补序列的5’末端。

调制由包含切口的双链DNA构成的环状DNA模板后，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口为起点进行3’末端延伸反应。本技术领域公知：链置换型DNA聚合酶会从切口位置开始以修复的形式合成新的DNA链(切口平移，nick translation)。本发明中使用链置换型DNA聚合酶，通过滚环扩增(RCA)以切口为起点进行3’末端延伸反应，从而扩增环状DNA模板。

“链置换型DNA聚合酶”是指用于3’末端延伸反应(互补链合成)的聚合酶，其为使模板DNA的双链部分解离从而进行3’末端延伸反应的类型的聚合酶。本发明中可以使用的聚合酶只要是具有这种链置换活性就没有特别限定，可以列举例如phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶(大片段)、Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、Vent(Exo-)DNA聚合酶(从Vent DNA聚合酶中去除核酸外切酶活性后的产物)、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶(从DeepVent DNA聚合酶中去除核酸外切酶活性后的产物)及KOD DNA聚合酶等。根据所选聚合酶的种类，适当设定3’末端延伸反应的反应条件。例如，在使用phi29DNA聚合酶的情况下，最好在其最适反应温度即25～35℃附近(约30℃)进行反应，在使用Bst DNA聚合酶的情况下，最好在60～65℃附近进行反应。

通过这种3’末端延伸反应，形成形状为靶DNA序列和能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA串联地多个连接的串联体。在切口形成于环状DNA模板的一条链、例如双链接头的一条接头DNA链的情况下，形成形状为靶DNA序列和接头DNA链作为单链DNA串联地多个连接的串联体(例如参照图1)。而在切口形成于环状DNA模板的两条链、例如双链接头的两条接头DNA链的情况下，形成形状为靶DNA序列、一条接头DNA链、与靶DNA序列互补的DNA序列及另一条接头DNA链串联地多个连接的串联体(参照图5)。这种串联体包含靶DNA序列和与之互补的DNA序列，因此通过它们之间的结合，串联体会形成由相同序列构成的坚固的簇(集团)。具体实施方式例如可以进行如下工序：(1)第1切口形成于第1接头DNA链上的第1DNA序列的5’末端、第2切口形成于第2接头DNA链上的第3互补序列的5’末端的工序；(2)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以第1切口为起点，3’末端延伸至第2接头DNA链上的第2切口位置，形成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链后停止延伸反应，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；(3)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列互补的DNA序列延伸，接着，生成与第2接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；(4)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列相同的DNA序列延伸，接着，生成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；(5)重复工序(3)和(4)，从而形成形状为靶DNA序列、第1接头DNA链、与靶DNA序列互补的DNA序列及第2接头DNA链串联连接多个的串联体的工序。

根据上述方法，无需引物，即能够以均等的扩增效率进行核酸扩增。如上所述形成的串联体的形状为靶DNA序列和能够形成折返结构的接头DNA链串联连接多个，从而形成该折返结构，具有折叠形状。串联体为包含多个靶DNA序列的簇(集团)，因此可以用于后述碱基序列确定、靶DNA序列的检测等。

通过本发明的核酸扩增方法形成的串联体包含多个靶DNA序列，并且具有所存在的空间区域限定在一定范围内的折叠形状(亦称球状)，因而适合用于碱基序列确定方法。因此，本发明的核酸扩增方法可以作为碱基序列确定的前处理进行。

碱基序列确定方法中，将通过本发明的核酸扩增方法形成的一个或者多个串联体固定于基板、优选流路基板上。基板或者流路基板是指在其上进行碱基序列确定反应的基板，是本技术领域所公知的。例如，只要是通常用于碱基序列确定操作的固体基板就没有特别限定。具体而言，为水不溶性且在加热变性时不会熔融的固体基板，作为其材料，可以列举例如为金、银、铜、铝、钨、钼、铬、铂、钛、镍等金属；不锈钢、哈氏合金、因科镍合金、蒙乃尔合金、硬铝等合金；硅；玻璃、石英玻璃、熔融石英、合成石英、矾土、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石及光敏玻璃等玻璃材料；聚酯树脂、聚苯乙烯、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene树脂)、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂及氯乙烯树脂等塑料；琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚乙烯醇、硝酸纤维素、几丁质、壳聚糖。为了利用荧光标记对反应进行检测，优选透明材料(例如玻璃、塑料等)的固体基板。此外，有关基板的形状也没有特别限定，可以列举平板、分区的平面(例如滴定板)、薄膜、管及粒子等。

将串联体固定于流路基板上的方法没有特别限定，可以例示通过例如物理吸附、共价键、离子键、生物结合(例如，生物素与亲和素或者链霉亲和素的结合、抗原与抗体的结合等)进行固定化的方法等。

作为通过物理吸附将串联体固定于流路基板上的方法，可以列举利用串联体DNA的电荷使其静电结合于用氨基硅烷分子或者阳离子(多聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺等)进行表面处理后的流路基板上的方法等。

通过共价键将串联体固定化于流路基板例如可以通过下述方法来实施：将官能团导入串联体并将与该官能团具有反应性的官能团导入流路基板，使二者反应。例如，可以通过将氨基导入串联体，并将活性酯基、环氧基、醛基、碳二亚胺基、异硫氰酸酯基或者异氰酸酯基导入流路基板表面来形成共价键。此外，也可以将巯基导入串联体，并将活性酯基、马来酰亚胺基或者二硫基导入流路基板表面。作为活性酯基，可以列举例如对硝基苯基、N-羟基丁二酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亚胺基等。作为将官能团导入流路基板表面的一种方法，可以列举用具有所期望官能团的硅烷偶联剂处理流路基板表面的方法。作为偶联剂的例子，可以使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-β-氨丙基甲基二甲氧基硅烷或者γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷等。作为将作为结合位点的官能团导入流路基板表面的其它方法，可以列举等离子处理。

然后，将引物结合于各个串联体的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列。优选将引物结合于接头DNA链中的第2DNA序列或者形成发夹部分或环部分的序列。引物可以通过本技术领域公知的引物设计步骤或者引物设计用程序，在考虑其长度、熔解温度(Tm)的同时，根据接头DNA链中的引物结合区域进行设计。引物的长度为例如10～80碱基，优选12～30碱基，本领域技术人员可以适当选择。串联体中包含多个接头DNA链串联连接，因此引物能够结合于各个接头DNA链。

将包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记的探针依次连接于结合了的引物末端。该探针与常用碱基序列确定方法中所使用的探针相同，由任意的多个碱基构成，例如由2、3、4、5、6、7、8个碱基左右构成。所述多个碱基可以为任意组合的碱基，准备多种包含由各种组合的多个碱基构成的识别位点的探针，将这些探针依次用于向引物末端的连接。结合在探针上的标记只要是本技术领域常用的标记就没有特别限定，可以列举例如荧光标记(Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)等)、发光性半导体标记(硒化锌(Zn-Se)等)、化学发光标记(荧光素等)、酶标记(过氧化酶、β－半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性标记(氚、碘125等)。考虑到标记的检测容易性，标记优选为荧光标记。

探针只有在包含对应于靶DNA序列的碱基种类的识别位点的情况下才能够连接至引物末端。因此，通过检测标记，能够检测所连接的探针的识别位点的碱基种类、即靶DNA序列的碱基种类。标记的测定可以根据标记的种类使用本技术领域公知的方法及设备进行。例如荧光标记、发光性半导体标记及化学发光标记可以使用合适的激光激发，并使用对发射光进行计数的光学系统、荧光显微镜、酶标仪等进行测定。此外，酶标记的情况下，可以添加通过酶作用分解显色的底物，通过光学测定底物的分解量对标记进行测定。放射性标记的情况下，利用闪烁计数器等对放射性标记所发出的放射线量进行测定。本发明中，优选利用荧光，通过对获得的亮点进行计数来分析引物与探针的连接。

通过重复上述步骤，可以确定靶DNA序列的全部或者部分碱基序列。

上述本发明的方法能够通过使用试剂盒更节省工夫且简便地进行。本发明的试剂盒包含双链接头，该双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链与第2接头DNA链结合而形成双链。其中，第1接头DNA链具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列，第2接头DNA链具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列，第1接头DNA链及第2接头DNA链中的一条链或者两条链包含切口或者具有能够形成切口的序列。作为能够形成切口的序列，可以列举例如切口酶的识别序列。双链接头可以具有平滑末端或者具有突出末端。

此外，本发明的试剂盒还可以进一步包含特异性结合于第2DNA序列的引物和/或特异性结合于第2互补序列的引物，该情况下能够更加简便地实施碱基序列确定方法。

此外，本发明提供一种碱基序列确定装置。本发明的碱基序列确定装置例如具备：

固定有通过本发明的方法形成的1个或多个串联体的流路基板；

供给引物的单元和供给探针的单元，所述引物结合于前述串联体中包含的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列；所述探针包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记；

检测前述标记的单元。

碱基序列确定装置还可以进一步具备实施本发明的方法从而形成1个或者多个串联体的单元。

固定有串联体的流路基板可以设为如下流路基板：在周期性配置有柱状结构的流路基板中，该柱状结构的上表面各配置有1个串联体。其中，柱状结构是相对流路基板垂直设置的结构，例如可以设为实施例6中例示的微细柱。柱状结构的尺寸根据所使用的串联体的大小、所使用的标记(荧光等)的信号的强弱等适当设定。碱基序列确定中，要求串联体通过简便的步骤以高的面密度且无重合地固定于流路基板上。因此，例如优选在柱状结构的直径为100nm到10μm、柱状结构的高度为100nm到10μm的区间内设定。此外，柱状结构的配置周期(柱状结构中心线的间隔)优选设为柱状结构直径的1倍到10倍。

串联体由带负电荷的DNA构成，因此可以通过调整因串联体所带负电荷产生的电场所及的范围和柱状结构的尺寸，使串联体通过相互之间的斥力无重复地固定于一个柱状结构的上表面。例如，设为周期性配置的柱状结构的断面直径及柱状结构的配置周期在串联体投影于任意平面时的最大外形尺寸的0.5倍到3倍的范围内。

此外，流路基板中周期性配置的柱状结构的上表面优选为亲水性，具体而言，优选具有对于水的接触角为90度以下的表面。而周期性配置的柱状结构的侧面及流路基板的表面优选为疏水性，具体而言，优选具有对于水的接触角为90度以上的表面。为了设为疏水性，例如可以通过氧等离子体处理的条件进行亲水性及疏水性(憎水性)的控制，或者对表面进行憎水处理，或者用憎水性材质制作流路基板。例如，通过缩短氧等离子体的表面处理时间，能够形成与水的接触角达到90°以上那样的显示强疏水性的状态。从而能够避免串联体被固定于除柱状结构的上表面之外的部分。

标记检测单元方面，在测定例如荧光标记、发光性半导体标记或者化学发光标记的情况下，包括光照射单元、发光检测单元等。光照射单元及发光检测单元可以根据所使用标记的种类和激发、发射波长等进行选择和设计。

此外，本发明的碱基序列确定装置还可以具备温度调节单元、洗涤液供给单元、洗涤单元、洗涤液排液单元、标记检测结果记录单元等。

实施例

下面，参照附图对本发明实施方式的具体例子进行说明。不过应当注意，这些实施例仅为用于实现本发明的一个例子，本发明不受其限定。

[实施例1]

本实施例使用图1对具有立体结构的串联体分子的合成方法、即本发明的核酸扩增反应的一个例子进行说明。

在连接酶的作用下，将具有内部结构3、4、6、7、8、9的双链接头20连接于由靶DNA片段1和与之互补的DNA片段2构成的解析对象双链DNA片段(图1(a))。双链接头20的内部结构3与6以及7与9具有互补的序列，在溶液中能够形成折返结构。序列4是合成的串联体分子29形成折返结构时以环结构的形态形成单链的任意序列，适于设置后述碱基序列解析中的引物结合位点。序列8是与序列4互补的序列。在该双链接头20中的一条接头DNA链上的任意位置，介于双链接头的内部结构4和6之间形成有一个切口5。这里，切口5如后所述可以形成于双链接头的包括两端的任意位置(图2)。通过使连接酶作用于该双链接头20和解析对象双链DNA片段1、2，形成作为DNA扩增模板的环状双链DNA。

使链置换型DNA聚合酶作用于图1(a)所示位置形成有切口5的模板，如图1(b)所示，DNA序列4的3’末端以DNA序列9为模板发生DNA互补链合成，进行延伸。此时，在链置换型DNA聚合酶的作用下，4的3’末端进行延伸的同时，以9为模板生成序列16，最初与9相结合的DNA序列6进行解离。该3’末端进而以构成解析对象双链DNA片段的DNA片段2为模板，一边将反应前结合在2上的靶DNA片段1序列解离，一边形成序列17，并且一边将3、4、16解离，一边形成第2折返结构10、11、12，进行延伸(图1(c)(d))。

然后，如图1(d)所示，靶DNA片段的2次延伸产物18一边解离17一边延伸，形成折返结构13、14、15。通过同样的延伸反应，18解离(图1(e))，随着该反应连续进行，形成被折返结构夹着的靶DNA片段串联连接的形状(串联体)29(图1(f))。反应继续进行，从而形成了串联体的分子在其自身的碱基序列中依次形成折返结构，该串联体分子形成立体结构。

起到串联体分子合成的起点作用的模板DNA中的一条DNA链的切口位置可以设置在双链接头分子的任意位置，接头结构中的折返结构也并非限定于图1所示结构，例如，可以使用图2所示结构。图2(a)为使用图1所示接头结构和切口位置的模板结构。图2(b)为使能够形成折返结构的DNA序列3和6直接邻接，并将序列4配置在序列6的3’末端侧，将切口设置在序列3与靶DNA片段1之间的结构；图2(c)为使能够形成折返结构的DNA序列3和6直接邻接，并将序列4配置在序列6的5’末端侧，将切口设置在序列3与序列4之间的结构。

作为使切口得以存在于这些位置的方法，可以使用下述的任一种：(i)合成预先存在切口的双链接头的方法；(ii)对双链接头的一条DNA链的5’端进行去磷酸化的方法；(iii)利用识别双链接头上配置的特异性碱基序列的切口酶生成切口的方法。

其次，对由解析对象双链DNA片段1、2和双链接头20形成环状模板的方法的两个例子进行说明。第1个例子如图3所示。以通过基因组DNA的物理性切断或者限制酶酶切调制的解析对象双链DNA片段1、2或者通过PCR等DNA扩增方法得到的解析对象双链DNA片段1、2(图3(a))、以及至少一条DNA链中具有互补的DNA序列从而能够形成折返结构的双链接头20(图3(b))为材料，使它们各1分子在连接酶的作用下连接，从而合成环状双链DNA分子(图3(c))。一般利用解析对象双链DNA片段1、2和双链接头20的连接部具有互补的突出末端碱基的结构，但即使是具有平滑末端结构的DNA分子的连接也能够适用。第2个例子如图4所示。对于1分子解析对象双链DNA片段1、2(图4(a))，在其两末端分别结合双链接头的序列后(图4(b))，通过使两个接头序列结合，能够合成环状双链DNA分子(图4(c))。本合成方法中，在连接于解析对象双链DNA片段(图4中1、2)的时刻(图4(b))，可以设想双链接头的序列中(图4中3、4、6、7、8、9)不存在由互补的DNA序列形成折返结构能力的情况，但在形成了环状双链DNA分子的阶段，成为可以设想在接头区域内在1个分子内由互补序列构建折返结构的结构。

[实施例2]

本实施例使用图5对具有立体结构的串联体分子的合成方法、即本发明的核酸扩增反应的一个例子进行说明。

在连接酶的作用下，将具有内部结构103、104、106、107、108、109的双链接头21连接于由靶DNA片段101和与之互补的DNA片段102构成的解析对象双链DNA片段101、102(图5(a))。双链接头21的内部结构103与106以及107与109具有互补的序列，在溶液中能够形成折返结构。序列104是合成的串联体分子129形成折返结构时以环结构的形式形成单链的任意序列，可以设为后述碱基序列解析中引物的结合位点。作为另一实施例，还可以在接头的内部结构103、104或者106中的任一个序列或者以跨多个序列的形式设置引物结合位点。序列108是与序列104互补的序列。其中，第1切口105形成于靶DNA片段101与接头内部结构103之间，第2切口155形成于与靶DNA片段101互补的DNA片段102与接头内部结构109之间。延伸反应可以以切口105或者155为起点发生。在任一种情况下都可以形成目标串联体，这里对以105为起点进行延伸的情况进行说明。

通过使链置换型DNA聚合酶作用于图5(a)的模板，如图5(b)所示，靶DNA片段101的3’末端会先后以DNA序列107、DNA序列108为模板进行延伸形成110、111，最初与107、108、109结合的DNA序列103、104、106解离，在切口155的位置延伸终止。如果通过热波动使110、111、112从107、108、109解离，则110、111、112由于110和112的序列互补性而形成折返结构(图5(c))。109的5’末端被去磷酸化，存在切口155，因此从102的3’末端分离(图5(c))。该折返结构中112的3’末端以101为模板，一边解离102一边延伸，形成具有靶DNA片段101的互补序列的序列116，接着，以106、104、103为模板形成113、114、115(图5(d))。通过热波动使113、114、115从106、104、103解离，由于113和115的序列互补性，形成折返结构，113的3’末端以116为模板，一边解离101一边延伸(图5(e))。通过延伸反应，形成与靶DNA片段101序列相同的117，并以112、111、110为模板形成118、119、120，与前述同样地，通过热波动，由于118和120的序列互补性，形成折返结构，120的3’末端以101为模板进行延伸(图5(f))。120的3’末端以101为模板，一边形成121一边延伸，接着，以106、104、103为模板形成122、123、124(图5(g))。通过重复上述步骤，形成靶DNA片段和与之互补的DNA片段交替重复的串联体129(图5(h))。

[实施例3]

本实施例使用图5、图6及图7举例说明形成供超并行碱基序列测定的串联体分子的方法。

解析对象双链DNA片段如图6(b)的152所示。作为解析对象双链DNA片段的一个例子，152可以使用通过PCR扩增得到的pUC19质粒DNA的部分片段。pUC19质粒的部分片段的扩增可以使用如图6(a)所示的包含通用引物即M13正向引物序列130和限制酶BsaI识别序列134的引物(M13_f01_BsaI)136(序列号1)、和包含M13反向引物序列131和限制酶BsaI识别序列135的引物(M13_f02_BsaI)137(序列号2)，通过以pUC19质粒DNA为模板的PCR法进行，还会生成互补序列138、139(序列号3及4)(图6(b))。通过用限制酶BsaI(NEB制)在150及151位点对得到的扩增DNA产物进行酶切，合成具有突出末端132、133、引物识别位点130和131以及与之互补的DNA序列140、141的解析对象双链DNA片段(图6(c))。

化学合成具有与解析对象双链DNA片段152的突出末端结构互补的DNA序列并且各DNA链的5’端经去磷酸化的双链接头21，与之前合成的解析对象双链DNA片段152混合(图7(a))，通过在T4DNA连接酶(Invitorogen制)的作用下进行的连接反应，合成环状双链DNA分子(图7(b))。本工序中得到的环状双链DNA分子如图7所示在各DNA链上均具有1个切口，切口存在的位置为双链接头的5’端位置。将图7(a)的结构对应于图5(a)的结构给出的图为图7(b)。构成包含靶DNA片段101的双链DNA片段152的单链DNA包含靶DNA片段101、PCR用正向引物、反向引物、突出末端形成用序列，组合有这些的序列对应于图7(b)的序列。

以合成的环状双链DNA分子为材料，添加phi29DNA Polymerase(NEB制)作为链置换型DNA聚合酶，添加dNTP溶液作为反应底物，按照图5的步骤进行核酸扩增反应。本工序中，作为DNA延伸反应的起点起作用的3’末端结构仅存在于环状双链DNA分子101、102中的切口105或者155，从形成环状双链DNA分子的DNA分子开始进行延伸反应(图5(b))。以互补链为模板的DNA延伸反应在存在于互补链DNA分子的接头序列109末端部的切口155位置停止，但由于存在通过延伸反应新形成的接头序列的能够形成折返结构的序列110、112，3’末端序列相对于自身DNA分子形成折返结构(图5(c))，折返后，通过利用自身的靶DNA片段101作为模板序列，继续进行DNA延伸反应。在利用截止到自身的靶DNA片段的末端作为模板的阶段(图5(d))，本应当作为模板的对象DNA序列被打断，但通过存在于所合成的末端序列区域内的接头序列113、115的折返结构，末端序列部形成折返，继续进行以自身DNA分子为模板的DNA延伸反应。本工序中，以自身DNA分子为模板的延伸反应和末端位置处的末端序列折返连续发生，从而合成重复包含靶DNA片段的串联体分子129(图5(h))。由于串联体分子129中重复的折返结构的存在，形成了由串联体分子构成的立体结构。

图8给出了按照上述步骤形成串联体的结果。使用具有图5(a)所示的结构并且由图6(c)所示的序列和接头连接形成的环状双链DNA分子作为模板。反应条件为：模板浓度设为0.2fmol及0.6fmol、滚环扩增(RCA：Rolling CircleAmplification)时间设为1小时(1hr)及3小时(3hr)。使用用于检测双链DNA的PicoGreen(Invitrogen)进行观察。图8所示的亮点对应于1个通过折返结构折叠成球状的、即簇化的串联体。可知，如果模板浓度升高、反应时间延长，则串联体的数量增加(例如图8的样品(4))。

[实施例4]

本发明中，形成串联体所使用的模板DNA可以是供序列测定的DNA。模板DNA可以从任意细胞、组织或者生物中提取，并可以通过该技术领域中所利用的任意方法进行调制。通过图9给出该步骤的一个例子。

例如将基因组DNA201(图9(a))作为测定对象的情况下，在将所提取的基因组DNA201片段化202为数百bp后(图9(b))，进行末端修复、A碱基添加及双链接头DNA204的连接，除去碱基长度超标准的片段，形成包含靶DNA序列203a～f及接头序列204的模板DNA205文库(图9(c))。以205为模板进行扩增，得到立体折叠的DNA纳米球状串联体206a～f，将206a～f固定于流路基板207上，供序列解析。

[实施例5]

本实施例使用图10举例说明将供超并行碱基序列测定的串联体分子206固定于流通池基板209的方法。

如美国专利申请公开第2009/0270273号(专利文献5)中所披露，由DNA分子构成的串联体206带有负电荷，因此通过用氨基硅烷分子对玻璃制流通池基板209的表面进行修饰，串联体206会静电结合于基板209表面的氨基208(图10(b)及(c))上。从而能够将串联体固定于基板上。

[实施例6]

本实施例举例说明将按照基于本发明的步骤形成的、供超并行碱基序列测定的串联体分子206固定于流通池基板270的方法。以下使用图11进行说明。

在玻璃制流通池基板270的流通池内表面形成微细柱271，并将串联体206a～c固定于微细柱271的上表面。这里，优选将微细柱的直径设定为100nm到10μm之间的值、将微细柱的配置周期(微细柱中心线的间隔)设定为微细柱直径的1倍到10倍之间的值、将微细柱的高度设定为100nm到10μm之间的值。序列解析中，要求串联体通过简便的步骤以高的面密度且无重合地固定于流通池。串联体206由带有负电荷的DNA片段构成，因此如图11(b)所示，如果将由串联体所带的负电荷产生的电场所及的范围设为208，则串联体会由于相互之间的斥力而无重复地配置在1个微细柱的上表面。

使用荧光体(PicoGreen、Invitrogen)对通过实施例3所示步骤生成的对象串联体进行标记，并将其固定于微细柱上，通过荧光显微镜进行观察，将其结果示于图12。图12中，微细柱直径为1.0μm、微细柱高度为1.0μm、微细柱配置周期为1.5μm。由图12可知，图中所示的荧光291及292限定在微细柱上表面的有限的区域内。

[实施例7]

本实施例举例说明将按照基于本发明的步骤形成的、供超并行碱基序列测定的串联体分子206固定于流通池基板270上的其它方法。

在玻璃制流通池基板270的流路内表面形成例如由聚苯乙烯等树脂材料制成的微细柱271，并利用氨基硅烷分子对微细柱271进行修饰。由DNA分子构成的串联体206带有负电荷，因此能够静电结合于氨基上(图11(a)及(b))。

如图11(c)所示，通过使包含反应溶液等的溶液280流入流路273、272中，能够在固定于微细柱274上表面的串联体281、282、283上进行序列解析。这里，通过将柱高度设定为0.5μm以上并且使荧光检测光学系统的焦点位置设定在柱的上表面，不仅能够抑制固定在如275、276、277那样进行了DNA固定化处理的上表面、侧面、谷间部的串联体发出的荧光混入检测系统，而且能够抑制如284那样固定在微细柱274的谷间区域的串联体284发出的荧光混入检测系统。

作为另一实施例，可以考虑下述结构：在形成有微细柱274的基板中，仅对微细柱274的上表面实施串联体固定化处理，从而抑制串联体向柱谷间的固定。包括上表面、侧面、谷间部的微细柱基板的表面可以通过例如氧等离子体处理的条件对亲水性、疏水性(憎水性)程度进行控制。通过缩短上述氧等离子体的处理时间，能够形成与水的接触角达到90°以上那样的显示强疏水性的状态。如果在该表面状态的微细柱基板上滴加聚-L-赖氨酸(Poly-L-Lysine：SIGMA-ALDRICH)，则聚-L-赖氨酸液仅接触柱上表面，而不接触柱谷间、柱侧面，如图11(d)所示，聚-L-赖氨酸仅附着于如285那样的上表面，而不附着于侧面287、谷间286的部分。此外，在序列解析中，由于侧面287、谷间部286为疏水性，流路中流通的包含探针等的溶液280也不会浸润。因此，作为模板的串联体281、282、283及探针不会到达除微细柱上表面285之外的位置，所以在除柱上表面之外的位置不会发生反应，能够提高检测精度。

[实施例8]

本实施例使用图13对使用按照基于本发明的步骤形成的串联体进行超并行碱基序列测定的步骤的一个例子进行说明。

作为超并行碱基序列测定的一个例子，周知的是通过连接进行的序列解析(sequencing by ligation)(M.L.Metzker，“Sequencing technologies-the nextgeneration”，Nature Reviews Genatics112010p31-46(非专利文献2))。如图13(a)所示，串联体分子206具有接头序列210和靶DNA序列211串联连接而成的串联体序列212。

如图13(b)所示，引物213结合于接头DNA序列216中的引物识别位点，接着，连接识别引物213的5’侧的两个碱基序列的探针(第1碱基识别位点)214。该探针上修饰有对应于两碱基序列的色素(第1标记)215，通过读取该色素的荧光信号，能够识别该两碱基序列、即靶DNA序列217(图13(b)中的b-1)。然后，去除215后，使用以色素(第2标记)225修饰的探针(包含第2碱基识别位点224)读取探针5’端的两个碱基(图13(b)中的b-2)。使用234及235，通过同样的反应读取下两个碱基(图13(b)中的b-3)、依次重复之，以解析从引物端开始的序列。

为提高杂交的稳定性，探针具有在两个碱基的序列识别位点增加6个碱基的碱基长度。其中，如图13(c)所示，准备多个引物213、223、233、243、253，使其能够依次杂交于各有1个碱基不同的识别位点，通过使连接的开始位置平移，能够读取靶DNA序列217的整个区域。

串联体212在接头DNA序列210中串联地具有多个引物识别位点，在一个串联体中同时进行多个同样的连接反应。根据串联连接的接头和靶DNA序列的连接数，能够获得较强的信号强度。

另外，本发明不限定于上述实施例，还包含各种变形例。例如，上述实施例是为了对本发明易于理解地进行说明而详细说明的例子，并不一定限定于具备所说明的全部构成。此外，可以将某一实施例的部分构成换到另一实施例的构成中，另外，也可以在某一实施例的构成中添加另一实施例的构成。此外，还可以在各实施例的部分构成追加、删除或置换其他构成。

附图标记说明

1：靶DNA片段

2：与1互补的DNA片段

3：构成接头的DNA序列

4：构成接头的DNA序列

5：切口

6：能够与3形成折返结构的DNA序列

7：与3互补的DNA序列

8：与4互补的DNA序列

9：与6互补的DNA序列

10：以7的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

11：以8的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

12：以9的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

13：以7的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

14：以8的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

15：以9的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

16：以9的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

17：以2的DNA片段为模板延伸的靶DNA片段

18：以2的DNA片段为模板延伸的靶DNA片段

20：双链接头

21：双链接头

29：串联体

101：靶DNA片段

102：与101互补的DNA片段

103：构成接头的DNA序列

104：构成接头的DNA序列

105：切口

106：能够与103形成折返结构的DNA序列

107：与103互补的DNA序列

108：与104互补的DNA序列

109：与106互补的DNA序列

110：以107的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

111：以108的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

112：以109的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

113：以106的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

114：以104的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

115：以103的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

116：以101的DNA片段为模板延伸的与靶DNA片段101互补的DNA序列的一部分

117：以116的DNA序列为模板延伸的与靶DNA片段具有相同序列的DNA序列

118：以112的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

119：以111的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

120：以110的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

121：以101的DNA片段为模板延伸的与靶DNA片段101互补的DNA序列的一部分

122：以106的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

123：以104的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

124：以103的DNA序列为模板延伸的接头的一部分

129：串联体

130：包含引物识别位点的DNA序列

131：包含引物识别位点的DNA序列

132：形成突出末端的序列

133：形成突出末端的序列

134：限制酶识别序列

135：限制酶识别序列

136：由包含引物识别位点的DNA序列、形成突出末端的序列及限制酶识别序列构成的引物序列

137：由包含引物识别位点的DNA序列、形成突出末端的序列及限制酶识别序列构成的引物序列

138：与136互补的DNA序列

139：与137互补的DNA序列

140：与DNA序列130互补的DNA序列

141：与DNA序列131互补的DNA序列

150：限制酶酶切位点

151：限制酶酶切位点

152：解析对象双链DNA片段

155：切口

201：基因组DNA

202：片段化的基因组DNA

203、203a、203b、203c、203d、203e、203f：模板DNA中的靶DNA序列

204：模板DNA中的接头序列

205：模板DNA

206、206a、206b、206c、206d、206e、206f：DNA纳米球状的串联体

207：流路基板

208：串联体的静电力所及的范围/氨基

209：流通池基板

210：接头DNA序列

211：靶DNA序列

212：串联体序列

213：引物/第1轮引物结合中的引物

214：第1碱基识别位点

215：第1标记

216：接头DNA序列

217：靶DNA序列

223：第2轮引物结合中的引物

224：第2碱基识别位点

225：第2标记

233：第3轮引物结合中的引物

234：第3碱基识别位点

235：第3标记

243：第4轮引物结合中的引物

253：第5轮引物结合中的引物

270：流通池基板(流路基板)

271：微细柱

272：构成流通池基板(流路基板)下表面的结构

273：构成流通池基板(流路基板)上表面的结构

274：微细柱

275：经DNA固定化处理的微细柱上表面

276：经DNA固定化处理的流通池基板(流路基板)下表面中的无流通池部分(谷间)

277：经DNA固定化处理的微细柱侧面

280：反应溶液

281：固定于微细柱上表面的串联体

282：固定于微细柱上表面的串联体

283：固定于微细柱上表面的串联体

284：固定于无微细柱的流通池基板(流路基板)下表面的串联体

285：经DNA固定化处理的微细柱上表面

286：未经DNA固定化处理的流通池基板(流路基板)下表面中的无流通池部分(谷间)

287：未经DNA固定化处理的微细柱侧面

291：固定于微细柱上的串联体的荧光

292：固定于微细柱上的串联体的荧光

序列表自由文本

序列号1～8：人工序列(合成DNA)

本说明书中所引用的全部出版物、专利及专利申请均原封不动地作为参考引入本说明书。

Claims

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包含：

(a)将包含能够形成折返结构的接头DNA链的双链接头连接于包含靶DNA序列的双链DNA，调制由包含切口的双链DNA构成的环状DNA模板的工序；和

(b)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口为起点，进行3’末端延伸反应，从而形成形状为该靶DNA序列和该能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA串联连接多个的串联体的工序；

该串联体具有通过该折返结构进行了折叠的形状。

2.根据权利要求1所述的方法，所述双链接头具有包含第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的接头DNA链，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列，通过该接头DNA链和与之互补的接头DNA链结合而形成双链。

3.根据权利要求2所述的方法，所述双链接头具有接头DNA链，所述接头DNA链从5’末端向3’末端按照第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的顺序构成、或者按照第1DNA序列、第3DNA序列及第2DNA序列的顺序构成、或者按照第2DNA序列、第1DNA序列及第3DNA序列的顺序构成。

4.根据权利要求1所述的方法，

所述双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链和第2接头DNA链结合而形成双链；

所述方法包含：

(b1)在所述环状DNA模板中，于第1接头DNA链上的第1DNA序列的5’末端形成第1切口、于第2接头DNA链上的第3互补序列的5’末端形成第2切口的工序；

(b5)重复工序(b3)和(b4)，从而形成形状为靶DNA序列、第1接头DNA链、与靶DNA序列互补的DNA序列及第2接头DNA串联连接多个的串联体的工序。

5.一种碱基序列确定方法，其特征在于，包含：

将通过权利要求1～4中任一项所述的方法形成的1个或者多个串联体固定于流路基板上的工序；

基于所述标记，检测连接的探针，从而确定靶DNA序列的碱基序列的工序。

6.一种用于实施权利要求1～5中任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，包含双链接头，所述双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链和第2接头DNA链结合而形成双链；

其中，

7.根据权利要求6所述的试剂盒，切口包含于或形成于第1接头DNA链的第2DNA序列的3’末端或者5’末端和/或第2接头DNA链的第2互补序列的3’末端或者5’末端。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，切口包含于或形成于第1接头DNA链的第1DNA序列的5’末端和/或第2接头DNA链的第3互补序列的5’末端。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的试剂盒，第1接头DNA链从5’末端向3’末端具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列。

10.根据权利要求6～9中任一项所述的试剂盒，进一步包含特异性结合于第2DNA序列的引物和/或特异性结合于第2互补序列的引物。

11.一种碱基序列确定装置，其特征在于，具备：

固定有通过权利要求1～4中任一项所述的方法形成的1个或者多个串联体的流路基板；

供给引物的单元和供给探针的单元，所述引物结合于所述串联体中包含的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列，所述探针包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记；

检测所述标记的单元。

12.根据权利要求11所述的装置，周期性配置有柱状结构的流路基板中，该柱状结构的上表面各配置有1个所述串联体。

13.根据权利要求12所述的装置，周期性配置的柱状结构的断面直径及柱状结构的配置周期在串联体投影于任意平面时的最大外形尺寸的0.5倍到3倍的范围内。

14.根据权利要求12或者13所述的装置，周期性配置的柱状结构的侧面及流路基板的表面为疏水性，对于水的接触角为90度以上。