CN101935703B

CN101935703B - 肠出血性大肠杆菌o157:h7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101935703B
Application number: CN201010264295A
Authority: CN
Inventors: 罗阳; 高维寅; 陈鸣; 张波; 万莹铧; 罗灿; 府伟灵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: CN101935703A

Abstract

本发明公开了肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，包含以下试剂：①固定在固相载体上的捕获探针，②分别用荧光发射波长互不重叠的量子点标记的rfbE基因探针、HlyAB基因探针和stx2基因探针，③核酸样本的PCR扩增引物A组或B组；还公开了该试剂盒的检测方法：取疑是EHEC O157:H7感染的核酸样本，用PCR扩增引物A组或B组进行PCR扩增，所得PCR产物再与捕获探针和三种量子点标记的检测探针进行杂交，通过每种检测探针所标记量子点的荧光发射波长和强度对相应靶基因进行检测，根据三种靶基因的检测结果可准确、快速地确定样本中是否含有EHEC O157:H7。

Description

肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，还涉及该试剂盒的检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个主要血清型，感染该菌可使人患腹泻和出血性结肠炎，也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。

EHEC O157:H7感染的死亡率之所以高居不下，主要原因之一就是EHECO157:H7难以在早期被快速、准确地检测出来。目前，临床上对EHEC O157:H7主要采用传统的增菌培养、分离提纯、生化实验和血清学实验进行检测，存在操作繁琐、费时等缺点。近年来已有文献报道采用PCR、酶谱分析、高效液相色谱分析、代谢指纹法等新技术检测EHEC O157:H7，但这些方法存在特异性不强、假阳性结果较高等缺点。因此，建立一种准确、快速的EHEC O157:H7检测方法，是临床的迫切需求。

核酸分析，尤其是核酸原位杂交，作为一种准确、快速的分析方法，近年来在病原菌鉴定方面受到越来越多的关注。其基本原理是将带有发光标记物的能够识别特定核酸序列的寡核苷酸探针与待测核酸样本进行杂交反应，将杂交反应结果转化为可以读取的光信号，从而实现对待测核酸样本中特定核酸序列的定性或定量检测。传统的发光标记物多采用有机荧光染料，但其存在荧光强度弱、检测灵敏度较低；不同荧光染料的光谱间干扰严重，检测特异性较弱；光漂白现象明显，检测重复性较差等缺点，使荧光核酸杂交技术的发展和应用受到一定限制。

量子点(QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子点是一种由周期表中II-VI族或III-V族元素组成，直径在1～10nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多独特的理化特性：①发射波长可调谐，可以通过控制量子点的粒径大小来调节其发射荧光的颜色；②激发波长范围宽，从紫外区到近红外区，可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点；③发射峰狭窄且对称，半峰宽通常为25～45nm；④荧光强度高且稳定，对光漂白有强烈的抵制作用。由于这些独特的量子优势，近年来将量子点应用于荧光材料的替代研究更为深入，范围不断扩展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，目的之二在于提供所述EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒的检测方法，以满足临床对准确、快速检测EHEC O157:H7的迫切要求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，包含以下试剂：

①固定在固相载体上的捕获探针；

②三种分别用荧光发射波长互不重叠的量子点标记的检测探针：O157抗原编码基因rfbE探针、溶血性基因HlyAB探针和志贺毒素基因stx2探针；

③核酸样本的PCR扩增引物A组或B组：所述PCR扩增引物A组用于扩增分别包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段和志贺毒素基因stx2片段中的一种、以及与捕获探针结合片段的PCR产物；所述PCR扩增引物B组用于扩增同时包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段、志贺毒素基因stx2片段、以及与捕获探针结合片段的PCR产物。

在本发明中，捕获探针用于捕获PCR产物，其与PCR产物中与捕获探针结合片段的核苷酸序列互补，二者可通过杂交结合，从而将PCR产物捕获至固相载体上。在实际应用时，捕获探针和与捕获探针结合片段的核苷酸序列可根据需要进行选择和优化，优选地，与捕获探针结合片段的序列为EHEC 16S rDNA保守序列，捕获探针的序列为EHEC 16S rDNA保守序列的互补序列。EHEC 16SrDNA保守序列具有种属特异性，可进一步增强本发明的检测特异性。

EHEC O157:H7的特异性基因较多较复杂，同时检测多种特异性基因，可提高EHEC O157:H7的检测准确度，减少假阳性和假阴性结果的产生，但检测时间相对较长。为了兼顾准确、快速检测两方面的要求，本发明通过筛选并合理组合，确定了三种特异性基因作为基础检测靶基因，它们分别是：O157抗原编码基因rfbE、溶血性基因HlyAB和志贺毒素基因stx2。同时检测这三种特异性基因，EHEC O157:H7的检测准确度可达到95％以上(图4)且检测时间较短，能够满足临床准确、快速检测EHEC O157:H7的迫切要求。当然，也可以按照实际需要，在上述三种靶基因基础上进一步添加其它特异性基因如表面抗原编码基因、鞭毛抗原编码基因等作为附加检测靶基因，以进一步提高检测准确度。

由于靶基因的PCR扩增产物中存在非特异性扩增成分，用特异性的检测探针能够特异性检测靶基因，提高检测特异性。检测探针的核苷酸序列应与靶基因的序列互补，从而可通过杂交反应将量子点标记的检测探针结合到PCR产物中的靶基因片段部位。根据本发明的三种基础检测靶基因序列，其对应的检测探针序列设计如下：O157抗原编码基因rfbE探针序列优选如SEQ ID No.1所示，溶血性基因HlyAB探针序列优选如SEQ ID No.2所示，志贺毒素基因stx2探针序列优选如SEQ ID No.3所示。

本发明中用于标记检测探针的量子点可以是ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/ZnS、CdSe/CuSe、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，或以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；其荧光发射波长优选在420～680nm范围内，这一波段的量子点合成技术成熟，荧光效果好。进一步，本发明的三种检测探针优选分别用荧光发射波长为490、540、620nm的量子点进行标记，这三种波长对应的荧光颜色分别为蓝、黄、红，分辨明显且发光稳定。

本发明的PCR扩增引物有A组和B组两种方案：A组方案是采用相应的特异性引物通过三次PCR分别扩增出三种靶基因，再通过PCR扩增获得由靶基因片段(分别为O157抗原编码基因rfbE、溶血性基因HlyAB、志贺毒素基因stx2中的一种)、与捕获探针结合片段、以及连接上述两种片段的缓冲序列组成的三种PCR产物。所述缓冲序列不与本系统内任何探针和DNA片段结合，其主要作用为缓冲靶基因片段、与捕获探针结合片段与相应探针杂交时产生的结构应力。所述PCR扩增引物A组包括以下三对特异性引物：扩增O157抗原编码基因rfbE的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；扩增溶血性基因HlyAB的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQID No.6和SEQ ID No.7所示；扩增志贺毒素基因stx2的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。B组方案是采用通用引物通过一次PCR扩增出同时包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段、志贺毒素基因stx2片段、以及与捕获探针结合片段的一种PCR产物。所述通用引物的上、下游引物序列优选如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。

2、所述EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

a、取疑是肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的核酸样本，经常规预处理后，采用试剂盒提供的PCR扩增引物A组或B组进行PCR扩增，获得相应的PCR产物；

b、将步骤a所得PCR产物与试剂盒提供的固定在固相载体上的捕获探针进行杂交反应，反应完成后，取固相载体，经充分洗涤后，再与三种量子点标记的检测探针进行杂交反应，反应完成后，取固相载体，经充分洗涤后进行荧光检测，通过每种检测探针所标记量子点的荧光发射波长和荧光强度对相应靶基因片段进行检测，最后根据三种靶基因片段的检测结果确定样本中是否含有肠出血性大肠杆菌O157:H7。

本发明检测方法为固相捕获、探针杂交相结合的一种特异性PCR产物检测方法，其基本原理如图1所示：首先以疑是EHEC O157:H7感染的核酸样本为模板，采用PCR扩增引物A组或B组进行PCR扩增，获得相应的三种PCR产物或一种PCR产物，再将所得的三种PCR产物或一种PCR产物先与捕获探针进行杂交，再与三种量子点标记的检测探针同时进行杂交，当PCR产物中存在能够与捕获探针结合的片段时，则固相化的捕获探针可将PCR产物捕获至固相载体上；当PCR产物中进一步存在靶基因片段时，则捕获至固相载体上的PCR产物可通过结合特异的检测探针而标记上具有特定荧光发射波长的量子点，最后对固相载体进行荧光检测，根据特定量子点的荧光发射波长和荧光强度即可对相应的靶基因进行定性和定量检测。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，可以满足临床对准确、快速检测EHEC O157:H7的迫切要求，应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明试剂盒的检测原理示意图；

图2为不同回流反应时间制得的CdSe量子点的最大吸收波长变化趋势图(A)和粒径变化趋势图(B)；

图3为不同回流反应时间制得的CdTe/CdSe量子点的荧光光谱图；

图4为特异性基因检测数量与EHEC O157:H7检测准确度的关系；

图5为三种特异性基因PCR扩增后产物浓度与荧光强度的关系；

图6为三种特异性基因在各种细菌中的荧光强度。

具体实施方式

下面将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒的制备

1、固定在固相载体上的捕获探针的制备

捕获探针采用Clustal-X设计，其序列与EHEC 16S rDNA保守序列互补，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。本实施例采用的固相载体为玻片，所述捕获探针通过常规巯基法固定在玻片上。

2、量子点标记的检测探针的制备

(1)链霉亲和素标记的量子点的制备

在圆底烧瓶中加入Na₂SO₃ 6.302g、Se粉1.579g和高纯水100mL，在搅拌、氮气保护条件下升温至90℃回流反应6小时，抽滤，得浓度为0.2mol/L的澄清Na₂SeSO₃溶液，温度70℃保存备用；将CdCl₂·2.5H₂O 1.1418g溶于高纯水50mL中，加入巯基乙酸稀释液(巯基乙酸0.84mL用高纯水60mL稀释)，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至10，在搅拌条件下加入前述Na₂SeSO₃溶液12mL，回流反应，通过控制回流反应时间，制得荧光发射波长为490nm、表面修饰有羧基的CdSe量子点(不同回流反应时间制得的CdSe量子点的最大吸收波长变化趋势图和粒径变化趋势图如图2所示)。

将Se粉0.0195g、NaBH₄ 0.0184g和高纯水1mL搅拌反应至黑色Se粉消失，立即冰浴冷却，低温离心10分钟，取上清液即NaHSe溶液，保存备用；在圆底烧瓶中加入高纯水100mL，再加入CdCl₂·2.5H₂O 0.2864g和巯基乙酸222μL，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值至11.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的无氧NaHTe溶液(由Te粉80mg和NaBH₄ 50mg反应制得)，回流反应56小时；取反应液20mL，加高纯水稀释至100mL，再加入CdCl₂·2.5H₂O0.0576g和巯基乙酸32mL，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值至11.2，通氮气30分钟后，将前述NaHSe溶液注射到浓度为0.5mol/L的稀硫酸中产生H₂Se气体并随氮气通入反应液中，回流反应，通过控制回流反应时间，制得荧光发射波长分别为540nm和620nm、表面修饰有羧基的CdTe/CdSe量子点(不同回流反应时间制得的CdTe/CdSe量子点的荧光光谱图如图3所示)。

在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别加入上述3种不同荧光发射波长的量子点和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚(EDC)(EDC用量为量子点的50～100倍)，混匀，再加入链霉亲和素，室温下搅拌反应3小时，即得3种不同荧光发射波长且链霉亲和素标记的量子点，用Sephadex G100层析柱进行纯化，采用竞争抑制反应法检测链霉亲和素标记后的生物活性。

(2)5’端生物素标记的寡核苷酸探针的制备

根据三种靶基因序列，分别设计其对应的寡核苷酸探针，并委托上海英俊生物技术公司进行合成和5’端生物素标记。

rfbE探针序列为：5’-attccttaattcctctctttcctctgcggtc-3’(SEQ ID No.1)；

HlyAB探针序列为：5’-tgatcttatcatgaataaagc-3’(SEQ ID No.2)；

stx2探针序列为：5’-cgttttgaccatcttcgtctgattattgagc-3’(SEQ ID No.3)。

(3)量子点标记的检测探针的制备

在浓度为0.1mol/L、pH为8.0的PBS中，分别将上述三种荧光发射波长不同且链霉亲和素标记的量子点与上述三种5’端生物素标记的寡核苷酸探针通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，室温下避光反应24小时，分别制得三种用不同荧光发射波长(490、540、620nm)量子点标记的检测探针(rfbE探针、HlyAB探针、stx2探针)，采用层析柱进行分离纯化。

3、PCR扩增引物A组或B组的制备

(1)PCR扩增引物A组的制备

根据三种靶基因序列，分别设计其对应的特异性引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

扩增rfbE基因的上、下游引物序列为：5’-ctaggaccgcagaggaaagaga-3’(SEQ IDNo.4)和5’-ttccgagtacattggcatcgt-3’(SEQ ID No.5)；

扩增HlyAB基因的上、下游引物序列为：5’-gtagggaagcgaacagag-3’(SEQ IDNo.6)和5’-aagctccgtgtgcctgaa-3’(SEQ ID No.7)；

扩增stx2基因的上、下游引物序列为：5’-accacatcggtgtctgttattaacc-3’(SEQ IDNo.8)和5’-aacgaacccggccacatata-3’(SEQ ID No.9)。

(2)PCR扩增引物B组的制备

根据EHEC O157:H7的基因组序列设计通用引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

上游引物序列为：5′-agagtttgatcctggctcag-3′(SEQ ID No.10)；

下游引物序列为：5′-ggttaccttgttacgactt-3′(SEQ ID No.11)。

二、EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒的检测方法

包括以下步骤：

a、取疑是EHEC O157:H7感染的核酸样本1.5ml，进行常规预处理：置1.5mlEppendorf离心管中，8000r/min离心5分钟，弃上清，加入TE 1.5ml离心洗涤后，用TE 567μl溶解菌体，混匀；加入10％(w/w)SDS 30μl和20mg/ml的蛋白酶K 3μl，混匀，37℃温育1小时；再加入5mol/L的NaCl 100μl和CTAB/NaCl80μl，混匀，65℃温育10分钟；再加入体积比为24∶1的氯仿/异戊醇0.8ml，混匀，12000r/min离心5分钟；取上清，加入体积比为25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇0.8ml，混匀，12000r/min离心5分钟；取上清，加入异丙醇0.48ml，轻轻混合直到DNA沉淀，12000r/min离心15分钟；弃上清，加入75％(v/v)乙醇1ml离心洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5小时，再用双蒸水50μl溶解DNA，并加入终浓度为20μg/ml的RNaseA，4℃保存备用。

取1支100μl EP管，加入双蒸水38μl、10mM dNTP 1μl、10×PCR缓冲液5μl、25mM MgCl₂ 3μl、PCR扩增引物B组(通用引物)2μl以及上述DNA溶液1μl(总体积为50μl)，1000r/min离心5分钟，100℃沸水浴1分钟，立即置冰上加入Tag酶0.5μl，再加入液体石蜡50μl封闭，10000rmp离心1分钟后进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性1分钟、58℃退火50秒、72℃延伸1.5分钟(共40个循环)，最后72℃延伸10分钟；所得产物于4℃、10000rmp离心5分钟，将下层水相转入新的EP管中，-20℃保存，即得同时包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段、志贺毒素基因stx2片段、以及与捕获探针结合片段(序列为EHEC 16S rDNA保守序列)的PCR产物。

当然，步骤a中也可以采用PCR扩增引物A组(特异性引物)参照上述方法通过三次PCR分别扩增出三种靶基因，再通过PCR扩增获得由靶基因片段(分别为O157抗原编码基因rfbE、溶血性基因HlyAB、志贺毒素基因stx2中的一种)、与捕获探针结合片段(序列为EHEC 16S rDNA保守序列)、以及连接上述两种片段的缓冲序列(不与本系统内任何探针和DNA片段结合的数个碱基)组成的三种PCR产物，都可以实现本发明目的。

b、将步骤a所得PCR产物与固定在固相载体上的捕获探针进行杂交反应，反应完成后，取固相载体，用三蒸水洗涤3次，再与三种不同荧光发射波长(490、540、620nm)量子点标记的检测探针(rfbE探针、HlyAB探针、stx2探针)同时进行杂交反应，反应完成后，取固相载体，用三蒸水洗涤3次，再利用荧光显微镜进行荧光检测并利用专用软件对结果进行分析，通过每种检测探针所标记量子点的荧光发射波长和荧光强度对相应的靶基因进行定性和定量检测。

三种靶基因(rfbE基因、HlyAB基因和stx2基因)PCR扩增后的产物浓度与荧光强度的关系如图5所示，可见本发明的三种靶基因PCR扩增后的产物浓度在一定范围内与荧光强度成线性关系，因此，根据三种检测探针所标记的量子点的荧光发射波长和荧光强度，即可获知三种靶基因PCR扩增后的产物浓度。

三种靶基因(rfbE基因、HlyAB基因和stx2基因)在各种细菌中的荧光强度如图6所示，可见将三种靶基因作为基础检测基因，可以满足临床准确、快速检测EHEC O157:H7的迫切要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：包含以下试剂：

①固定在固相载体上的捕获探针；

②分别用荧光发射波长互不重叠的量子点标记的三种检测探针：O157抗原编码基因rfbE探针、溶血性基因HlyAB探针和志贺毒素基因stx2探针；

2.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列为肠出血性大肠杆菌16S rDNA保守序列的互补序列，所述PCR产物中与捕获探针结合片段的核苷酸序列为肠出血性大肠杆菌16S rDNA保守序列。

3.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：所述O157抗原编码基因rfbE探针序列如SEQ ID No.1所示，所述溶血性基因HlyAB探针序列如SEQ ID No.2所示，所述志贺毒素基因stx2探针序列如SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：所述量子点的荧光发射波长在420～680nm范围内。

5.根据权利要求1至4任一项所述肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增引物A组包括以下三对特异性引物：扩增O157抗原编码基因rfbE的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；扩增溶血性基因HlyAB的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；扩增志贺毒素基因stx2的特异性引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

6.根据权利要求1至4任一项所述肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增引物B组为通用引物，其上、下游引物序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。