CN108291910A - 用于数字计数的流动系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检验样品中的材料(例如一种或多种类型的分析物)的存在情况的方法和系统，用于改进的单酶联免疫吸附测定法(sELISA)检验以及单酶联分子分析(SELMA)的其他变体。本发明包括用于数字计数分析物的流动系统，具有至少一个开口(进口/出口)。具有亲水和疏水膜片的支持体优选地具有固定化在亲水性特征上的捕获探针。在亲水特征上形成纳升‑至‑阿升的液滴。应用气相(称为气相密封)来防止/减少从液滴的蒸发。

Description

用于数字计数的流动系统和方法
技术领域
本发明涉及用于检验样品中的材料(例如一种或多种类型的分析物)的存在情况的方法和系统，更具体而言，本发明涉及改进的单酶联免疫吸附测定法(sELISA)检验以及单酶联分子分析(SELMA)的其他变体的方法和系统。
背景技术
科学家们正在研发用于分析生物和化学系统中的变化的技术，其中这些变化通常与2种或多种状态之间的转换有关。例如Witters等人在Digital Biology and Chemistry(DOI:10.1039/C4LC00248B,(Frontier)Lab on a Chip,2014,14,pp.3225-3232)中讨论了多种数字生物和化学技术的研发。由于可以使用定性测量获得定量信息，数字技术在鲁棒性(robustness)、测定法设计和简便性方面提供益处时，则这些数字技术可以相当良好地工作。但是，数字技术是相对复杂的，部分是由于在分离和操作单一分子方面的技术困难。例如一些技术使用微米尺寸的磁珠来处理飞升(femtoliter)体积的样品。参见Rissin等人的Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins atsubfemtomolar concentrations(DOI:10.1038/nbt.1641,Nature Biotechnology 2010,28,pp.595–599)。其他技术使用甚至更小体积的阿升(attoliter)。由于在典型的实验室温度和压力下造成处理困难的小体积的流体动力学呈现的行为，所以这些微小的体积可以造成挑战。
例如大部分的数字检测技术依赖于包含分析物以及多种检测和捕获探针的液体的微分隔区划分(micro-compartmentalization)。分析物以及检测/捕获探针被携带或存在于微米尺寸的液滴中，通常为皮升-至-阿升级体积。
因此，将样品分成较小的体积的方式是数字检测工艺的最重要的部分。最容易利用的设备格式取决于形成微分隔区的阵列的固体或聚合基底，其中样品可以被转移至所述的微分隔区中。这些阵列主要形成2种：(i)微孔阵列；以及(ii)毛细管阵列。在微孔阵列中，通过基底中的凹陷形成分隔区，而在毛细管阵列中，分隔区将所有的途径延伸通过基底，因此形成通孔。在这2种类型的阵列中固有的主要挑战是样品和辅助反应剂加载在这些阵列上的方式。在微孔阵列中，凹陷可能不容易被液体样品充满，这是因为由于孔的微小维度，使得空气不能离开孔，这种情况的实例参见Kim等人的研究文章，标题为“Large-scalefemtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules”，在Labon a Chip,(2012)vol.12,pp.4986-4991(DOI:10.1039/c2lc40632b)上出版。毛细管阵列不存在这种问题，这是因为每个分隔区都具有2个开口，这样如果由顶部开口加入液体样品，则空气可以通过底部开口逃逸。但是，当微孔或毛细管分隔区内保持的液体与另外的液体进行交换时，出现由于分子的缓慢扩散所导致的另外的问题。由于微孔和毛细管均与加入的液相流垂直定位，所以不能发生良好的混合，因此液体交换仅可以通过分子由大体积液体扩散进入毛细管来发生，反之亦然。因而，为了确保合适的液体交换，必须采用时间延迟(时间延迟的长度取决于微孔/毛细管的维度，以及所加入的分子物质的类型)。
为了克服这些挑战，研发出第三种阵列，其被称为表面张力阵列。表面张力阵列是平坦的，并且由疏水性基底中或在疏水性基底上形成图案的亲水性特征组成。当表面张力阵列与水性样品接触时(例如通过浸没在水相中并由阵列收回)，由于特征与周围基底之间的表面张力差，可以在亲水性特征上形成单一的液滴。由于液滴停留在平坦的表面上，当在阵列上引入液体样品时，则可以立即发生液体加载以及液体交换(或者比扩散限定的运送快至少几个数量级)。与微孔阵列不同，没有空气可以陷入在液体和亲水性特征之下，并且由于阵列不依赖于基底中的坑/凹陷/腔，所以液滴与大体积液体之间的液体混合不受分子扩散的限制。然而，所有3种类型的微分隔区划分格式(微孔、毛细管和表面张力阵列)都面临将大量的液体微液滴保持足够长的时间以使数字技术可以实施的挑战。
在实验室的典型环境温度和压力下，这些液滴在几秒内蒸发，例如参见Birdi,K.S.,Vu,D.T.和Winter的研究文章，标题为“A study of the evaporation rates ofsmall water drops placed on a solid surface”，在The Journal of PhysicalChemistry,1989,vol.93,pp.3702-3703(DOI:10.1021/j100346a065)上出版。
一旦蒸发，在微液滴内处理分子的能力将丧失，数字技术不能实施。
因此，必须防止快速蒸发，并将微液滴保持足以测量目的分子的存在情况的时间。
为此，科学家和工程人员研发了将保持微液滴的分隔区密封的某些技术。这些密封防止微液滴与周围环境接触，并由此防止蒸发。
通常，存在2种密封分隔区的技术：物理密封和化学密封。当分隔区在基底中被构造成微凹陷或微腔时，使用物理密封。就物理密封分隔区而言，将密封盖附着在分隔区的顶部。按照这种方式，单一分隔区的内容物不能蒸发，并且相邻的分隔区不能交换它们的内容物(否则会导致交叉污染)。物理密封的缺点在于一旦分隔区被拆封，因为盖不能在不破坏微分隔区的整体性的情况下容易地除去，分析就终止了。此外，为了施加物理密封，分隔区必须被构造成微孔/微腔/微凹陷，由于缓慢的分子扩散，这会导致在初始制备步骤中，分隔区内的液体发生交换的技术难题。
一种类型的化学密封依赖于使用油(或非极性液体)相来覆盖分隔区。按照这种方式，由于得自样品的水仅缓慢地分配至油相中，所以减少了样品的蒸发。化学密封的益处在于其基于界面张力，因此，分隔区无需被构造成腔，但是反而可以形成停留在表面上的液滴。这种特征能够使反应剂快速交换，其不受到分子扩散的限制，而且相反可以通过引入新反应剂的流速来测定。此外，与物理密封不同，化学密封可以通过将油相由样品中吸出而更容易地除去。然而，化学密封的一个缺点在于得自样品的分析物或其他生物分子可以分配至非极性相中，并导致(i)样品损失；和/或(ii)液滴之间的污染。具体而言，诸如蛋白质之类的生物分子往往溶解于非极性液体中，这主要是由于蛋白质中的疏水性氨基酸在暴露于疏水性界面时本身会重排的事实。分子由水分配进入非极性相的这种性质可以通过分配系数来描述，即，油-水分配系数，水-辛醇分配系数等，例如Lien,E.J.和Ren,S.S.在Chapter186in Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,Third Edition,2006,ISBN:9780849393990中所述。此外，已经显示，水甚至(尽管缓慢)分配进入周围的油相中，例如参见Huebner,A.等人在Lab on a Chip,2009,vol.9,pp.692-698(DOI:10.1039/B813709A)中出版的著作。此外，当大体积水相被大体积油相替代时，或反之，存在产生乳滴的风险，即，微米尺寸的油包水包涵体，或反之。乳滴可以构成实验的滋扰，这是因为它们可以弄脏表面和/或破坏装置的流动性能。
标题为“Enrichment and detection of nucleic acids with ultrahighsensitivity”的WO2015061362A1描述了制备液体液滴的非密封表面张力阵列的方式，其中所述的液滴展现出快速的蒸发速率。标题为“Patterning device”的WO2013110146A2描述了制备液体液滴的表面张力阵列的方式以及在化学密封下将其用于生物测定法的方式。标题为“Device and method for apportionment and manipulation of sample volumes”的WO2013063230A1描述了制备化学密封的表面张力阵列以及将该阵列用于生物测定法(包括数字计数测量)的方法。标题为“Apparatus and method for forming artificiallipid membrane”的JP2014021025A描述了制备使用脂膜化学密封的表面张力阵列的方法。标题为“High sensitivity determination of the concentration of analytemolecules or particles in a fluid sample”的WO2010039180A2描述了通过将样品分开入物理密封的微孔分隔区来数字计数分析物。标题为“Method and apparatus fordiscretization and manipulation of sample volumes”的WO2010019388A2描述了微孔分隔区，其可以通过施加由一种或多种不可混溶的液体构成的化学密封而用于捕获和分开液体样品。标题为“Microwell arrays for direct quantification of analytes on aflat sample”的WO2012022482A1描述了物理密封的微孔分隔区分析平坦基底上所包含的样品的用途。标题为“Ultrasensitive detection of molecules on single moleculearrays”的US20100075407A1描述了在物理密封的微孔分隔区上实施的数字计数测量。标题为“Methods and systems for performing digital measurements”的WO2012100198A2描述了通过制备和分析液体液滴的阵列而实施的数字计数测量。标题为“Multilayer highdensity microwells”的US20130052649A1描述了用于生物分析的微孔分隔区的化学密封阵列。标题为“Apparatus and methods for parallel processing of micro-volumeliquid reactions”的WO2001061054A2描述了化学密封的毛细管阵列用于实施生物测定法的用途。标题为“A method of charging a test carrier and a test carrier”的WO2014001459A1描述了毛细管阵列用于实施生物测定法的用途。标题为“An analyticalassembly for polymerase chain reaction”的WO1998047003A1描述了寡核苷酸的数字计数。
因此，本领域仍需要用于密封分隔区的改进的系统和方法，其中所述的分隔区保持包含待分析的材料的液滴。
发明概述
在本发明公开的第一个方面中，提供了用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统，其包含：在疏水性基底中或在疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的纳升-至-阿升液滴。
在本发明公开的另一个方面中，提供了用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统(10)，其包含：在平坦的疏水性基底(16)中或在平坦的疏水性基底(16)上具有平坦的亲水性特征(14)的图案的支持体(12)，所述的疏水性基底(16)嵌入在包含至少一个开口(20)的流动分隔区(18)中，所述的亲水性特征(14)被构造用于支持大量的纳升-至-阿升液滴，该液滴包含至少一种用于一种或多种不同的分析物类型的捕获探针(22)，所述的捕获探针(22)附着在亲水性特征(14)上。
在本发明公开的第二个方面中，提供了用于数字计数样品中一种或多种分析物类型的流动系统，其包含：在疏水性基底中或在疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的纳升-至-阿升液滴，其中每个液滴均具有最大液滴体积，以及所述的流动分隔区被构造用于支持减少各个纳升-至-阿升液滴的蒸发的气相密封。
在本发明公开的另一个方面中，提供了用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统(10)，所述的流动系统包含：在疏水性基底(16)中或在疏水性基底(16)上具有亲水性特征(14)的图案的支持体(12)，所述的疏水性基底(16)嵌入在包含至少一个开口(20)的流动分隔区(18)中，所述的亲水性特征(14)被构造用于支持大量的纳升-至-阿升液滴，其中每个液滴均具有最大液滴体积，以及所述的流动分隔区(18)被构造用于支持减少各个纳升-至-阿升液滴的蒸发的气相密封，其中所述的流动分隔区(18)具有体积(VC)，其中体积(VC)大于所有纳升-至-阿升液滴的最大聚集液滴体积(VDA)，而且小于通过以下等式计算的VMAX：
其中ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
在本发明公开的另一个方面中，提供了制备本发明公开的流动系统的方法。
在本发明公开的另一个方面中，提供了使用本发明所述的流动系统来数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法。
在本发明公开的另一个方面中，提供了数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法，该方法包括计数在气相密封下大量纳升-至-阿升液滴中所包含的分析物类型。
在本发明公开的另一个方面中，提供了在气相密封下大量纳升-至-阿升液滴用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的用途。
在此，被构造用于支持大量纳升-至-阿升液滴的亲水性特征的特征具体可以指亲水性特征形成具有第一亲水性性质的材料的图案，所述材料被具有第二亲水性性质的材料包围，所述的第一性质比第二性质具有更高的亲水性，这是指对于具有第一亲水性性质的材料上的液滴而言，接触角更低。在一个实例中，认为具有第二亲水性性质的材料是疏水性的，由此所述的液滴基本上专门地定位在具有第一亲水性性质的材料上。
被构造用于支持减少蒸发的气相密封的流动分隔区的特征是指流动分隔区的体积相对于液滴的体积。本发明认为具有体积VC(其临界值通过下式设定：)的流动分隔区是在被构造用于支持减少蒸发的气相密封的分隔区的界定范围内。
减少蒸发的气相的实例可以为基本处于饱和温度和压力的蒸气，使得其不能增加相对湿度，即，接近100pct.湿度，或者至少90-100pct.范围内，例如95-100pct.湿度的范围内。术语“开口”是指样品进入疏水性基底上的亲水性特征的入口。开口可以通过由外部进入分隔区的相同或不同尺寸的一个或多个入口形成。
流动分隔区是其中样品可以流动并且将亲水性特征安置在疏水性基底上的分隔区。流动分隔区可以通过一个或多个不同的室形成。如果其通过多于一个的室界定，则所述的室处于流体连接下。
捕获探针是能够捕获特定构成成分的特征。捕获探针可以基于例如PNA或DNA，例如单链PNA寡聚体。
在一个实施方案中，用于亲水性特征的支持体位于流动分隔区内的中心。在一个实例中，用于亲水性特征的支持体在流动分隔区内被疏水性材料包围，其中所述的疏水性材料形成用于亲水性特征的支持体的边界。
发明详述
在一个实施方案中，本发明所述的系统和方法提供了用于微液滴的改进的密封，并由此，提供了气相密封。在一个实施方案中，本发明所述的系统和方法包括通道型流动分隔区，其具有用于支持大量微液滴的表面。在一个实施方案中，如本发明所公开，通道型流动分隔区还具有在支持液滴的表面上延伸的表面，并且包含壁，使得通道型流动分隔区具有2个开口，每个开口分别在流动分隔区的一侧上。在一个实施方案中，通道是具有正方形截面的长方形，使得每个开口都是正方形。在其他实施方案中，流动分隔区是圆柱形，并且每个开口是圆形。在这两种实施方案中，例如在阵列中，微液滴彼此间隔开，并且位于流动分隔区内的中心。在一个实施方案中，中心定位的液滴与每个开口间隔一定长度(LE)。在一个实施方案中，部分基于微液滴中所包含的流体的聚集体积、与流动分隔区接触的周围环境的温度和压力以及长度LE来选择流动分隔区的高度(h)。在一个实施方案中，选择高度h，以创建流动分隔区内的蒸气压力，该蒸气压力降低微液滴蒸发的速率。不被理论所限定，但是当微液滴蒸发时，由蒸发形成的蒸气创建了气相密封，与通常暴露于周围环境，微液滴所经历的速率相比，所述的气相密封降低蒸气发生时的速率。在一个实践中，应该理解的是对于水性溶液，水的某些级份将蒸发进入气相中。但是，蒸发的程度可以通过选择(i)合适的流动通道的深度和几何形状；(ii)合适的滴液体积；以及(iii)合适的微液滴阵列几何形状来预测和合理地控制。通过正确地选择参数，由于流动通道中的蒸气压力以及由此增加的湿度，微液滴将不会蒸发。这提供了气相密封，其类似于化学密封，而且替代了使用液相覆盖流动分隔区，微液滴保持在气相中，例如空气。与液相相比，气相的益处在于许多大生物分子(蛋白质、DNA、脂质等)不分配进入空气中，这是因为它们的沸点显著高于水。与化学密封不同，气相密封允许反应剂容易地被引入在阵列上，而不必除去油相。
对于其中流动分隔区储存停留在平坦的基底上的微液滴(通过表面张力原位保持并整合至流动通道中)的实施方案，可以通过将阵列与液体接触，然后收回液体，来建立气相密封。在液体收回时，阵列将保持微液滴，并且流动通道将充满例如空气，由此建立气相密封。因此，本发明所述的系统和方法除此之外提供了嵌入流动通道中的基于表面张力的微液滴阵列，其中流动通道的几何形状与阵列的几何形状匹配，例如将蒸发降低至某一级份以下，例如低于5％。
附图简述
通过下文进一步的描述，并参照附图，将更全面地理解本发明的上述和其他目的及益处，其中：
图1描绘了具有大量微液滴26的流动分隔区18的一个实例。草图未按比例绘制；
图2描绘了图1中流动分隔区18的末端的一个实例。草图未按比例绘制；
图3描绘了流动分隔区18的示例图，其具有形成气相密封的蒸气相。草图未按比例绘制；
图4描绘了将流体由流动分隔区收回以创建气相密封的过程的示例图。绘图为在操作流动系统时所获得的亮视野显微照片的摘录，参见实施例1-5。亮视野显微照片的比例尺为20μm；
图5描绘了亲水性特征14的示例图，所述的亲水性特征14包括(i)平坦的特征；(ii)在疏水性基底16中形成凹陷的特征；以及(iii)包含由疏水性基底上凸起的特征，其中所述的凹陷包含亲水区。草图未按比例绘制；
图6描绘了与固体支持体接触的液体液滴的实例。在该实例中，草图上示出以下方面的实例：(i)在气体气氛中，停留在疏水性基底上的液体液滴的接触角(γ)；(ii)圆形的平坦亲水性特征的半径(RD)；(iii)停留在圆形的平坦亲水性特征上的液体液滴的接触角(α)；以及(iv)对于圆形的平坦亲水性特征，最大液滴体积的几何形状的界定。草图未按比例绘制；
图7描绘了制备平坦的亲水性特征(被疏水性基底包围)的图案的2个示例性基于光刻的过程。所示的步骤包括：
A—提供亲水性晶片基底；
B2—光敏薄膜涂层的沉积；或B1—晶片的同质表面改性；
C2—涂层的UV暴露和显影；
C1—光敏薄膜涂层的沉积，然后进行C1’—涂层的UV暴露和显影；
D2—晶片的疏水性表面改性；或D1—疏水性层的选择性蚀刻；
E—薄膜涂层的去除，从而取得F—亲水性特征的平坦的图案。
图8示意性地提供了通用数字计数测量的实例，其中样品中的分析物的浓度是通过分析展示阳性信号的分隔区的数量而获得的；
图9提供了基于平坦的亲水性特征的SELMA过程的示例性草图。在步骤(A)中，得自样品的分析物在单一的步骤中结合，从而捕获位于亲水性特征上的探针。在步骤(B1)中，存在于大体积液体中的捕获探针(捕获探针部分2)与得自样品的分析物结合，由此在步骤(B2)中，导致分析物/捕获探针部分2复合物形成。步骤(B3)在B2之后，并且显示分析物/捕获探针部分2复合物与停留于固体支持体上的捕获探针(捕获探针部分1)结合。捕获探针部分1和2彼此识别，并由此在固体支持体上形成捕获探针部分1/捕获探针部分2/分析物复合物，因此将分析物固定化在亲水性特征上。在步骤(C)中，将标记试剂加入捕获探针/分析物复合物中，例如由此形成捕获探针/分析物/标记试剂复合物。在步骤(D)中，捕获探针/分析物复合物通过标记试剂的第一部分(标记试剂部分1)进行标记。在步骤(E)中，捕获探针/分析物/标记试剂部分1复合物随后被标记试剂的第二部分(标记试剂部分2)进行第二标记。在步骤(F)中，形成功能捕获探针/分析物/标记试剂复合物。在步骤(G)中，在亲水性特征的表面上形成液体液滴。液滴包含检测试剂，并且通过气相密封而免于蒸发。在步骤(H)中，通过处理标记试剂将检测试剂转化成分子报告子。草图未按比例绘制；
图10提供了示例性流动系统的草图。流动系统由包含5个功能元件的长方形板组成。每个元件都用数字标记，并且通过虚线正方形包围。元件1为液体出口，其与提供抽吸的压力源连接。元件2为流动分隔区。元件3为液体入口，其将流动分隔区与液体加载垫连接。元件4为液体加载垫，其成型为用于液体反应剂的容器。元件5为滴落区域，其呈现被疏水性基底围绕的亲水性特征的图案。液滴区域存在于流动分隔区的底部。草图未按比例绘制；
图11示出蒸发与流动通道/液滴/阵列的几何形状之间的理论关系的实例。(A)用于阵列的Eqn.17的图，其中液滴半径为2.5μm，并且比例因子为N＝4和当温度升高时，以及当流动通道的高度由100μm增加至1500μm时，蒸发的级份将增高。(B)用于最大高度(hMAX)的Eqn.18的图，其中在35℃以及对于多种阵列/液滴的几何形状而言，最大高度(hMAX)为最大允许蒸发级份(θMAX)的函数。(C)用于流动通道的Eqn.17的图，其中所述的流动通道展示高度100μm，比例因子并且保持在35℃。相邻液滴之间更大的间距(更大的N值)导致更高的蒸发的级份，而更大的液滴的尺寸减少蒸发；
图12证明对于多种流动通道几何形状和温度而言，在气相密封下的抗蒸发微液滴和液滴稳定性的实例。亮视野显微照片显示在流动通道中形成的液滴，其中所述的流动通道展示高度(A)2000μm、(B)800μm和(C)150μm。对于A-C，阵列参数是一致的，即，液滴半径RD＝2.5μm，凹陷与高度的比值而阵列行距N＝4。以相同的方式制备3种阵列：将水性溶液灌输至流动通道并由其中收回，将温度调节至25℃。在平衡时间30min后，获得显微照片，并且温度斜升(rampe)至35℃。在30min平衡后再次获得显微照片。在45℃，重复所述的过程。在面板A中，仅在25℃可以清楚地区分液滴。在更高的温度下，液滴蒸发。在面板B中，在25℃和35℃可以区分液滴，但是液滴直径由于蒸发显示收缩。在45℃，阵列由于蒸发和水-蒸气的再次冷凝而被大量破坏，这表明在获得显微照片时，流动通道/阵列未达到热平衡。在面板C中，液滴在所有的温度下均可清楚地区分，并且液滴直径显示未大幅改变。比例尺为20μm；
图13提供了定义(A)示例性流动通道28和(B)嵌入在流动通道中的示例性微液滴阵列30的参数的示例性草图。草图未按比例绘制；
图14提供了对于包含1pM DNA靶的校准样品而言，对应的一对亮视野(i)和荧光(ii)显微照片。荧光信号如实施例4中所述鉴定，并使用白色圆形进行标记。将荧光信号的位置施加于亮视野显微照片中，并以黑色的圆形显示。显而易见的是荧光信号的位置对应于液体液滴的位置。比例尺为10μm；
图15提供了由包含以下浓度的DNA靶((A)100aM、(B)1fM和(C)10fM)的样品得到的3个代表性荧光显微照片。计数各样品的荧光液滴的数量，并对阵列上存在的液滴的总数归一化，从而提供荧光液滴的百分级份(percentwise fraction)，即，阳性级份。对于包含100aM DNA靶、1fM DNA靶、10fM DNA靶的样品以及不包含DNA靶的对照样品(D)绘制阳性级份。柱状图上的值表示对于各样品，由5个检测实验收集的平均值。误差棒表示对于5个相同实施的试验，阳性级份的标准偏差；
图16提供了包含100aM靶DNA的样品的一系列荧光显微照片，如实施例5中所概括。在该系列中的第一显微照片(i)是在第一检测步骤之后获得的，该系列中的第二显微照片(ii)是在第二检测步骤之后在相同的位置获得的，该系列中的第三显微照片(iii)是在第三检测步骤之后在相同的位置获得的。
图17提供了用于数字计数样品中一种或多种分析物的示例性流动系统(10)的截面草图，其中所述的流动系统(10)包含显示亲水性特征(14)的图案的支持体(12)。该图案嵌入疏水性基底(16)中、放置疏水性基底(16)上或者被疏水性基底(16)包围，并且嵌入在流动分隔区(18)中，其展示开口(20)。每个亲水性特征都具有附着在表面上的捕获探针(22)。支持体分成2个区域(24)，每个区域都呈现特定类型的捕获探针。草图未按比例绘制。定义
在本发明的内容中，术语“数字计数”是指其中将样品的特定成分以有限浓度分配至分隔区中，使得分隔区的数量大于特定样品成分的数量的任何分析。按照这种方式，可以根据各分隔区是空的(值0)还是加载的(值1)将二进制/数字值分配给各分隔区。在该内容中，加载的是指包含至少一种特定的样品成分的分隔区，而空的是指不包含特定的样品成分的分隔区。当基于由特定的样品成分本身来源的特定信号或者由辅助检测反应剂(其与存在特定的样品成分缀合)来源的特定的信号，评价加载的和空的分隔区的数量时，发生数字计数。
在本发明的内容中，术语“数字计数测量”是指上文定义的数字计数过程，但是进一步包括数字计数结果的任何数学处理或校准，从而赋予所有分隔区中存在的特定的样品成分的绝对数值。这可以包括(i)说明以下事实：加载的分隔区可以包含相同样品成分的1、2、3个等等拷贝；或者(ii)说明以下事实：加载的分隔区可以错误地分类成空的，反之亦然，这是由于信号生成过程中的缺陷。数字计数测量的实例包括数字聚合酶链式反应(dPCR)、单酶联免疫吸收测定法(sELISA)或者数字单酶联免疫吸附测定法(dELISA)。数字计数测量过程的草图概括于图8中。
在本发明的内容中，术语“SELMA”作为单酶联分子分析的缩写，并且是指特定的一种数字计数测量。在SELMA中，数字计数测量发生在流动系统中，其中液滴的分隔区以图案形式组织，并且特定的样品成分在分隔区内成为固定化的/被捕获的。按照这种方式，可以使样品成分经过多个反应步骤而不损失，其中每个反应步骤均由溶液或反应剂的浸渍以及由流动系统中收回组成。示例性SELMA过程的草图在图9中提供。
在本发明的内容中，“亲水性特征”是指具有第一组材料性质的结构，该结构被具有另一组材料性质的固体基底围绕或支持。可以调节结构和固体基底的材料性质，使得所述的结构比固体基底是更加可润湿的。换言之，与固体基底相比，构成所述的结构的材料展现出与水形成更小的接触角。所述的结构可以通过化学和/或物理手段界定。非限定性的一组可能的结构包括(i)封闭的平坦的区域，其由比围绕的基底更具有亲水性的材料构成；以及(ii)在围绕的基底上形成的凹陷、凸起或它们的组合，其中一个或多个侧面由比围绕的基底更具亲水性的材料组成。示例性亲水性特征的草图在图5中提供。在SELMA的内容中，可以例如通过提供用于分析物捕获的不同的化学功能性，以及通过提供用于信号生成和检测的液滴的图案，操作亲水性特征，从而呈现用于数字计数测量的合适的反应分隔区。
在本发明的内容中，术语“平坦的亲水性特征”是指其中疏水性基底是平坦的并且嵌入在疏水性基底中的亲水性特征是平坦的设计。平坦性的理想情况概括于图5中，但是对于实际应用而言，平坦性必须根据表面粗糙度进行界定。例如因为疏水性基底和亲水性特征可以由不同的材料形成，所以在疏水性区域和亲水性区域之间的高度可以具有微小的差异。在一个实施方案中，认为亲水性特征是平坦的合适的标准应该是疏水性区域和亲水性区域之间的高度差(Δh)(备选地，表面粗糙度)与特征特征的尺寸相比，应该是可忽略的。在半径为RD的圆形亲水性特征的情况下，标准可以为RD>>Δh。在一个实施方案中，展现Δh值小于20nm的特征被认为是平坦的。
在本发明的内容中，术语“接触角”是指在液体/蒸气/固体界面处测量的特征角。在其中液体液滴以气相形式沉积在固体表面上的内容中，通过线上(on the line)某点的液体测量接触角，其中液体/蒸气界面与固体界面相遇。在固体表面与液体界面的切线之间测量所述的角，如W.C.Bigelow,D.L.Pickett和W.A.J.Zisman在“Oleophobic monolayersI:Films adsorbed from solution in non-polar liquids”published in Journal ofColloid Science,vol.1,pp.513-538(1946)(DOI:10.1016/0095-8522(46)90059-1)的著作中所定义。示例性接触角的草图在图6中提供。
在本发明的内容中，术语“RH”是指“液体的气体成分的相对蒸气饱和度”，其是术语“相对湿度”的泛化。相对湿度定义为水的分蒸气压(PW)与大气中水的饱和压力(PSAT)之间的比值，即，RH＝PW/PSAT。饱和压力在本发明中定义为与液态水形成热平衡的水蒸汽所赋予的分压。RH值可以泛化，从而包括除了水以外的其他液体。在这种情况下，RH仍等于PW /PSAT，但是此时PW被理解为给定液体的气体成分所赋予的分压，而PSAT被理解为与给定液体形成热平衡的气体成分所赋予的分压。分压是指这样的情况，其中气相由几种气体物质构成。RH因此可以被视为相应气相的蒸气饱和度水平的指示。对于RH＝0，气相不包含液体的任何气体成分，而对于RH＝1，气相抽吸了液体的气体成分的最大可能的内容物。
在本发明的内容中，术语“RHI”是指“液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度”。当使用术语“液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度”时，则其是指这样的情况，其中将发生改变，并因此其中仍尚未建立热平衡。例如如果将液体1(具有PSAT的特征饱和压力)放置于包含气相的封闭的环境中，其中液体1的气体成分的分压为P1，那么如果P1<PSAT，液体将蒸发。因为液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度是在发生任何改变之前计算的，所以液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度为RHI＝P1/PSAT。然而，一旦液体1开始蒸发，RH值将逐渐由RHI值增加，直至(i)RH＝1，由此使气相饱和；或者(ii)所有的液体均蒸发。
在本发明的内容中，术语“最大液滴体积”是指如果在最佳的条件下制备时可以支持单一亲和性特征的最大液体体积。在液体从液滴蒸发的内容中，则参照最大液滴体积来计算蒸发的液体的体积级份。用于平坦的圆形亲水性特征的示例性最大液滴体积的草图在图6中提供。
在本发明的内容中，术语“聚集最大液滴体积”是指通过将包含大量液滴的图案的最大液滴体积加在一起而获得的体积总和。在液体由所述的图案蒸发的内容中，参照聚集最大液滴体积来计算蒸发的液体的体积级份。
在本发明的内容中，术语“样品”是指生物或化学材料的集合，其可以经过或未经过实验室处理。样品可以呈现液体或固体形式，并且可以包含特定的成分，其起到用于数字计数的输入的作用。
在本发明的内容中，术语“分析物”是指特定的样品成分，其可以用于数字计数测量中。分析物是生物或分子本性的，并且将(i)与其余的样品材料分离，和/或(ii)在数字计数处理过程中分开操作。
在本发明的内容中，术语“捕获探针”是指能够识别并结合分析物的特定区域的分子本性的化学或生物化学试剂，例如将分析物保留和/或限制在反应分隔区中。
在本发明的内容中，术语“标记试剂”是指能够识别和结合分析物的特定区域的分子本性的化学或生物化学试剂。标记试剂的结合区域不同于捕获探针的结合区域，从而在数字计数测量过程中，可以建立捕获探针/分析物/标记试剂复合物。此外，除了一种或多种分析物结合模式以外，标记试剂包括一种或多种检测模块。术语标记试剂可以进一步指一种或多种试剂，当该试剂结合在一起时，其可以提供分析物结合模式和检测模块。
在本发明的内容中，术语“检测模块”是指能够介导可通过检测器检测的信号生成的生物化学、化学、生物或物理部分。信号在本性上可以是光学、电学或磁性的。此外，检测模块可以依赖于检测试剂，从而取得信号生成。
在本发明的内容中，术语“检测试剂”是指化合物，通常为分子本性的，当其与相容的检测模块接触时，可以改变化学或物理状态。检测试剂的状态的改变可以通过合适的检测器记录并转换成信号。此外，发生状态改变的检测试剂可以称为报告分子或分子报告子。
在本发明的内容中，术语“可检测浓度”或“最低可检测浓度”是指局限于反应分隔区内的分子报告子的最低浓度，其可以通过合适的检测器检测。为了使浓度是可检测的，由分子报告子得到的信号应该超过检测器的噪声水平。通常，更高浓度的分子报告子往往产生检测器记录的、相应的更高的信号。
本发明的具体实施方案
本发明公开了用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统，其包括：在疏水性基底中或疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴。在一个实施方案中，流动分隔区被构造用于支持减少各个纳升-至-阿升液滴的蒸发的气相密封。在一个实施方案中，气相密封将各个纳升-至-阿升液滴的蒸发减少至最大液滴体积的小于50％。
在本发明公开的实施方案中，流动系统包括在疏水性基底中或在疏水性基底上提供亲水性特征的图案的液滴区域，从而能够形成抗蒸发的气相密封的纳升-至-阿升液滴。
在本发明公开的实施方案中，流动系统包括重叠液滴区域的一个或多个流动分隔区，例如流动通道，从而使液体能够与亲水性/疏水性图案接触。
在本发明公开的实施方案中，流动系统包括用于供应流动分隔区的液体加载垫以及具有液体和反应剂的液滴区域。
在本发明公开的实施方案中，流动系统包括连接流动分隔区和液体加载垫的液体入口。
在本发明公开的实施方案中，流动系统包括连接流动分隔区与提供抽吸的压力源的液体出口，并由此介导液体驱动通过流动分隔区。
在本发明公开的另一个实施方案中，流动系统包括至少5种不同的元件，从而发挥单分子数字计数装置的功能，还参见图10。
这些元件如下：
·提供亲水特征的图案的液滴区域，其中所述的亲水性特征被疏水性基底
包围，从而能够形成抗蒸发的气相密封的纳升-至-阿升液滴；
·重叠液滴区域的一个或多个流动分隔区，从而能够使液体与亲水性/疏
水性图案接触；
·使用液体和反应剂供入流动分隔区的液体加载垫；
·连接流动分隔区和液体加载垫的液体入口；
·连接流动分隔区和提供抽吸压力源的液体出口，并由此介导液体驱动通
过流动分隔区。
上述提及的5种特征定义了示例性流动系统，其中通过由入口至出口的压力下降的手段将液体驱动穿过流动分隔区。不采用提供抽吸，可以将加载垫中的液体反应剂推动通过流动通道。这需要加载垫的一侧与压力源连接，而另一侧与液体入口连接。在这种情况下，液体出口不需要与压力源连接。驱动液体流动的备选手段是通过重力，在这种情况下，不需要压力源；或者通过双向电泳驱动，这需要电极嵌入在流动通道中。在本发明公开的实施方案中，液体驱动是抽吸驱使的。
如本领域那些技术人员已知的那样，相似的功能流动系统可以通过多种不同的方法制造。这些方法包括但不限于：
1.使用计算机数控(CNC)铣削，注射成型，热模压印或3D打印，从而
在固体基底上制造流动分隔区。
2.采用与CNC铣削、注射成型、热模压印或3D打印相容的任何固体基底。
3.由一种或多种成分生产流动系统，随后将成分粘合(bonding)在一起，
从而取得所需的几何形状或功能性。粘合技术包括压敏粘附膜、液体粘合
剂的喷涂、热粘合、超声波焊接或激光焊接。不采用粘合技术，可以将单
一的成分以机械、电机或磁性方式夹住，从而生产最终的组件。对于用于
微流体应用的粘合和制造工艺的综述，参见Temiz,Y.,Lovchik,R.,Kaigala,
G.V.和Delamarche,E.在“Lab-on-a-chip devices:How to close and plug the
lab”published in Microelectronics Engineering,vol.132,pp.156-175(2015)
(DOI:10.1016/j.mee.2014.10.013)中的综述。
如本发明所公开，基底上的亲水性特征被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴，每个液滴都具有最大的液滴体积。亲水性表面可以是能够保持具有最大液滴体积的液滴的任何种类。即，只要最大体积的液滴保持在亲水性特征上，亲水性特征则可以被构造用于支持这种液滴。
在本发明公开的实施方案中，液滴区域由亲水性特征的图案组成，其中所述的亲水性特征被疏水性介质所包围。在这种实施方案中，亲水性特征的几何形状、液体的物理/化学性质以及疏水性基底决定了最大液滴体积，其中单一的特征能够保持，使得液体不会接触周围的疏水性介质。凭实验确定最大液滴体积的一种方式是将增加量的液体沉积在初始干燥的亲水性特征上。液体沉积可以借助于自动化微分配器实施，或者在微米尺寸的特征上，可以借助于压力驱动的微操作器实施，但是应该在加湿的室中进行，这样不能发生蒸发。此外，借助于显微镜，可以测量沉积的液滴的印迹。因此，一旦测量的印迹超越亲水性特征所界定的周边，则可以达到并超过最大液滴体积。
除了实验方法，还可以由简单的理论模型评估最大液滴体积。在这种情况下，假设亲水性特征为半径RD的圆形，并且当液体与疏水性介质接触时，液体展现出接触角γ，而且液滴停留在平坦的表面上，参见图5-6。进一步假设，液滴足够小，使得重力不显著地影响液滴的形状。当液体沉积在亲水性特征上时，其分散至周边，并且液体将由此形成接触角α。接触角α定义为这样的角：液滴表面的切线与在周边处平坦的亲水性表面形成的角。当液滴的体积增加时，α也增加，但是仅达到某一点。如果α超过γ，对于液滴扩散至疏水性介质上，并由此超越亲水性周长在能量上是更有利的。结果，在最大液滴体积，α等于γ，并且体积(VD)可以通过冠状球形(capped sphere)的几何形状描述而获得如下：
对于足够接近90°的γ值而言，Eqn.1可以通过假设液滴为半球冠而进一步简化，由此展现VD值为
在另一种情况下，其中亲水性特征被成型为半径RD且深度d的圆形腔，则通过将腔体积加入Eqn.1中可以发现最大体积。
在一个实施方案中，亲水性特征被构造用于支持纳升-至-阿升液滴，并且液体展现出在疏水性基底上的接触角为至少90°且至多150°。在一个实施方案中，亲水性特征被构造用于支持半径(RD)为至少0.1μm且至多100μm的纳升-至-阿升液滴。
尽管可以采用多种方法制造被疏水性介质包围的亲水性特征的阵列，但是最容易应用的一种方法涉及光刻术。光刻术能够精确地生产微米尺寸的化学和/或物理结构，并且依赖于平的晶片基底(具有光敏薄膜)的涂层。在随后的步骤中，通过提供预期图案的光掩模暴露于高强度的紫外光而选择性地除去所述的薄膜。示例性制造过程的草图在图7中提供。但是，由于UV光刻术的光学分辨率，精确地生产低于0.1μm的特征在技术上仍是挑战。在其中图案化的亲水性特征为平坦的圆形并且展现RD值为0.1μm的情况下，根据Eqn.1，对于γ值为90°而言，相应的最大液滴体积为VD＝2.9阿升，并且对于γ值为150°而言，相应的最大液滴体积为VD＝33.1阿升。
展现出RD值降低至0.1μm的亲水性特征可以形成高密度的阵列，在单分子数字计数的内容中，其可以转化成(i)扩大的动力学范围；以及(ii)更快速的检测时间。
扩大的动力学范围是由于以下事实：对于数字计数而言，测量中存在的液滴分隔区的数量决定了信号的线性。直到所有的液滴分隔区均产生信号，则认为该信号是线性的，即，阵列已经饱和。例如覆盖10mm x 10mm的规则长方形阵列(RD值为0.1μm并且特征间间距为0.4μm)应该容纳625000000个液滴，由此展现出跨越大约8个数量级的线性动力学范围。
更快速的检测时间依赖于以下事实：对于数字计数而言，分子报告子通常由酶或酶缀合系统产生。在这种实施方案中，单一的酶通过将非荧光的/化学发光的/比色分子重复转化成发荧光的/发光的/吸光的物质(分子报告子)而产生信号。报告分子的最低可检测浓度取决于液滴体积；假设恒定的酶周转率，体积越小，达到所述的浓度越快。
在另一方面中，在纳升范围内展现出更大体积的液滴(例如对于γ值为90°而言，RD值为100μm的圆形平坦的亲水性特征具有最大体积2.1纳升，而对于γ值为150°而言，RD值为100μm的圆形平坦的亲水性特征具有最大体积33.1纳升)在以下情况下是有利的：(i)其中不需要大的动力学范围，例如预计分析物浓度太低以至于不能使阵列饱和；或者(ii)其中亚纳升(sub-nanoliter)液滴不能被成像传感器分辨。
备选地，纳升体积的液滴可以用于使更大的生物实体(例如细胞、细胞碎片、病毒颗粒、囊泡、细胞器等)形成阵列并组织，然后测量。
在一个实施方案中，亲水性基底为玻璃、亲水性聚合物或金属氧化物化合物。
亲水性基底的主要要求在于液体应该在其上形成接触角，该接触角小于在疏水性基底上形成的接触角。此外，基底优选地应该顺应微制造方法，例如光刻术、软刻术或微压印。二氧化硅及其纯的和掺杂的变体是此目的的合适的选择，不仅因为其是作为光刻术的良好表征的基底，而且还因为大量化学和生物化学表面功能化方案都是可利用的。例如有广泛的市售可得的硅烷化合物(例如参见Gelest Inc.公开的“Silane coupling agents,version 3.0”)，其可以用于二氧化硅表面的直接的衍生化。尽管硅烷化对于在表面上呈现硅烷醇基团的材料(例如二氧化硅)是最高效的，但是许多其他的材料可以顺应这种工艺。这些材料包括但不限于铝、硅酸铝、硅、铜、锡、滑石、无机氧化物(例如氧化亚铁、二氧化钛、氧化铬)、不锈钢、铁、镍和锌。
在基底的硅烷衍生化时，新的化学功能性被引入至材料中，因此，液体在官能化后的基底上展现出改变的接触角。鉴于此，最初亲水性的基底(例如玻璃)可以通过使用疏水性硅烷部分(例如氟碳硅烷)的官能化而成为疏水性的。备选地，最初轻微亲水性的基底可以通过使用高度亲水性硅烷部分(例如聚(乙二醇)硅烷)的官能化而成为甚至更高的亲水性的。这是本领域那些技术人员公知的，因此本文件中所指的液体/固体接触角仅涉及任何初始基底材料的任何表面改性后的液体/固体接触角。
无机基底的硅烷衍生化仅构成了将新的化学功能引入基底中的多种过程中的一种。另一种方法包括使单硫醇盐化合物吸附在金基底上，从而产生自组装的单层。而另一种方法(其顺应于软的有机基底，例如塑料)为等离子体聚合，其中所需的化学聚合物薄层沉积在由相应的单体的等离子体得到的塑料表面上。
亲水性特征的构造可以涉及以下的至少一种：
·构成亲水性特征的材料的亲水性；
·构成疏水性基底的材料的疏水性；
·所述的特征的面积；以及
·所述的特征的厚度。
在一个实施方案中，最大液滴体积为通过Eqn.1计算的VD。因此，可以提供亲水性特征，使得该体积的液滴可以保持在各个亲水性特征处。
关于如何使最大液滴体积达到单个亲水性特征的特定构造的实例，可以实施以下步骤：
1.首先，为手头上的应用选择合适的液滴体积，参见上文提及的关于液
滴体积的讨论。
2.接着，针对本发明应用中施加的液体，获得固体/液体接触角γ。
3.然后，决定亲水性特征的所需几何形状，即，圆形、正方形、六角形
等。所述的形状可能取决于生产图案所采用的制造过程。
4.计算由步骤3得到的特定形状的周长与相应的最大液滴体积之间的关
系。在圆形的情况下，所述的关系在Eqn.1中提供。对于其他的几何形
状，所述的关系必须以相似的方式推导得到，如在Eqn.1的推导中所述。
5.获得与由步骤4中的关系得到的所选液滴的体积相对应的周长。在圆形
的情况下，足以解答Eqn.1，求得RD。
在另一个实施方案中，流动分隔区(其中保留有亲水性特征的图案)的构造必须确定，以提供功能气相密封，从而减少从微米尺寸的液滴的蒸发。例如如果阿升水性液滴在环境条件下沉积在基底上，由于高的表面/体积比，液滴将在几秒内蒸发。因此，对于其中必须测量液滴内容物的应用而言，液滴必须在延长的时间内是稳定的，因此蒸发可以极大地减少或完全消除。
在本发明公开的另一个实施方案中，提供了容纳亲水性特征的图案的流动分隔区，所述的亲水性特征被构造用于支持上文所述的特定最大体积的液滴，其中所述的流动分隔区展现出体积VC，并且携带液滴的亲水性图案的最大可得聚集体积记录为VDA。如果所述的图案容纳大量的液滴(ND)(每个液滴都展现出相同的最大液滴体积(VD))，则VDA＝VD·ND。如果所述的图案容纳变化尺寸的液滴，则相应的VDA值如下给出：
其中VD,i为在所述的图案上第i个液滴的最大体积。因此，液滴的相应的摩尔量(nDA)则为：
其中MW为液滴的摩尔重量，并且ρL为液滴的密度。如果所有的液滴都完全蒸发，并且假设蒸发的蒸气作为理想的气体，那么所得的蒸气将在流动分隔区内产生相应的蒸气压力(PVAP)，如下给出：
其中R为摩尔气体常数，T为温度。然而，完全的液滴蒸发仅对于VC>>VDA是可能的，这是因为在这种情况下，完全液滴蒸发所产生的蒸气量不会显著改变流动分隔区的初始蒸气压力。但是对于接近VDA的流动分隔区体积而言，液滴蒸气会增加流动分隔区内的压力，直至饱和蒸气压力(PSAT)建立起来。一旦达到PSAT，则进一步的蒸发是不可能的。PSAT值(即，在热动力平衡，由液体的气体成分产生的蒸气压力)通过如下Clausius-Clapeyron等式给出：
其中ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力。
因此，能够蒸发的液体的最大允许摩尔量(nVAP)可以由如下的理想的气体等式获得：
对于nVAP≥nDA而言，发生完全的液滴蒸发。用于最大流动分隔区体积(VMAX)(即，其中液滴不完全蒸发的最大可能的流动分隔区体积)的表示方式现在可以如下获得：
因此，能够容纳功能的且长期稳定的液滴图案的任何流动分隔区都应该被构造成使得VC<VMAX。
Eqn.7中的表示方式是指平衡状态。达到平衡的途径有多种，而且可以描述为：(i)亲水性特征的图案与液滴接触，从而产生液滴的图案，每个液滴最初都展现出最大可能体积；(ii)液体将从液滴蒸发，直至在流动分隔区内建立饱和压力；以及(iii)现在由于蒸发而具有减小的体积的液滴保持稳定。
重要的是，所述的图案必须与液体以合适的方式接触，从而产生功能气相密封。例如通过驱动液体塞(liquid plug)穿过所述的图案，由此使液体微液滴沉积在亲水性特征上。一旦液体塞与阵列上所有的特征接触，液体入口和出口必须被堵塞，从而提供封闭的环境。这可以通过多种方式取得，例如(i)通过在液滴入口和出口处安装阀；或者(ii)通过使液体流动同步，使得第一液体塞之后跟随第二塞，第一液体塞被驱动至液体出口，然后停止，第二液体塞被驱动进入液体入口，由此使用液体堵塞入口和出口。按照这种方式，由液滴得到的蒸发的液体将在流动分隔区内建立饱和压力，并因此成为抗蒸发的。这将在实施例1和2中举例说明。
此外，在Eqn.7和以下的讨论中，假设在其中制备流动系统的气相在将亲水性特征的图案与液体接触之前不包含任何蒸发的液体(即，液体的气体成分)。但是，并非总是这种情况。例如在其中液体为水并且气相为大气的情况下，空气最初可以包含水蒸汽的特定级份。对于大气而言，相对湿度(RH)提供相对于饱和压力的水蒸汽压力，即RH＝PW/PSAT，其中PW为大气中水蒸汽的分压。如果大气的初始相对水蒸汽饱和度(RHI)等于0，则空气将不具有水蒸汽内容物，因此可以使用Eqn.7。另一方面，如果RHI>0，Eqn.7需要修改，因为更少的液滴需要蒸发以建立饱和压力，因此参见Eqn.6：
这将转换为以下解答方式，求得VMAX：
在本发明的内容中，尽可能一般地理解RHI，即，因此不仅涉及水，而且涉及任何其他的液体(参见上文定义的部分)。在这种情况下，RHI的更通常的定义为RHI＝PL/PSAT，其中PL为施加液体的气体成分的初始蒸气压力。PL值是指其中使用流动系统然后形成液滴阵列的气相。一旦在流动分隔区内达到饱和压力，则将建立气相密封。因此，在流动分隔区内的局部，RH值将由初始值升至1，表明完全饱和以及功能气相密封。
在一个实施方案中，本发明公开的流动分隔区具有体积(VC)，其中体积(VC)大于所有的液体纳升-至-阿升液滴的聚集最大液滴体积(VDA)，并且小于VMAX，如Eqn.9中计算。
在本发明公开的实施方案中，为了获得用于数字计数分析物的流动系统的最佳构造(在疏水性基底中或在疏水性基底上包含亲水性特征的图案)，必须考虑：(i)单个亲水性特征的构造；(ii)所述的特征的图案的构造；以及(iii)其中存在图案的分隔区的构造。综上，这3种构造提供了通过气相密封能够保持液滴的抗蒸发图案的流动系统。单个亲水性特征的构造上文已经概述。用于测定流动系统的构造的示例性下一步骤如下：
1)确定应用所需的液滴的总数。如上文所讨论的那样，液滴的总数决定了测量的动力学范围，因此应该与分析物的预期浓度范围匹配。
2)所述的图案的VDA值现在可以由Eqn.2计算，因此提供流动分隔区体积的更低的界限，即，VC值。
3)测定所施加的液体的公称摩尔重量(MW)和体积密度(ρL)，以及进行测量时的温度(T)和RHI值。对于参照温度、压力和蒸气焓使用一组合适的值，从而使用Eqn.9计算流动分隔区体积的VMAX值。例如对于水而言，在T0＝373K，P0＝1.0atm，其展示出ΔHVAP值为40.7kJ/mol。
4)确定亲水性特征的图案的特定排列，例如正方形晶格阵列、六角形晶格阵列、长方形晶格阵列、菱形晶格阵列等。优选的阵列几何形状通常通过制造方法测定。确定阵列的长度和宽度，从而容纳液滴的总数。
5)确定流动分隔区的几何形状，例如长方形通道、圆形通道、半圆形通道等。优选的阵列的几何形状通常通过制造方法测定。
6)使流动分隔区的几何形状成比例，使得总体积小于VMAX。其实例在实施例2中提供。简言之，在长方形通道的情况下，总体积以通道的宽度x长度x高度给出。通道的宽度和长度应该例如与阵列的宽度和长度匹配，因此高度是可变的。因此可以选择高度，从而提供小于VMAX的总体积。
在本发明公开的另一个实施方案中，提供了流动系统，其中亲水性特征为具有半径(RD)的圆形，并且其中单一亲水性圆形可以支持的最大液滴体积(VD)在Eqn.1中提供。
在一个实施方案中，各个纳升-至-阿升液滴的蒸发为各个纳升-至-阿升液滴的最大液滴体积的小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％。
对于流动系统的给定构造，即，指定的一组VC和VDA值，可以计算相应的蒸发的级份θVAP。蒸发的级份定义为蒸发形成气相的液滴体积级份，即，θVAP＝nVAP/nDA。将Eqn.3和Eqn.8带入该表示中得到：
如果假设θVAP值大于1，由于例如太大的流动分隔区体积、阵列上太少的液滴、太高的温度、太小的亲水性特征等，整个液滴阵列则蒸发。另一方面，如果θVAP小于1，因为完整的液滴(尽管展现出减小的体积)可以保持在亲水性特征上，则认为气相密封发挥功能。
原则上，可以使用本领域技术人员已知的、能够密封液滴以抵抗蒸发的任何气体。气相密封的实例为大气、氮气、氩气、氦气或它们的混合物。在一个实施方案中，通过大气、氮气、氩气或氦气提供气相密封。在另一个实施方案中，通过大气提供气相密封。
数字计数测量可以允许单一的分析物分子被直接检测，并由此计数，从而测定它们在样品中的浓度。数字计数测量可以用于数字聚合酶链式反应(dPCR)、数字酶联免疫吸附测定法(dELISA)或它们的变体中。对于dPCR，在反应分隔区中分离单一的核苷酸分析物，并使其经历聚合酶辅助核苷酸扩增以及扩增子的荧光标记。对于dELISA，在微胶体颗粒的表面上捕获单一蛋白质/肽分析物，使用酶缀合的抗体进行标记，在微观反应分隔区中分离，并提供检测试剂。当检测试剂被酶处理时，产生光学信号(例如荧光、化学发光、吸光)，这是由于反应分隔区的微观体积快速达到可检测浓度。数字计数测量的原理概括于图8中。
在本发明公开的实施方案中，为了使用本发明所述的流动系统实施给定分析物的数字计数测量，至少需要以下3个一般的步骤：(1)分析物捕获；(2)分析物标记；以及(3)分析物计数，例如参见图9中的草图。在步骤1中，得自样品的分析物被特异性地捕获在亲水性特征上。在步骤2中，使用合适的试剂，例如酶缀合物，特异性地标记捕获的分析物。在步骤3中，形成微液滴的阵列，使得液体包含检测试剂。在其中标记试剂为酶的情况下，检测试剂应该为用于酶的发荧光的/显色的/化学发光的底物。在处理底物的时候，在液滴中产生可检测的光学信号，其中所述的液滴最初容纳有标记试剂和检测反应剂。接着，可以通过阵列的光学成像来计数产生信号的液滴。
在一个实施方案中，流动系统包含用于一种或多种不同的分析物类型的一种或多种捕获探针，所述的捕获探针附着在亲水性特征上。在其他的实施方案中，不同类型的捕获探针排列在区域中。
本发明超过dPCR和微胶体辅助的dELISA的益处在于分析物可以被捕获，并且特异性地组织在亲水性特征上。当要(i)在单一测量中测量多种不同的分析物类型；以及(ii)如果需要重复测量时，上述情况是理想的。
在第一种情况下，不同的捕获探针可以被置于流动分隔区中的不同区域，使得对一种分析物类型具有特异性的捕获探针位于第一区域中，对另一种分析物类型具有特异性的另一种捕获探针位于第二区域中，等等。这是DNA和蛋白质微阵列研究领域内公知的策略，其中可以在单一测量中检测几百种靶分析物，例如参见Weinrich,D.等人在AngewandteChemie International Edition(2009),vol.48,pp.7744-7751.(DOI:10.1002/anie.200901480)中出版的标题为“Applications of Protein Biochips in Biomedicaland Biotechnological Research”的综述。
在第二种情况下，可以通过除去标记和检测试剂，并将它们再次引入流动系统中而重复数字计数。因为被捕获的分析物保持固定化在亲水性特征上，所以可以重复数字计数测量，从而改进例如信噪比，参见实施例5。这对于dPCR或dELISA都是不可能的，因为标记和检测试剂不能在未除去分析物的情况下被除去。
在一个实施方案中，用于一种或多种不同的分析物类型的一种或多种捕获探针通过连接体部分附着在亲水性特征上。在大多数情况下，连接体分子起到连接亲水性特征的硬质无机表面与软质有机捕获探针的作用。因此，连接体分子可以包含双重化学官能性，从而连接捕获探针与表面。连接体分子可以选择为聚(乙二醇)聚合物，其是挠性的、惰性的并且是亲水性的。它们还可以选择为线性烷烃链。聚(乙二醇)连接体可以制备成不同的尺寸/长度，因此在表面和捕获探针之间提供更大的分离，而烷烃链通常更短。其他连接体分子包括但不限于多肽或寡核苷酸。连接体分子上存在的化学官能性可以选自反应性化学官能团的多种选择，例如醛、炔、胺、叠氮化物、生物素、Boc/Fmoc-保护的胺、羧酸、环氧化物、酰肼、羟基、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、乙烯砜和它们的变体。
在一个实施方案中，超过一种类型的捕获探针附着在亲水性特征上，而不同类型的捕获探针排列在多个区域中。在一个实施方案中，捕获探针选自以下探针：寡核苷酸、蛋白质、肽或它们的合成变体。
在其中捕获探针为寡核苷酸的情况下，该探针能够捕获其他的寡核苷酸，其展现出对于捕获探针的互补序列。合成寡核苷酸变体例如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)(其展现出链入侵性质)还可以用于捕获单链或双链DNA。适体也可以用作捕获探针，从而能够捕获蛋白质或肽。此外，抗体或抗体片段可以用作捕获探针，从而介导蛋白质、肽或小分子的特异性捕获。
在一个实施方案中，具有亲水性特征基底的图案的疏水性支持体是平坦的。在另一个实施方案中，亲水性特征的图案包括其中亲水性特征以阵列形式排列的至少一个区域。
在一个实施方案中，亲水性特征以二次平面阵列组织，所述的特征被成型为具有半径(RD)的圆形，所述的阵列在相邻的特征之间具有行距(δ)，其中δ为至少3RD，所述的阵列沿流动方向延伸长度(LAX)，所述的阵列在垂直于流动方向上延伸长度(LAY)，所述的通道沿流动方向具有长度(LCX)，其中LCX大于或等于LAX，所述的通道在垂直于流动方向上具有长度(LCY)，其中LCY大于或等于LAY，所述的通道具有高度(h)，其为至少2RD且至多hMAX，其中hMAX由以下等式计算得到：
其中根据Eqn.1，θMAX为液滴的最大允许蒸发体积级份，并且VD(RD,γ)为最大液滴体积。为了达到Eqn.11，必须考虑Eqn.10，其将蒸发的级份(θVAP)表示为流动分隔区体积(VC)和液滴阵列的最大聚集体积(VDA)的函数。对于展现出上文提及的几何形状的流动分隔区，流动分隔区体积为VC＝hLCXLCY，而最大聚集液滴阵列的体积为VDA＝VD(RD，γ)LAXLAYδ-2。用于建立流动分隔区的功能构造以提供气相密封的一种方法是将液滴的最大允许蒸发体积级份设定为合适的值，例如θMAX＝0.05。接着，通过使流动分隔区高度作为唯一的可变参数，可以通过将VC＝VMAX＝hMAXLCXLCY、VDA和θMAX带入Eqn.10，以求得hMAX，由此得到Eqn.11中的结果，从而获得最大允许高度(hMAX)。
在一个实施方案中，亲水性特征的图案包括至少2个区域，而一个区域的阵列不同于另一个区域的阵列。
在其中亲水性特征被构造用于支持不同尺寸的液滴的情况下，应该使用与图案上最小液滴体积相对应的VD值实施Eqn.11中的hMAX的计算。按照这种方式，阵列上最小和最大液滴可以保持稳定而不会蒸发超过θMAX值的设定。
在一个实施方案中，用于亲水性特征的支持体位于流动分隔区的中心。
尽管在包含亲水性特征的阵列的流动分隔区中的中心位置通常是优选的，但是阵列的确切位置不影响之前计算的结果。这是由于该计算基于以下假设：在流动分隔区内建立热动力平衡，即，其中由亲水性特征支持的液体液滴得到的蒸发速率等于流动分隔区中蒸气冷凝成液滴的速率的平衡。然而，因为分隔区内蒸气的传输动力学，与分散定位的阵列相比，中心定位的阵列可以更快地达到平衡。
在一个实施方案中，亲水性特征的数量为至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少10,000,000。
在一个实施方案中，疏水性层为与基底共价接枝的分子单层。在一个实施方案中，疏水性层为化学吸收在金属基底上的分子单层。
在一个实施方案中，流动分隔区是通道成型的，并且在流动分隔区的相对末端的2个开口之间形成流动方向。在一个实施方案中，流动分隔区和开口在垂直于流动方向的截面中具有长方形形状。在一个实施方案中，在垂直于流动方向的截面中流动分隔区具有长方形形状并且开口具有圆形。
在本发明公开的一个方面中，提供了制备流动系统的方法。
为了提供对本发明的全面的理解，现在将描述某些示意性的实施方案，包括支持微液滴的阵列从而可以进行酶的sELISA分析的系统。然而，本领域的任一普通技术人员应该理解的是本发明所述的系统和方法可以适用于以及经修改而用于其他合适的应用中，并且这种其他的加入和修改不脱离本发明的范围。
图1描绘了用于支持大量的微液滴并具有降低的蒸发速率的系统的一个实施方案。具体而言，图1示出系统18，其中长方形流动分隔区容纳大量的微液滴。所述的微液滴被置于流动分隔区的底表面上。流动分隔区的各个末端对周围环境开放。
图2为流动分隔区的末端的剖视图。图2示出对于这种实施方案，在高度h的形状中，末端为正方形(通过垂直的箭头描绘)。返回至图1，显示微液滴阵列的各个末端与流动分隔区的末端间隔距离LE(通过双箭头显示)。
图1的流动分隔区为支持微液滴阵列的流动通道。可以使用任何已知的技术将微液滴插入流动通道中。所绘制的流动通道的维度通常可以通过图1理解，并且表征为通道的高度h，LA为被液滴阵列覆盖的流动通道的长度，LE为将微阵列与入口和出口分开的通道的长度(并且不支持微液滴阵列的任何部分)。考虑到流动通道的长度、高度和形状，可以计算流动通道的体积。一种此类计算的细节在实施例2中列出。
各个液滴基本上都是半球形的，并且可以模制成这样。半球形的液滴具有半径。滴基本上以标准的行距间隔开。虚线可以是线性阵列、正方形阵列或任何其他合适的排列。当然可以评估微液滴的阵列中所包含的液体的总聚集体积(作为半径和液滴数量的函数)。一种此类计算的细节在实施例2中列出。
一旦已知流动通道的几何形状，便可以计算可利用的体积。体积和平衡水蒸汽压力(PW)决定将蒸发的水量，如Clausius-Clapeyron等式所述。一种此类计算的细节在实施例2中列出。因为蒸气压力是通过从液滴蒸发的水产生的，由此使流动通道中的空气潮湿并饱和。结果，如果仅聚集液滴体积的小级份便足以建立平衡蒸气压力，则剩余的水体积将作为液滴保存在表面上。按照这种方式，潮湿的空气提供了气相密封，如图3所示(通过包围微液滴的虚线显示)。
针对溶液的某一体积，通过选择例如特定的高度h，蒸发的水量可以保持在大约5％，如图11B所示。
建立气相密封的过程示于图4的显微照片中。在此，水塞(a plug of water)从流动通道的一个末端驱动到另一个末端，留下良好界定的微米尺寸的水性液滴。在显微照片的左侧可以看见后退的水边(water-front)，并且可以在水边的右侧看见液滴的阵列。黑色箭头表明其中液体被驱动的方向。
应用
本文所述的发明具有许多可能的应用，这是本领域那些技术人员已知的，例如参见Witters等人的Digital Biology and Chemistry(DOI:10.1039/C4LC00248B,(Frontier)Lab on a Chip,2014,14,pp.3225-3232)。这些包括一类测定法，我们称其为单酶联分子分析(SELMA)。基于SELMA的测定法依赖于单一肽、蛋白质和/或寡核苷酸分子的操作和检测。
在一个方面中，本发明公开的流动系统可以用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法中。
基于SELMA的测量为数字计数测定法，其中分析物固定化在气相密封的液滴内部，并且其中分析物在一个或多个步骤中依次使用酶缀合的试剂进行标记。由于液滴的纳升-至-阿升级体积，单一的酶通过检测试剂的连续酶转化能够在几秒至几分钟内产生可检测的光学信号。在图9中提供关于示例性基于SELMA的测量的草图，并且在实施例4中描述SELMA的实验证明。
在本发明公开的一个方面中，提供了用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法，该方法包括在气相密封下，计数在大量的液体纳升-至-阿升液滴中所包含的分析物类型。
在本发明公开的实施方案中，气相密封在流动分隔区内建立能够减少微液滴的蒸发的蒸气压力。
在本发明公开的实施方案中，在流动系统中实施数字计数，所述的流动系统包括：在疏水性基底中或疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的纳升-至-阿升液滴。
在本发明公开的实施方案中，亲水性特征为具有半径(RD)的圆形，并且其中单一亲水性圆形可以支持的最大液滴体积(VD)如下：
其中γ为在疏水性基底上的液体接触角。
在本发明公开的实施方案中，气相密封将各个纳升-至-阿升液滴的蒸发减少至最大液滴体积的小于50％。
在本发明公开的实施方案中，本发明所述的流动系统用于本发明公开的方法中。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括以下步骤：(i)将疏水性基底中或疏水性基底上的亲水性特征的图案与包含一种或多种分析物类型的样品接触。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括以下步骤：(ii)在亲水性特征上捕获至少一种分析物类型。
在亲水性特征上可以捕获大量的分析物类型，其中所述的亲水性特征已经发生(生物)化学官能化，如之前更详细地描述的那样。例如为了特异性地捕获基于寡核苷酸的分析物，例如RNA、mRNA、病毒RNA、DNA、病毒DNA、细菌DNA、DNA/RNA复合物或蛋白质/DNA/RNA，必须施加展示对于分析物的互补寡核苷酸序列的基于寡核苷酸的捕获探针。为了特异性地捕获基于蛋白质或肽的分析物或其复合物，必须施加基于抗体或适体的捕获探针，其特异性地识别分析物的三级结构，即，抗原/抗体结合。可以使用特异性靶向分析物所展示的抗原的抗体以相同方式捕获包含完整生物实体或大分子组件(例如细胞、细菌、病毒、病毒样颗粒、纳米颗粒或细胞碎片)的分析物。备选地，上文提及的分析物类型可以不借助于捕获探针而被捕获，但是必须使微液滴的尺寸(即，VD值)与分析物的尺寸匹配，使得仅一种分析物能够保留在液滴中。
此外，可以使用介导捕获的辅助探针补充捕获探针，使得辅助探针首先特异性地结合分析物，然后特异性地结合表面上的捕获探针，由此起到绳索(tether)的作用，例如参见图9中的草图。
此外，所有上文提及的分析物类型可以通过使用异双功能化学交联试剂而非特异性地被捕获在亲水性特征上，使得交联试剂的一个末端与分析物结合，并且另一个末端与表面结合。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括以下步骤：(iii)使用对待检测的分析物类型具有特异性的标记试剂，标记至少一种被捕获的分析物类型。
可以以相同方式选择标记试剂作为捕获探针，从而介导分析物的特异性标记。例如如果分析物为寡核苷酸，则捕获探针和标记试剂都可以为寡核苷酸或其合成的变体。在这种情况下，捕获探针可以识别分析物上的一个特定的序列，并且标记试剂可以识别另一个特定的序列。标记试剂可以包含用于特异性识别分析物的一个模块，以及用于随后检测分析物的另一个模块。至少3种类型的标记试剂达到这些标准：酶缀合的寡核苷酸、酶缀合的蛋白质/肽或酶缀合的适体。分析物识别模块分别通过寡核苷酸、蛋白质/肽或适体提供，而检测模块通过酶提供。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括以下步骤：(iv)检测试剂流动通过所述的图案以及从所述的图案收回，从而产生纳升-至-阿升液滴的形式的单个液滴。
在形成包含检测反应剂的水性微液滴的情况下，可以在呈现标记试剂和检测试剂的液滴的子集中引发信号生成。在其中标记试剂包含酶的情况下，合适的检测反应剂为任何相容的酶底物，其能够响应于酶处理而生成光学信号。例如在其中所述的酶属于过氧化物酶类的情况下，合适的检测试剂包括ABTS(2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)、OPD(o-苯二胺二盐酸盐)、TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，以及以下商品名的产品Quantablu、QuantaRed、Amplex UltraRed或SuperSignal ELISA pico/femto。在其中所述的酶属于磷酸酶类的情况下，合适的检测试剂包括PNPP(p-硝基苯基磷酸盐)、4-MUP(4- 甲基伞形基磷酸酯)、BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑)，以及以下商品名的产品CSPD、CPD Star或Dynalight。在所述的酶属于半乳糖苷酶类的情况下，合适的检测试剂包括FDG(荧光素Di-β-D-吡喃半乳糖苷)、DDAO半乳糖苷(9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)、MUG(4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷)、ONPG(o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)、试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷)，以及以下商品名的产品Galacton-Star或Bluo-Gal。此外，可以使用任何ELISA相容的酶/底物对。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括以下步骤：(v)计数容纳标记试剂和检测反应剂的液滴的数量。
借助于成像装置(例如光学显微镜)最方便地执行展现光学信号的液滴的计数。使用显微镜，可以将单个液滴成像，并由显微照片的相对强度单位来评价它们的信号水平。在其中信号的本性是化学发光或荧光的情况下，可以使用荧光滤波器组记录所得的显微照片。此外，如实施例4所示，可以使用在相同位置获得的亮视野显微照片来补充荧光显微照片，从而验证液滴的位置和外观，并将其与荧光信号的位置相关联。
在其中信号的本性是比色的情况下，可以通过亮视野显微镜成像来记录所得的显微照片，从而评价单个液滴的吸光率、反射率或透光率。
在其中液滴阵列覆盖大面积使得单一显微照片的视野不能包含液滴的情况下，可以在多个位置记录多个显微照片，从而重新构建展示完整阵列的更大的显微照片。为了指导成像的重新构建(例如显微照片拼接)，可以将容易识别的微图案并入在阵列上。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括一次或多次重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括通过使用对待检测的第二分析物类型具有特异性的第二标记试剂，而不使用第一标记试剂，重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
在本发明公开的实施方案中，所述的方法进一步包括使之前的步骤中存在的标记试剂失活的步骤，然后重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
重复标记、加入检测反应剂和计数信号阳性液滴的步骤的能力是SELMA测量的独特征质，其具有至少2个益处：
首先，通过从之前的测量除去标记和检测试剂以及随后再次引入标记和检测试剂可以增加信噪比。这是由于以下事实：标记试剂可以非特异性地结合不存在任何分析物的亲水性特征的表面。非特异性地结合的标记试剂由此可以在计数测量中包含背景噪声，由此导致潜在的低的信号比。然而，由于非特异性的结合是在阵列上的随机位置发生的，而与分析物的特异性结合仅在存在分析物的阵列特征上发生，则可以通过重复测量来区分2种结合模式。在重复测量中，仅展现非特异性结合的液滴不能在每次重复测量时提供阳性信号，而展现特异性结合的液滴每次都可以提供阳性信号。按照这种方式，背景噪声可以显著地降低，由此得到更高的测量灵敏性。
接着，通过从之前的测量除去对分析物类型具有特异性的标记和检测试剂并且随后引入对另一种分析物类型具有特异性的标记和检测试剂，可以提供更高的复用能力。在这种情况下，每次重复测量时，都计数新的一组分析物类型。例如如果使用对10种不同分析物类型具有特异性的捕获探针将所述的阵列官能化，则通过重复测量10次(每次都引入新的标记和检测试剂)，则所有的10种分析物都可以定量。
在本发明公开的实施方案中，标记试剂是通过与表面结合的分析物分离而失活的，并且通过流动系统的冲洗而除去。
如本领域那些技术人员已知的那样，存在使分子探针失活的多种方法。在SELMA测量的情况下，最方便的方法依赖于从分析物释放标记试剂，同时保持分析物与捕获探针结合。一旦标记试剂分离，可以通过使用漂洗溶液冲洗流动通道而除去标记试剂。由于检测试剂不倾向于与阵列表面结合，所以检测试剂更容易除去，因此无需分离步骤。
在本发明公开的实施方案中，标记试剂通过酶切割而分离。
在其中捕获探针、分析物和标记试剂为寡核苷酸的情况下，可以通过核酸外切酶处理来特异性除去标记试剂。核酸外切酶是降解双链DNA的酶，所述的双链DNA例如分析物与标记试剂之间的互补序列。通过使捕获探对于核酸外切酶处理迟钝(例如通过选择肽核酸、锁核酸或化学改性的单链DNA作为捕获探针)，仅分析物和标记试剂之间的结合被破坏。
在一个实施方案中，标记试剂是通过化学断裂或解吸附而分离的，例如通过加入或调节pH、离子强度、变性盐或洗涤剂。
在一个实施方案中，标记试剂是通过增加流动系统的温度而分离的。
在一个实施方案中，标记试剂是通过改变其化学或物理状态而失活的。
在其中分析物和标记试剂均为寡核苷酸并且均通过碱基配对序列互补而彼此结合的实施方案中，可以通过改变溶液的pH和离子强度而特异性地除去标记试剂。例如当pH升高时，由于核碱基的去质子化作用，DNA的双链结构被破坏。此外，还可以通过降低溶液的离子强度，由此增加DNA主链上带电荷的磷酸盐基团之间的静电排斥而取得双螺旋DNA的分离。进一步地，通过将温度升至双螺旋DNA的熔融转变温度以上，可以使得标记试剂与分析物分离。
在其中分析物和标记试剂为基于蛋白质或肽的实施方案中，可以通过使用洗涤剂、变性盐或通过升高温度来使破坏/变性三级结构，而使标记试剂分离。
在一个实施方案中，标记试剂包括酶，并且可以通过活性位点的化学或生物化学修饰来改变酶的状态，使得标记试剂失活。
可以通过破坏活性位点使酶失活，使得进一步的酶处理不可能。例如在其中所述的酶属于过氧化物酶类的情况下，当暴露于苯酚溶液时，活性位点被不可逆的破坏，例如参见Mao,L.,Luo,S.,Huang,Q.和Lu,J.在Scientific Reports,vol.3,article number 3126(2013)(DOI:10.1038/srep03126)出版的"Horseradish peroxidase inactivation:Hemedestruction and influence of polyethylene glycol"著作。此外，在所述的酶属于磷酸酶类的情况下，活性位点需要锌和镁离子复合物来发挥功能。因此，通过使用螯合试剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)除去这些离子，可以导致酶不可逆的灭活，即，酶活性的终止，例如参见Ackermann,B.P.和Ahlers,J.在Biochemical Journal,vol.153,pp.151-157(1976)(DOI:10.1042/bj1530151)中出版的“Kinetics of alkaline phosphatase from pigkidney.Influence of complexing agents on stability and activity”著作。
在一个实施方案中，标记试剂包括酶，并且其中酶的状态是通过化学或物理破坏酶的三级结构而改变的。
例如可以通过升高溶液的温度、通过升高或降低pH、同升高或降低溶液的离子强度、通过加入洗涤剂或通过使用化学交联试剂以共价修饰酶而改变酶的结构。
在一个实施方案中，标记试剂包括酶和特异性分析物识别部分，并且分析物识别部分选自以下分子：寡核苷酸、蛋白质、肽、适体、抗体、它们的复合物或它们的合成变体。
在一个实施方案中，通过完全浸渍将在液体中包含一种或多种分析物类型的样品与包含亲水性特征的基底接触。
在一个实施方案中，所述的方法进一步包括除去液体和洗涤基底。
在一个实施方案中，标记是通过完全浸渍使包含用于分析物的标记试剂的溶液与被捕获的分析物接触而实施的。
在一个实施方案中，所述的方法进一步包括除去包含残余的标记试剂的溶液，和洗涤基底。
在本发明公开的实施方案中，容纳亲水性特征的图案的基底位于流动分隔区内部，由此能够通过压力驱使的驱动使液滴塞从入口到出口进行液体接触。包含不同反应剂(标记试剂、检测试剂、失活试剂、漂洗溶液)的不同溶液可以被加载至液体加载垫中，并驱动至流动分隔区中。液体接触模式可以分类为：(i)流动通过接触；或者(ii)灌输-停止-收回接触。在流动通过接触模式中，液体塞被驱动穿过流动分隔区中，直至液体塞的整个体积通过。在灌输-停止-收回接触模式中，液体塞被驱动，直至其充满流动分隔区的整个体积，然后停止。在某段等待时间后，液体塞被驱动出流动通道，并进入液体出口。
流动通过接触模式通常适用于其中反应剂过量的反应步骤。该步骤的持续时间可以通过流速(体积/时间)和液滴塞的体积来确定，并且可以调节，从而取得所需的处理时间。诸如漂洗步骤、标记步骤、失活步骤和检测步骤之类的步骤通常以流动通过的接触模式进行实施。
灌输-停止-收回接触可以适用于需要更长温育时间的步骤中，并且其中反应剂以低浓度存在。例如捕获步骤，其中包含低浓度分析物的样品将与亲水性特征表面上的捕获探针结合。对于捕获步骤，有利的是延长该步骤的持续时间，从而确保所有的分析物均从样品中完全捕获，即，足够的温育时间以允许分析物从流动分隔区的顶部扩散至底部，以及足够的时间以在表面上能够成功捕获的。灌输-停止-收回接触等同于亲水性图案在溶液中的完全浸渍。
在一个实施方案中，分析物选自以下分析物：单链寡核苷酸、双链寡核苷酸复合物、蛋白质、蛋白质/寡核苷酸复合物、蛋白质/脂质复合物、肽、外泌体、病毒颗粒、病毒样颗粒、纳米颗粒、细胞碎片或细胞。
在一个实施方案中，样品选自以下样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织。
在一个实施方案中，样品选自以下样品的实验室处理的样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织，例如血液。
根据样品的类型，可以存在不同种类的分析物类型，并且可以需要不同的实验室方案以制备用于测量的分析物。例如如果样品为血液样品，必须使用抗凝剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐或草酸盐)处理血液，以防止凝固。血液样品的实验室处理的另一个实例是离心或者过滤血液，以便除去样品中的细胞。血液样品的实验室处理的另一个实例是稀释血液或加入活性成分，从而有助于目的生物标志物的特异性提取。例如可以使用固相可逆固定化方法从液体样品纯化DNA分析物，其中将血液与拥挤试剂(crowding agents)和羧酸涂敷的顺磁性微颗粒混合。这些反应条件可以有利于DNA选择性吸收在微颗粒的表面上，然后可以通过施加磁场进行提取。对于其他应用而言，有利的是使稀释的或以其他方式处理的样品经过(i)电泳步骤或(ii)透析步骤，从而基于分子的电荷、尺寸和分子量由样品中选择这些分子。
在一个实施方案中，一种或多种被捕获的分析物与随后用于捕获的捕获探针形成共价交联或缀合。
有利的是在分析物和捕获探针之间建立共价连接，因为其提供了将分析物基本上不可逆的固定化在表面上。按照这种方式，可以更容易地取得标记试剂的分离，这是因为分析物与标记试剂之间的连接是非共价的，因此较弱。例如如果捕获探针和分析物均为寡核苷酸，并且通过互补碱基配对结合在一起，此外通过一个或多个共价连接结合在一起，而且如果标记试剂也是寡核苷酸，但是仅通过互补碱基配对与分析物结合，则可以通过使复合物经过碱性pH而容易地使标记试剂从分析物上解离。碱性pH不可能如同分析物/标记试剂之间较弱的碱基配对连接的程度那样，影响捕获探针/分析物之间强的共价连接。
关于另一个实例，考虑捕获探针为抗体，而分析物为蛋白质或肽，并且在这二者时间建立共价连接。如果标记试剂是基于抗体的，并且通过抗体/抗原相互作用与分析物结合，则可以通过加入洗涤剂或加入变性剂容易地除去，同时仍保持捕获探针与分析物之间的共价连接。
在一个实施方案中，捕获探针为寡核苷酸或合成的寡核苷酸，分析物为通过与捕获探针序列的碱基配对而与捕获探针结合的寡核苷酸，并且其中通过使用链间交联试剂(例如铂络合物、丝裂霉素C、氮芥、补骨脂素或醛)进行共价交联。如同上述那些的链间交联试剂能够在双螺旋DNA、双螺旋DNA/RNA、或者包含核碱基的它们的合成变体中，在相对的链上的核碱基之间形成共价键。与非共价链间碱基配对连接相比，链间共价连接提供增强的稳定性，由此提供分析物与捕获探针(并由此与亲水性特征之间)的实际不可逆的固定化。
在一个实施方案中，捕获探针为蛋白质、肽或它们的合成变体，分析物为蛋白质、肽或者包含蛋白质或肽的复合物，分析物通过分析物特定区域的结构识别与捕获探针结合，并且其中通过使用化学固定试剂(例如甲醛、戊二醛、四氧化锇或乙酸铀酰)实施共价交联。如同上述那些的化学固定剂能够交联氨基酸，由此在分析物和捕获探针之间的接触区域提供共价连接。这可以提供分析物与捕获探针(并由此与亲水性特征之间)的实际不可逆的固定化。
在本发明所述的方法和流动系统的实施方案中，通过大气提供气相，和/或捕获探针选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体，和/或不同类型的捕获探针排列在区域中，和/或分析物为由经处理的血液样品提取的单链DNA，和/或标记试剂包含检测模块和识别部分，和/或检测模块为酶，和/或识别部分选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体。
在本发明所述的方法和流动系统的另一个实施方案中，通过大气提供气相，捕获探针选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体，不同类型的捕获探针排列在区域中，分析物为由经处理的血液样品提取的单链DNA，标记试剂包含检测模块和识别部分，检测模块为酶，以及识别部分选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体。
在下文中，描述应用的一些非限定性实例：
单酶联免疫吸附测定法(sELISA)，其中蛋白质或肽分析物被表面结合的抗体探针捕获，然后通过单酶缀合的检测探针进行标记并检测。
单寡核苷酸杂交测定法，其中寡核苷酸分析物被表面结合的互补性寡核苷酸探针捕获，然后通过单酶缀合的检测探针进行标记并检测。
另一类应用处理了单一生物实体(例如细胞、细胞碎片/细胞器、细菌、病毒壳体等)的操作和定量。在这些情况下，所述的测定法可以使用表面结合的捕获探针将任何上文提及的生物实体固定化，然后施加特定的检测探针，从而定量它们的数量和种类。备选地，在生物实体被捕获后，它们可以被破裂，它们的蛋白质、肽、脂质或寡核苷酸的内容物可以被另一组表面结合的捕获探针捕获，然后通过单酶缀合的检测探针进行标记并检测。
此外，本发明适用于实施数字聚合酶链式反应(dPCR)或它们的变体。在本发明的一个实施方案中，dPCR测定法通过在单一的液滴中包含靶序列以及扩增反应剂和检测探针，检测特定的寡核苷酸序列。当PCR发生时，靶序列被扩增，由此可以通过检测探针可检测。在本发明的另一个实施方案中，靶寡核苷酸首先被表面结合的探针特异性地捕获，然后，扩增反应剂和检测探针被供入单个液滴中，从而可以进行PCR和检测反应。
本领域的那些技术人员至多使用常规的试验，便知道或者能够弄清楚本发明所述的实施方案和实践的多种等价物。
因此，应该理解的是本发明不限于本发明公开的实施方案，而且通过以下权利要求可以理解本发明，其中所述的权利要求可以解释为在法律规定下是广泛允许的。
本发明的其他的具体的实施方案
用于将体积为皮升或更低的微滴适当地保持在基底上和液相中的方法，其包括将微滴置于具有至少一个开口的通道内，将所述的通道的体积设定为在该通道内建立能够减少微滴的蒸汽的蒸气压力的值。
具体而言本发明涉及以下实施方案：
实施方案1.用于数字计数样品中一种或多种分析物类型的流动系统，包含：在疏水性基底中或在疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴，其中每个所述的液滴都具有最大液滴体积，以及所述的流动分隔区被构造用于支持减少各个纳升-至-阿升液滴的蒸发的气相密封。
实施方案2.根据实施方案1所述的流动系统，其中所述的流动分隔区具有体积(VC)，其中所述的体积(VC)大于所有的液体纳升-至-阿升液滴的聚集最大液滴体积(VDA)，并且小于通过以下等式计算的VMAX：
其中ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为所述的液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
实施方案3.根据实施方案1-2的任意一项所述的流动系统，其中所述的亲水性特征为具有半径(RD)的圆形，并且其中所述的单一亲水性圆形可以支持的最大液滴体积(VD)如下：
其中γ为在所述的疏水性基底上的液体接触角。
实施方案4.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的各个纳升-至-阿升液滴的蒸发为所述的各个纳升-至-阿升液滴的最大液滴体积的小于50％、小于40％、优选地小于30％、优选地小于20％、优选地小于10％、优选地小于5％、优选地小于1％。
实施方案5.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的气相密封是通过大气、氮气、氩气和/或氦气构成的。
实施方案6.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的气相密封是通过大气构成的。
实施方案7.用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统，包含：在疏水性基底中或在疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴。
实施方案8.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其包含重叠在所述的液滴区域的一个或多个流动分隔区，从而能够使液滴与所述的亲水性/疏水性图案接触。
实施方案9.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其包含一个或多个液体加载垫，用于使用液体和反应剂供入所述的流动系统。
实施方案10.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其包含连接所述的流动分隔区和所述的液体加载垫的液体入口。
实施方案11.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中液体是通过由所述的入口至所述的出口的压力下降的手段而驱动穿过所述的流动通道。
实施方案12.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其包含连接所述的流动通道和压力源从而提供抽吸的液体出口，并因此介导液体驱动通过所述的流动通道。
实施方案13.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的气相密封是通过大气、氮气、氩气和/或氦气构成的。
实施方案14.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的气相密封是通过大气构成的。
实施方案15.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其包含用于一种或多种不同的分析物类型的至少一种捕获探针，所述的捕获探针附着在所述的亲水性特征上。
实施方案16.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的不同类型的捕获探针排列在区域中。
实施方案17.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的支持体是平坦的。
实施方案18.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征是平坦的。
实施方案19.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征的图案包含其中所述的亲水性特征以阵列排列的至少一个区域。
实施方案20.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征以二次平面阵列组织，所述的特征被成型为具有半径(RD)的圆形，所述的阵列在相邻的特征之间具有行距(δ)，其中δ为至少3RD，所述的阵列沿流动方向延伸长度(LAX)，所述的阵列在垂直于流动方向上延伸长度(LAY)，所述的通道沿流动方向具有长度(LCX)，其中LCX大于或等于LAX，所述的通道在垂直于流动方向上具有长度(LCY)，其中LCY大于或等于LAY，所述的通道具有高度(h)，其为至少2RD且至多hMAX，其中hMAX由以下等式计算得到：
其中γ为与所述的疏水性材料的液体接触角，θMAX为所述的液滴的最大允许蒸发体积级份，ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为所述的液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
实施方案21.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征的图案包含至少2个区域，并且其中所述的一个区域的阵列与另一个区域的阵列不同。
实施方案22.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中支持所述的亲水性特征的区域位于所述的流动分隔区内的中心。
实施方案23.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中亲水性特征的数量为至少1,000、优选为至少10,000、优选为至少100,000、优选为至少1,000,000、优选为至少10,000,000。
实施方案24.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的流动分隔区是通道成型的，并且在所述的分隔区的相对末端的2个开口之间形成流动方向。
实施方案25.根据实施方案13所述的流动系统，其中所述的流动分隔区和所述的开口在与流动方向垂直的截面中具有长方形形状。
实施方案26.根据实施方案13所述的流动系统，其中所述的流动分隔区具有长方形形状，并且所述的开口在与流动方向垂直的截面中具有圆形形状。
实施方案27.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征被构造用于支持所述的纳升-至-阿升液滴，并且其中所述的液滴在所述的疏水性基底上展现出接触角为至少90°且最大150°。
实施方案28.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性特征被构造用于支持半径为至少0.1μm且最大100μm的纳升-至-阿升液滴。
实施方案29.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的亲水性基底是玻璃、亲水性聚合物或金属氧化物化合物。
实施方案30.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的疏水性层为与所述的基底共价接枝的分子单层。
实施方案31.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的疏水性层是化学吸收在金属基底上的分子单层。
实施方案32.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的一种或多种被捕获的分析物与随后用于捕获的所述的捕获探针形成共价交联或缀合。
实施方案33.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的捕获探针为寡核苷酸或合成的寡核苷酸，所述的分析物为寡核苷酸或包含寡核苷酸的分子复合物，其中所述的分析物为通过与所述的捕获探针序列互补的序列而与所述的捕获探针结合，并且其中所述的共价交联是通过使用链间交联试剂实施的，所述的链间交联试剂例如铂络合物、丝裂霉素C、氮芥、补骨脂素或醛。
实施方案34.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中捕获探针为蛋白质、肽或它们的合成变体，所述的分析物为蛋白质、肽或者包含蛋白质或肽的复合物，所述的分析物为通过对所述的分析物特定区域的结构识别而与所述的捕获探针结合，并且其中所述的共价交联是通过使用化学固定试剂实施的，所述的化学固定试剂例如甲醛、戊二醛、四氧化锇或乙酸铀酰。
实施方案35.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的数字计数为数字计数测量。
实施方案36.根据上述实施方案的任意一项所述的流体系统，其中所述的数字计数测量为单酶联分子分析(SELMA)、数字聚合酶链式反应(dPCR)、单酶联免疫吸附测定法(sELISA)或者数字单酶联免疫吸附测定法(dELISA)。
实施方案37.制备上述实施方案的任意一项所定义的流动系统的方法。
实施方案38.使用上述实施方案的任意一项所定义的流动系统用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法。
实施方案39.用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法，所述的方法包括在气相密封下计数在大量的液体纳升-至-阿升液滴中所包含的所述的分析物类型。
实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中所述的气相密封在所述的流动系统内建立能够减少所述的微滴的蒸发的蒸气压力。
实施方案41.根据实施方案39-40的任意一项所述的方法，其中所述的数字计数是在流动系统中实施的，其中所述的流动系统包含：在疏水性基底中或在疏水性基底上具有亲水性特征的图案的支持体，所述的疏水性基底嵌入在包含至少一个开口的流动分隔区中，所述的亲水性特征被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴。
实施方案42.根据实施方案39-41的任意一项所述的方法，其中所述的亲水性特征为具有半径(RD)的圆形，并且其中所述的单一亲水性圆形可以支持的最大液滴体积(VD)如下：
其中γ为所述的疏水性基底上的液体接触角。
实施方案43.根据实施方案39-42的任意一项所述的方法，其中所述的液相密封将各个纳升-至-阿升液滴的蒸发减少至所述的最大液滴体积的小于50％。
实施方案44.根据实施方案39-43的任意一项所述的方法，其中所述的流动系统如实施方案1-36的任意一项定义。
实施方案45.根据实施方案39-44的任意一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：(i)将疏水性基底中或疏水性基底上的亲水性特征的图案与包含一种或多种所述的分析物类型的样品接触。
实施方案46.根据实施方案39-45的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(ii)在所述的亲水性特征上捕获至少一种分析物类型。
实施方案47.根据实施方案39-46的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(iii)使用对待检测的分析物类型具有特异性的标记试剂标记至少一种所述的被捕获的分析物类型。
实施方案48.根据实施方案39-47的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(iv)使检测试剂流动穿过所述的图案以及从所述的图案收回，从而产生纳升-至-阿升液滴的形式的单个液滴。
实施方案49.根据实施方案39-48的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(v)计数容纳所述的标记和检测试剂的液滴的数量。
实施方案50.根据实施方案39-49的任意一项所述的方法，其包括一次或多次重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
实施方案51.根据实施方案39-50的任意一项所述的方法，其包括通过使用对待检测的第二分析物类型具有特异性的第二标记试剂，而不使用所述的第一标记试剂，重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
实施方案52.根据实施方案39-51的任意一项所述的方法，其包括使在所述的上述步骤中存在的标记试剂失活的步骤，然后重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
实施方案53.根据实施方案39-52的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过从所述的表面结合的分析物分离而失活的，并通过冲洗所述的流动系统而除去。
实施方案54.根据实施方案39-53的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过酶切割而分离的。
实施方案55.根据实施方案39-54的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过调节pH、调节所述的离子强度、加入变性盐或加入洗涤剂的化学断裂或解吸附而分离的。
实施方案56.根据实施方案39-55的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过升高所述的流动系统的温度而分离的。
实施方案57.根据实施方案39-56的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过改变其化学或物理状态而失活的。
实施方案58.根据实施方案39-57的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂包括酶，并且其中所述的酶的状态是通过活性位点的化学或生物化学修饰而改变的。
实施方案59.根据实施方案39-58的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂包括酶，并且其中所述的酶的状态是通过化学或物理破坏所述的酶的三级结构而改变的。
实施方案60.根据实施方案39-59的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂包括酶和特异性分析物识别部分，并且所述的分析物识别部分选自以下分子：寡核苷酸、蛋白质、肽、适体、抗体、它们的复合物或它们的合成变体。
实施方案61.根据实施方案39-60的任意一项所述的方法，其中用于一种或多种不同的分析物类型的一种或多种捕获探针附着在所述的亲水性特征上。
实施方案62.根据实施方案39-61的任意一项所述的方法，其中用于一种或多种不同的分析物类型的一种或多种捕获探针通过连接体部分附着在所述的亲水性特征上，所述的连接体部分选自以下分子：聚(乙二醇)、线性或支化的烷烃、肽、寡核苷酸或它们的合成变体。
实施方案63.根据实施方案39-62的任意一项所述的方法，其包括多于一种类型的附着在所述的亲水性特征上的捕获探针，并且其中不同类型的所述的捕获探针排列在多个区域中。
实施方案64.根据实施方案39-63的任意一项所述的方法，其中所述的捕获探针选自以下探针：寡核苷酸、蛋白质、肽或它们的合成变体。
实施方案65.根据实施方案39-64的任意一项所述的方法，其中包含在液体中所述的一种或多种分析物类型的所述的样品通过完全浸渍与包含所述的亲水性特征的所述的基底接触。
实施方案66.根据实施方案39-65的任意一项所述的方法，其包括除去所述的液体，以及洗涤所述的基底。
实施方案67.根据实施方案39-66的任意一项所述的方法，其中所述的标记是通过使包含用于所述的分析物的标记试剂的溶液通过完全浸渍与所述的被捕获的分析物接触而实施的。
实施方案68.根据实施方案39-67的任意一项所述的方法，其包括除去包含残余探针的溶液，以及洗涤所述的基底。
实施方案69.根据实施方案39-68的任意一项所述的方法，其中所述的液体是通过由所述的入口至所述的出口形成的压力下降的手段而驱动穿过所述的流动通道。
实施方案70.根据实施方案39-69的任意一项所述的方法，其中所述的分析物选自以下分析物：单链寡核苷酸、双链寡核苷酸复合物、蛋白质、蛋白质/寡核苷酸复合物、蛋白质/脂质复合物、肽、外泌体、病毒颗粒、病毒样颗粒、纳米颗粒、细胞碎片或细胞。
实施方案71.根据实施方案39-70的任意一项所述的方法，其中所述的样品选自以下样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织。
实施方案72.根据实施方案39-71的任意一项所述的方法，其中所述的样品选自以下样品的实验室处理的样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织，例如处理的血液样品。
实施方案73.根据实施方案39-72的任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种被捕获的分析物与随后用于捕获的所述的捕获探针形成共价交联或缀合。
实施方案74.根据实施方案39-73的任意一项所述的方法，其中所述的捕获探针为寡核苷酸或合成的寡核苷酸，所述的分析物为通过与所述的捕获探针序列互补的序列而与所述的捕获探针结合的寡核苷酸，并且其中所述的共价交联是通过使用链间交联试剂而实施的，所述的链间交联试剂例如铂络合物、丝裂霉素C、氮芥、补骨脂素或醛。
实施方案75.根据实施方案39-74的任意一项所述的方法，其中所述的捕获探针为蛋白质、肽或它们的合成变体，所述的分析物为蛋白质、肽或包含蛋白质或肽的复合物，所述的分析物为通过对所述的分析物特定区域的结构识别而与所述的捕获探针结合，并且其中所述的共价交联是通过使用化学固定试剂实施的，所述的化学固定试剂例如甲醛、戊二醛、四氧化锇或乙酸铀酰。
实施方案76.根据实施方案39-75的任意一项所述的方法，其中所述的数字计数为数字计数测量。
实施方案77.根据实施方案39-76的任意一项所述的方法，其中所述的数字计数测量为单酶联分子分析(SELMA)、数字聚合酶链式反应(dPCR)、单酶联免疫吸附测定法(sELISA)或者数字单酶联免疫吸附测定法(dELISA)。
实施方案78.根据实施方案1-38的任意一项所述的流动系统，其中所述的气相是由大气提供的，和/或其中所述的捕获探针选自：单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体，和/或其中所述的不同类型的捕获探针排列在区域中，和/或其中所述的分析物为从处理的血液样品提取的单链或双链DNA，和/或其中所述的标记试剂包括检测模块和识别部分，和/或其中所述的检测模块为酶，和/或所述的识别部分选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体。
实施方案79.根据实施方案39-77的任意一项所述的方法，其中所述的气相是由大气提供的，和/或其中所述的捕获探针选自：单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体，和/或其中所述的不同类型的捕获探针排列在区域中，和/或其中所述的分析物为从处理的血液样品提取的单链或双链DNA，和/或其中所述的标记试剂包括检测模块和识别部分，和/或其中所述的检测模块为酶，和/或所述的识别部分选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体。
实施方案80.大量的液体纳升-至-阿升液滴在气相密封下用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的用途。
实施方案81.根据实施方案80所述的用途，其是通过根据实施方案39-77和79的任意一项所述的方法实施的。
实施方案82.根据实施方案80-81的任意一项所述的用途，其是根据实施方案1-38和78的任意一项所述的流动系统实施的。
在下文中，描述应用的一些非限定性实施例。
实施例1：飞升水性微滴阵列的形成和保持
为了形成稳定的微液滴，将嵌入在平坦的疏水性区域上的亲水性圆形特征的规则二次阵列与磷酸盐缓冲的水性溶液接触。将10μl溶液塞驱动穿过阵列的表面，由此将微液滴留在亲水性特征上，如图4中的显微照片所示。
流动系统是通过长方形通道的各个末端的2个开口界定的，从而指导液体。通道的宽度为3mm，长度为16mm，而高度为150μm。阵列被放置于通道内的中心，并且宽度为2.9mm，长度为14mm，并且由总计406,000个亲水性特征组成。亲水性圆形的直径为5μm，圆间间距(intercircle spacing)为10μm。疏水性表面上水性溶液的接触角为大约110°，并且在21℃的环境温度实施实验。允许蒸发至多3％的液滴体积，根据Eqn.11，其表明对于干燥的空气(RHI＝0)而言，通道的最大高度为大约680μm。由于流动分隔区的高度仅为150μm并因此小于最大高度，所以气相密封是功能性的，并且能够保持微滴完整。
通过将10-μl体积放置于与通道入口连接的加载垫中，使阵列与大体积水相溶液接触。接着，在通道的出口处，施加负压，由此使10-μl液滴塞以5μl/min流速驱动穿过通道。一旦大体积液体的后退边缘(receding edge)达到通道出口，则停止施压，并将新的液体塞放置在加载垫上。由于功能性气相密封，在亲水性特征的顶部上面形成的液滴在超过1个小时的时间内保持稳定，而不会发生任何显著的蒸发，例如参见图12C。
实施例2：如何通过优化流动通道、液滴和阵列的几何形状使得水性微液滴的阵列抗蒸发
考虑其中化学图案化的固体基底已经被嵌入的流动通道。化学图案由组织在阵列中的圆形亲水性区域组成。亲水性阵列被连续的疏水性区域包围。按照这种方式，一旦水性溶液被灌输并随后由流动通道收回，则在亲水性特征的顶部上面形成微滴的阵列，如实施例1所示。
流动通道的维度在图13上定义，并且通过以下方面表征：h，其为通道的高度；lA，其为被阵列覆盖的流动通道的长度；lE，其为通向入口/出口，但是不容纳阵列的通道的过多部分的长度。定义阵列的参数为微滴半径RD(其定义为固体基底上亲水性特征的半径)，和δ(其为相邻的液滴之间的中心-与-中心的距离)。在下文中，我们假设阵列以四角形图案组织，但是可以使用相同的原理驱动用于其他阵列图案的溶液，如下文所示。
首先，我们将计算在流动通道中存在的水的总摩尔量。这是通过计算液滴的体积(VD)，并将其乘以存在的液滴的总数量而得到的。我们将假设可以通过展现球形一半体积的半球形来表示液滴。因为阵列和流动通道沿着y方向是一致的，所以我们仅需要考虑由一条线的液滴组成的一维阵列(如草图所示)以及液滴间间距的宽度为δ的准一维流动通道。沿着一维阵列的液滴的总数量(ND)则为：
ND＝lA/δ Eqn.12
所有液滴的总摩尔量(nTOT)现在可以评价如下：
在此，mw为所有液滴的总质量，MW为水的摩尔重量(18.016g/mol)，ρw为水的密度(1000g/l)。为了计算在给定温度下有多少水发生蒸发，我们必须使用Clausius-Clapeyron等式计算水的平衡蒸气压力(PW)：
在此，P0为在参照温度T0的参照平衡蒸气压力，T为反应温度，R为气体常数(8.31J·mol-1·K-1)，并且ΔHVAP(40.65kJ·mol-1)为在水蒸发时的焓变。在293K温度，P0和T0的合适的值分别为2.34kPa。对于体积为VF的封闭的流动通道而言，水的蒸气压力表明多少水可以作为水蒸汽转变成空气。根据理想气体定律，在平衡下水蒸汽的摩尔量(nEVAP)符合：
蒸发的水的级份(θW)现在可以评价为蒸发的水与水的总摩尔量的比值。
我们现在将引入：(i)无量纲比例因子(dimensionless scaling factor)N＝δ/RD，其为表征阵列的几何形状的参数(即，N值越大，导致越发的几乎不密集的阵列)；以及(ii)无量纲比例因子其为表征流动通道设计的几何形状的参数(即，大的值表明阵列仅占据流动通道的小部分)。使用这些说明，Eqn.16可以再次书写为：
Eqn.17可以重排，由此如果选择所需的最大蒸发的级份(θMAX)，则可以评价相应的最大高度(hMAX)：
在图11中，针对多个流动通道/液滴/阵列的几何形状和温度，描绘Eqn.17和Eqn.18。进一步地在图12中，已经示出液滴稳定性作为温度和流动通道几何形状的函数的实验证明。对于液滴保留而优化的流动通道而言(图12C)，液滴阵列在一定的温度范围内(25-45℃，如本文所证明)并且在至少1.5小时的延长的时间内保持稳定。原则上，一旦建立热动力学平衡，液滴阵列则是无限稳定的。但是，在实际中，流动通道/阵列不能完美地密封而杜绝外部环境，因此液滴会缓慢蒸发。
实施例3：流动系统的制造
流动系统的制造在2个主要的步骤中进行；一个步骤使用UV光刻术和微制造处理来生产图案化的亲水性特征，而第二步骤将亲水性图案整合至流动分隔区中，从而展现正确的几何形状。下文将更详细地描述2个步骤。
图案化的亲水性基底的微制造
在本发明的这种实施方案中，亲水性特征由石英(SiO2)构成，疏水性区域由全氟十二烷基三氯硅烷(FDTS)构成。在制造过程的第一个步骤中，使用MVD 100MolecularVapor Deposition系统(Applied Microstructures Inc.)通过分子气相沉积将FDTS的分子单层沉积在石英晶片上。FDTS与石英表面上的硅烷醇基团共价附着，并由此在晶片表面上产生疏水性单层。
接着，通过旋涂，然后在90℃对晶片进行软烘使过量的溶剂蒸发，将AZ5214E光刻胶(Microchemicals GmbH)的层沉积在经FDTS处理的晶片的顶部上面。使用MA6型Mask Aligner( MicroTec)，通过铬掩模使光刻胶暴露于UV照射，然后在AZ351B显影液(Microchemicals GmbH)中使晶片显色。按照这种方式，光刻胶的连接的图案保持在晶片上，由此将圆形的孔暴露于下方的FDTS单层上。
在最终的处理步骤中，选择性地除去FDTS单层，从而暴露下方的亲水性石英表面。这是通过使用300型Plasma Processor(TePla)使晶片经历短时间的氧气-等离子体，由此除去FDTS单层但是留下更厚的光刻胶膜而实现的。为了除去光刻胶膜，将晶片在丙酮中超声波处理10min，由此将所述的膜溶解并由此提供被疏水性FDTS分子单层包围的亲水性石英特征的图案。
微制造的阵列在流动通道中的整合
在整合之前，将微结构化的晶片切割成长方形小块(25mm x 12mm)，以适合流动分隔区。在这种情况下，在所述的阵列需要进一步的表面官能化的情况下，实施官能化方案，然后进行分隔区整合，如以下实施例4-5所述。
通过CNC铣削聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)片，制备流动通道和液体加载垫。流动通道的宽度为1mm，长度为8mm，高度为100μm，并且壁厚为200μm。流动通道在与蠕动泵连接的出口达到终点，其中所述的蠕动泵提供液体驱动所需的抽吸。液体加载垫展现出体积为大约100μl，并且通过入口与流动通道连接。流动通道、加载垫、入口和出口是由单一的8mm厚PMMA厚板雕刻的，其在下文中称为PMMA流动结构。
为了将容纳亲水性特征的微制造的阵列的长方形晶片(芯片)附着在PMMA流动结构上，使用CO2激光仪切割一块公称厚度为142μm的双侧压敏粘附膜(ARcare 90106,Adhesives Research,Inc.)。激光切割的粘附膜的几何形状与PMMA流动结构的几何形状匹配，但是稍微更小一点，使得流动通道被粘附剂包围，但是不接触。接着，使粘附剂附着在PMMA流动结构的底部侧，然后在粘附剂的顶部上面放置阵列芯片。然后，将组件(PMMA流动结构、粘附剂和阵列芯片)夹在2个平的5mm厚的PMMA片之间，并放置在粘结压力机中。将夹层在40℃、6kN压力夹紧60秒。按照这种方式，粘合剂被压制成由流动通道的高度界定的100μm的厚度。所得的粘结的组件界定了功能流动系统。
实施例4：单一DNA分子的数字计数
在本实施例中，显示如何通过使用具有整合的液滴阵列芯片的流动系统可以检测和数字计数单一的生物分子(在这种情况下为单链DNA)。根据实施例1-3所述的过程，生产和操作流动系统组件，但是在液滴阵列芯片整合至PMMA流动结构之前，使芯片经历进一步的表面官能化，从而可以使单链靶DNA被特异性的捕获。微制造的芯片由93,750个圆形亲水性特征组成，其直径为4μm，并且以正方形阵列排列，特征之间的间距为8μm。
表面官能化方案
通过在丙酮中进行10min超声波处理，然后在异丙醇中进行10min超声波处理，再在乙醇中进行10min超声波处理，完全清洁液滴阵列的芯片。将该芯片在氮气流下干燥，并浸渍在1％(v/v)环氧硅烷(Dynasylan GLYEO,Evonik Industries)溶液在95％(v/v)乙醇中形成的溶液中。将芯片在环氧硅烷溶液中温育30min，随后使用95％乙醇洗涤3次，在氮气流下干燥，并在110℃固化30min。
接着，使硅烷化芯片上的环氧基基团与聚(乙二醇)部分上存在的胺基团反应。聚(乙二醇)由甲氧基-聚(乙二醇)2000-胺(OH-PEG2000-NH2)(Jenkem Technology)和羧酸-聚(乙二醇)2000-胺(COOH-PEG2000-NH2)(Jenkem Technology)的混合物组成。该混合物具有10:1摩尔比的OH-PEG2000-NH2与COOH-PEG2000-NH2，并且在10mM磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)，138mM NaCl，2.7mM KCl，1.5M硫酸铵，pH 7.4中具有100g/l的公称总浓度。将芯片在40℃与混合物温育20小时。随后，使用Milli-Q水(Millipore Corp.)将芯片洗涤3次，并在氮气流下干燥。
在最后的表面改性步骤中，使用对DNA靶具有特异性的捕获探针将芯片官能化。捕获探针为在N末端具有赖氨酸基团的14-mer肽核酸(PNA)，其用于附着在接枝COOH-PEG2000-NH2的表面上的羧酸基团上。PNA探针的序列从N末端至C末端为K-O-ACA TAG TTG ACA CG-OO(SEQ ID NO:1:ACA TAG TTG ACA CG)(Panagene)，其中K表示赖氨酸基团，O表示乙二醇连接体，而字母G、C、A和T表示DNA核碱基的PNA类似物。
首先，通过将芯片浸渍在摩尔比为1:1并且各种化合物在100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲剂中的公称浓度为25g/l的N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合物中，制备芯片的表面用于与PNA探针反应。将芯片在所述的混合物中在4℃温育30min，然后在100mM MES缓冲剂中进行简单的冲洗。然后，将芯片浸渍在PNA探针在100mM MES缓冲剂中形成的100nM溶液中，并在环境温度温育30min。随后，使用100mM MES缓冲剂简单冲洗芯片，然后在50mM三(羟甲基)氨基甲烷中浸渍10min。使用Milli-Q水冲洗芯片3次，在氮气流下干燥，并储存在真空干燥器中，直至它们与PMMA流动结构结合，如实施例3中概述。
检测方案
用于检测的靶为50-bp DNA寡聚体(5'-TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TACGGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT-3'(SEQ ID NO:2))。DNA寡聚体的最后14个碱基对与PNA捕获探针互补，而DNA寡聚体的最初12个碱基对与基于DNA的标记试剂互补。标记试剂由一个或多个与辣根过氧化物酶缀合的12-bp DNA寡聚体构成。标记DNA寡聚体的序列为5'-GCC TAC GAC AGA-3'-TEG-生物素(与TEG-生物素缀合的SEQ ID NO:3)，其中TEG表示四(乙二醇)连接体。
通过将中性抗生物素蛋白(neutravidin)-辣根过氧化物酶(NAv-HRP)缀合物(Invitrogen,A2664)与标记寡聚体以NAv-HRP与寡聚体的摩尔比为1:3进行混合，制备标记试剂。NAv-HRP的最终浓度为100nM，并且在5X柠檬酸钠(SSC)缓冲剂，1.0g/l牛血清白蛋白(BSA)，0.5％(v/v)Triton X-100，pH 7.0中制备混合物。将混合物在4℃温育24小时，由此能够使生物素化的DNA寡聚体附着在NAv-HRP上的中性抗生物素蛋白部分上。所得的缀合物展现出每个NAv-HRP具有平均3个结合的DNA寡聚体，并且在下文中简写为NAv-HRP-LO3。
以下缓冲剂用于检测实验：
钝化缓冲剂：5X SSC缓冲剂，0.5％(v/v)Triton X-100，10g/l BSA，pH 7.0。
标记缓冲剂：5X SSC缓冲剂，0.5％(v/v)Triton X-100，10g/l BSA，pH 7.0。
清洁缓冲剂1：10mM PBS，138mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％(v/v)Triton X-100，50g/l 20kDa分子量的聚(乙二醇)(PEG20000)，pH 7.4。
清洁缓冲剂2：10mM PBS，138mM NaCl，2.7mM KCl，50g/l PEG20000，pH7.4。
检测缓冲剂：10mM PBS，138mM NaCl，2.7mM KCl，10g/l PEG20000，1.0mM H2O2，pH7.4。
在5X SSC缓冲剂，0.5％Triton X-100，pH 7.0中制备公称DNA靶浓度变化(10fM，1fM和100aM)的溶液以及不包含DNA靶的对照，然后立即进行检测实验。为了实施检测实验，按照以下方式操作流动系统：
步骤1：将25μl DNA靶溶液以流速0.2μl/min驱动通过流动通道。
步骤2：使用10μl钝化缓冲剂灌输流动通道。
步骤3：温育10min，并将溶液驱动流出流动通道。
步骤4：使用在标记缓冲剂中10μl的50pM NAv-HRP-LO3灌输流动通道。
步骤5：温育10min，并将溶液驱动流出流动通道。
步骤6：以流速10μl/min驱动100μl清洁缓冲剂1。
步骤7：以流速10μl/min驱动100μl清洁缓冲剂2。
步骤8：以流速5μl/min驱动检测缓冲剂中3μl的200μM Ampliflu red(SigmaAldrich，90101-5MG-F)溶液。
简言之，上述方案能够使DNA靶在步骤1中与表面附着的PNA捕获探针结合。接着，在步骤4-5中，使用NAv-HRP-LO3标记被捕获的DNA靶。在步骤6-7中除去过量的标记试剂后，在步骤8中建立包含检测试剂Ampliflu red的微液滴。Ampliflu red为辣根过氧化物酶的荧光底物，当酶处理时其转化成发荧光的化合物试卤灵(激发波长570nm，发射波长585nm)。结果，容纳标记试剂的液滴产生荧光信号，其使用荧光显微镜可以容易地检测。
在步骤8之后，使用与合适的荧光滤波器组结合的555-nm LED激发光源，在荧光显微镜(Zeiss Axio Vert.A1)下检查流动系统，从而检测由试卤灵发出的信号。使用1.4MPCCD照相机(AxioCam MR3)记录相应的亮视野和荧光显微照片，如图14中所示。
使用图像分析软件ImageJ定量荧光显微照片，以计数发荧光的液滴的数量。简言之，通过将低于某一强度阈值的像素值格式化成0并将高于某一强度阈值的像素值格式化成1，将灰度级显微照片转化成二进制格式。接着，计数值为“1”的相连的像素群集。由低于4个像素组成的群集作为噪声弃去。记录整个阵列的群集的总数量用于随后的数据分析。相同的强度阈值适用于所有检测实验的所有荧光显微照片。
图15中示出总计20个检测实验的结果。图中示出在阵列上存在的液滴的百分率级份，其中所述的阵列展现出对不同浓度的DNA靶的可检测荧光信号。在对照样品中，其中不存在DNA靶的情况下，仍有一些液滴是可检测的。这可能是由于阵列上存在非特异性结合(例如物理吸收或化学吸收)的标记试剂。非特异性结合(NSB)是普通的现象，其在高敏感应用(例如单一分子计数)中是更明显的。在此所示的试验中，容纳NSB标记试剂的液滴的级份为0.280+/-0.097％(从5个试验得到的平均值+/-标准偏差)。另一方面，发现包含靶DNA的样品展现出更高级份的可检测微液滴，因此证明微量分子靶的特异性检测和定量。然而，当靶DNA的浓度升高时，发荧光的液滴的数量并非以正比例方式增加。这可能是由于通过以下方式的靶的浓度依赖性损失：例如非特异性吸收在流动系统的其他表面上，或者表面结合的DNA靶的不完全标记。
实施例5：单一DNA分子的重复检测
在本实施例中，显示被捕获的DNA靶如何可以通过标记试剂的失活而被重复检测。根据实施例1-3生产和操作在本实施例中使用的流动系统，并根据实施例4中提供的表面官能化方案来官能化所述的流动系统。
如下文所示，使用被捕获的靶的重复检测的益处在于每次重复检测，都可以改进信噪比，还可以改进检测极限。此外，在区分容纳一个或多个单核苷酸多态性(SNP)的DNA靶与不具有SNP但其他方面一致的野生型DNA链中，上述操作能够得到增加的特异性，例如实施例6。
在本实施例中，我们使用如实施例4中所述的相同的检测方案，但是3次重复标记和检测步骤。由于捕获探针基于PNA而标记试剂基于DNA，所以可以使用消化标记试剂的T7核酸外切酶选择性地除去标记试剂，同时保持捕获探针/靶复合物完整。此外，为了除去来自NSB标记试剂的信号，使用苯酚溶液使探针的酶部分失活，其中所述的苯酚选择性地改变过氧化物酶的活性位点的结构，由此防止其在随后的检测测定法中产生信号。
钝化缓冲剂、标记缓冲剂、清洁缓冲剂1、清洁缓冲剂2和检测缓冲剂与实施例4中使用的相同。此外，使用以下2种反应剂：
消化缓冲剂：在50mM乙酸钾，20mM tris-醋酸，10mM乙酸镁，1mM DTT，pH 7.9中的1500单位/ml T7核酸外切酶(New England Biolabs,M0263L)。失活缓冲剂：10mM PBS，138mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4中的5.0mM苯酚，1.0mM H2O2。
按照以下方式实施试验，从而能够进行相同被捕获的DNA靶的3个不同的检测步骤。
步骤1：将25μl DNA靶溶液以流速0.2μl/min驱动通过流动通道。
步骤2：使用10μl钝化缓冲剂灌输流动通道。
步骤3：温育10min，并将溶液驱动流出流动通道。
步骤4：使用在标记缓冲剂中10μl的50pM NAv-HRP-LO3灌输流动通道。
步骤5：温育10min，并将溶液驱动流出流动通道。
步骤6：将100μl清洁缓冲剂1以流速10μl/min驱动通过流动通道。
步骤7：将100μl清洁缓冲剂2以流速10μl/min驱动通过流动通道。
步骤8：以流速5μl/min驱动检测缓冲剂中3μl的200μM Ampliflu red(SigmaAldrich,90101-5MG-F)溶液。
步骤9：记录液滴阵列的荧光和亮视野显微照片。
步骤10：使用10μl消化缓冲剂灌输流动通道。
步骤11：温育10min，并将溶液驱动流出流动通道。
步骤12：以流速5μl/min使20μl失活缓冲剂驱动通过流动通道。
步骤13：以流速10μl/min使50μl清洁缓冲剂1驱动通过流动通道。
步骤14：重复步骤4-13。
步骤15：重复步骤4-9。
对于各种样品，记录一系列三张连续的荧光显微照片，并使用实施例4中概括的相同的设置和过程进行分析。在所述的系列中的第一显微照片对应于第一检测步骤，该系列中的下一张显微照片对应于第二检测步骤，以此类推。通过在流动系统表面上使用特定的标记(其在亮视野显微照片上是可见的)，针对检测步骤之间XY位置的变化校正荧光显微照片的坐标。按照这种方式，可以比较不同检测步骤中单个液滴的XY位置。接着，对于检测系列中的各个显微照片，记录展示出荧光信号的液滴的XY像素位置，并与该系列中其余的2名成员比较。在检测步骤之间差异不超过4个像素的液滴位置被认为是“持续性”液滴，即，当加入标记和检测试剂时，重复产生信号的液滴。
3个检测步骤的结果示于图16中，其中针对包含100aM DNA靶的样品显示一系列荧光显微照片。在显微照片上，使用圆形标记持续性液滴。对于对照样品，其中未加入DNA靶，在所有的3个检测步骤中均没有识别到持续性液滴。
下表显示在100aM DNA靶样品与对照样品之间的定量比较。表格概括了由5个相同制备的样品(包含100aM靶DNA)和5个相同制备的对照样品(不包含靶DNA)得到的平均结果。所述表格提供了对于对照样品(第一行)和100aM靶DNA样品(第二行)的持续性液滴(平均)的平均阳性级份，如实施例5中定义。标准偏差(St.dev.)对应于5个样品的标准偏差。第三行提供了由各个随后的检测步骤得到的信噪(S/N)比。S/N比以实验测量值形式提供(括号中补充理论值)。第二行的平均值除以第一行的平均值，得到实验值。如下计算理论值，将100aM样品的平均值除以：(i)第一检测步骤的0.28％；(ii)第二检测步骤的7.84·10-4％(0.28％·0.28％)；以及(iii)第三检测步骤的2.2·10-6％(0.28％·0.28％·0.28％)。
对于检测步骤的各次重复而言，对照样品的持续性液滴的百分率级份降低，随后导致S/N比增加。该结果的原因在于在对照样品中，仅NSB标记试剂提供荧光信号。它们以随机方式与阵列结合，并且因为它们的信号在随后的检测步骤之间失活，所以相同的液滴不可能在随后的检测步骤中产生信号。例如假设NSB标记试剂的随机结合图案，如果在各个检测步骤中，容纳NSB标记试剂的液滴的级份为0.28％(例如图15D)，则仅有2.2·10-6％(0.28％·0.28％·0.28％)的机会在所有的3个检测步骤中均观察到持续性液滴。对于容纳100,000个液滴的阵列而言，2.2·10-6％的假阳性检测率相当于仅0.002的假阳性检测。因此，非常不可能观察到对照样品的任何持续性液滴。
因此，对于这些特定的试验背景而言，从NSB标记试剂衍生的所有噪声均可以被排除在外，由此持续至少3个连续的检测步骤的任何液滴均以极高的可能性代表了功能组装的捕获探针/DNA靶/标记探针复合物。
实施例6：在非靶DNA(在序列中与靶具有单一碱基对的差异)的1:10,000(靶:非靶)背景下用于检测单一DNA分子的流动系统设置的描述
在本实施例中，能够实施数字检测100μl样品溶液中存在的DNA分析物的流动系统是通过下文描述的步骤获得的。预计分析物(靶DNA)以大约10aM的浓度存在于样品中，并且包含以下序列段：5'-TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTCACTAT-3'(SEQ ID NO:4)。除了分析物以外，预计样品包含浓度为大约10,000倍以上的(即，100fM)的另外一种非靶DNA分子(野生型DNA)，并且其包含以下序列段：5'-TCT GTC GTAGGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTCAC TAT-3'(SEQ ID NO:5)。靶与野生型DNA在序列中的不同仅在黑体字和下划线的位置处。
捕获探针为单链PNA寡聚体，其选择为与靶和野生型DNA的5’末端互补，这可以通过使用包含以下序列的捕获探针而实现：5'-GTG CCT ACG ACA GA-3'(SEQ ID NO:6)，其中5’和3’分别对应于探针的N末端和C末端。根据IDT Oligo Analyzer软件(https:// eu.idtdna.com/calc/analyzer)，预计捕获探针的解链温度为至少46.8℃，因此，100％的靶和野生型DNA在环境温度(即，23℃)是结合的。因此，阵列必须被设计成容纳至少6000000个DNA分子结合，这相当于包含100fM DNA的100μl样品的100％结合。
为了实施数字计数测量，使用标记试剂标记被捕获的靶DNA，其中所述的标记试剂由包含以下序列的单链DNA寡聚体组成：5-ATA GTT GAC AC-3'(SEQ ID NO:7)，该寡聚体与诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶之类的酶缀合，所有这些均具有市售可得的荧光底物。标记试剂与DNA靶的序列在3’末端完全匹配。在优化的结合条件下，82.6％的靶DNA在23℃的温度与标记试剂结合(IDT Oligo Analyzer)。但是，在相同的条件下，1％的野生型DNA也与标记试剂结合，这是由于靶与野生型之间高度的序列相似性。结果，为了实施数字计数测量，阵列必须存在至少120,000个亲水性特征。选择120,000个特征的量，使得在实施第一标记和第一检测步骤时，阵列的大约一半的液滴会产生荧光信号，即，6000000个野生型DNA的1％+600个靶DNA的82.6％。
为了容纳120,000个亲水性特征，该特征必须成型为直径为5μm的圆形，并且被放置在规则的二次阵列(最邻近的间隔为10μm)中。根据Eqn.1，单个的亲水性特征由此可以支持最大体积为VD＝52飞升的水性液滴。为了计算最大液滴体积，使用110o的γ值(其对应于在全氟十二烷基三氯硅烷(FDTS)支持体上水的接触角)。因此，液滴阵列的聚集体积为VDA＝6.2纳升(120,000乘以52飞升)。最大流动分隔区体积则得自Eqn.9，VMAX＝326μl。
为了计算最大流动分隔区体积，使用以下值；ρL＝1000kg/m3为水的体积密度，R＝8.31J/(mol·K)为摩尔气体常数，T＝296K(23℃)为温度，RHI＝0作为干燥大气的初始相对水蒸汽饱和度，P0＝1226Pa为在温度T0＝283K(10℃)水蒸汽的蒸气压力，MW＝18.016·10- 3kg/mol为水的摩尔重量，并且ΔHVAP＝40.65·103J/mol为水的蒸汽焓。所述的值可以得自Lange’s Handbook of Physical Chemistry(ISBN-13:9780070163843)和Atkin’sPhysical Chemistry,Volume 1:Thermodynamics and Kinetics(ISBN-13:9780716785675)。
然而，为了使液滴(i)在成像检测步骤过程中保持稳定；以及(ii)提供用于酶反应的最佳条件，仅允许液滴体积的小的级份蒸发。因此，液滴的最大允许蒸发体积级份设定为5％，即，θMAX＝0.05，因此得到流动分隔区体积VC＝16.3μl，即，VC＝θMAX·VMAX。
流动分隔区的最终几何形状的设计是通过选择分隔区的长方形通道形状而获得的，其中所述的分隔区长方形通道形状展现出10:1的纵横比，长度LCX＝15mm，宽度LCY＝1.5mm。因此，需要通道的高度为低于hMAX＝724μm(hMAX＝VC/(LCY·LCX))，以确保不超过5％的最大液滴体积蒸发。可以将10:1纵横比用于亲水性特征的阵列，使得该阵列呈现1,091x110圆形特征，对应于LAX＝10.9mm和LAY＝1.1mm。
对于上文概述的流动系统设置而言，可以通过3次重复标记和检测步骤，在背景超过靶10,000倍下可信赖地检测DNA靶，如实施例5中所述。按照这种方式，预计平均60,496个DNA分子(6000000个野生型DNA的1％+靶DNA的82.6％)在第一检测步骤中可以提供信号，对应于野生型DNA的60000假阳性检测和靶DNA的496个正确的检测。
在第二检测步骤中，预计平均1,010个DNA分子(60,000个野生型DNA的1％+496个靶DNA的82.6％)可以提供持续性信号，对应于野生型DNA的600个假阳性检测和靶DNA的410个正确的检测。在第三检测步骤中，预计平均344个DNA分子(600个野生型DNA的1％+410个靶DNA的82.6％)可以提供持续性信号，对应于野生型DNA的6个假阳性检测和靶DNA的338个正确的检测。
对于第三检测步骤而言，预计正确检测的数量超过假阳性检测的数量是56倍，因此提供优异的定量精确度。而且，通过第四次重复标记和检测步骤，预计会完全消除假阳性检测。
序列表
SEQ ID NO:1:ACA TAG TTG ACA CG
SEQ ID NO:2:5'-TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGTGTC AAC TAT GT-3'
SEQ ID NO.3:5'-GCC TAC GAC AGA -3'
SEQ ID NO:4:5'-TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGTGTC AAC TAT-3'
SEQ ID NO:5:5'-TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGTGTC CAC TAT-3'
SEQ ID NO:6:5'-GTG CCT ACG ACA GA-3'
SEQ ID NO:7:5'-ATA GTT GAC AC-3'
序列表
<110> Selma Diagnostics ApS
<120> 用于数字计数的流动系统和方法
<130> IIC180750
<141> 2016-10-07
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA序列的PNA类似物
<400> 1
acatagttga cacg 14
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模型寡核苷酸
<400> 2
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tcaactatgt 50
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素标记的DNA寡核苷酸
<400> 3
gcctacgaca ga 12
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模型靶DNA
<400> 4
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tcaactat 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模型非靶DNA
<400> 5
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tccactat 48
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA修饰的捕获探针
<400> 6
gtgcctacga caga 14
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA标记
<400> 7
atagttgaca c 11

Claims (43)

1.用于数字计数样品中一种或多种分析物类型的流动系统(10)，所述流动系统包含：在疏水性基底(16)中或在疏水性基底(16)上具有亲水性特征(14)的图案的支持体(12)，所述的疏水性基底(16)嵌入在包含至少一个开口(20)的流动分隔区(18)中，所述的亲水性特征(14)被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴，其中每个所述的液滴都具有最大液滴体积，并且所述的流动分隔区(18)被构造用于支持减少各个纳升-至-阿升液滴的蒸发的气相密封，其中所述的流动分隔区(18)具有体积(VC)，其中所述的体积(VC)大于所有的液体纳升-至-阿升液滴的聚集最大液滴体积(VDA)并且小于通过以下等式计算的VMAX：
其中ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为所述的液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
2.根据权利要求1所述的流动系统(10)，其包含用于所述的一种或多种不同的分析物类型的至少一种捕获探针(22)，所述捕获探针(22)附着在所述的亲水性特征(14)上。
3.用于数字计数样品中一种或多种不同的分析物类型的流动系统(10)，包含：在平坦的疏水性基底(16)中或在平坦的疏水性基底(16)上具有平坦的亲水性特征(14)的图案的支持体(12)，所述的疏水性基底(16)嵌入在包含至少一个开口(20)的流动分隔区(18)中，所述的亲水性特征(14)被构造用于支持大量的液体纳升-至-阿升液滴，所述液滴包含用于所述的一种或多种不同的分析物类型的至少一种捕获探针(22)，所述的捕获探针(22)附着在所述的亲水性特征(14)上。
4.根据权利要求3所述的流动系统(10)，其中所述的流动分隔区(18)具有体积(VC)，其中所述的体积(VC)大于所有的液体纳升-至-阿升液滴的聚集最大液滴体积(VDA)并且小于通过以下等式计算的VMAX：
其中ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为所述的液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
5.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的亲水性特征(14)为具有半径(RD)的圆形，并且其中所述的最大液滴体积(VD)为：
其中γ为在所述的疏水性基底上的液体接触角。
6.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的气相是通过大气提供的。
7.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中不同类型的捕获探针(22)排列在区域(24)中。
8.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的亲水性特征(14)以二次平面阵列组织，所述的特征被成型为具有半径(RD)的圆形，所述的阵列在相邻的特征之间具有行距(δ)，其中δ为至少3RD，所述的阵列沿流动方向延伸长度(LAX)，所述的阵列在垂直于流动方向上延伸长度(LAY)，所述的通道沿流动方向具有长度(LCX)，其中LCX大于或等于LAX，所述的通道在垂直于流动方向上具有长度(LCY)，其中LCY大于或等于LAY，所述的通道具有高度(h)，其为至少2RD且至多hMAX，其中hMAX由以下等式计算得到：
其中γ为所述的疏水性材料的液体接触角，θMAX为所述的液滴的最大允许蒸发体积级份，ρL为所述的液体的体积密度，R为摩尔气体常数，T为温度，RHI为所述的液体的气体成分的初始相对蒸气饱和度，P0为在相应的参照温度T0的所述液体的参照蒸气压力，MW为所述的液体的摩尔重量，并且ΔHVAP为所述的液体的蒸发焓。
9.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中用于所述的亲水性特征(14)的支持体(12)位于所述的流动分隔区(18)内的中心。
10.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的亲水性特征(14)的数量为至少1,000，优选为至少10,000，优选为至少100,000，优选为至少1,000,000，优选为至少10,000,000。
11.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的捕获探针(22)能够与所述的一种或多种被捕获的分析物共价缀合。
12.根据上述权利要求的任意一项所述的流动系统(10)，其中所述的数字计数为数字计数测量。
13.制备上述权利要求的任意一项所定义的流动系统的方法。
14.使用上述权利要求的任意一项所定义的流动系统用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法。
15.用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的方法，所述的方法包括在气相密封下计数在大量的液体纳升-至-阿升液滴中包含的所述的一种或多种分析物类型。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的气相密封在所述的流动系统内建立能够减少所述的微液滴的蒸发的蒸汽压力。
17.根据权利要求15-16的任意一项所述的方法，其中所述的气相密封将各个纳升-至-阿升液滴的蒸发降低至所述的最大液滴体积的小于50％。
18.根据权利要求15-17的任意一项所述的方法，其中所述的流动系统如权利要求1-12的任意一项所定义。
19.根据权利要求15-18的任意一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：(i)将在所述的疏水性基底(16)中或在所述的疏水性基底(16)上的亲水性特征(14)的图案与包含所述的一种或多种分析物类型的样品接触。
20.根据权利要求15-19的任意一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：(ii)在所述的亲水性特征(14)上捕获所述的一种或多种分析物类型。
21.根据权利要求15-20的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(iii)使用对待检测的分析物类型具有特异性的标记试剂标记所述的被捕获的多种分析物类型。
22.根据权利要求15-21的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(iv)使检测试剂流动穿过所述的图案并从所述的图案收回，从而产生纳升-至-阿升液滴形式的单个液滴。
23.根据权利要求15-22的任意一项所述的方法，其包括以下步骤：(v)计数容纳所述的标记和检测试剂的液滴的数量。
24.根据权利要求15-23的任意一项所述的方法，其包括一次或多次重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
25.根据权利要求15-24的任意一项所述的方法，其包括通过使用对待检测的第二分析物类型具有特异性的第二标记试剂，不使用所述的第一标记试剂，重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
26.根据权利要求15-25的任意一项所述的方法，其包括使在之前的步骤中存在的标记试剂失活的步骤，然后重复步骤(iii)、(iv)和(v)。
27.根据权利要求15-26的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂是通过从所述的表面结合的分析物分离而失活的，并通过冲洗所述的流动系统而除去。
28.根据权利要求15-27的任意一项所述的方法，其中所述的标记试剂包含酶和特异性分析物识别部分，并且所述的分析物识别部分选自以下分子：寡核苷酸、蛋白质、肽、适体、抗体、它们的复合物或合成变体。
29.根据权利要求15-28的任意一项所述的方法，其中用于一种或多种不同的分析物类型的一种或多种捕获探针(22)附着在所述的亲水性特征(14)上。
30.根据权利要求15-29的任意一项所述的方法，其包括超过一种类型的附着在亲水性特征(14)上的捕获探针(22)，并且其中所述的不同类型的捕获探针(22)排列在区域(24)中。
31.根据权利要求15-30的任意一项所述的方法，其中所述的捕获探针(22)选自如下探针：寡核苷酸、蛋白质、肽或它们的合成变体。
32.根据权利要求15-31的任意一项所述的方法，其中在液体中包含所述的一种或多种分析物类型的样品通过完全浸渍与包含所述的亲水性特征(14)的基底接触。
33.根据权利要求15-32的任意一项所述的方法，其中所述的标记是通过使包含用于所述的分析物的标记试剂的溶液通过完全浸渍与所述的被捕获的分析物接触而实施的。
34.根据权利要求15-33的任意一项所述的方法，其中所述的分析物选自以下分析物：单链寡核苷酸、双链寡核苷酸复合物、蛋白质、蛋白质/寡核苷酸复合物、蛋白质/脂质复合物、肽、外泌体、病毒颗粒、病毒样颗粒、纳米颗粒、细胞碎片或细胞。
35.根据权利要求15-34的任意一项所述的方法，其中所述的样品选自以下样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织。
36.根据权利要求15-35的任意一项所述的方法，其中所述的样品选自以下样品的实验室处理的样品：血液、血浆、血清、尿、唾液、脑脊液、泪液或组织。
37.根据权利要求15-36的任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种被捕获的分析物与随后用于捕获的所述的多种捕获探针(22)共价缀合。
38.根据权利要求15-37的任意一项所述的方法，其中所述的数字计数为数字计数测量。
39.根据权利要求15-38的任意一项所述的方法，其中所述的数字计数测量为单酶联分子分析(SELMA)、数字聚合酶链式反应(dPCR)、单酶联免疫吸附测定法(sELISA)或者数字单酶联免疫吸附测定法(dELISA)。
40.根据权利要求15-39的任意一项所述的方法，其中所述的气相是通过大气提供的，并且其中所述的捕获探针选自：单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体，其中不同类型的捕获探针排列在区域中，其中所述的分析物为从处理的血液样品提取的单链DNA，其中所述的标记试剂包含检测模块和识别部分，其中所述的检测模块为酶并且所述的识别部分选自单链DNA寡聚体、单链锁核酸寡聚体或单链肽核酸寡聚体。
41.大量的液体纳升-至-阿升液滴在气相密封下用于数字计数至少一种或多种不同的分析物类型的用途。
42.根据权利要求41所述的用途，其是通过根据权利要求15-40的任意一项所述的方法实施的。
43.根据权利要求41-42的任意一项所述的用途，其是在根据权利要求1-12的任意一项所述的流动系统中实施的。
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