CN102947703A - 多表位测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标以及以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。

Description

多表位测定

技术领域

本发明涉及亲和力测定的领域。具体地，本发明涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法以及生物学靶标的检测配置。

背景技术

亲和力测定是测量溶液中的物质，分析物的存在或浓度的生物化学测试，所述溶液通常包含物质的复杂混合物，例如生物学液体，如血液、唾液、血清或尿。这样的测定基于给定分子或所述分子的特定部分如抗体以高特异性结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。测定的特异性取决于分析物能够结合至其特异性结合伙伴以排除待分析的样品中的所有其他物质的程度。

除了需要特异性，必须选择对分析物具有足够高亲和力的结合伙伴以产生准确和可重复的测量，即可测量信号。在历史上，这通过测量一些物理特征如光散射的变化或折射率的变化来完成。通过现代仪器，这类方法再次越来越受欢迎。然而，现在的大多数免疫测定依赖于使用分析试剂以结合至分析物，所述分析试剂与可检测的标记相关。已证实各种标记，包括用于放射免疫测定的放射性元素；酶；荧光、磷光和化学发光染料；乳胶和磁性颗粒；染料微晶、金、银和硒胶体颗粒；金属螯合物；辅酶；电活性基团；寡核苷酸、稳定的自由基、聚合物等。这类标记用于分离游离和结合的标记试剂之后检测和定量结合事件，或者通过以结合事件影响标记产生的信号的变化这样的方式设计系统来检测和定量结合事件。

亲和力测定通常探测肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如适配体与固定的结合伙伴的相互作用。典型的结合伙伴包括蛋白，其可以为受体、酶或抗体，但是还包括多肽和多氨基酸(例如，镍结合位点的多His标签、酰胺或Schiff碱连接的多赖氨酸、硫醚连接的多半胱氨酸)。例如，基于固定方案的链霉亲和素广泛用于将生物素化的生物学元素连接至测定表面。

例如，亲和力测定可以进一步分类为竞争性和非竞争性测定。在竞争性亲和力测定中，生物学样品中的分析物与标记的分析物类似物竞争结合其伙伴。然后测量结合至伙伴的标记的分析物类似物的量。在这种方法中，反应信号与生物学样品中分析物的浓度成反比。这是因为反应信号越大，样品中越少分析物可用于与标记的分析物类似物竞争。

在非竞争性亲和力测定中，其也称为“夹心测定”，生物学样品中的分析物结合至其伙伴，然后标记试剂结合至所述分析物。然后测量位点上标记试剂的量。不像竞争性方法，非竞争性方法即夹心测定的结果直接与生物学样品中分析物的浓度成比例。这是因为如果生物学样品中不存在分析物，则标记试剂不会结合。

亲和力测定，特别是免疫测定广泛用作细菌、病毒、内分泌和寄生疾病的诊断工具以及滥用和慢性疾病状态的检测药物，一个实例是可以导致心脏病发作的心脏疾病。

各种技术如放射免疫测定、免疫过氧化物酶和ELISA目前用于亲和力测定，特别是免疫测定。然而，放射免疫测定具有需要使用危险和破坏环境的试剂的缺点。

此外，除了特异性，如上文所述，灵敏度对于测定性能是至关重要的。测定的灵敏度可以通过结合事件产生的特异性信号与系统的背景噪声相比的比例来定义。

降低信噪比(SNR)的因素包括试剂如抗体非特异性结合至测定的各种组分。此外，与测定的试剂如酶底物反应的测定基质的一些内源性组分的活性倾向于产生“假”反应产物，其干扰标记的复合物如标记的抗体-抗原复合物形成的“真正”产物的准确检测。

通常，将添加剂如封闭试剂加入测定基质以降低测定噪声并减少假阳性信号。

发明内容

本发明的目的是提供一种与现有技术已知的亲和力测定相比具有更高信噪比的亲和力测定。

本发明的另一目的是提供这样的亲和力测定，其适合广泛的分析物。

具体地，本发明的目的是提供一种适合整合入医疗点或者台面、装置和微型化的亲和力测定。

本发明的另一目的是提供一种产生最少假阳性结果的快速和可靠的亲和力测定。

这些目的通过用独立权利要求所示的亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法来实现。从属权利要求表明优选的实施方案。在这种上下文中值得注意的是，以下描述中给出的所有范围应当理解为它们包括限定这些范围的值。

附图说明

本发明的这些和其他方面参考下文所述的实施方案会清楚和阐明。

图1图示根据本发明将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积以及检测和/或定量的进一步任选存在的步骤的一个实例。

图2图示根据本发明在亲和力测定中检测生物学靶标的方法的一个实例。

图3示出本发明怎样实现增加信噪比的目的的另一方面。

图4示出第一捕获部分的组织的实例。

图5示出合适的接头的模块设计的一些实例。

图6示出富集的3-表位亲和力测定的概念验证。

图7示出来自建立心肌肌钙蛋白-I(cTnI)和前列腺特异性抗原(PSA)的3-表位亲和力测定的初步实验的结果。

图8图示热切割然后竞争性亲和力测定的实例。

图9更详细地示出3-表位测定中的第一捕获部分不干扰检测。

图10示出捕获时间常数的确定。

图11示出步骤c)的评价，即对各种体积浓缩因素的生物学靶标浓缩的评价。

图12示出步骤c)的剂量反应曲线，即生物学靶标浓缩的剂量反应曲线。

具体实施方式

根据本发明，通过亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法包括以下步骤

a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；

b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；

c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；

d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；

e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。

这种亲和力测定具有这样的优势，将生物学靶标浓缩并去除可以干扰检测的因素，因此导致增加的特异性结合和减少的非特异性结合，从而导致测定的大大增加的信噪比和更高的灵敏度。

具体地，生物学靶标结合至第一捕获部分与生物学靶标的检测和/或定量分开是有益的。因此第一捕获部分的量与粘附的颗粒可以是大的，以便捕获尽可能多的生物学靶标，但是第一捕获部分与粘附的颗粒不干扰生物学靶标的检测和/或定量。例如，如果第一捕获部分与粘附至它们的大磁性颗粒用来捕获大体积的生物学靶标，例如生物学样品，其比较小的颗粒更易于驱动。因此，更易于从大体积(生物学样品)收集这些较大的颗粒，并且将它们和结合的生物学靶标转移至较小的体积(洗脱体积)。

如本文所用，术语“生物学靶标”指待检测的生物学来源的物质。生物学靶标的非限制性实例为蛋白、肽、抗体、毒性物质、脂质、氨基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、细胞组分、病毒、细胞外基质的组分、细胞、细胞片段、核酸、半抗原和/或药物。

如本文所用，术语“亲和力测定”指测量生物学靶标的存在或浓度的生物化学测试，其基于捕获部分以高特异性结合至生物学靶标以及任选地结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。

如本文所用，术语“生物学样品体积”指其中最初提供生物学靶标的体积或部分体积。

如本文所用，术语“捕获部分”指结合元件，例如这样的部分，其包含选择性结合至生物学靶标的表位的互补性决定区域并可以结合至至少一种其他实体如颗粒，并且可以具有与其相关的试剂。

在一优选实施方案中，捕获部分为抗体，例如动物抗体、人抗体、人嵌合抗体和人源化抗体及其片段，如Fab片段等，或者为适配体，或者为核酸或多肽或包含结合位点的任何物质。

如本文所用，术语“结合元件”指另一元件可以结合或关联的位点。在本发明的一优选实施方案中，结合位点为表位，即抗原决定簇，即被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T细胞识别的抗原部分。

适配体是结合至特异性靶分子的寡核酸(oligonucleic acid)或肽分子。适配体通常通过从大的随机序列池选择来产生，但是天然适配体还存在于核糖开关(riboswitch)中。

如本文所用，术语“颗粒”指能够支持捕获部分的粘附的结构，例如珠。颗粒可以制备自琼脂糖、聚苯乙烯、乳胶、聚乙烯醇、硅。在一优选实施方案中，颗粒可以具有5μm-0.1μm的直径，更优选1μm-0.3μm，即≥0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和/或≤1μm。

如本文所用，术语“切割”指从颗粒分离捕获部分或者从捕获部分分离生物学靶标。

如本文所用，术语“粘附至”指捕获部分通过接头粘附至颗粒之一的情况。

如本文所用，术语“接头”指允许从颗粒分离第一捕获部分的结构。接头可以位于第一捕获部分上和/或颗粒中。例如，如果采用pH诱导的切割就可以是这样。或者，接头可以是偶联至捕获部分和/或颗粒的分离结构。

接头可以利用模块设计来构建；图5给出一些实例。原则上可以使用任何偶联(生物)化学(羧基、胺、sulfhydride、马来酰亚胺等)，优选互相不同。此外，接头应当包含可切割的实体。可切割的实体的实例和切割的方法包括但不限于：

可以通过蛋白酶切割的肽(优选特异性氨基酸序列)；和/或

可以通过核酸酶切割的核酸序列(优选特异性序列/核酸酶)；和/或

光致断裂元件(Photocleavable element)；和/或

温度诱导的切割；和/或

化学诱导的切割(例如S-S键的还原)；和/或

pH诱导的切割。

接头的实例为包含限制位点的合成DNA片段，但是接头的许多不同选择是可用的。

如本文所用，术语“相关”指物理关联。

如本文所用，术语“直接检测和/或定量”表示检测和/或定量生物学靶标本身。

如本文所用，术语“间接检测和/或定量”表示使用竞争性亲和力测定，其中不检测和/或定量生物学靶标本身，但是检测和/或定量与生物学靶标竞争步骤e)的至少一种捕获部分的实体，例如生物学靶标的类似物。

在一优选实施方案中，步骤e)中的至少一种捕获部分为检测表面的一部分。

如本文所用，术语“检测表面”指能够结合生物学靶标以及使得能够检测的表面。为了本发明的目的，检测表面可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或者它们的组合，并且可以为颗粒、链、沉淀、凝胶、片、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、膜、玻片等的形式，具有任何方便的形状，包括圆盘、球形、圆形等，只要其允许检测结合的生物学靶标。

在这样的设定中，特别优选步骤e)中的至少一种捕获部分包含以这样的方式构建的生物化学分子或结构，其允许结合至支持物以及生物学靶标。这样的生物化学分子或结构的实例为核酸，优选多达200个碱基的DNA寡核苷酸，以及蛋白和半抗原如抗体或凝集素，其可以结合分子结构如DNA序列、抗体、抗原或酶。

步骤e)中的至少一种捕获部分还可以包含强结合物质如链霉亲和素。

如本文所用，术语“检测”指确定生物学靶标的物理存在和/或定量检测生物学靶标。

在一优选实施方案中，亲和力测定为免疫测定，即该测定利用抗体特异性结合分析物，即生物学靶标。这有利于可获得具有不同结合位点的不同抗体的良好选择的那些生物学靶标，因为抗体-抗原结合通常是高度特异性和非常灵敏的。

在另一优选实施方案中，步骤a)-d)顺序应用一次或多次。这是有利的，因为其允许更高地富集和/或纯化溶液中的生物学靶标。

此外，优选生物学靶标与步骤e)中的至少两种捕获部分相关，其中所述两种捕获部分中的一种为检测表面的一部分，而另一种使得能够在这种表面上检测。换句话说，生物学靶标直接结合至检测表面。

这种生物学靶标直接结合至检测表面的捕获部分具有这样的优势，检测和/或定量生物学靶标不需要额外的系列结合步骤。

在本发明的方法的另一优选实施方案中，在步骤e)中，第一捕获部分或第二捕获部分与另一捕获部分相关。

因此，如果第一捕获部分与生物学靶标一起从颗粒切割，第一捕获部分或其一部分可以用来结合至另一捕获部分。优选地，额外的捕获部分是检测表面的一部分。这样，生物学靶标间接结合至额外的捕获部分并因此结合至检测表面，从而使得能够检测(参见例如图3B)。

如本文所用，术语“间接结合”表示生物学靶标本身不结合至检测表面。取而代之，第一捕获部分的一部分如第三实体或标签结合至检测表面(参见例如图3B和图3C)。

如果生物学靶标仅具有一个捕获部分可以结合的位点，则间接结合特别有利，因为在检测表面上的生物学靶标的重新捕获发生时这个位点已被第一捕获部分占据。

或者，无论第一捕获部分是否与生物学靶标一起从颗粒切割，第二捕获部分均可以结合至生物学靶标，并且这种第二捕获部分转而可以用来结合至另一捕获部分。因此同样地，如果额外的捕获部分是检测表面的一部分，则生物学靶标间接结合至额外的捕获部分并因此结合至检测表面，从而使得能够检测(参见例如图3C)。

在本发明的方法的另一优选实施方案中，在步骤e)中，生物学靶标与进一步的捕获部分相关。

因此在这个优选实施方案中，生物学靶标与至少3种捕获部分相关。例如，这些可以是与生物学靶标一起从颗粒切割的第一捕获部分以及两种额外的捕获部分，其中一种是检测表面的一部分，而另一种使得能够在这种表面上检测。换句话说，生物学靶标直接结合至检测表面(参见例如图3D)。

这种生物学靶标直接结合至检测表面的捕获部分具有这样的优势，检测和/或定量生物学靶标不需要额外的系列结合步骤。

此外，生物学靶标可以与4种捕获部分相关，如果第一捕获部分与生物学靶标一起从颗粒切割就可以是这样。可能来自生物学靶标的第二轮浓缩并在切割之后还保持连接至生物学靶标的第二捕获部分结合至第三捕获部分，其是检测表面的一部分，而第四捕获部分连接至颗粒，使得能够在这种检测表面上检测。第二部分可以通过DNA-接头结合至第三捕获部分，所述DNA-接头具有第三捕获部分识别的表位。

例如，如果检测表面的捕获部分即第三捕获部分与第二捕获部分之间的结合通过强结合物质介导，如生物素与链霉亲和素之间的相互作用，则这种配置是有利的。

在本发明的方法的另一优选实施方案中，试剂与至少一种捕获部分相关，或者在竞争性亲和力测定形式的情况下，与步骤e)中的生物学靶标的类似物相关。

如本文所用，术语“试剂”指使得能够在亲和力测定中检测生物学靶标和/或促进在亲和力测定中检测生物学靶标的物质。

如本文所用，术语“生物学靶标的类似物”指在竞争性亲和力测定中与生物学靶标竞争结合位点的物质。

包含这个额外步骤的亲和力测定是有利的，因为试剂可以是与本领域已知的公认的检测系统一起工作的许多物质中的任何一种。因此，无论测定的生物学靶标，实际的检测反应可以从多种已知的方法中选择。

如果亲和力测定包含这个额外步骤，如果接头包含间隔元件，这是有益的，因为检测表面与试剂之间的距离增加，这允许非特异性与特异性结合之间更好的区别。

优选地，所述试剂选自：

放射性同位素；和/或

固相，例如磁珠或乳胶珠或检测表面；和/或

荧光、磷光和/或化学发光染料；和/或

酶和/或酶底物；和/或

核酸序列、肽；和/或

胶体或纳米颗粒；和/或

聚合物或大分子，例如树状聚体或脂质体。

在本发明的优选方法中，将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的第二体积通过磁性分离或重力来进行。

优选地，在浓缩步骤中，生物学样品体积以1:2-1:1000的比例减小，即1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:500和/或1:1000。

此外，生物学样品体积优选具有1μl-5ml的体积，即≤1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、50μl、100μl、300μl、500μl、1ml、3ml和/或5ml。

浓缩步骤之后的生物学样品体积，这里也称为洗脱体积，对于酶促洗脱可以高达例如5μL，而对于光化学洗脱可以高达例如15μL。

可用于浓缩步骤a)中的生物学靶标的两种方法磁性分离或重力是快速、可靠的技术。

在一可选实施方案中，生物学样品体积比生物学靶标比例的减小通过过滤来进行。在这种情况下，颗粒可以为His-标签，即由至少5个组氨酸(His)残基组成的氨基酸基序，并且过滤可以利用亲和介质如Ni Sepharose、NTA-琼脂糖、His60Ni、HisPur树脂或Talon树脂来进行。

优选地，颗粒为磁性颗粒和/或超顺磁颗粒。这是有益的，因为磁性颗粒和/或超顺磁颗粒具有高表面比体积比例，并且磁性颗粒使得生物学样品体积比生物学靶标的比例能够通过磁性分离而减小。

例如，如果颗粒为磁性颗粒，则本发明的方法可以如下进行：首先，将包含生物学靶标的生物学样品体积提供在第一室中。然后，加入粘附至磁性颗粒的第一捕获部分。在足够的生物学靶标与粘附至磁性颗粒的第一捕获部分之间的结合发生之后，利用磁力将捕获部分与生物学靶标转移至第二个较小的室，从而减小生物学样品体积比生物学靶标的比例。随后，从磁性颗粒切割第一捕获部分，并且将磁性颗粒从第二个较小的室去除。最后，在检测表面上重新捕获生物学靶标，并且在检测表面上检测和/或定量生物学靶标。

利用这种方法，大量磁性颗粒可以用来分离和浓缩生物学样品体积内的生物学靶标而不干扰随后的检测步骤。

在本发明的另一优选方法中，从颗粒切割第一捕获部分通过酶促、热和/或光化学切割进行。

还可以平行或顺序(after each other)联合使用的每种不同的切割方法具有其特定优势。然而，所有切割方法均可以与亲和力测定联合使用，因为所有切割方法均引起最小干扰和流体的最小污染。可选方法，例如通过降低pH切割或化学诱导的切割如还原反应可以强烈影响生物学靶标的状态和构象，并且可以改变溶液的化学条件，从而强烈干扰随后的亲和力测定。虽然最后这两种方法均为简单的公知的从抗体洗脱分析物的方式，但是它们具有在过程中以后影响生物学靶标的亲和力测定的缺点。

例如酶促切割可以用于所有靶标，并且它是温和的过程，可以用于是蛋白的生物学靶标，因为它通常不变性蛋白。因此，本发明的方法对于浓缩即蛋白的富集特别有利，浓缩的进行通常非常具有挑战性，这是由于蛋白分子对温度的敏感性和缓冲制剂的变化。此外，酶促切割允许随后的免疫测定。使用DNA的优势是测定的性能可以通过在抗体结合以外的地方放置限制位点来增强。剩余的DNA接头可以用来增加最终测定上的检测信号。

切割的优选酶为DNase和EcoR1。对于优选实施方案，DNAse表现出比EcoR1更高的收率。可以使用任何特异性核酸酶，具有对DNA序列的最小影响。这里，在优选实施方案中，EcoRI用来显示系统可以是可适应的，并且还显示核酸检测方法的通用性。

热切割具有这样的优势，切割位点具有比酶促切割少的特异性要求，其特别适合可以耐受高温的生物学靶标，例如小分子。然而，如果小心不要使用可以变性蛋白的温度，则还可以对是蛋白的生物学靶标进行热切割。

在热切割的情况下，从颗粒切割第一捕获部分的步骤可以被从第一捕获部分切割生物学靶标代替。然而，当然还可能将热切割位点构建入接头和/或第一捕获部分本身。

光化学切割是有益的，因为不需要加入其他底物，例如酶促反应的酶。关于将这种测定整合入紧凑型装置，光化学切割也表现出一些优势。

然而，用这种形式的切割，测定需要在允许光穿透的环境如暗盒(cartridge)中进行。

此外，优选的检测和/或定量方法选自：

-光学检测，例如荧光、磷光、化学发光、吸收、散射、成像、瞬逝场技术、受抑全内反射、表面等离子共振、拉曼、光谱学；和/或

-酶反应；和/或

-核酸扩增技术，例如免疫-PCR、滚环扩增；和/或

-磁性检测，例如通过磁致电阻、霍尔效应、线圈；和/或

-声波检测，例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体；和/或

-电检测，例如电导、阻抗、电流、氧化还原循环、电荷；和/或

-光磁检测。

一种光学检测技术为受抑全内反射(FTIR)。在正确的角度照明，通常反射击中传感器的活性表面下侧的光强度没有任何损失，这是全内反射。然而，当纳米颗粒结合至表面的对侧时，它们散射并吸收光，减少反射光束的强度。通过传感器检测对应于结合的纳米颗粒的数量的反射光束的这些强度变化，例如与数码相机中使用的相似的CMOS图像传感器。这是FTIR。

各种合适的酶反应如辣根过氧化物酶是本领域公知的。

免疫-PCR为抗原检测系统，其中特异性DNA分子用作标记，并且PCR用来检测这种标记。

如果试剂为磁性颗粒，检测的优选方法为FTIR，因为其可靠、快速，并且可以在小体积中工作。

在本发明的方法的一优选实施方案中，切割为酶促的，试剂为磁珠，并且生物学靶标与进一步的捕获部分相关。

在另一优选实施方案中，生物学靶标结合至第一捕获部分、第二捕获部分和第三捕获部分全部通过生物学靶标上的结合位点进行。

在这样的情况下，生物学靶标上的3个结合位点被与试剂相关的第一捕获部分、第二捕获部分以及第三捕获部分占据，所述第三捕获部分优选为检测表面的一部分。

本发明的发明人令人惊讶地发现虽然生物学靶标上的2个结合位点已被占据，靶标仍然可以通过第三结合位点直接结合至检测表面。换句话说，已结合的元件不空间上阻碍生物学靶分子的检测，即使在磁珠作为试剂，第二捕获部分试剂复合物非常大的情况下也是如此。

在另一优选实施方案中，生物学靶标结合至第一捕获部分、第二捕获部分和第三捕获部分全部通过结合至表位进行，即结合至生物学靶标的抗原决定簇。

这种“3-表位-测定”是有利的，因为其具有高特异性，这是由于结合至生物学靶标的3个抗原决定簇。此外，由于从颗粒酶促切割第一捕获部分，生物学靶标在空间上对于试剂相关的第二捕获部分非常易于接近，并且直接结合至检测表面。

在一可选实施方案中，提供生物学靶标的检测配置，其包含第一、第二和第三捕获部分，其中试剂与第二和/或第三捕获部分相关，并且生物学靶标直接结合至所有三个捕获部分，从而使得能够检测。

在这种检测配置的一优选实施方案中，生物学靶标通过表位结合至所有捕获部分。

在另一可选实施方案中，提供捕获部分，其包含

a)用于附着至颗粒的第一实体，

b)用于切割对颗粒的附着的第二实体，以及

c)用于附着至检测表面的第三实体。

优选地，权利要求13的捕获部分在权利要求1-10中任一项的方法中用作第一捕获部分。

因此，当使用这个实施方案时，第一捕获部分结合至生物学靶标，并且与生物学靶标一起从颗粒切割。

优选地，检测表面包含进一步的捕获部分。

与上述3-表位测定相反，结合至检测表面是间接的，因为第三实体结合至检测表面而不是生物学靶标。

在这种情况下，如果接头包含间隔是有益的，因为这增加检测表面上第三实体的结合面积。具体地，间隔增加在检测表面上找到结合位置的面积，因为其中第三实体可以成功地结合更多方向或空间。

一般来说，可以研究本发明的方法的步骤b)期间发生的第一捕获反应作为时间和颗粒浓度的函数。步骤b)期间发生的第一捕获部分与生物学靶标之间的相互作用可以模拟为一阶速率表达式及之后的重排；捕获效率(ε_capt)如下：

${\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{capt}}={1-e}^{\left(\frac{t_{\mathrm{capt}}}{\mathrm{\τ}}\right)}$ 其中 $\mathrm{\τ}=\frac{1}{k_{\mathrm{on}}\left[\mathrm{Ab}\right]}---\left(1\right)$

其中，tc_apt为本发明的方法的步骤b)的实验温育时间，τ为估计的捕获常数，k_on为以M^-1.s^-1计的结合速率常数，而[Ab]为颗粒(M)上的第一捕获部分如抗体的浓度。τ直接关联至颗粒的浓度。在这个捕获步骤中，第一捕获部分浓度与生物学样品体积中颗粒的量成比例。当t_capt>>τ时，ε_capt接近100%。当t_capt<<τ时，则ε_capt较低，并且可以接近被t_capt超过。τ与生物学样品体积中颗粒的量成比例。

此外，例如图11所示，可以计算富集因子(ξ)。然而，富集效率与体积比例不是线性的。对于30分钟方法，对于1:1体积，用最小量的颗粒，整个方法的效率ξ确定在0.29，而80:1体积获得的富集的因子约14.9。这可以通过将该方法分离为捕获、浓缩和洗脱步骤来理解。富集效率(ξ)如下：

$\mathrm{\&xi;}={\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{capt}}\&CenterDot;{\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{conc}}{\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{el}}={\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{capt}}\&CenterDot;\frac{V_S}{V_{\mathrm{el}}}\&CenterDot;{\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{el}}---\left(2\right)$

其中(ξ)为富集效率；ε_capt为捕获效率，其为0-1；ε_conc为浓缩效率，其为生物学样品体积比洗脱体积的比例(V_S/V_el)，如果需要富集，其大于1；ε_el为洗脱效率，其为0-1。

总效率或富集效率独立于生物学靶标浓度。

附图讨论

本发明的目的的其他细节、特点、特征和优势公开于从属权利要求，附图以及各附图和实例的以下描述以示例性方式显示本发明的几个实施方案和材料的实例。在附图中：

图1图示将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积以及检测和/或定量的进一步任选存在的步骤的一个实例。在这个实例中，第一容器101包含生物学样品体积102，其包含生物学靶标103和粘附至颗粒104的第一捕获部分，在这种情况下，所述颗粒104为磁珠。此外，第一容器101通过连接器105与小于第一容器的第二容器106以流体联系，并且第二容器106通过另一连接器105与第三容器108以流体联系。第三容器108包含与试剂107相关的第二捕获部分。

图1A显示一些生物学靶标103已结合至粘附至磁珠104的第一捕获部分。在下一步中，在图1B中，利用磁力将粘附至磁珠104的第一捕获部分转移至第二容器106。还因此大部分生物学靶标103现在存在于第二容器106中，并且因此以较小的洗脱体积存在。因此将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积。

在图1C中，已从粘附至磁珠104的第一捕获部分切割生物学靶标，并且已利用磁力将粘附至磁珠104的第一捕获部分转移回第一容器101。

在图1D中，已通过连接器105将与试剂107相关的第二捕获部分从第三容器108转移至第二容器106，并且第二捕获部分已重新捕获生物学靶标103。

利用这种方法，粘附至磁珠104(高珠浓度)的大量第一捕获部分可以用来捕获生物学靶标103，而较少量的与试剂107相关的第二捕获部分可以用于检测。

如这个实例所示，将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积导致信噪比的显著增加，这甚至可以通过将生物学样品体积的溶液交换为不同溶液的机会来进一步增强，例如所述不同溶液储存在第二容器中，其包含较少的可以干扰检测的因子。

图2图示根据本发明在亲和力测定中检测生物学靶标的方法的一个实例。提供包含生物学靶标202的生物学样品体积201之后，加入第一捕获部分203，这里为生物学靶标上的表位的抗体，其通过DNA-接头209粘附至颗粒204，在这个图2中为链霉亲和素磁性颗粒。在下一步中，将捕获的生物学靶标202浓缩为小于生物学样品体积201的洗脱体积。这种将生物学靶标从较大体积浓缩为较小体积这样进行，通过磁力转移磁性颗粒204并因此将具有任何结合的生物学靶标的第一捕获部分203转移至较小体积。然后从磁性颗粒204切割第一捕获部分203。在这个实例中，这通过用酶DNase处理来进行，DNase在预定位置切割DNA-接头209，从而从磁性颗粒204分别释放抗体-生物学靶标复合物和未结合的抗体。在下一步中，将生物学靶标202重新捕获在包含第三捕获部分206的检测表面205上，这里所述第三捕获部分206为结合生物学靶标202的抗体。此外，具有与其相关的试剂208(这里为磁珠)的第二捕获部分207也结合生物学靶标202。因此，形成的复合物为3-表位复合物，其可以在Magnotech装置上通过FTIR检测。这种装置具有这样的优势，未结合或弱结合的磁珠通过磁力从表面去除，因此不可以干扰检测。本发明的方法的步骤e)例如在转换驱动下进行4分钟。代替生物学靶标直接结合在检测表面，还可能使用间接结合，其中部分第一捕获部分结合至检测表面。部分一结合至检测表面可以是例如DNA-接头209的剩余物“标签”切割以从颗粒释放第一捕获部分。如果选择这种方法，该测定称为“标签-测定”。

图3示出本发明怎样实现最小化信噪比的目的的另一方面。图3A示出的是终点，即在常规夹心测定中检测信号，其中生物学靶标301结合至与试剂303(这里为磁性颗粒)相关的捕获部分302和检测表面304。

图3B示出终点，即在“标签-测定”中检测，其中生物学靶标301结合至与试剂303(这里为磁性颗粒)相关的捕获部分302以及包含另一实体305标签的第一捕获部分306。然后标签305结合检测表面304。

图3C示出终点，即在另一“标签-测定”中检测，其中生物学靶标301结合至第一捕获部分308，所述第一捕获部分308在将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积中起作用，但是在生物学靶标的检测和/或定量中不起作用。为了这一事件，即检测和/或定量步骤，使用与试剂303(这里为磁性颗粒)相关的第二捕获部分302以及包含另一实体305标签的另一捕获部分306。标签305结合检测表面304。因此，因为检测表面还包含捕获部分，该测定包含4种不同的捕获部分。

图3D示出终点，即在“3-表位测定”中检测，如上文图2的最后一张图片所示。生物学靶标301结合至与试剂303(这里为磁性颗粒)相关的捕获部分302。生物学靶标还结合至第一捕获部分307和检测表面304。

标签-测定和3-表位测定与常规夹心测定相比是有利的，因为它们允许减小生物学样品体积比生物学靶标的比例，导致信噪比的显著增加。此外，在标签-测定和3-表位测定中，可以通过切割入清理溶液来纯化生物学靶标。此外，在两种测定中，当使用磁性颗粒时可以避免样品基质中不可逆的磁性颗粒聚集的问题，并且两种测定允许使用强结合剂如生物素以增加测定反应速率。

图4示出第一捕获部分的组织的实例。

图4A示出粘附至颗粒402的第一捕获部分401的实例。在这个实例中，捕获部分401通过接头403粘附至颗粒402，所述接头403包含附着至颗粒402的第一部分404(即第一实体)以及附着至第一捕获部分401的第二部分405。接头403包含第一预定位置406(即第二实体)，在这里第一捕获部分401可以从颗粒402切割，并且还包含第二预定位置或区域407(即第三实体)，其可以结合至检测表面(未显示)。因此在进行标签-测定时可以采用粘附至颗粒402的第一捕获部分401的这种组织。

图4B示出粘附至颗粒402的第一捕获部分401的实例。在这个实例中，捕获部分401通过接头403粘附至颗粒402，所述接头403包含附着至颗粒402的第一部分404(即第一实体)以及附着至第一捕获部分401的第二部分405(即第二实体)。接头403包含第一预定位置406，在这里可以从颗粒402切割第一捕获部分401。与图4A的结构相比，这里不需要可以结合至检测部分的第二预定位置或区域。因此在进行3-表位测定时可以采用粘附至颗粒402的第一捕获部分401的这种组织。

图4A和4B可以用于DNAse洗脱与3-表位测定重新捕获。优选地，图4A示出的设计可以用于如先前定义的标签测定；图4B可以优选用于重新捕获，仅利用DNA的互补单链。

图5示出合适的接头的模块设计的一些实例。

图5A示出包含可以切割为两个部分的接头502的捕获部分501的图示实例。

图5B示出包含可以切割为两个部分的接头502和强结合剂503(在这种情况下为生物素)的捕获部分501的图示实例。

图5C示出包含可以切割为两个部分的接头502、强结合剂503(这里为生物素)和间隔504的捕获部分501的图示实例。使用生物素具有这样的优势，任何颗粒均可以粘附至第一捕获部分，只要其包含链霉亲和素或抗生物素蛋白。

图6示出上文图3所述的3-表位亲和力测定的概念验证。采用的生物学靶标为25pM的PSA，样品体积为5μl，第一捕获部分为PSA的单克隆抗体PSA10，并且颗粒为磁性颗粒。磁性颗粒与PSA10通过DNA接头互相粘附。所述接头由48个碱基对的双链DNA随后10个碱基的单链DNA组成。这种DNA接头为这个实验设计以适合两种类型的切割：用DNAse (其消化双链和单链DNA)非特异性切割和用EcoRI (其消化双链DNA的特定序列)特异性洗脱。其优势在于允许颗粒的更高柔性和足够的间隔以使得酶能够接近。图6中的数据是用DNAse (750单位，来自Qiagen)产生的。在这个测定中，采用结合第二捕获部分的额外的步骤，所述第二捕获部分具有与其相关的试剂。第二捕获部分为PSA的另一单克隆抗体PSA36，并且试剂为磁珠。在检测表面(这里为Magnotech装置的FTIR生物传感器表面)上重新捕获PSA通过PSA结合至另一单克隆PSA抗体即PSA66来完成。所有抗体均来自Fujirebio。生物学样品体积比生物学靶标(缓冲液中的25pM的PSA)的比例的减小在1:1、1:5和1:10的比例下测量。可以清楚地看到，随着体积比例增加，检测信号增加。因此，生物学样品体积比生物学靶标的比例的减小导致检测之前生物学靶标的浓缩，因此导致较低的信噪比以及亲和力测定的更大灵敏度。

图7A示出建立如上文所述的用于心肌肌钙蛋白-I (cTnI)的3-表位亲和力测定的初步实验的数据，心肌肌钙蛋白-I (cTnI)是用来确定心肌缺血发病率的心脏标志物。将生物学靶标cTnI与第一捕获部分60nM的MAb2(来自BiosPacific)预温育10分钟，然后将溶液注射入MagnoTech测定，并且生物学靶标cTnI结合至与磁珠相关的第二捕获部分a-cTnI 560(来自Hytest)以及检测表面，这里为Magnotech装置的FTIR生物传感器表面。cTnI结合至检测表面通过多克隆抗体4T21/2(来自Hytest)介导。数据清楚地证实第一捕获部分和与磁珠相关的第二捕获部分的结合不抑制cTnI结合至检测表面或用Magnotech装置检测。

图7B示出来自与图7A中相似的建立PSA的3-表位亲和力测定的实验的数据。

图8图示热切割的实例，其中从颗粒切割第一捕获部分的步骤被从第一捕获部分切割生物学靶标代替。示出的是将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积之后的测定步骤。通过热切割从粘附至颗粒(这里为磁性颗粒803)的第一捕获部分802切割生物学靶标801，并且利用磁力去除粘附至磁性颗粒803的第一捕获部分802。随后以竞争性测定形式检测和/或定量生物学靶标801。通过第二捕获部分807重新捕获生物学靶标801，所述第二捕获部分807具有与其相关的试剂808，这里为磁珠。检测表面805包含第三捕获部分806，其为靶标类似物。捕获部分807上靶标801的存在减少试剂808结合至具有靶标类似物806的检测表面805。检测表面805上试剂808的存在减少或者抑制试剂808结合至检测表面805可以例如通过Magnotech装置上的FTIR来检测。

图9更详细地示出3-表位测定中的第一捕获部分不干扰检测。这可以从图6和图7扣除。具体地，比较夹心测定和3-表位测定以确定第一捕获部分如第三抗体对检测的影响。两条剂量反应曲线比较用PSA-10涂覆的珠和PSA-66涂覆的表面产生的夹心测定与用PSA-66涂覆的暗盒上的PSA-36珠和额外的PSA-10获得的3-表位测定。因为两种测定均具有相似的剂量反应曲线和1pM左右的灵敏度，所以第一捕获部分的存在不阻碍检测。

图10示出捕获时间常数的确定。一般来说，可以研究本发明的方法的步骤b)期间发生的第一捕获反应作为时间和颗粒浓度的函数。可以调整颗粒浓度以在选择的时间中高效捕获生物学靶标。当颗粒浓度增加时，捕获会快得多。对于现实分析时间，在这个实例中富集过程设计为不超过30分钟，而第一捕获部分的量优化为25μg捕获部分/mg颗粒。在该前景中，捕获温育时间固定在15分钟或900s。然而，如图10所示，在溶液中对于0.2mg/mL颗粒在5pM下需要30分钟以达到平衡。捕获过程不是线性过程，但是这可以模拟。生物学靶标与第一捕获部分之间的相互作用可以模拟为一阶速率表达式和之后的重排；捕获效率由如上文所示的方程I给出。对以下条件研究捕获过程：将5μL的2mg/mL的颗粒与45μL的PSA样品混合并温育不同时间直至平衡。图10中的结果使得能够如方程II所定义地估计τ，实验上约720s。τ取决于第一捕获部分的浓度，因此取决于颗粒浓度。在步骤b)中，使用不同浓度的颗粒。结果对于各浓度的颗粒，τ改变。然后如图10b所示，可以确定各颗粒浓度的捕获效率。

图11示出在30min的总测定时间中对各种体积浓缩因素的富集测定。将光信号相对于以pM计的PSA的终浓度作图。不同体积比例用于富集，生物学样品体积为5-400μL，而洗脱体积固定在5μL。

在这个实例中，将捕获的生物学靶标浓缩为洗脱体积用酶促洗脱来进行，以便保持该过程独立于生物学靶标如所关注的蛋白。在这个实例中酶用来切割颗粒与抗体之间的接头。该方法进行30分钟，包括本发明的方法的步骤b的15分钟，本发明的步骤c和d的10分钟，步骤e)的5分钟和30s。如图11所示，对0-50pM范围的PSA获得与参考剂量反应曲线相比富集的信号。富集剂量反应曲线的区别在于作为PSA的起始体积的生物学样品体积(V_S)与洗脱体积(V_el)之间的比例。生物学样品体积为5-400μL。将生物学样品与0.01mg的颗粒混合，将其浓缩至5μL。将洗脱液在生物传感器上检测。富集因子(ξ)通过计算富集测定获得的剂量反应曲线的斜率比参考的剂量反应曲线的斜率的比例获得自图11。图11显示当体积比例超过因子10时，样品有效浓缩。灵敏度的增加与体积比例的增加一致。

图12示出步骤c)的剂量反应曲线，即生物学靶标浓缩的剂量反应曲线。在这个实例中，对于30分钟的总测定时间，将肝素血浆池与缓冲液中的剂量反应曲线比较。在这个实例中，生物学靶标的浓缩联合酶促洗脱在生物基质中具有有效清理血浆的潜力，因为非特异性蛋白不可以用酶洗脱。图12证实富集在掺入靶标的肝素血浆池中是可行的。将血浆首先用抗PSA颗粒耗尽以确保该池不含PSA。将样品首先耗尽，然后掺入准确浓度的PSA。为了避免稀释，将颗粒直接重悬于血浆(V_P=0)中，并且颗粒与血浆的接触很大。如图12所示，血浆中获得的斜率在与富集x80的缓冲液中获得的斜率相同的范围中。两种基质令人惊讶地表现出相似的灵敏度。

对于前列腺癌的复发这是有意义的，靶向的PSA的范围实际上低于健康供体，一般为10-20pM。在缓冲液中，图12的x80的测定表现出10-20pM的饱和度。PSA测试靶向0.01-100ng/ml的范围，具有4-10ng/mL的癌症诊断的灰色地带。然而，前列腺癌中的复发病例显示需要高度灵敏的测试。PSA的情况是有趣的，因为通过浓缩捕获的生物学靶标，据证实灵敏度可以变换至检测活组织检查后癌症的复发。因此，对于相同的检测平台，测定可以富集并且可适用于两种应用：一般监测和高度灵敏的测定。

实施例

材料

除非另有说明，所有缓冲材料均由Sigma Aldrich Corporation提供。用羧酸基团官能化的超顺磁性颗粒(MasterBeads 500nm直径)购自Ademtech。筛选许多识别PSA上的各种表位的抗体对，并且发现其对利用光磁生物传感器技术检测非常有效。在这个工作中，我们集中在来自由作为捕获抗体的单克隆抗体PSA-10、作为第二重新捕获抗体的PSA-36和作为固定在传感器表面上的捕获抗体的PSA-66组成的对的结果。抗体由Fujirebio提供。校准品通过在来自20个看起来健康的供体的纯人肝素血浆池或PBS中的5%BSA(用于缓冲液实验)中稀释来制备自人PSA复合物(Fujirebio PSA试剂盒)。DNase购自Qiagen，并且在无菌不含RNAse的水中稀释。NEB EcoRI的x10浓缩缓冲液由NEBiolabs提供，用作洗脱缓冲液。在室温与振荡下于1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC,Sigma Aldrich)化学将抗体缀合1小时。用TSK-Gel SuperSW 3000柱(Tosoh Biosciences，300x4.6mm，4μm颗粒，25nm平均孔径)纯化缀合物，以0.25mL的60mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8每分钟的流速在环境温度下运行，在260和280nm下监测。捕获珠制备如下：将用500nM DNA偶联的PSA-10IgG偶联的2mg/mL的1:1链霉亲和素珠的混合物温育20分钟。然后，将珠洗涤并以2mg/mL重悬于PBS中的5%BSA中。将50μL 2mg/ml的捕获珠与PSA样品混合15分钟，然后将珠通过磁力洗涤并重悬于1:1DNase和NEB EcoRI x1中。10分钟洗涤之后，将珠通过磁力去除。将3.5μL洗脱物与3.5μL 2mg/mL的PSA-36涂覆的磁珠混合并直接注射入一次性暗盒。

实施例1

除了图6和图7所示的实验，本发明的亲和力测定还利用热切割来进行。对于这个实验，30ng/mL的阿片剂(来自Cerillian的DB1327)用作生物学靶标，第一捕获部分为来自NatuTec的吗啡-3抗体，并且颗粒为磁性颗粒。热切割步骤在50°C-95°C的温度范围中测试，80°C给出最佳结果。在检测表面上重新捕获生物学靶标通过在用BSA和阿片剂涂覆的FTIR生物传感器表面上捕获阿片剂来进行，并且检测在MagnoTech装置中利用第二捕获部分进行，其再次为与磁性颗粒相关的来自NatuTec的吗啡-3抗体。清楚地证实热切割从第一捕获部分释放靶标。

本发明描述的装置、方法和系统可以用于快速、稳健和容易地使用医疗点生物传感器。反应室可以为一次性物品，与包含一种或多种检测方法的紧凑型读数器一起使用。而且，本发明的装置、方法和系统可以用于自动化高通量测试。在这种情况下，反应室为例如装入自动化仪器的孔板或小杯。

虽然本发明已在附图和前文的描述中详细说明和描述，但是这样的说明和描述应当认为是说明性或示例性而不是限制性的；本发明并不限于公开的实施方案。本领域技术人员在实施所要求保护的发明中从附图、公开和所附权利要求的研究可以理解和实施公开的实施方案的其他变化。在权利要求中，词语“包含”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”不排除复数。某些测量在互相不同的从属权利要求中列举的事实不表示这些测量的组合不可以有利地使用。权利要求中的任何参考符号不应当理解为限制范围。

实施例2

捕获效率通过如上文图10中解释的捕获过程拟合来确定。结果如表1所总结的，洗脱效率可以推导自方程II。图11用来确定表1所述的实验数据，然后富集效率推导自来自图11的剂量反应曲线的斜率，并且导出洗脱效率。

表1：对应于图11的富集测定表。富集效率为富集剂量反应曲线的斜率比参考的剂量反应曲线的斜率的比值。捕获效率计算自方程I。从体积浓缩、富集效率和捕获效率确定洗脱效率。

这清楚地表明取决于方法所应用的限制，富集效率依赖于时间或样品体积或洗脱效率。对于短捕获时间(t<<τ)，富集效率与捕获时间、洗脱效率和洗脱体积直接相关。对于大于或等于τ的捕获时间，富集效率与样品体积和洗脱效率直接相关。如表1所示，对于900s，富集效率取决于样品体积和洗脱效率。捕获效率与样品体积成比例改变。结果对于约30%的各富集因子，发现导出的洗脱效率可以在相同范围中。对于这套数据，颗粒的量保持不变。因此，认为洗脱效率与生物学样品体积中颗粒的量直接相关。这通过两个简单的实验证实：洗脱在凝胶上进行，并且洗脱还在较小量的颗粒上进行。在凝胶上没有珠的第一尝试中，在10分钟内洗脱相同比例的DNA接头，为98%(±5%)。在第二个实验中，少10倍的颗粒用于富集。考虑到捕获效率的变化(从100%至92%)，在那种情况下发现洗脱效率为70%。结果，在洗脱期间加入越多颗粒，洗脱效率越低。这导致认为两种现象在洗脱期间竞争：化学反应和扩散。总之，该过程是稳定和可重复的。然而，如果改善扩散因子，可以改善富集测定。

总结附图和实实施例，证实本发明的方法可以用来浓缩生物学靶标例如以用于免疫测定检测。与样品制备中的传统方法相比，这种测定表现出相似或更好的回收率以及更有利的对免疫测定检测的适应性。测定斜率表现出18倍增加，并且具有80倍的体积浓缩的优化参数。所述方法可以在检测之前30分钟完成，并且注意到仍然可以有15倍提高。该过程在全血浆中也是有效的。良好的回收率与富集以达到高灵敏度的潜力的这种组合使得这种方法成为小型化形式的蛋白分析的非常有希望的方法，包括纯化、富集和检测。

Claims (14)

1.一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；

b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；

c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；

d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；

e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤e)中，所述第一捕获部分或第二捕获部分与另一捕获部分相关。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤e)中，所述生物学靶标与进一步的捕获部分相关。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，试剂与至少一种捕获部分相关，或者在竞争性亲和力测定形式的情况下，与所述生物学靶标的类似物相关。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述试剂选自：

放射性同位素；和/或

固相，例如磁珠或乳胶珠或检测表面；和/或

荧光、磷光和/或化学发光染料；和/或

酶和/或酶底物；和/或

核酸序列、肽；和/或

胶体或纳米颗粒；和/或

聚合物或大分子，例如树状聚体或脂质体。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积通过磁性分离或重力来进行。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述颗粒为磁性颗粒。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标通过酶促、热和/或光化学切割进行。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测和/或定量方法选自：

-光学检测，例如荧光、磷光、化学发光、吸收、散射、成像、瞬逝场技术、FTIR、表面等离子共振、拉曼、光谱学；和/或

-酶反应；和/或

-核酸扩增技术，例如免疫-PCR、滚环扩增；和/或

-磁性检测，例如通过磁致电阻、霍尔效应、线圈；和/或

-声波检测，例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体；和/或

-电检测，例如电导、阻抗、电流、氧化还原循环、电荷。

10.如权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述切割是酶促的，所述试剂为磁珠，并且所述生物学靶标与进一步的捕获部分相关。

11.一种生物学靶标的检测配置，其包括生物学靶标，第一、第二和第三捕获部分，其中试剂与第二和/或第三捕获部分相关，并且所述生物学靶标直接结合至所有三个捕获部分，从而使得能够检测。

12.如权利要求11所述的检测配置，其中所述生物学靶标通过表位结合至所有捕获部分。

13.一种用于如权利要求1-10所述的方法的捕获部分，其包含

a)用于附着至颗粒的第一实体(404)，

b)用于切割对颗粒的附着的第二实体(406)，以及

c)用于附着至检测表面的第三实体(407)。

14.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中加入所述生物学样品体积的第一捕获部分包含

a)用于附着至颗粒的第一实体(404)，

b)用于切割对颗粒的附着的第二实体(406)，以及

c)用于附着至检测表面的第三实体(407)。

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