CN101906488A

CN101906488A - 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法

Info

Publication number: CN101906488A
Application number: CN2010102514393A
Authority: CN
Inventors: 陈炯; 史雨红; 孔诚将; 陆新江; 李登峰; 李明云
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2010-08-09
Filing date: 2010-08-09
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-08-09
Also published as: CN101906488B

Abstract

本发明公开了传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，特点是包括以下步骤：(1)设计1条锁式探针和1对针对锁式探针连接序列的通用引物；(2)配制锁式探针连接反应体系，进行连接反应；(3)配制HRCA反应体系，进行HRCA扩增反应，最后对HRCA反应产物进行检测，优点是具有比现有技术的PCR检测传染性脾肾坏死病毒的方法具有更高的灵敏度、特异性和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制水产动物养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和交叉。

Description

传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法

技术领域

本发明涉及传染性脾肾坏死病毒的检测方法，尤其是涉及传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)属虹彩病毒科细胞肿大病毒属成员，是细胞质型DNA病毒，为养殖鱼类重要的病毒性病原之一，能引起全身性、系统性地感染，对感病鱼的脾脏、肾脏等造血器官和组织的破坏造成严重破坏，导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡，其寄主范围包括石斑鱼、花鲈、真鲷、大菱鲆、鳜鱼、牙鲆、条石鲷、大黄鱼等重要的养殖鱼类及蓝眼灯和丽丽鱼等重要的观赏鱼类。分子生物学研究表明，世界各地鉴定的鱼类，特别是海水养殖鱼类虹彩病毒，基本上都是ISKNV，近年来，由ISKNV引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，患病鱼的死亡率从30％(成鱼阶段)到100％(幼苗阶段)不等，给水产养殖业造成重大的经济损失，严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展，在国内外受到愈来愈大的关注。因此，快速、准确、灵敏的检测ISKNV的新技术，对控制早期病毒感染、切断病毒传播，保障我国鱼类水产养殖业的健康持续发展有重要意义。

目前ISKNV的检测方法主要采用PCR检测体系，实现了实验室条件下对ISKNV的简便、快速、敏感、特异性检测。如授权公告号为CN11864359C，公告日为2005年1月26日，发明名称为鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法，就公开了设计有两对引物的PCR反应液对样品模板进行PCR扩增反应检测。但是这些检测往往需要特定的设备、实验室及分子生物学专业实验人员操作，这只能在实验室条件下才可以检测，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

上世纪90年代中期，Fire和Xu在实验室的人工体系中，成功模拟了存在于自然界中许多质粒与病毒以环状DNA为模板进行的滚环扩增(Rolling cycle amplificatiRCA)。滚环扩增是一种在恒温条件下，利用DNA聚合酶和单链环状DNA模板，将与环状模板杂交的引物以线性方式连续不断延伸的DNA扩增方式。1998年，Lizardi等人在滚环扩增法的基础上增加了一个引物，发明了超分支滚环扩增法(hyperbranchedrolling circle amplification，HRCA)，也有文献中称之为级联滚环扩增(cascade rollingcircle amplification，CRCA)或分支扩增(ramification amplification，RAM)。超分支滚环扩增法有两种引物存在，其中一种引物与环状模板上一段序列互补，第二种引物与环状模板的另一段序列相同时，可引起自发、连续的双向多重分支状链取代反应，该技术能在短时间内(1h)进行大量扩增，扩增倍数达到10⁷(Thomas et al.1999)，灵敏度极高，能够检测到单分子水平(Zhang et al.2001)。HRCA技术安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势，另外，只要保证探针两端的特异性序列与靶序列互补，探针与靶序列的杂交结合时可以不考虑靶序列的性质(RNA或者DNA)，因此检测RNA链时不再需要预先进行RNA的逆转录。

目前，HRCA技术已应用于动植物基因及其病原检测等方面，但在水产动物病原检测方面未见报道，本发明第一次将HRCA技术应用于ISKNV的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用超分支滚环扩增法检测传染性脾肾坏死病毒的方法，克服PCR检测技术对仪器设备及操作技术要求高等问题，以实现对传染性脾肾坏死病毒进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为包括以下三部分：1、设计1条锁式探针和1对针对锁式探针连接序列的通用引物；2、配制锁式探针连接反应体系，进行连接反应；3、配制HRCA反应体系，进行HRCA扩增反应，最后对HRCA反应产物进行检测。

具体包括如下步骤：

(1)锁式探针的合成：从ISKNV-DPOL基因序列中分别选取20个碱基作为锁式探针5′端和3′端的特异识别区，5′末端碱基和3′末端碱基在ISKNV-DPOL基因序列上连续，从质粒载体pNAK1中选取3779-3692nt段的基因序列，将该基因序列中与5′末端碱基和3′末端碱基互补的碱基替换后形成的核苷酸序列作为锁式探针的连接段部分，然后进行锁式探针的合成，再对合成的锁式探针进行5’端磷酸化，所述的锁式探针的核苷酸序列如下：

5’-GAGTCGAGCT TGTGATCCAT tggactgctg aatccgttag ccagcagccg cctcgacgaatttctgccat tcatcccctt attatcactt attcaggcgt agcaccag CCACATAGTCCAGGCTGTAC-3’；128

(2)根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物：

CF1：5’-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’， 24

CF2：5’-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’； 21

(3)配制连接反应体系：连接反应体系的终浓度为锁式探针1pM-1μM，10×T4DNALigase Buffer 1μl，样品模板2μl，加双蒸水至反应总体积10μL；

(4)锁式探针的连接反应：将上述连接反应体系在94-100℃下变性3-5min后，冰浴3-5min，再加1U/μl T4 DNA Ligase，在37℃条件下，反应10-60min；

(5)配制HRCA反应体系：反应体系各组分终浓度分别为：dNTPs 0.4mM、CF1 0.4μM、CF2 0.4μM、pH 8.8的Tris-HCl₂0mM、KCl 10mM、MgSO₄ 6.5mM、(NH₄)₂SO₄ 10mM、0.1％Triton x-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，连接产物2μl，加双蒸水至反应体系总体积为25μl；

(6)HRCA反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-60min；

(7)HRCA反应产物的检测：将HRCA扩增反应产物通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增条带，呈阶梯状分布则表示该样品的ISKNV的检测结果为阳性，反之无扩增条带或扩增条带为非阶梯状分布，则为阴性。

步骤(1)中所述的5′端特异识别区和3′端特异识别区的解链温度一致。

步骤(6)中所述的最适反应温度为61℃，最适反应时间为40min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、灵敏度极高，能够检测到单分子水平，其检测灵敏度比常规PCR高10倍以上。

2、特异性强，所用的锁式探针两端的特异识别区根据ISKNV-DPOL基因中的保守区域设计，与DPOL基因上的靶序列特异性互补，当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成，因此确保了检测中的高特异性。

3、检测时间短，1h左右扩增倍数可达10⁷以上，足以满足观察所需，比常规PCR检测节省2-4h。

4、仪器设备要求低，不需PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需一个水浴锅即可完成检测，设备价格较低，节约了生产成本。

5、操作简单、便捷，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作。

综上所述，本发明具有比现有技术的PCR检测ISKNV的方法具有更高的特异、灵敏度和便捷性，并且可以在于实际生产中现场应用检测，有利于控制鱼类养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和交叉。

附图说明

图1为ISKNV-DPOL基因的HRCA锁式探针和通用引物设计示意图；通用引物中CF1与锁式探针的一段序列互补，CF2则与锁式探针的一段序列相同用框架表示；

图2为锁式探针的连接反应和HRCA反应的原理图；

图3为不同浓度的锁式探针对HRCA反应的影响图；M：100bp DNA Ladder；锁式探针浓度为1：10μM；2：100nM；3：1nM；4：10pM；5：0pM；样品模板浓度均为10⁹copies/μl；HRCA反应时间为1h；

图4为锁式探针的连接时间对HRCA反应的影响图；M：100bp DNA Ladder；连接反应时间分别为：1：10min；2：20min；3：30min；4：40min；5：60min；样品模板浓度均为10⁹copies/μl；HRCA反应时间为1h；

图5为HRCA反应时间对扩增的影响图；M：100bp DNA Ladder；HRCA反应时间分别为：1：10min；2：20min；3：30min；4：40min；5：50min；6：60min；连接反应中样品模板浓度为10⁹copies/μl，锁式探针为1μM，连接反应时间为30min；

图6为HRCA法检测ISKNV灵敏度的电泳图；M：100bp DNA Ladder；样品模板浓度(copies/μl)分别为：1：10⁵；2：10⁴；3：10³；4：10²；5：10¹；6：10⁰；7：0；

图7为HRCA法的特异性试验电泳图；M：100bp DNA Ladder；样品模板分别为1：传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney virus，ISKNV)；2：对下白班综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)；3：淋巴囊肿病病毒(Lymphocyst i sdisease virus，LCDV)；4：鲤鱼春季病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)；5：无菌水作为阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

1、制备ISKNV基因组的DNA样品模板及ISKNV-DPOL基因测序验证

1.1材料与方法

1.1.1材料

患病将死大黄鱼、花鲈采自浙江省象山港海湾水产苗种繁育中心，大肠杆菌菌株TG1由本室保存，pMD19-T Vector、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司，QIAquick Gel Extraction试剂盒购自QIAGEN公司，plasmid Mini kit购自OMEGA公司，BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit购自BIPoFlux公司。

1.1.2方法

1.1.2.1制备ISKNV基因组的DNA样品模板：

取待检鱼的脾脏组织0.5g，采用BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit(BIPoFlux公司)进行组织DNA的提取纯化，制备成用于HRCA反应的DNA样品模板。

1.1.2.2 ISKNV-DPOL基因的测序验证

根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒基因组序列(登录号：AF371960)设计DPOL基因全长的PCR特异扩增引物：

I SKNV-DPOL(+)：5’-ATGGATAGTGTGTACATCTATC-3’，

I SKNV-DPOL(-)：5’-TCATACGGCAGGCGTCGT G-3’，

上述PCR扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR扩增反应为25μl体系，包含10mM Tris-HCL(pH 8.3)，50mM KCL，1.5mM MgCL₂，0.8mM dNTPs，0.2μM引物ISKNV-DPOL(+)，0.2μM引物ISKNV-DPOL(-)，ISKNV基因组的DNA样品模板1.0μL，5U/μL r Taq DNA聚合酶；反应经94℃预变性2min后，循环扩增30次：94℃变性30s，58℃复性30s，72℃反应1.5min，循环结束后72℃延伸反应10min；扩增产物经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，预期大小的扩增条带用QIAquick GelExtraction纯化，然后克隆至pMD19-T载体；DPOL基因序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。ISKNV-DPOL基因序列的测定结果符合登录号为：FN429981

2、超分支滚环扩增技术检测ISKNV的方法的建立

2.1材料与方法

2.1.1材料

Bst DNA聚合酶大片段(含10×缓冲液)购自New England Biolabs公司，dNTPs、T4DNA Ligase(含10×缓冲液)购自TaKaRa公司，100bp DNA Ladder购自Fermentas公司。

2.1.2方法

2.1.2.1锁式探针和通用引物的设计

从ISKNV-DPOL基因序列(登录号为：FN429981)中分别选取20个碱基作为锁式探针5′端和3′端的特异识别区，5′末端碱基和3′末端碱基在ISKNV-DPOL基因序列上连续，再从质粒载体pNAK1中选取3779-3692nt段的基因序列，将该基因序列中与5′末端碱基和3′末端碱基互补的碱基替换后形成的核苷酸序列作为锁式探针的连接段部分，然后进行锁式探针的合成，再对合成的锁式探针进行5’端磷酸化，所述的锁式探针的核苷酸序列如下：

根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物：

CF1：5’-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’， 24

CF2：5’-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’； 21

图1为ISKNV-DPOL基因的HRCA锁式探针和通用引物设计示意图；通用引物中CF1与锁式探针的一段序列互补，CF2则与锁式探针的一段序列相同用框架表示。

图2锁式探针的连接反应和HRCA反应的原理图，具体原理如下：

锁式探针的两端与靶序列特异性互补，当无错配存在时，锁式探针在连接酶的作用下连接成环。成环后的锁式探针在一个与锁式探针连接段部分序列互补的引物CF1和具有链置换活性的DNA聚合酶作用下进行滚环复制，对环型探针进行扩增。该过程起始于引物CF1和环形模板单链的杂交，接着引物CF1在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下延伸，当延伸反应沿着环形模板进行一周后，新形成的3′端一边置换先前合成的序列，一边继续延伸，形成一条具有大量重复序列且与环状模板链完全互补的线状单链。DNA的延伸可以一直进行下去，因此产生的DNA链是亲代DNA单位长度的许多倍，与此同时，序列同锁式探针中部分序列相同的引物CF2结合于线状单链的互补区域，并由引物CF2起始延伸。随着引物CF1起始合成的线状单链的不断延伸，与引物CF2互补的结合位点不断暴露出来，CF2与新暴露出来的互补区域结合，开始新的酶促延伸，并置换掉下游由CF2起始延伸的核苷酸链。被上游引物CF2起始延伸所置换掉的延伸产物呈单链状态，一旦其与引物CF1互补的区域暴露出来，引物CF1将与之结合，并以之为模板进行扩增。

2.1.2.2锁式探针连接条件的优化

首先要配制最佳的连接体系，连接反应体系如下：锁式探针1μl，10×T4 DNA LigaseBuffer 1μl，DNA样品模板2μl，加双蒸水至反应总体积10μl。

确定锁式探针的最优用量对于保证反应的正常进行、降低本底信号以及节约成本至关重要，应用本发明提供的锁式探针和连接反应体系，取4个不同的锁式探针浓度(10μM、100nM、1nM、10pM)进行连接反应以确定锁式探针的最优用量，反应条件为：94℃变性3-5min后，冰浴3-5min，加1U/μl T4 DNA Ligase，在37℃下连接反应60min，反应结束后以2.1.2.3中所述体系进行HRCA反应(不同浓度的锁式探针对HRCA反应的影响图如图3所示)。为确定最优连接时间，应用确定的最优锁式探针浓度，在94℃5min变性以后，冰浴3-5min后，37℃下，连接反应时间分别为10min、20min、30min、40min、60min 5个时段，反应结束后以2.1.2.3中所述体系进行HRCA反应(锁式探针连接时间对HRCA反应的影响图如图4所示)。

2.1.2.3 HRCA条件的优化

本发明中最佳反应体系的终浓度分别为：dNTPs 0.4mM、CF1 0.4μM、CF2 0.4μM、Tris-HCl(pH 8.8)20mM、KCl 10mM、MgSO₄ 6.5mM、(NH₄)₂SO₄ 10mM、0.1％Tritonx-100和8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，连接产物2μl，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。

在HRCA反应的过程中，反应时间对产物的量和反应的特异性都有很大的影响，按照本发明中最佳反应体系配置反应液，反应时间为10min、20min、30min、40min、60min 5个不同时段(HRCA反应时间对扩增的影响图如图5所示)。

实施例2：

本发明ISKNV超分支滚环扩增检测技术的灵敏度测定

1、将获得的ISKNV基因组DNA模板原始浓度(10⁹copies/μl)10倍梯度稀释，分别作为样品模板。

2、使用实施例1中得出的优化条件法对各浓度的模板进行检测从而得出本发明的灵敏度(如图6)。

2.1锁式探针的连接

连接反应体系如下：锁式探针0.1μM，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，样品模板2μl，加双蒸水至反应总体积10μl，94-100℃下变性3-5min后，冰浴3-5min，再加1U/μl T4 DNA Ligase，在37℃条件下，反应30min。

2.2 HRCA反应

反应体系的终浓度分别为：dNTPs 0.4mM、CF1 0.4μM、CF2 0.4μM、Tris-HCl(pH8.8)20mM、KCl 10mM、MgSO₄ 6.5mM、(NH₄)₂SO₄ 10mM、0.1％ Triton x-100和8UBst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，连接产物2μl，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。反应条件为：61℃，40min。

ISKNV基因组DNA模板10倍梯度稀释试验表明，HRCA法所能检测的最低样品模板浓度为10°copies/μl(如图6所示)。

实施例3：

本发明基于HRCA检测ISKNV方法的特异性测定

提取传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney virus)、对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)、淋巴囊肿病病毒(Lymphocystis disease virus)和鲤鱼春季病毒血症病毒(spring viremia of carp virus)，即4种不同相关度病毒的基因组DNA作为模板，用于本发明的特异性验证实验，其中双蒸水作为阴性对照。其中DNA提取方法和HRCA反应体系和条件见前。扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示见图7，说明本发明提供的ISKNV-HRCA检测方法能保证对ISKNV的特异性检测，并不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例4：

用本发明HRCA法具体检测鱼体内的ISKNV

于浙江省象山港海湾水产苗种繁育中心收集大黄鱼样品15份，花鲈样品15份，根据以下步骤进行ISKNV的检测。

1、制备待检样品的DNA样品模板：

2、锁式探针连接反应：

取上述制备的DNA样品模板2μl，加入如下反应体系中：锁式探针0.1μM，10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，加双蒸水至反应总体积10μl，94℃变性5min，冰浴3-5min后加T4 DNA Ligase 1U/μl，37℃下连接反应30min。连接反应产物待用。

3、HRCA反应体系的配制及反应：

取上述连接反应液2μl，加入如下反应体系中：dNTPs 0.4mM，CF1 0.4μM，CF2 0.4μM，Tris-HCl(pH8.8)20mM，KCl 10mM，MgSO₄ 6.5mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，0.1％ Tritonx-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。其中DPOL-PCR扩增产物作为阳性对照模板，双蒸水作为阴性对照模板，61℃条件下反应40min。

4、判断HRCA检测结果：

扩增结束后，取10μlHRCA反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带，如果扩增条带呈阶梯状分布，则表示该样品的ISKNV的检测结果为阳性，反之无扩增条带或扩增条带为非阶梯状分布，则为阴性。

同时，上述检测结果与PCR检测的结果进行比较，结果显示，经ISKNV的PCR检测方法确定为阳性的样品，HRCA法均能检测到ISKNV的存在。

HRCA扩增结果还可采用荧光染料显色法目视观测。扩增反应结束后，观察反应小管混合液的外观变化，向各反应小管中加入1μL(1∶10)的SYBR Green I荧光染料。SYBRGreen I染料与双链DNA结合会发绿色荧光，所以，在自然光下肉眼观察，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则说明检测结果阳性，否则为阴性。

Claims

1.传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物：

CF1：5’-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’， 24

CF2：5’-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’； 21

(3)配制连接反应体系：连接反应体系的终浓度分别为：锁式探针1pM-1μM，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，样品模板2μl，加双蒸水至反应总体积10μL；

(5)配制HRCA反应体系：反应体系各组分终浓度分别为：dNTPs 0.4mM、CF10.4μM、CF2 0.4μM、pH 8.8的Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、MgSO₄ 6.5mM、(NH₄)₂SO₄ 10mM、0.1％Triton x-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，连接产物2μl，加双蒸水至反应体系总体积为25μl；

2.根据权利要求1所述的传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的5′端特异识别区和3′端特异识别区的解链温度一致。

3.根据权利要求1所述的传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的最适反应温度为61℃，最适反应时间为40min。