JPH10293128A - 試料中の核酸被検物質を検出するための装置および方法 - Google Patents
試料中の核酸被検物質を検出するための装置および方法Info
- Publication number
- JPH10293128A JPH10293128A JP9346496A JP34649697A JPH10293128A JP H10293128 A JPH10293128 A JP H10293128A JP 9346496 A JP9346496 A JP 9346496A JP 34649697 A JP34649697 A JP 34649697A JP H10293128 A JPH10293128 A JP H10293128A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- probe
- test substance
- analyte
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の核酸被検物質を検出するための装置
および方法を提供すること。 【解決手段】 本発明の装置は、それぞれが核酸被検物
質に結合する核酸プローブの二次元分布または場が結合
した固相支持体を含み、これは増幅方法を用いて検出さ
れる。
および方法を提供すること。 【解決手段】 本発明の装置は、それぞれが核酸被検物
質に結合する核酸プローブの二次元分布または場が結合
した固相支持体を含み、これは増幅方法を用いて検出さ
れる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の核酸被検
物質を検出するための装置および方法に関する。
物質を検出するための装置および方法に関する。
【０００２】
【発明が解決すべき課題】例えば医学的な診断で用いら
れる試料中に痕跡量存在する被検物質を検出するために
は、高感度かつ特異的な方法が必要とされる。こうした
被検物質の検出は、試料中により高濃度に存在する物質
の存在によって妨げられうる。この問題は、被検物質が
その検出を容易にさせる物理的または化学的な性質を有
しない場合には複雑なものとなる。
れる試料中に痕跡量存在する被検物質を検出するために
は、高感度かつ特異的な方法が必要とされる。こうした
被検物質の検出は、試料中により高濃度に存在する物質
の存在によって妨げられうる。この問題は、被検物質が
その検出を容易にさせる物理的または化学的な性質を有
しない場合には複雑なものとなる。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、固相支持体の
表面に結合したプローブの二次元分布または場を有する
アッセイ装置を提供する。本発明の装置は試料中の被検
物質核酸を検出するための方法において使用することが
できる。これらの方法において、プローブの場を有する
固相支持体の表面に試料を適用し、プローブに結合する
試料中の被検物質を増幅方法によって検出する。
表面に結合したプローブの二次元分布または場を有する
アッセイ装置を提供する。本発明の装置は試料中の被検
物質核酸を検出するための方法において使用することが
できる。これらの方法において、プローブの場を有する
固相支持体の表面に試料を適用し、プローブに結合する
試料中の被検物質を増幅方法によって検出する。
【０００４】従って、本発明の特徴のひとつは、試料中
の核酸被検物質の存在を検出するためのアッセイ装置で
ある。本発明の装置には、（１）支持体に、例えば共有
結合で結合し、自触媒作用的に複製しうる核酸（例えば
Ｑ−ベータレプリカーゼで複製しうる、中間変異型（mi
divariant）核酸のような核酸）の５’−部分を含む第
一の末端、および（２）被検物質結合セグメントを含む
第二の末端、をそれぞれ有する被検物質特異的な核酸プ
ローブの二次元場が、例えば共有結合で結合した固相支
持体（例えばガラスプレートのような非粒子型固相支持
体）が含まれる。
の核酸被検物質の存在を検出するためのアッセイ装置で
ある。本発明の装置には、（１）支持体に、例えば共有
結合で結合し、自触媒作用的に複製しうる核酸（例えば
Ｑ−ベータレプリカーゼで複製しうる、中間変異型（mi
divariant）核酸のような核酸）の５’−部分を含む第
一の末端、および（２）被検物質結合セグメントを含む
第二の末端、をそれぞれ有する被検物質特異的な核酸プ
ローブの二次元場が、例えば共有結合で結合した固相支
持体（例えばガラスプレートのような非粒子型固相支持
体）が含まれる。
【０００５】また本発明には、試料中の核酸被検物質の
存在を検出するための方法が含まれる。この方法におい
て、試料をまず、（ｉ）支持体に結合し、自触媒作用的
に複製しうる核酸（例えばＱ−ベータレプリカーゼで複
製しうる、中間変異型核酸のような核酸）の５’部分を
含む第一の末端、および（ｉｉ）第一の被検物質結合セ
グメントを含む第二の末端、をそれぞれ有する第一の被
検物質特異的核酸プローブの二次元場が、例えば共有結
合で結合している固相支持体に適用する。この方法で使
用される第一のプローブのそれぞれの第一の被検物質結
合セグメントは、被検物質の第一の領域とハイブリダイ
ズする。次いで、（ｉ）被検物質の第二の領域とハイブ
リダイズする第二の被検物質結合セグメントを有し、そ
して（ｉｉ）自触媒作用的に複製しうる核酸の残部を有
する、第二の核酸プローブを固相支持体に適用する。被
検物質の第一および第二の領域は隣接するヌクレオチド
セグメントであり、被検物質、第一のプローブ、および
第二のプローブは支持体上で共にハイブリダイズして、
完全に自触媒作用的に複製しうる核酸を有する複合体を
形成する。あるいはまた、固相支持体に適用する前に試
料を第二のプローブと接触させることもできる。
存在を検出するための方法が含まれる。この方法におい
て、試料をまず、（ｉ）支持体に結合し、自触媒作用的
に複製しうる核酸（例えばＱ−ベータレプリカーゼで複
製しうる、中間変異型核酸のような核酸）の５’部分を
含む第一の末端、および（ｉｉ）第一の被検物質結合セ
グメントを含む第二の末端、をそれぞれ有する第一の被
検物質特異的核酸プローブの二次元場が、例えば共有結
合で結合している固相支持体に適用する。この方法で使
用される第一のプローブのそれぞれの第一の被検物質結
合セグメントは、被検物質の第一の領域とハイブリダイ
ズする。次いで、（ｉ）被検物質の第二の領域とハイブ
リダイズする第二の被検物質結合セグメントを有し、そ
して（ｉｉ）自触媒作用的に複製しうる核酸の残部を有
する、第二の核酸プローブを固相支持体に適用する。被
検物質の第一および第二の領域は隣接するヌクレオチド
セグメントであり、被検物質、第一のプローブ、および
第二のプローブは支持体上で共にハイブリダイズして、
完全に自触媒作用的に複製しうる核酸を有する複合体を
形成する。あるいはまた、固相支持体に適用する前に試
料を第二のプローブと接触させることもできる。
【０００６】その後、拡散制限（例えば伝達（convecti
on）制限）マトリクス（例えばゼラチン、アガロース、
ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、あるい
はこれらの組み合わせからなるもの）を固相支持体に適
用し、完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅して
増幅産物を生成し、これを試料中の被検物質の存在の尺
度として検出する。拡散制限マトリクスには、自触媒作
用的複製の速度を調節するためにカチオン性ポリマーの
ような試薬を更に含有させることができる。場合によっ
て、この方法にはまた、第一および第二のプローブを複
合体中で共にライゲートして完全な自触媒的に複製しう
る核酸を形成する段階を含ませることができる。更に、
この方法に、未結合の第一または第二のプローブを複合
体から除去する洗浄段階を含ませることができる。ま
た、この方法において第二のプローブと接触する前に試
料を支持体に適用することができ、あるいは試料を支持
体に適用する前に第二のプローブと接触させることがで
きる。
on）制限）マトリクス（例えばゼラチン、アガロース、
ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、あるい
はこれらの組み合わせからなるもの）を固相支持体に適
用し、完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅して
増幅産物を生成し、これを試料中の被検物質の存在の尺
度として検出する。拡散制限マトリクスには、自触媒作
用的複製の速度を調節するためにカチオン性ポリマーの
ような試薬を更に含有させることができる。場合によっ
て、この方法にはまた、第一および第二のプローブを複
合体中で共にライゲートして完全な自触媒的に複製しう
る核酸を形成する段階を含ませることができる。更に、
この方法に、未結合の第一または第二のプローブを複合
体から除去する洗浄段階を含ませることができる。ま
た、この方法において第二のプローブと接触する前に試
料を支持体に適用することができ、あるいは試料を支持
体に適用する前に第二のプローブと接触させることがで
きる。
【０００７】この方法における増幅段階は、挿入型蛍光
色素の存在下で実施することができ、その場合、検出段
階はその色素の存在について増幅産物をモニターするこ
とにより実施することができる。検出段階はまた、蛍光
体−消光体対（fluor-quencher pair）を使用すること
によって実施することができる。この検出段階は、識別
しうる蛍光部分を有する多価の蛍光体−消光体対の使用
によって多価の被検物質を試料中で同時に検出する、こ
の方法の変法において用いることができる。
色素の存在下で実施することができ、その場合、検出段
階はその色素の存在について増幅産物をモニターするこ
とにより実施することができる。検出段階はまた、蛍光
体−消光体対（fluor-quencher pair）を使用すること
によって実施することができる。この検出段階は、識別
しうる蛍光部分を有する多価の蛍光体−消光体対の使用
によって多価の被検物質を試料中で同時に検出する、こ
の方法の変法において用いることができる。
【０００８】この方法にはまた、試料中の被検物質の濃
度を決定する段階を含ませることができる。例えば、以
下に更に記載するように、試料中の被検物質の濃度は固
相支持体上に形成される増幅産物のコロニーを計数する
ことにより決定することができる。
度を決定する段階を含ませることができる。例えば、以
下に更に記載するように、試料中の被検物質の濃度は固
相支持体上に形成される増幅産物のコロニーを計数する
ことにより決定することができる。
【０００９】本発明はまた、試料中の核酸被検物質を検
出するためのアッセイ系を含む。このアッセイ系には、
（ｉ）支持体に、例えば共有結合で結合し、自触媒作用
的に複製しうる核酸の５’−部分を含む第一の末端、お
よび（ｉｉ）第一の被検物質結合セグメントを含む第二
の末端、をそれぞれ有する第一の被検物質特異的核酸プ
ローブの二次元場が、例えば共有結合で結合した固相支
持体（例えば非粒子型の固相支持体）が含まれる。この
系の第一のプローブのそれぞれの第一の被検物質結合セ
グメントは、被検物質の第一の領域とハイブリダイズす
る。この系には更に、（ｉ）被検物質の第二の領域とハ
イブリダイズする第二の被検物質結合セグメント、およ
び（ｉｉ）自触媒作用的に複製しうる核酸の残部、を有
する第二の核酸プローブが含まれる。この系を使用して
検出される被検物質の第一および第二の領域は、隣接す
るヌクレオチドセグメントを含み、第一および第二のプ
ローブの被検物質への結合によって、自触媒作用的に複
製しうる核酸の増幅が可能となる。
出するためのアッセイ系を含む。このアッセイ系には、
（ｉ）支持体に、例えば共有結合で結合し、自触媒作用
的に複製しうる核酸の５’−部分を含む第一の末端、お
よび（ｉｉ）第一の被検物質結合セグメントを含む第二
の末端、をそれぞれ有する第一の被検物質特異的核酸プ
ローブの二次元場が、例えば共有結合で結合した固相支
持体（例えば非粒子型の固相支持体）が含まれる。この
系の第一のプローブのそれぞれの第一の被検物質結合セ
グメントは、被検物質の第一の領域とハイブリダイズす
る。この系には更に、（ｉ）被検物質の第二の領域とハ
イブリダイズする第二の被検物質結合セグメント、およ
び（ｉｉ）自触媒作用的に複製しうる核酸の残部、を有
する第二の核酸プローブが含まれる。この系を使用して
検出される被検物質の第一および第二の領域は、隣接す
るヌクレオチドセグメントを含み、第一および第二のプ
ローブの被検物質への結合によって、自触媒作用的に複
製しうる核酸の増幅が可能となる。
【００１０】本発明に含まれる試料中の核酸被検物質を
検出するための他のアッセイ系には、被検物質の捕捉領
域（capture region）とハイブリダイズする捕捉セグメ
ントをそれぞれ有する捕捉プローブの二次元場が結合し
た固相支持体（例えば非粒子型の固相支持体）が含まれ
る。このアッセイ系にはまた、（ｉ）被検物質の第一の
領域にハイブリダイズする第一のセグメントを有する第
一の核酸プローブ、（ｉｉ）被検物質の第二の領域にハ
イブリダイズする第二のセグメントを有する第二の核酸
プローブ、および（ｉｉｉ）固相支持体に適用するため
の拡散制限（例えば伝達制限）マトリクスが含まれる。
この系において、被検物質への捕捉プローブと、第一お
よび第二のプローブの結合によって、拡散制限マトリク
ス内での検出しうる産物の増幅が可能となる。
検出するための他のアッセイ系には、被検物質の捕捉領
域（capture region）とハイブリダイズする捕捉セグメ
ントをそれぞれ有する捕捉プローブの二次元場が結合し
た固相支持体（例えば非粒子型の固相支持体）が含まれ
る。このアッセイ系にはまた、（ｉ）被検物質の第一の
領域にハイブリダイズする第一のセグメントを有する第
一の核酸プローブ、（ｉｉ）被検物質の第二の領域にハ
イブリダイズする第二のセグメントを有する第二の核酸
プローブ、および（ｉｉｉ）固相支持体に適用するため
の拡散制限（例えば伝達制限）マトリクスが含まれる。
この系において、被検物質への捕捉プローブと、第一お
よび第二のプローブの結合によって、拡散制限マトリク
ス内での検出しうる産物の増幅が可能となる。
【００１１】このアッセイ系は、試料中の核酸被検物質
の存在を検出するための方法において用いることができ
る。この方法においては、試料を先に記載した結合型捕
捉プローブおよび第一および第二のプローブと接触さ
せ、被検物質の捕捉領域および第一の領域は隣接するヌ
クレオチドセグメントであり、被検物質の捕捉領域およ
び第二の領域は隣接するヌクレオチドセグメントであ
り、第一の核酸プローブは更に自触媒作用的に複製しう
る核酸分子の一部を有し、第二の核酸プローブは更に自
触媒作用的に複製しうる核酸分子の残部を有し、そして
接触によって被検物質、第一のプローブ、および第二の
プローブが支持体上で共にハイブリダイズして完全に自
触媒作用的に複製しうる核酸を有する複合体を形成す
る。次いで拡散制限マトリクスを固相支持体に適用し、
完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅して増幅産
物を生成し、これを試料中の被検物質の存在の尺度とし
て検出することができる。
の存在を検出するための方法において用いることができ
る。この方法においては、試料を先に記載した結合型捕
捉プローブおよび第一および第二のプローブと接触さ
せ、被検物質の捕捉領域および第一の領域は隣接するヌ
クレオチドセグメントであり、被検物質の捕捉領域およ
び第二の領域は隣接するヌクレオチドセグメントであ
り、第一の核酸プローブは更に自触媒作用的に複製しう
る核酸分子の一部を有し、第二の核酸プローブは更に自
触媒作用的に複製しうる核酸分子の残部を有し、そして
接触によって被検物質、第一のプローブ、および第二の
プローブが支持体上で共にハイブリダイズして完全に自
触媒作用的に複製しうる核酸を有する複合体を形成す
る。次いで拡散制限マトリクスを固相支持体に適用し、
完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅して増幅産
物を生成し、これを試料中の被検物質の存在の尺度とし
て検出することができる。
【００１２】上記のアッセイ系の変形として、被検物質
の第一および第二の領域は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであってもよく、第一の核酸プローブは更に自触媒
作用的に複製しうる核酸分子の一部を有することがで
き、また第二の核酸プローブは更に自触媒作用的に複製
しうる核酸分子の残部を有することができる。
の第一および第二の領域は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであってもよく、第一の核酸プローブは更に自触媒
作用的に複製しうる核酸分子の一部を有することがで
き、また第二の核酸プローブは更に自触媒作用的に複製
しうる核酸分子の残部を有することができる。
【００１３】この変形もまた、試料中の核酸被検物質の
存在を検出するための方法において用いることができ
る。この方法においては、試料を先に記載した結合型捕
捉プローブおよび第一および第二のプローブと接触さ
せ、被検物質の第一および第二の領域は隣接するヌクレ
オチドセグメントであり、第一の核酸プローブは更に自
触媒作用的に複製しうる核酸分子の一部を有し、第二の
核酸プローブは更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子
の残部を有し、そして接触によって被検物質、第一のプ
ローブ、および第二のプローブが支持体上で共にハイブ
リダイズして完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を有
する複合体を形成する。次いで拡散制限マトリクスを固
相支持体に適用し、完全な自触媒作用的に複製しうる核
酸の増幅を実施して増幅産物を生成し、増幅産物を試料
中の被検物質の存在の尺度として検出する。
存在を検出するための方法において用いることができ
る。この方法においては、試料を先に記載した結合型捕
捉プローブおよび第一および第二のプローブと接触さ
せ、被検物質の第一および第二の領域は隣接するヌクレ
オチドセグメントであり、第一の核酸プローブは更に自
触媒作用的に複製しうる核酸分子の一部を有し、第二の
核酸プローブは更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子
の残部を有し、そして接触によって被検物質、第一のプ
ローブ、および第二のプローブが支持体上で共にハイブ
リダイズして完全な自触媒作用的に複製しうる核酸を有
する複合体を形成する。次いで拡散制限マトリクスを固
相支持体に適用し、完全な自触媒作用的に複製しうる核
酸の増幅を実施して増幅産物を生成し、増幅産物を試料
中の被検物質の存在の尺度として検出する。
【００１４】もう一つのアッセイ系において、被検物質
の捕捉領域および第一の領域は隣接するヌクレオチドセ
グメントであり、被検物質の捕捉領域および第二の領域
は隣接するヌクレオチドセグメントであり、第一の核酸
プローブは更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子の一
部を有し、第二の核酸プローブは更に自触媒作用的に複
製しうる核酸分子の残部を有する。
の捕捉領域および第一の領域は隣接するヌクレオチドセ
グメントであり、被検物質の捕捉領域および第二の領域
は隣接するヌクレオチドセグメントであり、第一の核酸
プローブは更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子の一
部を有し、第二の核酸プローブは更に自触媒作用的に複
製しうる核酸分子の残部を有する。
【００１５】本発明は、試料中の核酸被検物質の存在を
検出する更に別の方法を含む。この方法において、試料
を、（ｉ）支持体に、例えば共有結合で結合している第
一の末端、および（ｉｉ）第一の被検物質結合セグメン
トを有する第二の末端、をそれぞれ有する第一の被検物
質特異的核酸プローブの二次元場が、例えば共有結合で
結合した固相支持体と接触させる。支持体に拡散制限マ
トリクスを適用し、第一のプローブおよび特定の被検物
質核酸双方の存在に依存する様式で、かつこの増幅反応
の産物が固相支持体上の拡散制限マトリクス内で局在す
る焦点を形成するように拘束される様式で、ポリメラー
ゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在型増幅、核酸
配列に基づく増幅、あるいはストランド置換型増幅を使
用して増幅を実施する。次いで増幅産物を試料中の被検
物質の存在の尺度として検出する。
検出する更に別の方法を含む。この方法において、試料
を、（ｉ）支持体に、例えば共有結合で結合している第
一の末端、および（ｉｉ）第一の被検物質結合セグメン
トを有する第二の末端、をそれぞれ有する第一の被検物
質特異的核酸プローブの二次元場が、例えば共有結合で
結合した固相支持体と接触させる。支持体に拡散制限マ
トリクスを適用し、第一のプローブおよび特定の被検物
質核酸双方の存在に依存する様式で、かつこの増幅反応
の産物が固相支持体上の拡散制限マトリクス内で局在す
る焦点を形成するように拘束される様式で、ポリメラー
ゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在型増幅、核酸
配列に基づく増幅、あるいはストランド置換型増幅を使
用して増幅を実施する。次いで増幅産物を試料中の被検
物質の存在の尺度として検出する。
【００１６】本発明において使用することのできる増幅
方法としては、既知の方法、例えば、（ｉ）ポリメラー
ゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”；Saikiら, Science, 230:1350
-1354, 1985）、転写に基づく増幅系（”ＴＡＳ”；Kwo
hら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177, 198
9）、自己保存型配列反応（self-sustained sequencere
action）（”３ＳＲ”；Guatelliら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87:1874-1878, 1990）、転写介在型増幅
（”ＴＭＡ”；米国特許第5,399,491号；国際公開ＷＯ9
3/22461号）、核酸配列に基づく増幅（”ＮＡＳＢ
Ａ”；Compton, Nature, (London) 350:91-92, 199
1）、ストランド置換型増幅（”ＳＤＡ”；Walkerら, N
ucleic Acids Research, 20:1691-1696, 1992）等の標
的増幅法；および（ｉｉ）Ｑ−ベータレプリカーゼ（”
ＱＢＲ”；Lizardiら, Bio/Technology, 6:1197-1202,
1988）、リガーゼ増幅反応（”ＬＡＲ”；Wuら, Genomi
cs, 4:560-569, 1989）およびリガーゼ連鎖反応（”Ｌ
ＣＲ”；Barany, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 88:189-
193, 1991）等のプローブ増幅法等が含まれる。本発明
において使用することのできるこれらの、あるいは他の
増幅方法はPershingらの総説にまとめられている（（編
集）診断分子微生物学−原理と応用；（eds.）Diagnost
ic Molecular Microbiology, Principles and Applicat
ions, American Society for Microbiology, Washingto
n, 1993）。原理的には、いずれの増幅系も本発明にお
いて使用することができる。
方法としては、既知の方法、例えば、（ｉ）ポリメラー
ゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”；Saikiら, Science, 230:1350
-1354, 1985）、転写に基づく増幅系（”ＴＡＳ”；Kwo
hら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177, 198
9）、自己保存型配列反応（self-sustained sequencere
action）（”３ＳＲ”；Guatelliら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87:1874-1878, 1990）、転写介在型増幅
（”ＴＭＡ”；米国特許第5,399,491号；国際公開ＷＯ9
3/22461号）、核酸配列に基づく増幅（”ＮＡＳＢ
Ａ”；Compton, Nature, (London) 350:91-92, 199
1）、ストランド置換型増幅（”ＳＤＡ”；Walkerら, N
ucleic Acids Research, 20:1691-1696, 1992）等の標
的増幅法；および（ｉｉ）Ｑ−ベータレプリカーゼ（”
ＱＢＲ”；Lizardiら, Bio/Technology, 6:1197-1202,
1988）、リガーゼ増幅反応（”ＬＡＲ”；Wuら, Genomi
cs, 4:560-569, 1989）およびリガーゼ連鎖反応（”Ｌ
ＣＲ”；Barany, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 88:189-
193, 1991）等のプローブ増幅法等が含まれる。本発明
において使用することのできるこれらの、あるいは他の
増幅方法はPershingらの総説にまとめられている（（編
集）診断分子微生物学−原理と応用；（eds.）Diagnost
ic Molecular Microbiology, Principles and Applicat
ions, American Society for Microbiology, Washingto
n, 1993）。原理的には、いずれの増幅系も本発明にお
いて使用することができる。
【００１７】一対の核酸分子（あるいは一本の核酸分子
内の二つの領域）は、これらが塩基対形成相互作用によ
ってデュープレックスを形成する場合、互いに”ハイブ
リダイズする”といわれる。当該分野で知られるよう
に、核酸対間のハイブリダイゼーションのためには、ハ
イブリダイズする領域間の完全な相補性は要求されず、
使用されるハイブリダイゼーションの条件下でデュープ
レックスを維持するために十分な程度の塩基対形成があ
ることのみが要求される。
内の二つの領域）は、これらが塩基対形成相互作用によ
ってデュープレックスを形成する場合、互いに”ハイブ
リダイズする”といわれる。当該分野で知られるよう
に、核酸対間のハイブリダイゼーションのためには、ハ
イブリダイズする領域間の完全な相補性は要求されず、
使用されるハイブリダイゼーションの条件下でデュープ
レックスを維持するために十分な程度の塩基対形成があ
ることのみが要求される。
【００１８】一対の分子（例えば一対の核酸）の一員
は、これらが他の非特異的な分子に対するよりもより大
きな親和性をもって互いに結合する場合、互いに”特異
的に結合している”といわれる。例えば、核酸プローブ
は、塩基対形成の相互作用によってハイブリダイズし
て、被検物質と特異的なデュープレックスを形成する場
合、被検物質核酸に特異的に結合しているということが
できる。
は、これらが他の非特異的な分子に対するよりもより大
きな親和性をもって互いに結合する場合、互いに”特異
的に結合している”といわれる。例えば、核酸プローブ
は、塩基対形成の相互作用によってハイブリダイズし
て、被検物質と特異的なデュープレックスを形成する場
合、被検物質核酸に特異的に結合しているということが
できる。
【００１９】核酸分子を特異的に結合させる他の方法
は、当該分野で既知であり、本発明において使用するこ
とができる。例えば、核酸類似体（すなわち、核酸の非
−天然変異体（non-natural variations）、Cohen,
（編）オリゴデオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアン
チセンス阻害剤；Oligodeoxynucleotides: Antisense I
nhibitors of Gene Expression, CRC Press Inc., Flor
ida, USA, 1989; Uhlmannら, Chem. Rev., 90:543-584,
1990）およびペプチド核酸のような非−核酸型ポリマ
ー（”ＰＮＡ”；Nielsenら, Sciense, 254:1479-1500,
1991; Egholmら, J. Am. Chem. Soc., 114:1895-1897,
1992; Egholmら, J. Am. Chem. Soc., 114:9677-9678,
1992）が使用できる。核酸を本発明の二次元場に特異
的に結合させるために使用することができる更に他の結
合方法は、三本鎖ヘリックスの形成である（Felsenfeld
ら, Biochim. Biophys. Acta., 26:457-468, 1957; Thu
ongら,Angewandte Chemie, 32:666-690, 1993; Chubb
ら, Trends Biotech. 10:132-136, 1992; Moffat, Scie
nce, 252:1374-1375, 1991）。
は、当該分野で既知であり、本発明において使用するこ
とができる。例えば、核酸類似体（すなわち、核酸の非
−天然変異体（non-natural variations）、Cohen,
（編）オリゴデオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアン
チセンス阻害剤；Oligodeoxynucleotides: Antisense I
nhibitors of Gene Expression, CRC Press Inc., Flor
ida, USA, 1989; Uhlmannら, Chem. Rev., 90:543-584,
1990）およびペプチド核酸のような非−核酸型ポリマ
ー（”ＰＮＡ”；Nielsenら, Sciense, 254:1479-1500,
1991; Egholmら, J. Am. Chem. Soc., 114:1895-1897,
1992; Egholmら, J. Am. Chem. Soc., 114:9677-9678,
1992）が使用できる。核酸を本発明の二次元場に特異
的に結合させるために使用することができる更に他の結
合方法は、三本鎖ヘリックスの形成である（Felsenfeld
ら, Biochim. Biophys. Acta., 26:457-468, 1957; Thu
ongら,Angewandte Chemie, 32:666-690, 1993; Chubb
ら, Trends Biotech. 10:132-136, 1992; Moffat, Scie
nce, 252:1374-1375, 1991）。
【００２０】本発明において使用することのできる自触
媒作用的に複製しうる核酸にはＱＢＲによって複製しう
る核酸、例えば、中間変異型−１（ＭＤＶ−１）のよう
な中間変異型ＲＮＡ、およびミニ変異型（minivarian
t）ＲＮＡ、ミクロ変異型（microvariant）ＲＮＡ、ナ
ノ変異型（nanovariant）ＲＮＡおよびこれらの更なる
変異型を含むＭＤＶ−１の変異型が含まれるが、これら
に制限されない。これらの分子は被検物質特異的な核酸
の配列を含むように典型的に修飾される。ＱＢＲ以外の
増幅方法が使用される本発明の具体例においては、シグ
ナル生成核酸は単に当該技術分野においてよく知られる
増幅系（例えば上記を参照）によって複製しうることが
必要とされる。
媒作用的に複製しうる核酸にはＱＢＲによって複製しう
る核酸、例えば、中間変異型−１（ＭＤＶ−１）のよう
な中間変異型ＲＮＡ、およびミニ変異型（minivarian
t）ＲＮＡ、ミクロ変異型（microvariant）ＲＮＡ、ナ
ノ変異型（nanovariant）ＲＮＡおよびこれらの更なる
変異型を含むＭＤＶ−１の変異型が含まれるが、これら
に制限されない。これらの分子は被検物質特異的な核酸
の配列を含むように典型的に修飾される。ＱＢＲ以外の
増幅方法が使用される本発明の具体例においては、シグ
ナル生成核酸は単に当該技術分野においてよく知られる
増幅系（例えば上記を参照）によって複製しうることが
必要とされる。
【００２１】プローブは、例えば共有結合を介して直接
的に、また、例えばポリアデノシンまたは他の核酸配列
のようなスペーサー、ストレプトアビジンのようなタン
パク質リガンド、タンパク質、有機ポリマー（下記参
照）、あるいは他の適当な試薬を介して間接的に、固相
支持体に結合させることができる。一例として、プロー
ブは牛血清アルブミンと共に（牛血清アルブミンの分子
を通じて）固相支持体に共有結合することができる。本
発明において用いられる被検物質特異的なＲＮＡプロー
ブは、ＲＮＡ合成反応において通常存在するグアノシン
５’−トリフォスフェート（ＧＴＰ）の量より多い、例
えば２０倍量のグアノシン５’−モノフォスフェート
（ＧＭＰ）の存在下で合成することができる。ＲＮＡプ
ローブの５’−末端に取り込まれるＧＭＰは、その５’
−モノフォスフェート部分で化学的に修飾されて、プロ
ーブの固相支持体への化学結合のための活性部位として
機能する。他に示さない限り、ここで使用する”ＧＭ
Ｐ”の語は、未修飾および化学的に修飾されたＧＭＰの
双方をいう。Ｔ７ポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラ
ーゼは、核酸の鋳型と接触させて必要なＲＮＡフラグメ
ントを生成するために使用することができ、必要に応
じ、接触段階は５’−修飾ＧＭＰ（例えば、ＧＭＰの
５’−モノフォスフェートが化学的に活性な官能基につ
ながっているもの）の存在下で実施する。
的に、また、例えばポリアデノシンまたは他の核酸配列
のようなスペーサー、ストレプトアビジンのようなタン
パク質リガンド、タンパク質、有機ポリマー（下記参
照）、あるいは他の適当な試薬を介して間接的に、固相
支持体に結合させることができる。一例として、プロー
ブは牛血清アルブミンと共に（牛血清アルブミンの分子
を通じて）固相支持体に共有結合することができる。本
発明において用いられる被検物質特異的なＲＮＡプロー
ブは、ＲＮＡ合成反応において通常存在するグアノシン
５’−トリフォスフェート（ＧＴＰ）の量より多い、例
えば２０倍量のグアノシン５’−モノフォスフェート
（ＧＭＰ）の存在下で合成することができる。ＲＮＡプ
ローブの５’−末端に取り込まれるＧＭＰは、その５’
−モノフォスフェート部分で化学的に修飾されて、プロ
ーブの固相支持体への化学結合のための活性部位として
機能する。他に示さない限り、ここで使用する”ＧＭ
Ｐ”の語は、未修飾および化学的に修飾されたＧＭＰの
双方をいう。Ｔ７ポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラ
ーゼは、核酸の鋳型と接触させて必要なＲＮＡフラグメ
ントを生成するために使用することができ、必要に応
じ、接触段階は５’−修飾ＧＭＰ（例えば、ＧＭＰの
５’−モノフォスフェートが化学的に活性な官能基につ
ながっているもの）の存在下で実施する。
【００２２】本発明において使用できる固相支持体に
は、ガラス、紙、ゲル、フィルム、ニトロセルロース膜
のような膜、あるいはプラスティックが含まれる。一般
に、核酸がその表面に結合できる限りにおいて、いずれ
の固体平面であっても使用できる。
は、ガラス、紙、ゲル、フィルム、ニトロセルロース膜
のような膜、あるいはプラスティックが含まれる。一般
に、核酸がその表面に結合できる限りにおいて、いずれ
の固体平面であっても使用できる。
【００２３】本発明は、数種の利点を有している。例え
ば、本発明の装置を使用して被検物質を検出するために
必要である被検物質の拡散の通路は”まっすぐ（straig
ht down）”である。すなわち、被検物質は固相支持体
と接触して、固相支持体の表面上のいずれの場所におい
ても”生産的な”複合体（例えば図１Ａを参照）を形成
することができる；横方向の拡散は必要ではない。これ
と対照的に、当該分野で知られる他の整列型（array-ty
pe）アッセイでは、一つの装置で数種の異なる被検物質
を検出するために別々の場所（例えばスポット、スクエ
ア等）を使用する。例えば、米国特許第5,445,934号、
第5,510,270号、第5,556,752号、第5,143,854号、およ
び第5,412,087号に開示されているオリゴヌクレオチド
整列においては、それぞれ異なるプローブ配列を含有す
る16,000個までのスポットが固相支持体の表面に特異的
なパターンで付着している。被検物質核酸含有試料をこ
うした整列の表面に適用し、ハイブリダイゼーションの
間、被検物質分子は本発明のように整列の表面に向かっ
て下向きに拡散しなければならないだけでなく、同種の
プローブ分子のスポットを見つけるために横向きにも拡
散しなければならない。このような横方向の拡散の必要
性によって、ハイブリダイゼーション反応の感受性およ
び速度論の双方が制限される。
ば、本発明の装置を使用して被検物質を検出するために
必要である被検物質の拡散の通路は”まっすぐ（straig
ht down）”である。すなわち、被検物質は固相支持体
と接触して、固相支持体の表面上のいずれの場所におい
ても”生産的な”複合体（例えば図１Ａを参照）を形成
することができる；横方向の拡散は必要ではない。これ
と対照的に、当該分野で知られる他の整列型（array-ty
pe）アッセイでは、一つの装置で数種の異なる被検物質
を検出するために別々の場所（例えばスポット、スクエ
ア等）を使用する。例えば、米国特許第5,445,934号、
第5,510,270号、第5,556,752号、第5,143,854号、およ
び第5,412,087号に開示されているオリゴヌクレオチド
整列においては、それぞれ異なるプローブ配列を含有す
る16,000個までのスポットが固相支持体の表面に特異的
なパターンで付着している。被検物質核酸含有試料をこ
うした整列の表面に適用し、ハイブリダイゼーションの
間、被検物質分子は本発明のように整列の表面に向かっ
て下向きに拡散しなければならないだけでなく、同種の
プローブ分子のスポットを見つけるために横向きにも拡
散しなければならない。このような横方向の拡散の必要
性によって、ハイブリダイゼーション反応の感受性およ
び速度論の双方が制限される。
【００２４】他で定義しない限り、ここで用いる全ての
技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野
における通常の技術を有する者が一般に理解するものと
同じ意味を有する。ここに記載したものと同様のあるい
は同等の方法および物質を本発明の実施あるいは試験に
おいて使用できるが、いくつかの好ましい方法および物
質を以下に記載する。ここに記載した全ての出版物、特
許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を本明
細書の一部としてここに引用する。矛盾が生じた場合に
は、本明細書が優先する。更に、記載した物質および方
法は単に例示的なものであり、制限を意図するものでは
ない。
技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野
における通常の技術を有する者が一般に理解するものと
同じ意味を有する。ここに記載したものと同様のあるい
は同等の方法および物質を本発明の実施あるいは試験に
おいて使用できるが、いくつかの好ましい方法および物
質を以下に記載する。ここに記載した全ての出版物、特
許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を本明
細書の一部としてここに引用する。矛盾が生じた場合に
は、本明細書が優先する。更に、記載した物質および方
法は単に例示的なものであり、制限を意図するものでは
ない。
【００２５】本発明の他の性質および利点は、以下の詳
細な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
細な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明は、試料中の核酸被検物質
を高感度かつ定量的に検出する装置および方法を提供す
る。本発明の装置の主たる特徴は、それぞれの装置が、
核酸被検物質にそれぞれ結合する核酸プローブの二次元
ランダム分布あるいは場が結合する固相支持体を有する
ことである。ひとたび核酸被検物質が装置のプローブに
結合すると、拡散制限マトリクス（例えばアガロース、
ゼラチン、またはポリエチレングリコールでできたも
の）内で被検物質特異的な増幅がおこり、増幅産物が生
成され、それらはそれぞれもとの核酸プローブの周囲に
集まる。このようにして、それぞれの被検物質−プロー
ブ複合体は、固相支持体上に検出可能な円形コロニーま
たは“スポット”を形成し、そのコロニーを試料中の核
酸被検物質の存在の尺度として検出する。
を高感度かつ定量的に検出する装置および方法を提供す
る。本発明の装置の主たる特徴は、それぞれの装置が、
核酸被検物質にそれぞれ結合する核酸プローブの二次元
ランダム分布あるいは場が結合する固相支持体を有する
ことである。ひとたび核酸被検物質が装置のプローブに
結合すると、拡散制限マトリクス（例えばアガロース、
ゼラチン、またはポリエチレングリコールでできたも
の）内で被検物質特異的な増幅がおこり、増幅産物が生
成され、それらはそれぞれもとの核酸プローブの周囲に
集まる。このようにして、それぞれの被検物質−プロー
ブ複合体は、固相支持体上に検出可能な円形コロニーま
たは“スポット”を形成し、そのコロニーを試料中の核
酸被検物質の存在の尺度として検出する。
【００２７】本発明の装置および方法は、多くの異なる
型に具体化することができる。例えば、図−１Aに示す
ように、装置の固相支持体１２に結合するプローブ１０
は、固相支持体１２に結合し自触媒作用的に複製しうる
核酸１５の部分を含む第一の末端１４、および、核酸被
検物質２０の第一の領域１８とハイブリダイズする第一
の被検物質結合セグメントを含む第二の末端１６を含む
ことができる。この装置は、（１）核酸被検物質２０を
含む試料、および、（２）核酸被検物質２０の第二の領
域２６とハイブリダイズする第二の被検物質結合セグメ
ント２４、および自触媒作用的に複製しうる核酸の残部
２８を含む第二の核酸プローブ２２、と接触する方法に
おいて使用できる。
型に具体化することができる。例えば、図−１Aに示す
ように、装置の固相支持体１２に結合するプローブ１０
は、固相支持体１２に結合し自触媒作用的に複製しうる
核酸１５の部分を含む第一の末端１４、および、核酸被
検物質２０の第一の領域１８とハイブリダイズする第一
の被検物質結合セグメントを含む第二の末端１６を含む
ことができる。この装置は、（１）核酸被検物質２０を
含む試料、および、（２）核酸被検物質２０の第二の領
域２６とハイブリダイズする第二の被検物質結合セグメ
ント２４、および自触媒作用的に複製しうる核酸の残部
２８を含む第二の核酸プローブ２２、と接触する方法に
おいて使用できる。
【００２８】この型では、被検物質２０の第一の領域１
８と第二の領域２６は隣接するヌクレオチドセグメント
であってもよく、その場合、被検物質２０、第一のプロ
ーブ１０、および第二のプローブ２２が支持体１２上で
共にハイブリダイズして複合体３０を形成する時、第一
のプローブ１０および第二のプローブ２２からなる、自
触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成される。
８と第二の領域２６は隣接するヌクレオチドセグメント
であってもよく、その場合、被検物質２０、第一のプロ
ーブ１０、および第二のプローブ２２が支持体１２上で
共にハイブリダイズして複合体３０を形成する時、第一
のプローブ１０および第二のプローブ２２からなる、自
触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成される。
【００２９】あるいはまた、図−１Bに示すように、被
検物質２０の第一の領域１８および第二の領域２６は、
第三のプローブ３４と結合する第三の領域３２で分離さ
れていてもよい。この場合、被検物質の両翼（flank）
の第一の領域１８および第二の領域２６は第三の領域３
２に隣接し、被検物質２０、第一のプローブ１０、第二
のプローブ２２、および第三のプローブ３４が支持体１
２上で共にハイブリダイズして複合体３０を形成する
時、第一のプローブ１０、第二のプローブ２２、および
第三のプローブ３４からなる、自触媒作用的な複製のた
めの完全な鋳型が形成される。
検物質２０の第一の領域１８および第二の領域２６は、
第三のプローブ３４と結合する第三の領域３２で分離さ
れていてもよい。この場合、被検物質の両翼（flank）
の第一の領域１８および第二の領域２６は第三の領域３
２に隣接し、被検物質２０、第一のプローブ１０、第二
のプローブ２２、および第三のプローブ３４が支持体１
２上で共にハイブリダイズして複合体３０を形成する
時、第一のプローブ１０、第二のプローブ２２、および
第三のプローブ３４からなる、自触媒作用的な複製のた
めの完全な鋳型が形成される。
【００３０】上に述べた二つの例では、自触媒作用的な
複製のための鋳型を形成するプローブは、必要により、
例えば酵素法（例えば、T4 DNAリガーゼ（ヨーロッパ特
許出願 EP 94/906626.0 号および EP 94/906682.3
号）、RNAリガーゼ、あるいはリボザイムリガーゼを使
用して）、化学的方法（例えば、Herrleinら, Nucleic
Acids Research, 22:5076-5078；Dolinnayaら, Nucleic
Acids Research, 16:3721,1988；Dolinnayaら, Nuclei
c Acids Research, 19:3067-3072,1991；Dolinnayaら,
Nucleic Acids Research, 21:5403-5407,1993を参照す
ること）、および光化学的方法（例えば、米国特許 No.
5,219,734号を参照すること）の様な、慣用的な方法を
用いて共にライゲートすることができる。更に、試料お
よびプローブが固相支持体と接触する順序は変更可能で
ある。
複製のための鋳型を形成するプローブは、必要により、
例えば酵素法（例えば、T4 DNAリガーゼ（ヨーロッパ特
許出願 EP 94/906626.0 号および EP 94/906682.3
号）、RNAリガーゼ、あるいはリボザイムリガーゼを使
用して）、化学的方法（例えば、Herrleinら, Nucleic
Acids Research, 22:5076-5078；Dolinnayaら, Nucleic
Acids Research, 16:3721,1988；Dolinnayaら, Nuclei
c Acids Research, 19:3067-3072,1991；Dolinnayaら,
Nucleic Acids Research, 21:5403-5407,1993を参照す
ること）、および光化学的方法（例えば、米国特許 No.
5,219,734号を参照すること）の様な、慣用的な方法を
用いて共にライゲートすることができる。更に、試料お
よびプローブが固相支持体と接触する順序は変更可能で
ある。
【００３１】本発明に含まれる装置の別の例では、図−
７Fに示すように、装置の固相支持体１２に結合する第
一のプローブ３６は、固相支持体１２に結合する第一の
末端３８、および核酸被検物質２０の第一の領域４２と
ハイブリダイズする第一の被検物質結合セグメントを含
む第二の末端４０を含む。この装置は、固相支持体１２
が、（１）被検物質２０を含有する試料、（２）被検物
質２０の第二の領域４８とハイブリダイズする第二の被
検物質結合セグメント４６、および自触媒作用的に複製
しうる核酸の部分５０を含む第二の核酸プローブ４４、
および、（３）被検物質２０の第三の領域５６とハイブ
リダイズする第三の被検物質結合セグメント５４、およ
び自触媒作用的に複製しうる核酸の残部５８を含む第三
の核酸プローブ５２、と接触する方法において使用でき
る。
７Fに示すように、装置の固相支持体１２に結合する第
一のプローブ３６は、固相支持体１２に結合する第一の
末端３８、および核酸被検物質２０の第一の領域４２と
ハイブリダイズする第一の被検物質結合セグメントを含
む第二の末端４０を含む。この装置は、固相支持体１２
が、（１）被検物質２０を含有する試料、（２）被検物
質２０の第二の領域４８とハイブリダイズする第二の被
検物質結合セグメント４６、および自触媒作用的に複製
しうる核酸の部分５０を含む第二の核酸プローブ４４、
および、（３）被検物質２０の第三の領域５６とハイブ
リダイズする第三の被検物質結合セグメント５４、およ
び自触媒作用的に複製しうる核酸の残部５８を含む第三
の核酸プローブ５２、と接触する方法において使用でき
る。
【００３２】この型では、被検物質２０の第二の領域４
８および第三の領域５６は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであってもよく、その場合、被検物質２０、第二の
プローブ４４、および第三のプローブ５２が固相支持体
１２上で共にハイブリダイズして複合体６０を形成する
時、第二のプローブ４４と第三のプローブ５２の間で自
触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成される。こ
の場合、固相支持体１２に結合する第一のプローブ３６
は、核酸被検物質２０、第二のプローブ４４、および第
三のプローブ５２から形成される複合体６０が固体支持
体１２に結合するための捕捉プローブとしてのみ機能す
る。また、第二のプローブ４４および第三のプローブ５
２は、必要により、被検物質２０に結合する際、共にラ
イゲ−トすることができる。更に、固相支持体１２への
プローブおよび試料の添加順序は変更可能である。
８および第三の領域５６は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであってもよく、その場合、被検物質２０、第二の
プローブ４４、および第三のプローブ５２が固相支持体
１２上で共にハイブリダイズして複合体６０を形成する
時、第二のプローブ４４と第三のプローブ５２の間で自
触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成される。こ
の場合、固相支持体１２に結合する第一のプローブ３６
は、核酸被検物質２０、第二のプローブ４４、および第
三のプローブ５２から形成される複合体６０が固体支持
体１２に結合するための捕捉プローブとしてのみ機能す
る。また、第二のプローブ４４および第三のプローブ５
２は、必要により、被検物質２０に結合する際、共にラ
イゲ−トすることができる。更に、固相支持体１２への
プローブおよび試料の添加順序は変更可能である。
【００３３】あるいはまた、図−７Gに示すように、被
検物質２０の第二の領域４８および第三の領域５６は、
それぞれ両翼にあって、被検物質２０の第一の領域４２
と隣接するヌクレオチドセグメントであってもよい。被
検物質２０、第一のプローブ３６（例えば、核酸および
リンカーを含むもの）、第二のプローブ４４、および第
三のプローブ５２が固相支持体１２上で共にハイブリダ
イズして複合体６２を形成する時、第一のプローブ３
６、第二のプローブ４４、および第三のプローブ５２か
らなる自触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成さ
れる。
検物質２０の第二の領域４８および第三の領域５６は、
それぞれ両翼にあって、被検物質２０の第一の領域４２
と隣接するヌクレオチドセグメントであってもよい。被
検物質２０、第一のプローブ３６（例えば、核酸および
リンカーを含むもの）、第二のプローブ４４、および第
三のプローブ５２が固相支持体１２上で共にハイブリダ
イズして複合体６２を形成する時、第一のプローブ３
６、第二のプローブ４４、および第三のプローブ５２か
らなる自触媒作用的な複製のための完全な鋳型が形成さ
れる。
【００３４】本発明に含まれる装置の別の例では、図−
９Aに示すように、装置の固相支持体１２に結合する第
一のプローブ６４は、固相支持体１２に結合する第一の
末端６６、および核酸被検物質２０の第一の領域７０と
ハイブリダイズする第一の被検物質結合セグメントを含
む第二の末端６８を含む。この装置は、固相支持体１２
が、（１）被検物質２０を含有する試料、および（２）
被検物質２０の第二の領域７６とハイブリダイズする第
二の被検物質結合セグメント７４を含む第二の核酸プロ
ーブ７２、と接触する方法において使用することができ
る。
９Aに示すように、装置の固相支持体１２に結合する第
一のプローブ６４は、固相支持体１２に結合する第一の
末端６６、および核酸被検物質２０の第一の領域７０と
ハイブリダイズする第一の被検物質結合セグメントを含
む第二の末端６８を含む。この装置は、固相支持体１２
が、（１）被検物質２０を含有する試料、および（２）
被検物質２０の第二の領域７６とハイブリダイズする第
二の被検物質結合セグメント７４を含む第二の核酸プロ
ーブ７２、と接触する方法において使用することができ
る。
【００３５】この型では、被検物質２０の第一の領域７
０および第二の領域７６は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであり、したがって、第一のプローブ６４、被検物
質２０、および第二のプローブ７２が支持体１２上で共
にハイブリダイズして複合体７８を形成する時、第一の
プローブ６４と第二のプローブ７２は被検物質核酸２０
との結合によって共に行動し、その結果、共にライゲー
トすることができる。その後、厳密な（high stringen
t）洗浄を行い、ライゲ−トしていない第二のプローブ
７２および被検物質核酸２０を除去する。次に、ライゲ
−ト産物（ligated product）を標準PCRにより増幅す
る。例えば、もし第一のプローブ６４が固相支持体に
５’−末端で結合していれば、第一のプライマー８２を
使用してライゲ−ト産物をコピーし、ライゲート産物に
相補的な第一の産物を得る。次に第二のプライマー８０
を第一の産物にアニールさせてそれを複製し、二つのプ
ライマーおよびその間の領域を含むライゲ−ト産物と同
一の第二の産物のストランドを得る。次いでこれら第一
および第二の産物についてPCR を行い、多量の第一およ
び第二の産物のストランドを得るが、それらは拡散制限
マトリクスにより、もとのライゲ−トプローブ産物の近
隣に局在する。このスポットを、先にQBR産物の検出に
関連して述べたいずれかの方法、例えば、放射能の取り
込み、蛍光の検出などによって検出することができる。
０および第二の領域７６は隣接するヌクレオチドセグメ
ントであり、したがって、第一のプローブ６４、被検物
質２０、および第二のプローブ７２が支持体１２上で共
にハイブリダイズして複合体７８を形成する時、第一の
プローブ６４と第二のプローブ７２は被検物質核酸２０
との結合によって共に行動し、その結果、共にライゲー
トすることができる。その後、厳密な（high stringen
t）洗浄を行い、ライゲ−トしていない第二のプローブ
７２および被検物質核酸２０を除去する。次に、ライゲ
−ト産物（ligated product）を標準PCRにより増幅す
る。例えば、もし第一のプローブ６４が固相支持体に
５’−末端で結合していれば、第一のプライマー８２を
使用してライゲ−ト産物をコピーし、ライゲート産物に
相補的な第一の産物を得る。次に第二のプライマー８０
を第一の産物にアニールさせてそれを複製し、二つのプ
ライマーおよびその間の領域を含むライゲ−ト産物と同
一の第二の産物のストランドを得る。次いでこれら第一
および第二の産物についてPCR を行い、多量の第一およ
び第二の産物のストランドを得るが、それらは拡散制限
マトリクスにより、もとのライゲ−トプローブ産物の近
隣に局在する。このスポットを、先にQBR産物の検出に
関連して述べたいずれかの方法、例えば、放射能の取り
込み、蛍光の検出などによって検出することができる。
【００３６】この方法の変形として、ライゲーションの
段階が必要ない方法では、固相支持体１２は試料とは接
触させるが、第二のプローブとは接触させない（図−９
B）。５’−末端を介して固相支持体１２に結合する第
一のプローブ６４と被検物質核酸２０の間の特異的ハイ
ブリダイゼーションによって形成される複合体を洗浄
し、支持体１２に結合する第一のプローブ６４の３’−
末端を被検物質核酸２０を鋳型として伸長する。厳密な
洗浄を行った後、緒言に挙げた標準的な標的あるいはプ
ローブの増幅技術のいずれか（例えば、PCR）を用いて
伸長した産物を増幅し、装置の場の上のライゲ−ト産物
の存在および位置に相当する検出可能なシグナルを得
る。例えば、もしPCRを使用し、第一のプローブ６４が
支持体１２に５’−末端で結合していれば、第一のプロ
ーブ６４の一部と同一である第一のプライマー８０、お
よび第一のプローブ６４の伸長された領域８４の一部と
相補的な第二のプライマー８２を使用して、検出可能な
増幅産物を生成することができる。
段階が必要ない方法では、固相支持体１２は試料とは接
触させるが、第二のプローブとは接触させない（図−９
B）。５’−末端を介して固相支持体１２に結合する第
一のプローブ６４と被検物質核酸２０の間の特異的ハイ
ブリダイゼーションによって形成される複合体を洗浄
し、支持体１２に結合する第一のプローブ６４の３’−
末端を被検物質核酸２０を鋳型として伸長する。厳密な
洗浄を行った後、緒言に挙げた標準的な標的あるいはプ
ローブの増幅技術のいずれか（例えば、PCR）を用いて
伸長した産物を増幅し、装置の場の上のライゲ−ト産物
の存在および位置に相当する検出可能なシグナルを得
る。例えば、もしPCRを使用し、第一のプローブ６４が
支持体１２に５’−末端で結合していれば、第一のプロ
ーブ６４の一部と同一である第一のプライマー８０、お
よび第一のプローブ６４の伸長された領域８４の一部と
相補的な第二のプライマー８２を使用して、検出可能な
増幅産物を生成することができる。
【００３７】以上に述べた第一の例に関連して、以下に
本発明について更に詳細に述べる。
本発明について更に詳細に述べる。
【００３８】前述および図−２Aと図−２Bに示すよう
に、本発明の装置は、顕微鏡のスライドのような、固相
支持体１２の表面上に被覆された被検物質特異的プロー
ブ８６の場である。プローブ８６は固相支持体１２上に
均一に被覆するのが望ましいが、必要により、特定の位
置に限定することもできる。例えば臨床検体８８中に含
有される被検物質核酸分子２０を固相支持体１２に適用
すると、それらは固相支持体１２の表面に拡散し、場上
の特異的プローブ８６に捕捉される（すなわち、ハイブ
リダイズする）。次に、被検物質２０を、適当な複製系
（例えばQBR増幅系）を使用して単に検出するかあるい
は定量する。
に、本発明の装置は、顕微鏡のスライドのような、固相
支持体１２の表面上に被覆された被検物質特異的プロー
ブ８６の場である。プローブ８６は固相支持体１２上に
均一に被覆するのが望ましいが、必要により、特定の位
置に限定することもできる。例えば臨床検体８８中に含
有される被検物質核酸分子２０を固相支持体１２に適用
すると、それらは固相支持体１２の表面に拡散し、場上
の特異的プローブ８６に捕捉される（すなわち、ハイブ
リダイズする）。次に、被検物質２０を、適当な複製系
（例えばQBR増幅系）を使用して単に検出するかあるい
は定量する。
【００３９】この検出段階で、第二の被検物質特異的な
プローブ９０は、固相支持体１２に結合したプローブ８
６のそれぞれ９４とハイブリダイズする部位９２のすぐ
隣で各被検物質分子２０とハイブリダイズする。次に、
これら二つのプローブ９０および９４をつなぎ合わせ、
QBRのような酵素による複製あるいは増幅が可能な核酸
分子を形成することができる。次に、QBR増幅を用い
て、固定された被検物質分子２０のすぐ隣に高度に濃縮
されたRNA産物９６のスポットを形成することができ、
これは検出に使用される標識によって、例えば蛍光顕微
鏡、CCDカメラ、目視検査、あるいは他の方法で簡単に
検出することができる。固相支持体１２上のこうした
“スポット”９６の数は、通常、初めに固相支持体１２
に結合した被検物質分子２０の数に相当する。
プローブ９０は、固相支持体１２に結合したプローブ８
６のそれぞれ９４とハイブリダイズする部位９２のすぐ
隣で各被検物質分子２０とハイブリダイズする。次に、
これら二つのプローブ９０および９４をつなぎ合わせ、
QBRのような酵素による複製あるいは増幅が可能な核酸
分子を形成することができる。次に、QBR増幅を用い
て、固定された被検物質分子２０のすぐ隣に高度に濃縮
されたRNA産物９６のスポットを形成することができ、
これは検出に使用される標識によって、例えば蛍光顕微
鏡、CCDカメラ、目視検査、あるいは他の方法で簡単に
検出することができる。固相支持体１２上のこうした
“スポット”９６の数は、通常、初めに固相支持体１２
に結合した被検物質分子２０の数に相当する。
【００４０】以上に述べたように、本発明のこれら又は
他の具体例では、QBRのような酵素で増幅することがで
きる被検物質特異的な核酸の配列を含むように修飾され
た、中間変異型および関連するRNAのような、自触媒作
用的に複製しうる核酸分子を使用する。本発明における
そのような核酸分子およびQBRの使用は図−３に示され
ており、以下に更に述べる。
他の具体例では、QBRのような酵素で増幅することがで
きる被検物質特異的な核酸の配列を含むように修飾され
た、中間変異型および関連するRNAのような、自触媒作
用的に複製しうる核酸分子を使用する。本発明における
そのような核酸分子およびQBRの使用は図−３に示され
ており、以下に更に述べる。
【００４１】本発明において、自触媒作用的に複製しう
る核酸を二元（binary）プローブアッセイに使用する。
したがって、本発明に使用するために、いずれも単独で
はQBRにより認めうるほど複製することのできない、二
つの“ハーフ分子”９８および１００にこれを分ける。
それぞれのハーフ分子は二つの機能要素、すなわち、部
分MDV配列１０２（および１０４）およびプローブ配列
１０６（および１０８）を有し、これは核酸被検物質２
０中の標的配列１１０（および１１２）と相補的であ
り、従って特異的にハイブリダイズすることが可能であ
る。二つのハーフ分子９８および１００のプローブ配列
１０６および１０８は、被検物質２０中の隣接したヌク
レオチドセグメント１１０および１１２とハイブリダイ
ズするように選択する。以下、構成する核酸の極性に基
づいて、二つのハーフ分子を個々に３’−ハーフプロー
ブ９８および５’−ハーフプローブ１００と記す。
る核酸を二元（binary）プローブアッセイに使用する。
したがって、本発明に使用するために、いずれも単独で
はQBRにより認めうるほど複製することのできない、二
つの“ハーフ分子”９８および１００にこれを分ける。
それぞれのハーフ分子は二つの機能要素、すなわち、部
分MDV配列１０２（および１０４）およびプローブ配列
１０６（および１０８）を有し、これは核酸被検物質２
０中の標的配列１１０（および１１２）と相補的であ
り、従って特異的にハイブリダイズすることが可能であ
る。二つのハーフ分子９８および１００のプローブ配列
１０６および１０８は、被検物質２０中の隣接したヌク
レオチドセグメント１１０および１１２とハイブリダイ
ズするように選択する。以下、構成する核酸の極性に基
づいて、二つのハーフ分子を個々に３’−ハーフプロー
ブ９８および５’−ハーフプローブ１００と記す。
【００４２】“ハーフ分子”あるいは“ハーフプロー
ブ”という呼称は、それらのプローブが完全に自触媒作
用的に複製しうる分子の厳密な“半分”を含んでいる必
要がある、ということを意味するものではない。例えば
MDVの場合、プローブの挿入位置は５’−末端から約１
／３、かつ３’−末端から約２／３のあたりでありう
る。他の挿入位置が当該分野で知られている（例えば、
Burgら, Anal. Biochem.,230:263-272,1995を参照する
こと）。これらの修飾を含む核酸の複製しうる修飾もま
た、本発明の範囲に含まれる。また、両ハーフプローブ
はDNAあるいはRNAから成ることが可能である。あるいは
また、一方のハーフプローブがDNAから成り、かつ、他
方がRNAから成ることも可能である。それぞれのハーフ
プローブはまた、デオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドの組み合わせ、あるいはそれを修飾したも
のも含みうる。
ブ”という呼称は、それらのプローブが完全に自触媒作
用的に複製しうる分子の厳密な“半分”を含んでいる必
要がある、ということを意味するものではない。例えば
MDVの場合、プローブの挿入位置は５’−末端から約１
／３、かつ３’−末端から約２／３のあたりでありう
る。他の挿入位置が当該分野で知られている（例えば、
Burgら, Anal. Biochem.,230:263-272,1995を参照する
こと）。これらの修飾を含む核酸の複製しうる修飾もま
た、本発明の範囲に含まれる。また、両ハーフプローブ
はDNAあるいはRNAから成ることが可能である。あるいは
また、一方のハーフプローブがDNAから成り、かつ、他
方がRNAから成ることも可能である。それぞれのハーフ
プローブはまた、デオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドの組み合わせ、あるいはそれを修飾したも
のも含みうる。
【００４３】被検物質核酸２０がアッセイする試料中に
存在すれば、両ハーフ分子９８および１００は図−３に
示すコンフィギュレーションでハイブリダイズする。こ
のような形で結合したハーフ分子は、任意に、ライゲー
ションの段階により互いに共有結合させることができ、
これにより、QBRによって複製しうる、従ってアッセイ
シグナルを発生しうる、完全な検出プローブ１１４が生
成する。しかしながら、たとえ二つのハーフプローブが
互いにライゲートしなくても、増幅を行うことは可能で
ある。互いに極めて接近して保持され、かつ、標的核酸
によりおおよそ正確なトポロジーにあるライゲートして
いないハーフプローブは、QBRにより増幅しうる（図−
４C）。しかしながら、ライゲートしたハーフプローブ
は有意に高い感度（使用されたハイブリダイゼーション
および洗浄の条件により、１０から１０6倍）で増幅し
うる。
存在すれば、両ハーフ分子９８および１００は図−３に
示すコンフィギュレーションでハイブリダイズする。こ
のような形で結合したハーフ分子は、任意に、ライゲー
ションの段階により互いに共有結合させることができ、
これにより、QBRによって複製しうる、従ってアッセイ
シグナルを発生しうる、完全な検出プローブ１１４が生
成する。しかしながら、たとえ二つのハーフプローブが
互いにライゲートしなくても、増幅を行うことは可能で
ある。互いに極めて接近して保持され、かつ、標的核酸
によりおおよそ正確なトポロジーにあるライゲートして
いないハーフプローブは、QBRにより増幅しうる（図−
４C）。しかしながら、ライゲートしたハーフプローブ
は有意に高い感度（使用されたハイブリダイゼーション
および洗浄の条件により、１０から１０6倍）で増幅し
うる。
【００４４】ライゲーション段階を使用するもう一つの
有意な利点は、ライゲーションに続いて、ライゲートし
たプローブ分子が固相支持体に共有結合するため、極め
て厳密な洗浄条件（例えば、３’−ハーフプローブが固
相支持体に共有結合していない、図−４Cに示すよう
な、シグナルを発生する複合体を粉砕するような条件）
を使用しうることである。しかしながら、より低い感度
を必要とする適用には、アッセイの一段階（例えばライ
ゲーションの段階）を削除することが有用でありうる。
有意な利点は、ライゲーションに続いて、ライゲートし
たプローブ分子が固相支持体に共有結合するため、極め
て厳密な洗浄条件（例えば、３’−ハーフプローブが固
相支持体に共有結合していない、図−４Cに示すよう
な、シグナルを発生する複合体を粉砕するような条件）
を使用しうることである。しかしながら、より低い感度
を必要とする適用には、アッセイの一段階（例えばライ
ゲーションの段階）を削除することが有用でありうる。
【００４５】前述のように、ハーフ分子のライゲーショ
ンは、例えば酵素法（例えば、T4 DNAリガーゼ、RNAリ
ガーゼ、あるいはリボザイムリガーゼの使用によるも
の）、化学的方法、および光化学的方法を含む、様々な
周知の方法のいずれかを用いて行いうる。
ンは、例えば酵素法（例えば、T4 DNAリガーゼ、RNAリ
ガーゼ、あるいはリボザイムリガーゼの使用によるも
の）、化学的方法、および光化学的方法を含む、様々な
周知の方法のいずれかを用いて行いうる。
【００４６】前述、および図−４A〜４Fに更に示すよう
に、本発明の主たる特徴は、QBR検出プローブのハーフ
分子１００を含有しうるプローブが、顕微鏡のスライド
または同種の表面のような固相支持体１２の表面に、あ
るいはその一部に、均一に分散し、かつ特異的に結合し
ていることである。５’−ハーフプローブ１００は、そ
の５’−末端を介して支持体１２に結合しているのが望
ましい（図−４A）。表面によって効率的なハイブリダ
イゼーションおよび複製が妨げられることを防ぐため
に、追加のヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドのスペ
ーサー、あるいは“リンカーグループ”１１６を、結合
に任意に含有させることができる。あるいはまた、３’
−ハーフプローブ９８はその３’−末端を介して支持体
１２に結合しうる。図−４A〜４Fに示すプローブは、中
間変異型RNAと呼ばれる、QBRにより増幅しうる特殊な構
築物に基づくものである。前述のように、本発明におい
ては、様々な他の自触媒作用的に複製しうる核酸を使用
することが可能である。
に、本発明の主たる特徴は、QBR検出プローブのハーフ
分子１００を含有しうるプローブが、顕微鏡のスライド
または同種の表面のような固相支持体１２の表面に、あ
るいはその一部に、均一に分散し、かつ特異的に結合し
ていることである。５’−ハーフプローブ１００は、そ
の５’−末端を介して支持体１２に結合しているのが望
ましい（図−４A）。表面によって効率的なハイブリダ
イゼーションおよび複製が妨げられることを防ぐため
に、追加のヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドのスペ
ーサー、あるいは“リンカーグループ”１１６を、結合
に任意に含有させることができる。あるいはまた、３’
−ハーフプローブ９８はその３’−末端を介して支持体
１２に結合しうる。図−４A〜４Fに示すプローブは、中
間変異型RNAと呼ばれる、QBRにより増幅しうる特殊な構
築物に基づくものである。前述のように、本発明におい
ては、様々な他の自触媒作用的に複製しうる核酸を使用
することが可能である。
【００４７】試料の溶解に次いで、必要であれば、その
間に被検物質核酸２０をハイブリダイゼーションが可能
な状態にし、被検物質核酸２０との特異的なハイブリダ
イゼーションを促進する条件下で、３’−ハーフプロー
ブ９８を試料に添加する。続いて、あるいは同時に、試
料を支持体に適用し、核酸ハイブリダイゼーションによ
りプローブ／被検物質核酸ハイブリッドを形成させる。
本発明においては、ハイブリダイゼーションを促進ある
いは修飾する、様々な周知の試薬を使用しうる。例え
ば、カオトロピック試薬であるグアニジニウムチオシア
ネートは、試料の溶解およびハイブリダイゼーションを
共に促進する、よく知られたハイブリダイゼーション試
薬である。
間に被検物質核酸２０をハイブリダイゼーションが可能
な状態にし、被検物質核酸２０との特異的なハイブリダ
イゼーションを促進する条件下で、３’−ハーフプロー
ブ９８を試料に添加する。続いて、あるいは同時に、試
料を支持体に適用し、核酸ハイブリダイゼーションによ
りプローブ／被検物質核酸ハイブリッドを形成させる。
本発明においては、ハイブリダイゼーションを促進ある
いは修飾する、様々な周知の試薬を使用しうる。例え
ば、カオトロピック試薬であるグアニジニウムチオシア
ネートは、試料の溶解およびハイブリダイゼーションを
共に促進する、よく知られたハイブリダイゼーション試
薬である。
【００４８】使用されるハイブリダイゼーションの条件
（例えば、塩の種類および濃度、温度、プローブの濃
度、促進剤、変性剤、および洗浄剤の存在；３’−ハー
フプローブ９８との“プレ−ハイブリダイゼーション”
の長さなど；上記を参照すること。）により、より高
い、あるいは低い割合の被検物質核酸２０が、固相支持
体上でハイブリダイゼーションを開始する時点で、それ
とハイブリダイズした３’−ハーフプローブ９８をすで
に有しうる（図−４B）。適当なハイブリダイゼーショ
ンの過程の後、５’−ハーフプローブ１００、核酸被検
物質２０、および３’−ハーフプローブ９８を有する複
合体１１８が形成される（図−４C）。
（例えば、塩の種類および濃度、温度、プローブの濃
度、促進剤、変性剤、および洗浄剤の存在；３’−ハー
フプローブ９８との“プレ−ハイブリダイゼーション”
の長さなど；上記を参照すること。）により、より高
い、あるいは低い割合の被検物質核酸２０が、固相支持
体上でハイブリダイゼーションを開始する時点で、それ
とハイブリダイズした３’−ハーフプローブ９８をすで
に有しうる（図−４B）。適当なハイブリダイゼーショ
ンの過程の後、５’−ハーフプローブ１００、核酸被検
物質２０、および３’−ハーフプローブ９８を有する複
合体１１８が形成される（図−４C）。
【００４９】必要により、結合していない反応体の実質
的な部分および試料の成分を支持体１２から除去するた
めに、洗浄段階を実施することが可能である。その後ラ
イゲーションの段階を実施することができ、ここで二つ
のハーフ分子９８および１００は互いに共有結合して、
増幅可能な核酸１２０を生成する（図−４D）。この段
階の重要な要素は、ライゲーションが、二つのハーフプ
ローブ９８および１００の、正しい被検物質核酸２０へ
の、正確なハイブリダイゼーションに依存している、と
いうことである。そのようなハーフあるいは二元プロー
ブの系を含む方法は、当該分野で知られており、例えば
ヨーロッパ特許出願 EP 94/906626.0号および EP 94/90
6682.3号に記載されている。
的な部分および試料の成分を支持体１２から除去するた
めに、洗浄段階を実施することが可能である。その後ラ
イゲーションの段階を実施することができ、ここで二つ
のハーフ分子９８および１００は互いに共有結合して、
増幅可能な核酸１２０を生成する（図−４D）。この段
階の重要な要素は、ライゲーションが、二つのハーフプ
ローブ９８および１００の、正しい被検物質核酸２０へ
の、正確なハイブリダイゼーションに依存している、と
いうことである。そのようなハーフあるいは二元プロー
ブの系を含む方法は、当該分野で知られており、例えば
ヨーロッパ特許出願 EP 94/906626.0号および EP 94/90
6682.3号に記載されている。
【００５０】ライゲーションの段階に続いて、試料中の
残存する成分、およびこの時点で支持体１２に共有結合
していない３’−ハーフ分子９８を除去するために、厳
密な洗浄を行うことが可能である。支持体上に残存する
のは、もともと結合していた５’−ハーフプローブ１０
０および、核酸被検物質が５’−ハーフプローブ１００
と結合したそれぞれの位置にある、複製に適し、シグナ
ルを発生する核酸１２０であり（図−４D）、これは複
製しうるMDV配列を有する。
残存する成分、およびこの時点で支持体１２に共有結合
していない３’−ハーフ分子９８を除去するために、厳
密な洗浄を行うことが可能である。支持体上に残存する
のは、もともと結合していた５’−ハーフプローブ１０
０および、核酸被検物質が５’−ハーフプローブ１００
と結合したそれぞれの位置にある、複製に適し、シグナ
ルを発生する核酸１２０であり（図−４D）、これは複
製しうるMDV配列を有する。
【００５１】増幅可能な核酸１２０の増幅は、次のよう
に行うことができる。QBR増幅反応の構成成分（すなわ
ち、QBR、ヌクレオチド三リン酸、Mg++、適当な塩、緩
衝剤など（例えば、Moodyら, Biochemistry, 33:13836-
13847, 1994 を参照すること））はよく知られており、
拡散制限（例えば、伝達制限）マトリクス（例えば、ア
ガロースあるいは、ゼラチン（例；KNOX（登録商
標））、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド
ゲル、もしくはそれらの混合物のような、別な種類の
“ゲル”マトリクス）と共に、あるいはその構成成分と
して、支持体に適用し、これにより、複製に適したQBR
分子１２０が形成されたそれぞれの位置の近隣で、ライ
ゲートしたQBR検出プローブ１２０の増幅が可能とな
る。重要なことに、固相支持体上の、一つの核酸被検物
質２０の存在に相当する位置に、増幅産物１２４のそれ
ぞれのコロニーが形成される。
に行うことができる。QBR増幅反応の構成成分（すなわ
ち、QBR、ヌクレオチド三リン酸、Mg++、適当な塩、緩
衝剤など（例えば、Moodyら, Biochemistry, 33:13836-
13847, 1994 を参照すること））はよく知られており、
拡散制限（例えば、伝達制限）マトリクス（例えば、ア
ガロースあるいは、ゼラチン（例；KNOX（登録商
標））、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド
ゲル、もしくはそれらの混合物のような、別な種類の
“ゲル”マトリクス）と共に、あるいはその構成成分と
して、支持体に適用し、これにより、複製に適したQBR
分子１２０が形成されたそれぞれの位置の近隣で、ライ
ゲートしたQBR検出プローブ１２０の増幅が可能とな
る。重要なことに、固相支持体上の、一つの核酸被検物
質２０の存在に相当する位置に、増幅産物１２４のそれ
ぞれのコロニーが形成される。
【００５２】それぞれの捕捉された被検物質分子の増幅
産物は、拡散制限マトリクスにより鋳型となる被検物質
分子の近隣に留められ、このため、これらの産物はコロ
ニーとして明視化されうる。
産物は、拡散制限マトリクスにより鋳型となる被検物質
分子の近隣に留められ、このため、これらの産物はコロ
ニーとして明視化されうる。
【００５３】拡散制限マトリクスとして特に有用なの
は、PEG ８０００（例；１０％）である。更に、カチオ
ン性ポリマー（例えば、n-ビニルピロリドン／ジエチル
アミノ−メチルメタクリル酸コポリマー）がQBR増幅反
応を適度に阻害することが見い出された。従ってこれら
のポリマーは、コロニーの大きさを小さくして、固相表
面の所定の面積でより多数のコロニーの検出を可能とす
るために使用しうる。
は、PEG ８０００（例；１０％）である。更に、カチオ
ン性ポリマー（例えば、n-ビニルピロリドン／ジエチル
アミノ−メチルメタクリル酸コポリマー）がQBR増幅反
応を適度に阻害することが見い出された。従ってこれら
のポリマーは、コロニーの大きさを小さくして、固相表
面の所定の面積でより多数のコロニーの検出を可能とす
るために使用しうる。
【００５４】増幅は、適当な条件（温度条件のような）
下で、独立した識別可能な量の増幅産物１２２を生成す
るために適当な時間で進行させる（図−４E）。そのよ
うな増幅されたQBRプローブRNAの位置、あるいはスポッ
トは、例えば増幅産物１２２に取り込まれた放射能、蛍
光、色、あるいは化学ルミネッセンスの検出を含む、当
該分野で知られる多くの方法のいずれかによって、明視
化しうる。例えば、ヨウ化プロピジウムのような挿入型
蛍光色素を増幅混合物に添加することが可能であり、そ
れによって、増幅産物１２２が生成するにしたがって産
物１２２に色素が挿入され、増幅の部位１２４に強度の
蛍光を生ずる（図−４F）。
下で、独立した識別可能な量の増幅産物１２２を生成す
るために適当な時間で進行させる（図−４E）。そのよ
うな増幅されたQBRプローブRNAの位置、あるいはスポッ
トは、例えば増幅産物１２２に取り込まれた放射能、蛍
光、色、あるいは化学ルミネッセンスの検出を含む、当
該分野で知られる多くの方法のいずれかによって、明視
化しうる。例えば、ヨウ化プロピジウムのような挿入型
蛍光色素を増幅混合物に添加することが可能であり、そ
れによって、増幅産物１２２が生成するにしたがって産
物１２２に色素が挿入され、増幅の部位１２４に強度の
蛍光を生ずる（図−４F）。
【００５５】増幅反応時間の最適な長さは多くの因子に
依存しているが、それらの因子は当該分野の技術者によ
く知られ、例えば、QBRプローブの固有の複製速度、増
幅反応における反応体の濃度（例えば、QBR濃度、dNTP
濃度、およびMg++濃度）ならびに反応を実施する温度
（例えば、Burgら, 1995,（ 上記参照）を参照するこ
と）を含む。最適な反応時間はまた、使用する検出方法
にも依存するであろう。例えば顕微鏡による蛍光の検出
では、非常に小さなスポットさえ生成すればよい。増幅
されたRNAの肉眼（例えば可視の）による検出は、装置
はより少なくてよいが、より大きなスポットを必要とし
うる。
依存しているが、それらの因子は当該分野の技術者によ
く知られ、例えば、QBRプローブの固有の複製速度、増
幅反応における反応体の濃度（例えば、QBR濃度、dNTP
濃度、およびMg++濃度）ならびに反応を実施する温度
（例えば、Burgら, 1995,（ 上記参照）を参照するこ
と）を含む。最適な反応時間はまた、使用する検出方法
にも依存するであろう。例えば顕微鏡による蛍光の検出
では、非常に小さなスポットさえ生成すればよい。増幅
されたRNAの肉眼（例えば可視の）による検出は、装置
はより少なくてよいが、より大きなスポットを必要とし
うる。
【００５６】増幅産物のコロニーの数、すなわちスポッ
トを計数して、支持体に適用した試料中の核酸被検物質
分子の数を定量することが可能である。これは、スライ
ドに適用した試料の容量および過程の総合的な効率に基
づいて、容易に決定しうる。例えば、アッセイの各段階
（例えば、固相支持体上における被検物質の第一（５’
−ハーフ）プローブへのハイブリダイゼーション、第二
（３’−ハーフ）プローブのハイブリダイゼーション、
およびライゲーション）は、１００％未満の固有の効率
を有する。従って、例えば装置に適用した被検物質核酸
の５０％が５’−および３’−ハーフプローブの両方と
ハイブリダイズし、更にそれらの５０％がライゲートす
るとすれば、被検物質分子の２５％が増幅可能なライゲ
ート産物を生成させることになる。従って、例えば、装
置に適用した１，０００個の被検物質核酸分子からは、
約２５０個の増幅されたシグナルのスポットが生成す
る。
トを計数して、支持体に適用した試料中の核酸被検物質
分子の数を定量することが可能である。これは、スライ
ドに適用した試料の容量および過程の総合的な効率に基
づいて、容易に決定しうる。例えば、アッセイの各段階
（例えば、固相支持体上における被検物質の第一（５’
−ハーフ）プローブへのハイブリダイゼーション、第二
（３’−ハーフ）プローブのハイブリダイゼーション、
およびライゲーション）は、１００％未満の固有の効率
を有する。従って、例えば装置に適用した被検物質核酸
の５０％が５’−および３’−ハーフプローブの両方と
ハイブリダイズし、更にそれらの５０％がライゲートす
るとすれば、被検物質分子の２５％が増幅可能なライゲ
ート産物を生成させることになる。従って、例えば、装
置に適用した１，０００個の被検物質核酸分子からは、
約２５０個の増幅されたシグナルのスポットが生成す
る。
【００５７】別の二つの検出方法を図−５Aおよび５Bに
示す。それらは、蛍光体−消光体（fluor-quencher ）
対あるいは、例えばMorrison（同位体によらないプロー
ビング、ブロッティング、シークエンシングにおけるエ
ネルギー伝達および蛍光消光の検出；Detection of Ene
rgy Transfer and Fluorescence Quenching, in Noniso
topic Probing, Blotting, and Sequencing, Academic
Press, 1995）およびTyagiら（Nature BioTechnology,
14:303-308, 1996）によって述べられているような、例
えば蛍光エネルギー伝達対（fluorescence energy tran
sfer pair）の使用を含む。蛍光体−消光体対は、蛍光
染料（“F”と表示。例えばフルオレセイン）および消
光染料（“Q”と表示。）から成り、その消光染料は、
二つの染料が極めて近接すると、蛍光染料から蛍光が発
光されるのを阻害する。
示す。それらは、蛍光体−消光体（fluor-quencher ）
対あるいは、例えばMorrison（同位体によらないプロー
ビング、ブロッティング、シークエンシングにおけるエ
ネルギー伝達および蛍光消光の検出；Detection of Ene
rgy Transfer and Fluorescence Quenching, in Noniso
topic Probing, Blotting, and Sequencing, Academic
Press, 1995）およびTyagiら（Nature BioTechnology,
14:303-308, 1996）によって述べられているような、例
えば蛍光エネルギー伝達対（fluorescence energy tran
sfer pair）の使用を含む。蛍光体−消光体対は、蛍光
染料（“F”と表示。例えばフルオレセイン）および消
光染料（“Q”と表示。）から成り、その消光染料は、
二つの染料が極めて近接すると、蛍光染料から蛍光が発
光されるのを阻害する。
【００５８】この概念の核酸検出への適用においては、
蛍光染料およびそれに対応する消光染料は、自己会合す
る短い核酸（例えばDNA）プローブ（例；図−５A中の
“ビーコン（beacon）”１２６、あるいは図−５B中のM
orrisonのプローブ対１２８）に結合することにより、
互いに近接して保持される。ビーコン１２６のループ構
造１３０の配列、あるいはMorrison対１２８中のオリゴ
ヌクレオチド１３２および１３４のいずれか一方の配列
は、増幅産物１２２中の特異的な、あらかじめ決定され
た標的配列にハイブリダイズするように設計する。この
具体例では、これらのプローブの配列は、増幅産物１２
２のプローブの一部１３６とハイブリダイズする。この
ハイブリダイズが起きると、物質FおよびQは二重ストラ
ンドのハイブリッドの堅固な構造によって引き離され、
それによって物質Fの蛍光が検出可能となる（図−５Aお
よび５B）。
蛍光染料およびそれに対応する消光染料は、自己会合す
る短い核酸（例えばDNA）プローブ（例；図−５A中の
“ビーコン（beacon）”１２６、あるいは図−５B中のM
orrisonのプローブ対１２８）に結合することにより、
互いに近接して保持される。ビーコン１２６のループ構
造１３０の配列、あるいはMorrison対１２８中のオリゴ
ヌクレオチド１３２および１３４のいずれか一方の配列
は、増幅産物１２２中の特異的な、あらかじめ決定され
た標的配列にハイブリダイズするように設計する。この
具体例では、これらのプローブの配列は、増幅産物１２
２のプローブの一部１３６とハイブリダイズする。この
ハイブリダイズが起きると、物質FおよびQは二重ストラ
ンドのハイブリッドの堅固な構造によって引き離され、
それによって物質Fの蛍光が検出可能となる（図−５Aお
よび５B）。
【００５９】図−６に、本発明の方法の、特異的QBR増
幅産物の検出における、蛍光体−消光体対あるいは蛍光
エネルギー伝達対の使用について示す。この例では、ビ
ーコン対プローブ１２６（例えば、F＝フルオレセイ
ン、Q＝４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）−
安息香酸（DABCYL））を増幅混液に加える。最初のライ
ゲートされたQBRプローブ産物１２０の増幅が進行する
にしたがって、ビーコンプローブ１２６が増幅産物１２
２にハイブリダイズし、それによって検出可能な蛍光シ
グナル１２４が生成される。この種の検出方法の利点
は、特異的産物の増幅を検出しうることである。挿入型
染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を使用するような
他の方法では、増幅は容易に検出されうるが、増幅産物
の同定はできない。
幅産物の検出における、蛍光体−消光体対あるいは蛍光
エネルギー伝達対の使用について示す。この例では、ビ
ーコン対プローブ１２６（例えば、F＝フルオレセイ
ン、Q＝４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）−
安息香酸（DABCYL））を増幅混液に加える。最初のライ
ゲートされたQBRプローブ産物１２０の増幅が進行する
にしたがって、ビーコンプローブ１２６が増幅産物１２
２にハイブリダイズし、それによって検出可能な蛍光シ
グナル１２４が生成される。この種の検出方法の利点
は、特異的産物の増幅を検出しうることである。挿入型
染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を使用するような
他の方法では、増幅は容易に検出されうるが、増幅産物
の同定はできない。
【００６０】ビーコンプローブあるいはMorrisonプロー
ブを増幅の検出に使用する更なる利点は、多種類の色の
F：Q対を設計し使用することにより、多種類のあらかじ
め決定したQBRプローブの増幅について、増幅反応を試
験しうることである。例えば、本発明の別の具体例で
は、多種類の被検物質核酸を同時に定量的に検出する方
法を提供する。この具体例では、支持体は、アッセイす
る核酸被検物質のそれぞれに対応するプローブ配列をも
つ、多種類のハーフプローブのランダム分布あるいは場
を有する。被検物質の表面上への拡散、ライゲーショ
ン、およびその後の増幅については前述と同じ原理を適
用するが、この具体例では、被検物質により複製しうる
産物が生成するそれぞれの位置あるいはスポットにおい
て、そのスポットから生成する増幅産物は、ライゲーシ
ョンの核となった標的配列に対応するプローブ配列を有
するであろう。従って、異なる被検物質核酸分子は、異
なるQBRプローブ分子の増幅を起こすであろう。それぞ
れの特異的プローブ分子は、その形成に必要な被検物質
に特異的な配列を有するであろう。
ブを増幅の検出に使用する更なる利点は、多種類の色の
F：Q対を設計し使用することにより、多種類のあらかじ
め決定したQBRプローブの増幅について、増幅反応を試
験しうることである。例えば、本発明の別の具体例で
は、多種類の被検物質核酸を同時に定量的に検出する方
法を提供する。この具体例では、支持体は、アッセイす
る核酸被検物質のそれぞれに対応するプローブ配列をも
つ、多種類のハーフプローブのランダム分布あるいは場
を有する。被検物質の表面上への拡散、ライゲーショ
ン、およびその後の増幅については前述と同じ原理を適
用するが、この具体例では、被検物質により複製しうる
産物が生成するそれぞれの位置あるいはスポットにおい
て、そのスポットから生成する増幅産物は、ライゲーシ
ョンの核となった標的配列に対応するプローブ配列を有
するであろう。従って、異なる被検物質核酸分子は、異
なるQBRプローブ分子の増幅を起こすであろう。それぞ
れの特異的プローブ分子は、その形成に必要な被検物質
に特異的な配列を有するであろう。
【００６１】多種類の可能なQBRプローブ配列に対応
し、かつ、識別可能な蛍光部分をそれぞれ有する、多種
類の蛍光エネルギー伝達プローブ（ビーコンあるいはMo
rrisonプローブ）は、増幅反応の間存在するか、あるい
はその後に添加する。これらのプローブは、それぞれの
スポットにおける増幅されたQBR RNA分子とのハイブリ
ダイゼーションの際に、それぞれのもとの被検物質分子
に対応する異なった色を呈する。従って、多種類の被検
物質核酸を、単一の均一アッセイにおいて検出および識
別することが可能である。これにより、それらのアッセ
イの能力、融通性、および費用効果が向上する。
し、かつ、識別可能な蛍光部分をそれぞれ有する、多種
類の蛍光エネルギー伝達プローブ（ビーコンあるいはMo
rrisonプローブ）は、増幅反応の間存在するか、あるい
はその後に添加する。これらのプローブは、それぞれの
スポットにおける増幅されたQBR RNA分子とのハイブリ
ダイゼーションの際に、それぞれのもとの被検物質分子
に対応する異なった色を呈する。従って、多種類の被検
物質核酸を、単一の均一アッセイにおいて検出および識
別することが可能である。これにより、それらのアッセ
イの能力、融通性、および費用効果が向上する。
【００６２】本発明の範囲に含まれる二元プローブ設計
の変法を図−７A〜７Gに示す。図−７A、７B、および７
Cは、ハーフプローブ９８および１００の別の可能な
“整列（alignment）”を、この例ではBCRおよびABL遺
伝子間の融合を有する被検物質核酸２０において疑われ
る点突然変異（黒矢印）と共に示す。図−７Dに、本発
明に同様に適用しうる、三元のQBRアッセイ（第三のプ
ローブ１３８を使用）を示す。三元のプローブ法を使用
する利点としては、二元のプローブ法より高度な特異性
をもつハイブリダイゼーションが達成できる点がある。
の変法を図−７A〜７Gに示す。図−７A、７B、および７
Cは、ハーフプローブ９８および１００の別の可能な
“整列（alignment）”を、この例ではBCRおよびABL遺
伝子間の融合を有する被検物質核酸２０において疑われ
る点突然変異（黒矢印）と共に示す。図−７Dに、本発
明に同様に適用しうる、三元のQBRアッセイ（第三のプ
ローブ１３８を使用）を示す。三元のプローブ法を使用
する利点としては、二元のプローブ法より高度な特異性
をもつハイブリダイゼーションが達成できる点がある。
【００６３】図−７Eに、独立した“捕捉”プローブ１
４０（この図では、磁気粒子のような、ビーズあるいは
粒子１４２に結合している）を有する、別のアッセイの
型の基本要素を示す。この型は、ライゲーションおよび
増幅の段階に先立って、被検物質分子２０を濃縮し、か
つ試料成分を除去するのに有効かつ便利である。あるい
はまた、磁気粒子を図−７Fに示すように固相として使
用し、ライゲーションおよび洗浄に続いて、増幅のため
に拡散制限マトリクス中に加えることが可能である。更
に別のアッセイの型は、図−７Fおよび７Gに示し、上述
している。
４０（この図では、磁気粒子のような、ビーズあるいは
粒子１４２に結合している）を有する、別のアッセイの
型の基本要素を示す。この型は、ライゲーションおよび
増幅の段階に先立って、被検物質分子２０を濃縮し、か
つ試料成分を除去するのに有効かつ便利である。あるい
はまた、磁気粒子を図−７Fに示すように固相として使
用し、ライゲーションおよび洗浄に続いて、増幅のため
に拡散制限マトリクス中に加えることが可能である。更
に別のアッセイの型は、図−７Fおよび７Gに示し、上述
している。
【００６４】上述の方法は、“厳密な”ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄の条件のような、ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件を使用する。ハイブリダイゼー
ション反応は典型的に、例えば特異的およびいくらかの
非特異的な相互作用が起こりうる低〜中程度の厳密な条
件のような“厳密な条件”下で実施する。ハイブリダイ
ゼーションの後、非特異的結合を除去するために、より
厳密な条件下で洗浄を行いうる。当該分野で知られるよ
うに、最適な洗浄条件は、例えば徐々に厳密さを増すこ
とにより、経験的に決定しうる。厳密さに影響を及ぼす
ために変化させうる条件パラメーターには、例えば温度
および塩濃度がある。一般的に、塩濃度、pH、およびカ
オトロピック試薬（例えばグアニジンチオシアネート）
の濃度が低いほど、そして温度が高いほど、厳密さは高
い。例えば、洗浄は、ハイブリダイゼーション溶液と等
しいか、あるいはより低い濃度の塩を含む溶液を用い
て、低温（例えば室温）で開始しうる。続く洗浄は、同
じ塩溶液で、段階的により高温にして行いうる。あるい
はまた、洗浄の段階において塩濃度を低下させ、かつ温
度を維持する、あるいは塩濃度を低下させ、かつ温度を
上げることが可能である。そのような標準的な変化は当
該分野で知られている。厳密さに影響を及ぼすために、
例えばホルムアミドのような不安定化試薬の使用等の、
別のパラメーターを変えることができる。
ーションおよび洗浄の条件のような、ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件を使用する。ハイブリダイゼー
ション反応は典型的に、例えば特異的およびいくらかの
非特異的な相互作用が起こりうる低〜中程度の厳密な条
件のような“厳密な条件”下で実施する。ハイブリダイ
ゼーションの後、非特異的結合を除去するために、より
厳密な条件下で洗浄を行いうる。当該分野で知られるよ
うに、最適な洗浄条件は、例えば徐々に厳密さを増すこ
とにより、経験的に決定しうる。厳密さに影響を及ぼす
ために変化させうる条件パラメーターには、例えば温度
および塩濃度がある。一般的に、塩濃度、pH、およびカ
オトロピック試薬（例えばグアニジンチオシアネート）
の濃度が低いほど、そして温度が高いほど、厳密さは高
い。例えば、洗浄は、ハイブリダイゼーション溶液と等
しいか、あるいはより低い濃度の塩を含む溶液を用い
て、低温（例えば室温）で開始しうる。続く洗浄は、同
じ塩溶液で、段階的により高温にして行いうる。あるい
はまた、洗浄の段階において塩濃度を低下させ、かつ温
度を維持する、あるいは塩濃度を低下させ、かつ温度を
上げることが可能である。そのような標準的な変化は当
該分野で知られている。厳密さに影響を及ぼすために、
例えばホルムアミドのような不安定化試薬の使用等の、
別のパラメーターを変えることができる。
【００６５】核酸ハイブリダイゼーション反応におい
て、特定の水準の厳密さを得るために使用される条件
は、ハイブリダイズする核酸の性質により、多様であ
る。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相
補性の程度、ヌクレオチド配列の構成（例えば、GC含量
対AT含量）、および核酸の種類（例えば、RNA対DNA）
は、ハイブリダイゼーションの条件の選択において考慮
されうる。更に考慮すべき点は、核酸の一つが、例えば
ガラスプレートあるいはフィルターのような固相支持体
上に、固定化されているかどうかである。
て、特定の水準の厳密さを得るために使用される条件
は、ハイブリダイズする核酸の性質により、多様であ
る。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相
補性の程度、ヌクレオチド配列の構成（例えば、GC含量
対AT含量）、および核酸の種類（例えば、RNA対DNA）
は、ハイブリダイゼーションの条件の選択において考慮
されうる。更に考慮すべき点は、核酸の一つが、例えば
ガラスプレートあるいはフィルターのような固相支持体
上に、固定化されているかどうかである。
【００６６】本発明の方法において使用されうるハイブ
リダイゼーションの条件の一例は、室温における3倍SSC
（処方については、Molecular Cloning, a Laboratory
Manual, 第２版, Sambrookら編集, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照す
ること）中でのハイブリダイゼーション、およびその後
の3倍SSC中での洗浄を含む。従って、この例では、ハイ
ブリダイゼーションから洗浄まで、厳密さに変化がな
い。別の例では、室温において３倍SSC中でハイブリダ
イゼーションを行い、引き続き、３倍SSC中で、以下の
温度で洗浄を行う：２５℃、４２℃、５２℃、５８℃、
および７０℃。
リダイゼーションの条件の一例は、室温における3倍SSC
（処方については、Molecular Cloning, a Laboratory
Manual, 第２版, Sambrookら編集, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照す
ること）中でのハイブリダイゼーション、およびその後
の3倍SSC中での洗浄を含む。従って、この例では、ハイ
ブリダイゼーションから洗浄まで、厳密さに変化がな
い。別の例では、室温において３倍SSC中でハイブリダ
イゼーションを行い、引き続き、３倍SSC中で、以下の
温度で洗浄を行う：２５℃、４２℃、５２℃、５８℃、
および７０℃。
【００６７】段階的により厳密な条件にする別な例は以
下の通りである：すなわち、2倍SSC／0.1% SDS、おおよ
そ室温（ハイブリダイゼーション条件）；0.2倍SSC／0.
1% SDS、おおよそ室温（低度に厳密な条件）；0.2倍SSC
／0.1% SDS、約42℃（中度に厳密な条件）；および0.1
倍SSC、約68℃（高度に厳密な条件）。洗浄は、これら
の条件の一つのみ（例えば高度に厳密な条件）を使用し
て行うか、あるいは、それぞれの条件を使用して（例え
ばそれぞれ１０〜１５分間、上に挙げた順で、上に挙げ
た段階のいずれか、あるいは全てを繰り返して）行うこ
とが可能である。しかしながら前述のように、最適な条
件は、それが関与する特定のハイブリダイゼーション反
応により様々であり、経験的に決定されうる。
下の通りである：すなわち、2倍SSC／0.1% SDS、おおよ
そ室温（ハイブリダイゼーション条件）；0.2倍SSC／0.
1% SDS、おおよそ室温（低度に厳密な条件）；0.2倍SSC
／0.1% SDS、約42℃（中度に厳密な条件）；および0.1
倍SSC、約68℃（高度に厳密な条件）。洗浄は、これら
の条件の一つのみ（例えば高度に厳密な条件）を使用し
て行うか、あるいは、それぞれの条件を使用して（例え
ばそれぞれ１０〜１５分間、上に挙げた順で、上に挙げ
た段階のいずれか、あるいは全てを繰り返して）行うこ
とが可能である。しかしながら前述のように、最適な条
件は、それが関与する特定のハイブリダイゼーション反
応により様々であり、経験的に決定されうる。
【００６８】本発明で使用する被検物質特異的核酸プロ
ーブは、増幅産物生成のための鋳型として働く、自触媒
作用的に複製しうる配列を含み、RNA、DNA、もしくはこ
れらの修飾物、あるいはこれらの組み合わせから成るこ
とが可能である。このような鋳型のＱＢＲ複製により生
成した増幅産物はＲＮＡである。
ーブは、増幅産物生成のための鋳型として働く、自触媒
作用的に複製しうる配列を含み、RNA、DNA、もしくはこ
れらの修飾物、あるいはこれらの組み合わせから成るこ
とが可能である。このような鋳型のＱＢＲ複製により生
成した増幅産物はＲＮＡである。
【００６９】核酸プローブは、標準的な化学合成法ある
いは組換え技術によって生成しうる。固相支持体への結
合に用いられるプローブは、支持体との共有結合を可能
とする化学基を（例えばそれらの５’−末端に）有しう
る。例えばそれらの化学基は、水溶性のカルボジイミド
を用いてプローブの５’−ホスフェートを誘導体化し、
５’−フォスフォイミダゾリドを生成させることによ
り、導入しうる（Chuら,Nucleic Acids Research 11: 6
513-6529, 1983）。ホスホルイミダゾリドが固相支持体
上のアミン含有分子にさらされることによって、支持体
へのプローブの化学結合が起こる。
いは組換え技術によって生成しうる。固相支持体への結
合に用いられるプローブは、支持体との共有結合を可能
とする化学基を（例えばそれらの５’−末端に）有しう
る。例えばそれらの化学基は、水溶性のカルボジイミド
を用いてプローブの５’−ホスフェートを誘導体化し、
５’−フォスフォイミダゾリドを生成させることによ
り、導入しうる（Chuら,Nucleic Acids Research 11: 6
513-6529, 1983）。ホスホルイミダゾリドが固相支持体
上のアミン含有分子にさらされることによって、支持体
へのプローブの化学結合が起こる。
【００７０】一例として、RNAプローブは、ファージ
（例えばT７）RNA ポリメラーゼを用いて鋳型を転写す
ることにより得ることが可能である。後の固相表面への
結合のためにすでに（例えばエチレンジアミンによっ
て）化学修飾をした、グアノシン５’−一リン酸（すな
わちグアニル酸、あるいは“GMP”）を、転写反応に加
えることが可能である。修飾されたGMPが、グアノシン
５’−三リン酸より過剰に存在すれば（例えば、２０
倍）、これはプローブの５’−末端に組み込まれる。こ
の方法では、プローブの転写後化学修飾は必要ない。
（例えばT７）RNA ポリメラーゼを用いて鋳型を転写す
ることにより得ることが可能である。後の固相表面への
結合のためにすでに（例えばエチレンジアミンによっ
て）化学修飾をした、グアノシン５’−一リン酸（すな
わちグアニル酸、あるいは“GMP”）を、転写反応に加
えることが可能である。修飾されたGMPが、グアノシン
５’−三リン酸より過剰に存在すれば（例えば、２０
倍）、これはプローブの５’−末端に組み込まれる。こ
の方法では、プローブの転写後化学修飾は必要ない。
【００７１】上述の方法におけるGMPの使用は、別な利
点も提供する。T７ RNA ポリメラーゼによって同一の鋳
型から生成されるRNA分子は、しばしば異種の３’−末
端を有する（すなわち、３’−末端に少数の余分な、鋳
型由来ではないヌクレオチドを有する）。この３’の異
質性は、本発明の多くの具体例において必要とされる、
次のライゲーションの段階を阻害する。余分なヌクレオ
チドは、主としてT７RNA ポリメラーゼのターミナルト
ランスフェラーゼ活性により、転写物に添加される。そ
れらの添加は、その活性に対して競合する基質を供給す
ることによって、低下しうる。効果的な競合物質には、
外来性のRNA（例えば酵母からの総RNA）、３’−ヒドロ
キシル末端を有するオリゴデオキシヌクレオチド、ヌク
レオチド一リン酸（例えばGMP）、デオキシリボヌクレ
オチド一リン酸、および３’−ヒドロキシルを有するヌ
クレオシドがある。化学的に修飾されたGMPも同様に効
果を示す。
点も提供する。T７ RNA ポリメラーゼによって同一の鋳
型から生成されるRNA分子は、しばしば異種の３’−末
端を有する（すなわち、３’−末端に少数の余分な、鋳
型由来ではないヌクレオチドを有する）。この３’の異
質性は、本発明の多くの具体例において必要とされる、
次のライゲーションの段階を阻害する。余分なヌクレオ
チドは、主としてT７RNA ポリメラーゼのターミナルト
ランスフェラーゼ活性により、転写物に添加される。そ
れらの添加は、その活性に対して競合する基質を供給す
ることによって、低下しうる。効果的な競合物質には、
外来性のRNA（例えば酵母からの総RNA）、３’−ヒドロ
キシル末端を有するオリゴデオキシヌクレオチド、ヌク
レオチド一リン酸（例えばGMP）、デオキシリボヌクレ
オチド一リン酸、および３’−ヒドロキシルを有するヌ
クレオシドがある。化学的に修飾されたGMPも同様に効
果を示す。
【００７２】本発明において用いられる固相支持体への
核酸プローブの結合は、表面上の反応基への直接の吸
着、あるいは化学結合を含む、多くの標準的な方法のい
ずれかを使用して行いうる。例えば、３−グリシドオキ
シプロピルトリ−メトキシシランリンカーのような可動
性の炭素鎖（例えば、Maskosら, Nucl. Acids Res., 20
(7): 1679-1684, 1992を参照すること）、あるいは、牛
血清アルブミン（“BSA”）分子のようなタンパク質
を、リンカーとして使用しうる。リンカー（例えば親水
性リンカー）の使用はまた、プローブの複製効率を向上
させうる。
核酸プローブの結合は、表面上の反応基への直接の吸
着、あるいは化学結合を含む、多くの標準的な方法のい
ずれかを使用して行いうる。例えば、３−グリシドオキ
シプロピルトリ−メトキシシランリンカーのような可動
性の炭素鎖（例えば、Maskosら, Nucl. Acids Res., 20
(7): 1679-1684, 1992を参照すること）、あるいは、牛
血清アルブミン（“BSA”）分子のようなタンパク質
を、リンカーとして使用しうる。リンカー（例えば親水
性リンカー）の使用はまた、プローブの複製効率を向上
させうる。
【００７３】BSAは、固相表面上に固定されたプローブ
への核酸の非特異的結合を有意に低下させることができ
るので、特に有用なリンカーである。また、BSAは、そ
れが結合する自触媒作用的に複製しうるRNAを、効率的
に複製させる。以下に、BSAを介して固相支持体にRNAプ
ローブを結合させる例示的なプロトコールを述べる。酸
で洗浄したスライドグラスを、まずグリシジルオキシプ
ロピルトリメトキシシランと反応させ、グラス上にアミ
ン反応性エポキシ基を生成させる。次にこれらのエポキ
シ基にBSAを結合させ、結合したアルブミン上のカルボ
キシル基を、例えば、N−ヒドロキシ−スクシンアミド
を、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリノ−エチ
ル）カルボジイミド（CMC）、あるいは１−エチル−３
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDA
C）のようなカルボジイミドと共に用いて活性化し、ア
ミン反応性N−ヒドロキシスクシンアミド−エステル（N
HS）を生成させる。次に、５’−末端アミノ基を有する
RNA を、NHSで誘導体化したアルブミンと反応させる。
への核酸の非特異的結合を有意に低下させることができ
るので、特に有用なリンカーである。また、BSAは、そ
れが結合する自触媒作用的に複製しうるRNAを、効率的
に複製させる。以下に、BSAを介して固相支持体にRNAプ
ローブを結合させる例示的なプロトコールを述べる。酸
で洗浄したスライドグラスを、まずグリシジルオキシプ
ロピルトリメトキシシランと反応させ、グラス上にアミ
ン反応性エポキシ基を生成させる。次にこれらのエポキ
シ基にBSAを結合させ、結合したアルブミン上のカルボ
キシル基を、例えば、N−ヒドロキシ−スクシンアミド
を、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリノ−エチ
ル）カルボジイミド（CMC）、あるいは１−エチル−３
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDA
C）のようなカルボジイミドと共に用いて活性化し、ア
ミン反応性N−ヒドロキシスクシンアミド−エステル（N
HS）を生成させる。次に、５’−末端アミノ基を有する
RNA を、NHSで誘導体化したアルブミンと反応させる。
【００７４】アミン−NHS 結合に用いられる通常の条件
（例えば、pHが約７より大きい反応緩衝水溶液）の下で
は、NHS基は不安定である。従って、BSA上のやや少ない
カルボン酸残基をできるだけ多く使用するためには、こ
れらの残基の活性化された状態（すなわち、NHS誘導体
化された状態）を、それらがRNA分子の５’−末端で脂
肪族アミンと反応し結合するまで保持するのが望まし
い。このために、非水系条件を用いることが可能であ
る。例えば、NHSで活性化したBSAで被覆した固相支持体
を乾燥し、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB））を用い
てブタノール中で可溶化したRNAプローブに暴露する。
（例えば、pHが約７より大きい反応緩衝水溶液）の下で
は、NHS基は不安定である。従って、BSA上のやや少ない
カルボン酸残基をできるだけ多く使用するためには、こ
れらの残基の活性化された状態（すなわち、NHS誘導体
化された状態）を、それらがRNA分子の５’−末端で脂
肪族アミンと反応し結合するまで保持するのが望まし
い。このために、非水系条件を用いることが可能であ
る。例えば、NHSで活性化したBSAで被覆した固相支持体
を乾燥し、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB））を用い
てブタノール中で可溶化したRNAプローブに暴露する。
【００７５】写真石版術（photolithography）もまた、
固相支持体にプローブを結合させるのに使用しうる。こ
の方法では、固相支持体の表面を感光性のリンカーで被
覆し、プローブの結合を望む表面の領域に、レーザー光
線の様な適当な光源を直射する。次にプローブを表面と
接触させ、光で活性化された領域に結合させる。この方
法は固相支持体への異なるプローブの結合を容易に可能
とする。
固相支持体にプローブを結合させるのに使用しうる。こ
の方法では、固相支持体の表面を感光性のリンカーで被
覆し、プローブの結合を望む表面の領域に、レーザー光
線の様な適当な光源を直射する。次にプローブを表面と
接触させ、光で活性化された領域に結合させる。この方
法は固相支持体への異なるプローブの結合を容易に可能
とする。
【００７６】上述のように、本発明においては、多くの
異なる増幅機構を使用しうる（例えば、Pershingら（上
記参照）を参照すること）。例えば、標的増幅（例：PC
R；Saikiら、上記参照）、転写型増幅系（TAS；Kwoh
ら、上記参照）、自己保存型配列反応（self-sustained
sequence reaction）（３SR ；Guatelliら、上記参
照）、転写介在型増幅（TMA；米国特許 第 5,399,491
号；国際特許公開WO 93/22461号）、核酸配列型増幅（N
ASBA；Compton、上記参照）、ストランド置換型増幅（S
DA；Walkerら、上記参照）、あるいはプローブ増幅
（例：QBR（Lizardiら、上記参照）、リガーゼ増幅反応
（LAR；Wuら、上記参照）、リガーゼ連鎖反応（LCR；Ba
ranyら、上記参照））を使用しうる。
異なる増幅機構を使用しうる（例えば、Pershingら（上
記参照）を参照すること）。例えば、標的増幅（例：PC
R；Saikiら、上記参照）、転写型増幅系（TAS；Kwoh
ら、上記参照）、自己保存型配列反応（self-sustained
sequence reaction）（３SR ；Guatelliら、上記参
照）、転写介在型増幅（TMA；米国特許 第 5,399,491
号；国際特許公開WO 93/22461号）、核酸配列型増幅（N
ASBA；Compton、上記参照）、ストランド置換型増幅（S
DA；Walkerら、上記参照）、あるいはプローブ増幅
（例：QBR（Lizardiら、上記参照）、リガーゼ増幅反応
（LAR；Wuら、上記参照）、リガーゼ連鎖反応（LCR；Ba
ranyら、上記参照））を使用しうる。
【００７７】上述のように、自触媒作用的に複製しうる
核酸を使用する具体例では、多くの異なる種類のそれら
の核酸を、本発明において使用しうる。例えば、中間変
異型RNA（例えば、中間変異型−１（MDV−１））、ミニ
変異型RNA、ミクロ変異型RNA、およびナノ変異型RNAを
使用しうる。これら、あるいは他の自触媒作用的に複製
しうる核酸の配列は当該分野でよく知られており、本発
明での使用に直ちに適合できる（例えば、Millsら, Pro
c. Natl. Acad. Sci USA, 72:4252-4256, 1975；Schaff
nerら, J. Mol. Biol., 117:877-907, 1977；Kacianら,
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 69:3038-3042, 1972；Ch
uら, 米国特許 第 4,957,858号；Mieleら, J. Mol. Bi
ol., 171:281-295, 1983、を参照すること）。更に、共
にいくつかのステム構造を有するMDV−１およびミクロ
変異型RNAのような、自触媒作用的に複製しうるRNAの二
次構造は、当該分野でよく知られている（例えば、Mill
sら（上記参照）；Nishiharaら, J. Biochem., 93:669-
674, 1983 を参照すること）。この情報に基づいて、当
該分野の技術者は、これらのRNAのステム構造における
補正的な塩基対変化がどこで許容されうるかを予測する
ことが可能であり、従って、自触媒作用的に複製しうる
核酸として使用しうる他の関連分子を同定できる。
核酸を使用する具体例では、多くの異なる種類のそれら
の核酸を、本発明において使用しうる。例えば、中間変
異型RNA（例えば、中間変異型−１（MDV−１））、ミニ
変異型RNA、ミクロ変異型RNA、およびナノ変異型RNAを
使用しうる。これら、あるいは他の自触媒作用的に複製
しうる核酸の配列は当該分野でよく知られており、本発
明での使用に直ちに適合できる（例えば、Millsら, Pro
c. Natl. Acad. Sci USA, 72:4252-4256, 1975；Schaff
nerら, J. Mol. Biol., 117:877-907, 1977；Kacianら,
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 69:3038-3042, 1972；Ch
uら, 米国特許 第 4,957,858号；Mieleら, J. Mol. Bi
ol., 171:281-295, 1983、を参照すること）。更に、共
にいくつかのステム構造を有するMDV−１およびミクロ
変異型RNAのような、自触媒作用的に複製しうるRNAの二
次構造は、当該分野でよく知られている（例えば、Mill
sら（上記参照）；Nishiharaら, J. Biochem., 93:669-
674, 1983 を参照すること）。この情報に基づいて、当
該分野の技術者は、これらのRNAのステム構造における
補正的な塩基対変化がどこで許容されうるかを予測する
ことが可能であり、従って、自触媒作用的に複製しうる
核酸として使用しうる他の関連分子を同定できる。
【００７８】本発明の装置および方法による核酸被検物
質の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学、お
よび獣医学のような分野において、有用でありうる。例
えば、医学の分野において、本発明の方法を、特定の核
酸マーカーの存在もしくは不在、および／あるいは、通
常存在する核酸のレベルの変化により特徴付けられる状
態（例えば、ガン）の診断に使用しうる。本発明の方法
はまた、例えば、一塩基対の変化、小さなもしくは大き
な欠失変異、挿入変異、あるいは転位（例えば、染色体
転座）によって特徴付けられる遺伝子突然変異、および
遺伝子の多形態性の検出にも使用しうる。更に、本発明
の方法は、試料（例えば患者からの試料）中の感染性病
原体（例えば、細菌、ウィルス、原生動物、寄生虫、も
しくは真菌）、あるいは数少ない細胞（例えば、妊婦の
血液中の胎児の細胞）の存在を検出するために使用しう
る。最後に、本発明の装置、方法、および系は、多種類
の標的被検物質の検出および定量のためのパネル型（pa
nel format）に、容易に組み込むことが可能である。
質の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学、お
よび獣医学のような分野において、有用でありうる。例
えば、医学の分野において、本発明の方法を、特定の核
酸マーカーの存在もしくは不在、および／あるいは、通
常存在する核酸のレベルの変化により特徴付けられる状
態（例えば、ガン）の診断に使用しうる。本発明の方法
はまた、例えば、一塩基対の変化、小さなもしくは大き
な欠失変異、挿入変異、あるいは転位（例えば、染色体
転座）によって特徴付けられる遺伝子突然変異、および
遺伝子の多形態性の検出にも使用しうる。更に、本発明
の方法は、試料（例えば患者からの試料）中の感染性病
原体（例えば、細菌、ウィルス、原生動物、寄生虫、も
しくは真菌）、あるいは数少ない細胞（例えば、妊婦の
血液中の胎児の細胞）の存在を検出するために使用しう
る。最後に、本発明の装置、方法、および系は、多種類
の標的被検物質の検出および定量のためのパネル型（pa
nel format）に、容易に組み込むことが可能である。
【００７９】
【実施例】以下の実施例では、染色体転座に起因する病
気の診断における、本発明の方法および装置の使用につ
いて述べる。
気の診断における、本発明の方法および装置の使用につ
いて述べる。
【００８０】一般的に、染色体の転座および逆位によっ
て、通常は物理的かつ転写的に互いに分離されている二
つの遺伝子（組換えに関与するそれぞれの染色体もしく
は染色体セグメントの一つ）の並置が起きる。そのよう
な転座は、有害な生理的影響を有しうる、新種の融合タ
ンパク質を生成させる可能性がある。例えば、このよう
な様式で生成される多くの融合タンパク質は、ガンの病
因に関係すると示唆されてきた（例えば、Rabbits, Nat
ure, 372:143-149, 1994を参照すること）。そのような
ガンの原因となる遺伝子転位の典型的な例は、その存在
が、慢性骨髄性白血病（CML）および急性リンパ球性白
血病（ALL）を含む多くの白血病と強い相関関係があ
る、いわゆる“フィラデルフィア”染色体の形成を引き
起こす、染色体９と染色体２２の転座（t 9 ; 22）であ
る。分子レベルでは、転座により、染色体２２上のbcr
遺伝子と染色体９上のabl遺伝子の結合が起きる。通常
の転写、スプライシング、および翻訳の機構を経て、そ
のハイブリッド遺伝子からハイブリッドBCR/ABLタンパ
ク質が生成され、それにより、コードされたチロシンキ
ナーゼの酵素活性の発現が高められる。
て、通常は物理的かつ転写的に互いに分離されている二
つの遺伝子（組換えに関与するそれぞれの染色体もしく
は染色体セグメントの一つ）の並置が起きる。そのよう
な転座は、有害な生理的影響を有しうる、新種の融合タ
ンパク質を生成させる可能性がある。例えば、このよう
な様式で生成される多くの融合タンパク質は、ガンの病
因に関係すると示唆されてきた（例えば、Rabbits, Nat
ure, 372:143-149, 1994を参照すること）。そのような
ガンの原因となる遺伝子転位の典型的な例は、その存在
が、慢性骨髄性白血病（CML）および急性リンパ球性白
血病（ALL）を含む多くの白血病と強い相関関係があ
る、いわゆる“フィラデルフィア”染色体の形成を引き
起こす、染色体９と染色体２２の転座（t 9 ; 22）であ
る。分子レベルでは、転座により、染色体２２上のbcr
遺伝子と染色体９上のabl遺伝子の結合が起きる。通常
の転写、スプライシング、および翻訳の機構を経て、そ
のハイブリッド遺伝子からハイブリッドBCR/ABLタンパ
ク質が生成され、それにより、コードされたチロシンキ
ナーゼの酵素活性の発現が高められる。
【００８１】CMLでは、最小残留症状（minimum residua
l disease；MRD）の状態が多年にわたって持続すること
があり、その状態では、比較的低レベルの変化したBCR/
ABLタンパク質だけが生成され、その間、病状は現われ
ないか、あるいは比較的軽度の病状が現われる。その
後、最初の診断から平均４〜５年で、病状は急性期に急
変し、多くの医療介入が必要となる。融合したBCR/ABL
mRNAおよびタンパク質の発現の上昇が、この急性期の開
始の前兆となる。この分野で理解されているように、医
療の介入は病状の急性期への移行に伴いできるだけ速や
かに開始すれば最も効果的である。従って、MRD状態に
あるCML患者のBCR/ABL mRNAの発現量の定量的なモニタ
ーに用いうる診断テストは、それらの病気の管理に使用
することが可能である。
l disease；MRD）の状態が多年にわたって持続すること
があり、その状態では、比較的低レベルの変化したBCR/
ABLタンパク質だけが生成され、その間、病状は現われ
ないか、あるいは比較的軽度の病状が現われる。その
後、最初の診断から平均４〜５年で、病状は急性期に急
変し、多くの医療介入が必要となる。融合したBCR/ABL
mRNAおよびタンパク質の発現の上昇が、この急性期の開
始の前兆となる。この分野で理解されているように、医
療の介入は病状の急性期への移行に伴いできるだけ速や
かに開始すれば最も効果的である。従って、MRD状態に
あるCML患者のBCR/ABL mRNAの発現量の定量的なモニタ
ーに用いうる診断テストは、それらの病気の管理に使用
することが可能である。
【００８２】MRD状態ではBCR/ABL mRNAの生成量はかな
り低い可能性があるため、また、できるだけ早期に発現
量の上昇を検出することが望ましいため、臨床で実用化
するためには高感度のアッセイが必要である。本発明
は、QBR増幅系を用いてこうしたモニタリングを実施す
る方法を述べる。例えば本発明は、通常は物理的かつ転
写的に互いに分離している二つの遺伝子の体細胞転位
（例えば、並置を引き起こすような）に起因する遺伝子
融合の発現量をモニタリングする方法を提供する。これ
は明らかに、CMLおよびALL、ならびに融合タンパク質が
重要な役割を果たす他の疾病（例えば他の血液ガンおよ
び固形腫瘍（Rabbits, 1994（上記参照）））の診断に
適用性がある。
り低い可能性があるため、また、できるだけ早期に発現
量の上昇を検出することが望ましいため、臨床で実用化
するためには高感度のアッセイが必要である。本発明
は、QBR増幅系を用いてこうしたモニタリングを実施す
る方法を述べる。例えば本発明は、通常は物理的かつ転
写的に互いに分離している二つの遺伝子の体細胞転位
（例えば、並置を引き起こすような）に起因する遺伝子
融合の発現量をモニタリングする方法を提供する。これ
は明らかに、CMLおよびALL、ならびに融合タンパク質が
重要な役割を果たす他の疾病（例えば他の血液ガンおよ
び固形腫瘍（Rabbits, 1994（上記参照）））の診断に
適用性がある。
【００８３】図−８に、上述した本発明の方法に従っ
て、bcr/abl遺伝子融合体（SEQ ID NO:３）から転写さ
れたmRNAを検出する診断方法において使用しうる、被検
物質結合プローブセグメント（SEQ ID NO:１および２）
の特異的配列を示す。
て、bcr/abl遺伝子融合体（SEQ ID NO:３）から転写さ
れたmRNAを検出する診断方法において使用しうる、被検
物質結合プローブセグメント（SEQ ID NO:１および２）
の特異的配列を示す。
【００８４】これらのプローブは、例えば以下の方法に
使用しうる。患者の末梢血試料中の細胞を、例えばグア
ニジンチオシアネートに溶解する。３’−ハーフプロー
ブ（50ng/100μL；例えばSEQ ID NO:２の配列を有する
プローブ；図−８を参照すること）を溶解した試料に加
えた後、その混合物を、例えばSEQ ID NO:１（図−８を
参照すること）の配列を有するプローブが結合する、本
発明の固相支持体の表面に適用し、例えば約１時間、ハ
イブリダイゼーションを進行させる。その後、例えばコ
ープランドジャー（Copeland jar）に入った緩衝液に固
相支持体（例えばガラスプレート）を浸すことにより、
固相支持体の表面を洗浄する。中程度に厳密な条件を使
用して洗浄することが可能であり、支持体をプローブを
含有しない新しいハイブリダイゼーション緩衝液中で、
３７℃、５分間、インキュベートする。次に、ライゲー
ション緩衝液およびリガーゼを支持体に加え、約３７℃
で約５分間、インキュベーションを行う。次に、支持体
を、例えば0.01 N NaOH中で３７℃、１分間、洗浄し、Q
BRおよび増幅試薬（dNTPs、Mg、トリス緩衝液pH7.8）を
含有する拡散制限マトリクス（例えば、ポリアクリルア
ミド、ポリエチレングリコール、ゼラチン、あるいはア
ガロース）を加え、約１５分間、増幅を行う。もしスポ
ットが、例えば直径約１mm以上の大きさになる程の十分
な時間、増幅が実施されれば、この反応中に生成するス
ポットは、多くの適当な方法（例えば、蛍光顕微鏡、CC
Dカメラ、あるいは目視検査）のいずれかを用いて計数
しうる。
使用しうる。患者の末梢血試料中の細胞を、例えばグア
ニジンチオシアネートに溶解する。３’−ハーフプロー
ブ（50ng/100μL；例えばSEQ ID NO:２の配列を有する
プローブ；図−８を参照すること）を溶解した試料に加
えた後、その混合物を、例えばSEQ ID NO:１（図−８を
参照すること）の配列を有するプローブが結合する、本
発明の固相支持体の表面に適用し、例えば約１時間、ハ
イブリダイゼーションを進行させる。その後、例えばコ
ープランドジャー（Copeland jar）に入った緩衝液に固
相支持体（例えばガラスプレート）を浸すことにより、
固相支持体の表面を洗浄する。中程度に厳密な条件を使
用して洗浄することが可能であり、支持体をプローブを
含有しない新しいハイブリダイゼーション緩衝液中で、
３７℃、５分間、インキュベートする。次に、ライゲー
ション緩衝液およびリガーゼを支持体に加え、約３７℃
で約５分間、インキュベーションを行う。次に、支持体
を、例えば0.01 N NaOH中で３７℃、１分間、洗浄し、Q
BRおよび増幅試薬（dNTPs、Mg、トリス緩衝液pH7.8）を
含有する拡散制限マトリクス（例えば、ポリアクリルア
ミド、ポリエチレングリコール、ゼラチン、あるいはア
ガロース）を加え、約１５分間、増幅を行う。もしスポ
ットが、例えば直径約１mm以上の大きさになる程の十分
な時間、増幅が実施されれば、この反応中に生成するス
ポットは、多くの適当な方法（例えば、蛍光顕微鏡、CC
Dカメラ、あるいは目視検査）のいずれかを用いて計数
しうる。
【００８５】本発明は、融合タンパク質をコードする核
酸（DNAあるいはRNA）の検出が必要とされる、あらゆる
状況に、使用しうる。
酸（DNAあるいはRNA）の検出が必要とされる、あらゆる
状況に、使用しうる。
【００８６】本発明について、その詳細な説明に関連し
て述べてきたが、前述の説明は例証であって本発明の範
囲を制限するものではないことが理解されるべきであ
る。本発明の、他の観点、利点、および改変は、特許請
求の範囲内のものである。
て述べてきたが、前述の説明は例証であって本発明の範
囲を制限するものではないことが理解されるべきであ
る。本発明の、他の観点、利点、および改変は、特許請
求の範囲内のものである。
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、本発明に包含されるア
ッセイの構成を模式的に表したものである。
ッセイの構成を模式的に表したものである。
【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、本発明の装置、および
核酸被検物質を検出する方法におけるその使用を模式的
に表したものである。
核酸被検物質を検出する方法におけるその使用を模式的
に表したものである。
【図３】 図３は、ＱＢＲライゲーションに基づく二元
プローブアッセイを模式的に表したものである。
プローブアッセイを模式的に表したものである。
【図４】 図４Ａ−４Ｆは、固相表面に結合したプロー
ブが自触媒作用的に複製しうる核酸の一部を有する、本
発明の装置を用いる方法を模式的に表したものである。
ブが自触媒作用的に複製しうる核酸の一部を有する、本
発明の装置を用いる方法を模式的に表したものである。
【図５】 図５Ａおよび５Ｂは、増幅された核酸産物を
検出するために、蛍光体−消光体対、例えば蛍光エネル
ギー伝達対を使用する二種の異なる方法を模式的に表し
たものである。
検出するために、蛍光体−消光体対、例えば蛍光エネル
ギー伝達対を使用する二種の異なる方法を模式的に表し
たものである。
【図６】 図６は、本発明の装置および方法の使用によ
って形成される増幅された核酸産物を検出するための、
蛍光体−消光体対、例えば蛍光エネルギー伝達対の使用
のフローチャートを模式的に表したものである。
って形成される増幅された核酸産物を検出するための、
蛍光体−消光体対、例えば蛍光エネルギー伝達対の使用
のフローチャートを模式的に表したものである。
【図７】 図７Ａ−７Ｇは、本発明の範囲に含まれる二
元プローブデザインの変形を模式的に表したものであ
る。
元プローブデザインの変形を模式的に表したものであ
る。
【図８】 図８は、ＣＭＬの患者で見いだされるメジャ
ーＢＣＲ／ＡＢＬジャンクションの検出に使用すること
ができる３’および５’−ハーフプローブを模式的に表
したものである。
ーＢＣＲ／ＡＢＬジャンクションの検出に使用すること
ができる３’および５’−ハーフプローブを模式的に表
したものである。
【図９】 図９Ａおよび９Ｂは、ＰＣＲ増幅を使用する
本発明の方法を模式的に表したものである。
本発明の方法を模式的に表したものである。
フロントページの続き (71)出願人 597060357 3100 Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ, Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓ 60515−5400，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
Claims (30)
- 【請求項１】 試料中の核酸被検物質の存在を検出する
ためのアッセイ装置であって、被検物質特異的核酸プロ
ーブの二次元場が共有結合している非粒子型固相支持体
を含有し、それぞれのプローブが、該支持体に共有結合
し、かつ自触媒作用的に複製しうる核酸の５’−部分を
有する第一の末端、および被検物質結合セグメントを有
する第二の末端を有することを特徴とするアッセイ装
置。 - 【請求項２】 該自触媒作用的に複製アッセイ装置し
うる核酸がＱ−ベータレプリカーゼによって複製しう
る、請求項１記載の装置。 - 【請求項３】 該自触媒作用的に複製しうる核酸が中間
変異型核酸を含むものである、請求項２記載の装置。 - 【請求項４】 試料中の核酸被検物質の存在を検出する
方法であて、下記（ａ）〜（ｅ）： （ａ）それぞれの第一の被検物質特異的核酸プローブ
が、固相支持体に結合し、かつ自触媒作用的に複製しう
る核酸の５’−部分を含む第一の末端、および第一の被
検物質結合セグメントを含む第二の末端を有し、それぞ
れの該第一のプローブの該第一の被検物質結合セグメン
トが被検物質の第一の領域にハイブリダイズする、該第
一の被検物質特異的核酸プローブの二次元場が共有結合
した固相支持体に試料を適用し； （ｂ）第二の核酸プローブが被検物質の第二の領域にハ
イブリダイズする第二の被検物質結合セグメントを含有
し、該第二のプローブが更に該自触媒作用的に複製しう
る核酸の残部を含有し、被検物質の第一および第二の領
域は隣接するヌクレオチドセグメントであり、かつ被検
物質、該第一のプローブ、および該第二のプローブが支
持体上で共にハイブリダイズして完全に自触媒作用的に
複製しうる核酸を含む複合体を形成する、該第二の核酸
プローブを固相支持体に適用し； （ｃ）該固相支持体に拡散制限マトリクスを適用し； （ｄ）該完全に自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅し
て増幅産物を生成し；そして （ｅ）試料中の被検物質の存在の尺度として該増幅産物
を検出する、の各工程を含む方法。 - 【請求項５】 更に該複合体中の該第一および第二のプ
ローブをライゲートして該完全に自触媒作用的に複製し
うる核酸を形成する段階を含む、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 該増幅段階を挿入型蛍光色素の存在下で
実施し、該検出段階を該色素の存在によって該増幅産物
をモニターすることで実施する、請求項４記載の方法。 - 【請求項７】 該検出段階を蛍光体−消光体対を使用す
ることによって実施する、請求項４記載の方法。 - 【請求項８】 多価被検物質を試料中で同時に検出し、
該検出段階を区別可能な蛍光部分を含有する多価の蛍光
体−消光体対を使用することによって実施する、請求項
４記載の方法。 - 【請求項９】 該自触媒作用的に複製しうる核酸がＱ−
ベータレプリカーゼによって複製しうる核酸を含む、請
求項４記載の方法。 - 【請求項１０】 該自触媒作用的に複製しうる核酸が中
間変異型核酸を含むものである、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 更に、未結合の第一または第二のプロ
ーブを除去するために該複合体を洗浄することを含む、
請求項４記載の方法。 - 【請求項１２】 該拡散制限マトリクスがゼラチン、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコー
ル、およびこれらのあらゆる組み合わせからなる群から
選択される、請求項４記載の方法。 - 【請求項１３】 試料中の被検物質の濃度を該固相支持
体上に形成される増幅産物のコロニーを計数することに
よって決定し、コロニー数が試料中の被検物質の濃度に
相当する、更に試料中の被検物質の濃度を決定すること
を含む、請求項４記載の方法。 - 【請求項１４】 試料中の核酸被検物質を検出するため
のアッセイ系であって、下記（ａ）〜（ｂ）： （ａ）それぞれの第一の被検物質特異的核酸プローブ
が、非粒子型固相支持体に共有結合し、かつ自触媒作用
的に複製しうる核酸の５’−部分を含む第一の末端、お
よび第一の被検物質結合セグメントを有する第二の末端
を有し、それぞれの該第一のプローブの該第一の被検物
質結合セグメントが被検物質の第一の領域にハイブリダ
イズする、該第一の被検物質特異的核酸プローブの二次
元場が共有結合した該非粒子型固相支持体；および
（ｂ）第二の核酸プローブが更に該自触媒作用的に複製
しうる核酸の残部を有し、被検物質の該第一および第二
の領域が隣接するヌクレオチドセグメントを有する、被
検物質の第二の領域にハイブリダイズする第二の被検物
質結合セグメントを有する第二の核酸プローブ；を含
み、該第一および第二のプローブの被検物質への結合に
よって該自触媒作用的に複製しうる核酸の増幅が可能に
なることを特徴とするアッセイ系。 - 【請求項１５】 試料中の核酸被検物質を検出するため
のアッセイ系であって、下記（ａ）〜（ｄ）： （ａ）それぞれの捕捉プローブが被検物質の捕捉領域に
ハイブリダイズする捕捉セグメントを有する、該捕捉プ
ローブの二次元場が結合した非粒子型固相支持体； （ｂ）被検物質の第一の領域にハイブリダイズする第一
のセグメントを有する第一の核酸プローブ； （ｃ）被検物質の第二の領域にハイブリダイズする第二
のセグメントを有する第二の核酸プローブ；および （ｄ）該固相支持体に適用させる拡散制限マトリクス； を含み、該捕捉プローブおよび該第一および第二のプロ
ーブの被検物質への結合によって拡散制限マトリクス内
での検出可能な産物の増幅が可能になることを特徴とす
るアッセイ系。 - 【請求項１６】 被検物質の第一および第二の領域が隣
接するヌクレオチドセグメントであり、該第一の核酸プ
ローブが更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子の一部
を有し、かつ該第二の核酸プローブが更に該自触媒作用
的に複製しうる核酸分子の残部を有するものである、請
求項１５記載のアッセイ系。 - 【請求項１７】 被検物質の捕捉および第一の領域が隣
接するヌクレオチドセグメントであり、かつ被検物質の
捕捉および第二の領域が隣接するヌクレオチドセグメン
トであり、該第一の核酸プローブが更に自触媒作用的に
複製しうる核酸分子の一部を有し、かつ該第二の核酸プ
ローブが更に該自触媒作用的に複製しうる核酸分子の残
部を有するものである、請求項１５記載のアッセイ系。 - 【請求項１８】 試料中の核酸被検物質の存在を検出す
る方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）： （ａ）被検物質の該第一および第二の領域が隣接するヌ
クレオチドセグメントであり、該第一の核酸プローブが
更に自触媒作用的に複製しうる核酸分子の一部を有し、
該第二の核酸プローブが更に該自触媒作用的に複製しう
る核酸分子の残部を有し、かつ該接触によって被検物
質、該第一のプローブ、および該第二のプローブが支持
体上で共にハイブリダイズして完全に自触媒作用的に複
製しうる核酸を含有する複合体を形成することが可能と
なるように、試料を請求項１５記載のアッセイ系の該結
合捕捉プローブおよび該第一および第二のプローブと接
触させ； （ｂ）該固相支持体に拡散制限マトリクスを適用し； （ｃ）該完全に自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅し
て増幅産物を生成し；そして （ｄ）試料中の被検物質の存在の尺度として該増幅産物
を検出する、の各工程を含む方法。 - 【請求項１９】 試料中の核酸被検物質の存在を検出す
る方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）： （ａ）被検物質の捕捉および第一の領域が隣接するヌク
レオチドセグメントであり、かつ被検物質の捕捉および
第二の領域が隣接するヌクレオチドセグメントであり、
該第一の核酸プローブが更に自触媒作用的に複製しうる
核酸分子の一部を有し、該第二の核酸プローブが更に該
自触媒作用的に複製しうる核酸分子の残部を有し、かつ
該接触によって被検物質、該第一のプローブ、および該
第二のプローブが支持体上で共にハイブリダイズして完
全に自触媒作用的に複製しうる核酸を含有する複合体を
形成することが可能となるように、試料を請求項１５記
載のアッセイ系の該結合捕捉プローブおよび該第一およ
び第二のプローブと接触させ； （ｂ）該固相支持体に拡散制限マトリクスを適用し； （ｃ）該完全に自触媒作用的に複製しうる核酸を増幅し
て増幅産物を生成し；そして （ｄ）試料中の被検物質の存在の尺度として該増幅産物
を検出する、の各工程を含む方法。 - 【請求項２０】 試料中の核酸被検物質の存在を検出す
る方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）： （ａ）それぞれの第一の被検物質特異的核酸プローブが
固相支持体に結合する第一の末端および第一の被検物質
結合セグメントを有する第二の末端を含む、該第一の被
検物質特異的核酸プローブの二次元場が共有結合してい
る該固相支持体に試料を接触させ； （ｂ）該支持体に拡散制限マトリクスを適用し； （ｃ）第一のプローブおよび特定の被検物質核酸の双方
の存在に依存するように、また増幅反応の産物が固相支
持体上の拡散制限マトリクス内で局在化した焦点を形成
することを防止するように、ポリメラーゼ連鎖反応、リ
ガーゼ連鎖反応、転写介在型増幅、核酸配列基本型増
幅、およびストランド置換型増幅のうちのいずれかで増
幅を実施し；そして （ｄ）試料中の該被検物質の存在の尺度として該増幅産
物を検出する、の各工程を含む方法。 - 【請求項２１】 それぞれの被検物質特異的核酸プロー
ブがグアノシン５’−モノフォスフェートの存在下でＲ
ＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡである、請
求項１記載の装置。 - 【請求項２２】 ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼである、請求項２１記載の装置。 - 【請求項２３】 それぞれの第一の被検物質特異的核酸
プローブがグアノシン５’−モノフォスフェートの存在
下でＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡであ
る、請求項４記載の方法。 - 【請求項２４】 ＲＮＡを合成する方法であって、５’
−修飾グアノシン５’−モノフォスフェートの存在下で
ＲＮＡのための鋳型をＴ７ポリメラーゼと接触させるこ
とを含む方法。 - 【請求項２５】 それぞれの被検物質特異的核酸プロー
ブが牛血清アルブミンと共に固相支持体に共有結合して
いる、請求項１記載のアッセイ装置。 - 【請求項２６】 それぞれの第一の被検物質特異的核酸
プローブが牛血清アルブミンと共に固相支持体に共有結
合している、請求項４記載の方法。 - 【請求項２７】 拡散制限マトリクス中にポリエチレン
グリコールを含有する、請求項４記載の方法。 - 【請求項２８】 拡散制限マトリクス中に更にカチオン
性ポリマーを含有する、請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 拡散制限マトリクス中にポリエチレン
グリコールを含有する、請求項１５記載のアッセイ系。 - 【請求項３０】 拡散制限マトリクス中に更にカチオン
性ポリマーを含有する、請求項２９記載のアッセイ系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/768,177 US5837466A (en) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples |
| US768177 | 1996-12-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10293128A true JPH10293128A (ja) | 1998-11-04 |
Family
ID=25081772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9346496A Pending JPH10293128A (ja) | 1996-12-16 | 1997-12-16 | 試料中の核酸被検物質を検出するための装置および方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5837466A (ja) |
| EP (1) | EP0853129A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10293128A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003508729A (ja) * | 1999-05-14 | 2003-03-04 | ブランディーズ・ユニバーシティ | 核酸をベースとする検出 |
| US8071734B2 (en) | 1999-05-14 | 2011-12-06 | Brandeis University | Nucleic acid-based detection |
Families Citing this family (105)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837466A (en) * | 1996-12-16 | 1998-11-17 | Vysis, Inc. | Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples |
| ES2563643T3 (es) | 1997-04-01 | 2016-03-15 | Illumina Cambridge Limited | Método de secuenciación de ácido nucleico |
| EP0878552A1 (en) | 1997-05-13 | 1998-11-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Molecular detection of chromosome aberrations |
| US6355421B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-03-12 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to PNA molecular beacons |
| US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
| US7569342B2 (en) | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| US6361942B1 (en) | 1998-03-24 | 2002-03-26 | Boston Probes, Inc. | Method, kits and compositions pertaining to detection complexes |
| WO1999057309A1 (en) | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Dako A/S | Method and probes for the detection of chromosome aberrations |
| US6787308B2 (en) | 1998-07-30 | 2004-09-07 | Solexa Ltd. | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
| JP2002521064A (ja) * | 1998-07-30 | 2002-07-16 | ソレックサ リミテッド | アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用 |
| US6709816B1 (en) * | 1999-10-18 | 2004-03-23 | Affymetrix, Inc. | Identification of alleles |
| US7118860B2 (en) * | 1999-10-29 | 2006-10-10 | Stratagene California | Methods for detection of a target nucleic acid by capture |
| US6235483B1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids |
| US20020098485A1 (en) * | 2000-02-08 | 2002-07-25 | Morello Ann M. | Method for nucleic acid detection via Qbeta replicase |
| EP1268769A2 (de) * | 2000-03-31 | 2003-01-02 | Memorec Stoffel GmbH Medizinisch-Molekulare Entwicklung | Verfahren zur extraktion von nukleinsäuren |
| DE60141205D1 (de) * | 2000-04-03 | 2010-03-18 | Cytyc Corp | Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden |
| US6936443B2 (en) * | 2000-04-03 | 2005-08-30 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes |
| US20050272085A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-12-08 | Hodge Timothy A | Methods for forensic and congenic screening |
| US20050266494A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-12-01 | Hodge Timothy A | System and method for computer network ordering of biological testing |
| US7494817B2 (en) * | 2000-09-06 | 2009-02-24 | Transnet Yx, Inc. | Methods for genotype screening using magnetic particles |
| US7011943B2 (en) * | 2000-09-06 | 2006-03-14 | Transnetyx, Inc. | Method for detecting a designated genetic sequence in murine genomic DNA |
| US20030082605A1 (en) * | 2000-09-06 | 2003-05-01 | Hodge Timothy A. | Genomic DNA detection method and system thereof |
| US20050239125A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-10-27 | Hodge Timothy A | Methods for genotype screening |
| US20030087286A1 (en) * | 2000-09-06 | 2003-05-08 | Hodge Timothy A. | Isolation of eukaryotic genomic DNA using magnetically responsive solid functionalized particles |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| EP1377679B1 (en) | 2000-12-14 | 2009-10-28 | Gen-Probe Incorporated | Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides |
| AU2002305585A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-11-05 | Michael F. Chou | Transcription factor network discovery methods |
| US20060014186A1 (en) * | 2001-09-04 | 2006-01-19 | Hodge Timothy A | Methods for genotype screening of a strain disposed on an adsorbent carrier |
| AU2002347872A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-22 | Vysis, Inc. | Imaging microarrays |
| US20040002090A1 (en) * | 2002-03-05 | 2004-01-01 | Pascal Mayer | Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype |
| US6913890B2 (en) * | 2002-12-18 | 2005-07-05 | Palo Alto Research Center Incorporated | Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes |
| US6936496B2 (en) * | 2002-12-20 | 2005-08-30 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Nanowire filament |
| US7132298B2 (en) * | 2003-10-07 | 2006-11-07 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Fabrication of nano-object array |
| US7223611B2 (en) * | 2003-10-07 | 2007-05-29 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Fabrication of nanowires |
| TWI246593B (en) * | 2003-11-12 | 2006-01-01 | Ind Tech Res Inst | Method and substrate for biochips by using single-step manufacturing process |
| US7407738B2 (en) * | 2004-04-02 | 2008-08-05 | Pavel Kornilovich | Fabrication and use of superlattice |
| US7683435B2 (en) | 2004-04-30 | 2010-03-23 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Misalignment-tolerant multiplexing/demultiplexing architectures |
| US7247531B2 (en) | 2004-04-30 | 2007-07-24 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Field-effect-transistor multiplexing/demultiplexing architectures and methods of forming the same |
| US20050241959A1 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-03 | Kenneth Ward | Chemical-sensing devices |
| JP4476050B2 (ja) * | 2004-06-30 | 2010-06-09 | 株式会社ニデック | 視野計 |
| US20060024814A1 (en) * | 2004-07-29 | 2006-02-02 | Peters Kevin F | Aptamer-functionalized electrochemical sensors and methods of fabricating and using the same |
| US9238518B2 (en) | 2004-10-01 | 2016-01-19 | Edge Medical Properties, Llc | Inspection system and method with a control process that inspects different medications |
| US8883487B2 (en) * | 2004-12-23 | 2014-11-11 | Abbott Point Of Care Inc. | Molecular diagnostics system and methods |
| US7375012B2 (en) * | 2005-02-28 | 2008-05-20 | Pavel Kornilovich | Method of forming multilayer film |
| CA2613101A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-11 | Bioveris Corporation | Compositions and methods for detecting, amplifying, and/or isolating nucleic acids |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| JP5178528B2 (ja) | 2005-12-29 | 2013-04-10 | アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド | 分子診断用増幅システムおよび方法 |
| DK1987159T4 (da) | 2006-02-08 | 2020-11-16 | Illumina Cambridge Ltd | Fremgangsmåde til sekventering af en polynukleotidtemplate |
| AU2007217765A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Nanogen, Inc. | Methods and compositions for analyte detection |
| EP2021503A1 (en) * | 2006-03-17 | 2009-02-11 | Solexa Ltd. | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008093098A2 (en) * | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2009014787A2 (en) * | 2007-04-30 | 2009-01-29 | Nanogen, Inc. | Multianalyte assay |
| US20090093378A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-04-09 | Helen Bignell | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2011025477A1 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | Illumina, Inc. | Methods for selecting and amplifying polynucleotides |
| WO2010038042A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Illumina Cambridge Ltd. | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US20110256637A1 (en) * | 2008-10-23 | 2011-10-20 | Hyongsok Soh | Target Detection Using a Single-Stranded, Self-Complementary, Triple-Stem DNA Probe |
| WO2010088404A1 (en) * | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Columbia University | Microarrays of binary nucleic acid probes for detecting nucleic acid analytes |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| PT2556171E (pt) | 2010-04-05 | 2015-12-21 | Prognosys Biosciences Inc | Ensaios biológicos codificados espacialmente |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| WO2012118745A1 (en) * | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Arnold Oliphant | Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| LT3013983T (lt) | 2013-06-25 | 2023-05-10 | Prognosys Biosciences, Inc. | Erdviniai koduoti biologiniai tyrimai, naudojant mikrofluidinį įrenginį |
| DE102013221402A1 (de) * | 2013-10-22 | 2015-04-23 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure |
| CN113186256A (zh) | 2015-04-10 | 2021-07-30 | 空间转录公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
| PT109359A (pt) | 2016-05-03 | 2017-11-03 | Univ Aveiro | Dispositivo portátil, método para leitura de etiquetas de autenticação e seus usos. |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| WO2021091611A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| AU2020412766A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-06-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
| US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
| ES2965354T3 (es) | 2020-04-22 | 2024-04-12 | 10X Genomics Inc | Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana |
| CN115551956A (zh) * | 2020-05-08 | 2022-12-30 | 沃特世科技公司 | 用于在固体载体上缀合生物分子的异官能涂层及其用于生物分析的用途 |
| WO2021236929A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| AU2021275906A1 (en) | 2020-05-22 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| WO2021247568A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | 10X Genomics, Inc. | Spatial trancriptomics for antigen-receptors |
| AU2021283174A1 (en) | 2020-06-02 | 2023-01-05 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
| EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| EP4165207A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-04-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| AU2021294334A1 (en) | 2020-06-25 | 2023-02-02 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of DNA methylation |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| EP4301870A1 (en) | 2021-03-18 | 2024-01-10 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| EP4196605A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-06-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4786600A (en) * | 1984-05-25 | 1988-11-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Autocatalytic replication of recombinant RNA |
| US4988617A (en) * | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5188963A (en) * | 1989-11-17 | 1993-02-23 | Gene Tec Corporation | Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids |
| US5112734A (en) * | 1989-05-26 | 1992-05-12 | Gene-Trak Systems | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna |
| CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| CA2046713A1 (en) * | 1990-10-16 | 1992-04-17 | Richard M. Martinelli | Amplification of midivariant dna templates |
| KR100231383B1 (ko) * | 1990-12-31 | 1999-11-15 | 랜들 엘. 다이어몬드 | Rna 레플리카제의 dna-의존성 rna 폴리머라제 활성을 이용한 핵산 증폭 |
| US5747244A (en) * | 1991-12-23 | 1998-05-05 | Chiron Corporation | Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces |
| CA2135073C (en) * | 1992-05-06 | 2002-11-19 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
| US5376692A (en) * | 1992-05-15 | 1994-12-27 | Purdue Research Foundation | Method of binding using irradiation and product with albumin bound to biomaterials |
| RU2048522C1 (ru) * | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
| US5795714A (en) * | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| EP0688366B1 (en) * | 1993-01-15 | 2002-05-22 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits |
| DE69434688T2 (de) * | 1993-01-15 | 2007-01-11 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase |
| WO1994016105A1 (en) * | 1993-01-15 | 1994-07-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Rna assays using rna binary probes and ribozyme ligase |
| DK1157743T3 (da) * | 1993-10-28 | 2009-07-06 | Houston Advanced Res Ct | Mikrofremstillet poröst gennemströmningsapparat til diskret påvisning af bindingsreaktioner |
| US5610287A (en) * | 1993-12-06 | 1997-03-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for immobilizing nucleic acid molecules |
| US5837466A (en) * | 1996-12-16 | 1998-11-17 | Vysis, Inc. | Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples |
-
1996
- 1996-12-16 US US08/768,177 patent/US5837466A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-16 JP JP9346496A patent/JPH10293128A/ja active Pending
- 1997-12-16 US US08/991,675 patent/US6165714A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-16 EP EP97310133A patent/EP0853129A3/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003508729A (ja) * | 1999-05-14 | 2003-03-04 | ブランディーズ・ユニバーシティ | 核酸をベースとする検出 |
| US8071734B2 (en) | 1999-05-14 | 2011-12-06 | Brandeis University | Nucleic acid-based detection |
| JP4949560B2 (ja) * | 1999-05-14 | 2012-06-13 | ブランディーズ・ユニバーシティ | 核酸をベースとする検出 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0853129A3 (en) | 1999-07-07 |
| US6165714A (en) | 2000-12-26 |
| US5837466A (en) | 1998-11-17 |
| EP0853129A2 (en) | 1998-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH10293128A (ja) | 試料中の核酸被検物質を検出するための装置および方法 | |
| US5804384A (en) | Devices and methods for detecting multiple analytes in samples | |
| EP0379369B1 (en) | Nucleic acid amplification using single primer | |
| EP0469755B1 (en) | Method producing a polynucleotide for use in single primer amplification | |
| EP0357336B1 (en) | Method for detection of specific nucleic acid sequences | |
| AU634969B2 (en) | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences | |
| JP4268944B2 (ja) | 核酸の検出あるいは定量方法 | |
| EP1255861B1 (en) | Methods and kits for proximity probing | |
| ES2320604T3 (es) | Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. | |
| TW200525026A (en) | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same | |
| JP2012509078A (ja) | 二本鎖核酸特異色素を用いる固体表面でのリアルタイムマルチプレックスｐｃｒ検出 | |
| JPH0630637B2 (ja) | 分離による核酸検出法 | |
| JP2022526466A (ja) | システム | |
| JP2009261406A (ja) | β２アドレナリン多型検出 | |
| JP2000502894A (ja) | 均質ｄｎａプローブ滴定検定 | |
| CN116829735A (zh) | 检测靶核酸序列的方法 | |
| JP2006504440A (ja) | 複数のｒｎａコピーを作成するための改良方法 | |
| JP4806150B2 (ja) | 腫瘍細胞検出のための核酸プライマー及びプローブ | |
| JP5681217B2 (ja) | 分枝状ｄｎａ複合体の形成促進を通じた核酸検出方法 | |
| JP4516032B2 (ja) | ハイブリダイゼーションによる核酸の検出方法およびアッセイキット | |
| US7550276B2 (en) | Method of detecting nucleic acid | |
| KR20230041808A (ko) | 고체 지지체에 핵산 분자를 로딩하는 방법 | |
| JPH10179179A (ja) | 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 | |
| WO2023241701A1 (zh) | 一种包含巯基封闭试剂的测序试剂盒及其应用 | |
| WO2023170151A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence in a single reaction vessel |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041216 |
|
| A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20050617 |