CN109415752A - 磁性电化学传感 - Google Patents

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Abstract

目标分析物检测装置包括具有恒电位仪和耦合到恒电位仪的微控制器的壳体。该装置还包括基板，所述基板在基板的第一表面上具有多个电极。所述多个电极中的第一组电极限定第一样品检测区域。基板可拆卸地连接到壳体，使得在将基板连接到壳体时第一组电极耦合到恒电位仪。该装置还包括可耦合到基板的第二表面的磁体组件。该磁体组件包括位于磁体组件中的磁体，使得在将磁体组件耦合到基板上时，来自磁体的磁场穿过基板和第一组电极延伸到第一样品检测区域上方的区域中。

Description

磁性电化学传感
相关申请的交叉引用
本发明要求于2016年1月27日提交的第62/287,719号美国临时申请、于2016年1月28日提交的第62/288,254号美国临时申请和于2016年5月20日提交的第62/339,519号美国临时申请的优先权，所有这些文献都通过引用整体并入本发明。
技术领域
本发明涉及使用磁性电化学传感检查分析物的系统和技术。
背景技术
通常检查生物样品中特定分析物诸如肽、蛋白质、脂质代谢物和其它小分子的存在和普遍性。在一些情况下，特定分析物的存在和普遍性可以提供对受试者的特定生物或致病过程、特定疾病的进展或一些其它生物学状况的了解。在一些情况下，特定分析物的存在和普遍性可以提供对特定物质或材料的组成的了解。
发明内容
在一个方面，本发明提供了目标分析物检测装置，其包括含有恒电位仪和耦合到恒电位仪的微控制器的壳体。该装置还包括在基板的第一表面上具有多个电极的基板。所述多个电极中的第一组电极限定了第一样品检测区域。基板可以被可拆卸地连接到壳体，使得在将基板连接到壳体时，第一组电极被耦合到恒电位仪。该装置还包括可耦合到基板的第二表面的磁体组件。磁体组件包括位于磁体组件中的磁体，使得在将磁体组件耦合到基板时，来自磁体的磁场穿过基板和第一组电极延伸到第一样品检测区域上方的区域中。
该方面的实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，壳体可以包含数模转换器(DAC)电路。DAC的输出可以电耦合到恒电位仪的输入。壳体还可以包含模数转换器(ADC)电路。包含电路的输入可以耦合到恒电位仪的输出。壳体还可以包含电耦合到DAC电路和ADC电路的微控制器。该微控制器可以被配置为向DAC电路的输入提供电压信号。微控制器可以被配置为从ADC电路的输出接收测量信号。
在一些实施方案中，所述装置可包括多个恒电位仪。多个电极可包括至少一组另外的电极。每组电极可以耦合到多个恒电位仪的不同的相应恒电位仪，并且每组电极可以限定不同的相应样品检测区域。
在其它实施方案中，所述装置可包括电耦合到多个恒电位仪中的每个恒电位仪的输出的多路复用器。多路复用器可以被配置为将所选输出电耦合到ADC电路的输入。
在一些实施方案中，所述装置可包括布置在基板表面上的孔板，所述孔板具有多个孔。多个孔中的每个孔可以被直接布置在不同的相应样品检测区域上。
在一些实施方案中，磁体组件可包括多个磁体。在将磁体组件耦合到基板上时，所述多个磁体中的每个磁体可以定位在基板附近并与相应的一组电极对齐，使得磁场从磁体穿过基板和相应的电极组延伸到由相应的一组电极限定的样品检测区域上方的区域中。
在另外的实施方案中，基板可以包括卡缘连接器(card-edge connector)，并且壳体可以包括卡缘连接器插座。在一些实施方案中，该装置还可以包括电子通信接口。在其它实施方案中，电子通信接口可以包括：至少一个通用串行总线连接器或无线收发器。在一些实施方案中，第一组电极可包括三个独立的电极。在其它实施方案中，三个独立的电极中的第一电极和第二电极可以是第一金属，并且三个独立的电极中的第三电极可以是第二金属。在一些实施方案中，第一组电极可以由两个独立的电极组成。在一些实施方案中，第一组电极可包括交叉指型电极。
在一些实施方案中，壳体可以进一步包含电源和耦合到微控制器的收发器。在一些实施方案中，该装置还可以包括耦合到微控制器的显示器。
通常，在另一方面，本发明提供了检测目标分析物的存在的方法。新方法包括向第一流体样品提供多个磁珠。多个磁珠包括特异性结合目标分析物的第一结合部分。该方法还包括允许多个磁珠结合第一流体样品内的目标分析物，并将磁珠从第一流体样品转移到第二流体样品。第二流体样品包括特异性结合目标分析物的第二结合部分。第二结合部分可以与活性酶或其它报道基团(reporter group)结合。转移磁珠可包括将护套浸入第一流体样品内，将磁体放置在被浸入第一流体样品内的护套内，使得磁珠粘附到护套上，从第一流体中移除包含磁体的护套，并将含有磁体的护套浸入第二流体样品中。
该方法还包括允许第二流体样品内的第二结合部分结合到与磁珠的第一结合部分结合的目标分析物，将包含多个磁珠和第二结合部分的第二流体样品与电子介体溶液(electron mediator solution)组合以获得第三流体样品，并将第三流体样品提供至基板的样品检测区域。样品检测区域可以是第一电极或布置在第一电极上。该方法还包括将第三流体样品暴露于磁场以将多个磁珠保持在第三流体样品中靠近第一电极的位置。第一电极被电耦合到恒电位仪。该方法还包括在第三流体样品内的电子介体和活性酶之间诱导氧化还原反应，并监测恒电位仪的输出以确定第三流体样品中目标分析物的存在。通过氧化还原反应改变恒电位仪的输出。
该方面的实施方案可包括一个或多个下列特征。在一些实施方案中，诱导氧化还原反应可包括将电位施加到第二电极，使得发生氧化还原反应，其中第二电极被电耦合到恒电位仪。
在其它实施方案中，监测恒电位仪的输出可以包括测量来自第一电极的电压或电流。来自第一电极的电压或电流可以根据氧化还原反应而变化。在一些实施方案中，监测恒电位仪的输出可以包括从多个不同的恒电位仪的输出中选择恒电位仪的输出，将所选择的输出提供给微控制器单元，并在显示器上呈现所选择的输出。在一些实施方案中，活性酶可包括辣根过氧化物酶(HRP)，且电子介体溶液包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
在一些实施方案中，目标分析物可包括细胞外囊泡。在一些实施方案中，细胞外囊泡可包括外泌体。在一些实施方案中，目标分析物可包括CD24、EpCAM、CA125、EGFR、HER2、MUC1、CD44、CD44v6、CEA、间皮素、Trop2、GPC1、WNT2、Grp94、SSTR2、EGFRv3、IDH1-R132、GPA33、KRAS、CD166、CD133、MET、B7H3、CD63、CD9和CD81生物标志物中的任一种。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将恒电位仪的输出与参考水平进行比较以确定输出是高于还是低于参考水平，并基于该比较诊断患者体内癌症的存在或不存在。
在一些实施方案中，目标分析物可包括免疫细胞标志物，诸如CD2、CD3、CD45、CD52、HLA-ABC、CD81、CXCL10或CXCL9生物标志物。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将恒电位仪的输出与参考水平进行比较以确定输出是高于还是低于参考水平，并基于该比较诊断患者是否排斥器官移植。
在一些实施方案中，第一流体样品可包括血液或尿液。在多个实施方案中，目标分析物可包括蛋白质、细胞、肽、蛋白质、脂质、毒素、核酸、微生物、食物抗原或代谢物。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括将食物样品与提取缓冲液组合以提供第一流体样品，并将食物样品与提取缓冲液一起温育以从食物样品中提取目标分析物。
通常，在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包括样品管、样品管帽、包含第一磁体的细长杆和目标分析物检测装置，例如，如本发明所述的装置。目标分析物检测装置包括壳体、壳体中的恒电位仪、以及包括多个电极的第一基板。所述多个电极包括限定第一样品检测区域的第一组电极。第一基板被配置为可拆卸地连接到壳体，使得当第一基板被连接到壳体时将第一组电极耦合到恒电位仪。目标分析物检测装置还包括第二磁体，第二磁体被配置为邻近第一基板定位，使得来自磁体的磁场穿过基板和第一组电极延伸到第一样品检测区域上方的区域中。
该方面的实施方案可包括一个或多个以下特征。在一些实施方案中，样品管帽可包括延伸到细长护套中的开口。细长杆的尺寸可以被设计成配合在细长护套内。
在一些实施方案中，试剂盒可包括具有多个磁珠的提取缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、目标分析物缓冲溶液和氧化酶缓冲溶液。
在一些实施方案中，目标分析物检测装置可包括数模转换器(DAC)电路。DAC的输出可以电耦合到恒电位仪的输入。目标分析物检测装置还可以包括模数转换器(ADC)电路。ADC电路的输入可以耦合到恒电位仪的输出。目标分析物检测装置还可以包括电耦合到DAC电路和ADC电路的微控制器。该微控制器可以被配置为向DAC电路的输入提供电压信号。微控制器可以被配置为从ADC电路的输出接收测量信号。在一些实施方案中，目标分析物检测装置可以包括显示器。
在一些实施方案中，所述试剂盒还可包括第二基板，所述第二基板具有限定第二样品检测区域的另外的多个电极。第二基板可以被配置为可拆卸地连接到壳体。在其它实施方案中，试剂盒可以包括第三磁体。第三磁体可以被配置为可拆卸地连接到第二基板。
所描述的一个或多个实施方案可以提供各种益处。例如，磁性电化学传感系统的实施方案可用于非侵入性地检查生物样品中特定分析物诸如肽、蛋白质、脂质代谢物和其它小分子的存在和普遍性。在一些情况下，该信息可以提供对特定生物或致病过程、特定疾病的特定进展或一些其它生物学状况的了解。在一些情况下，这些信息可以提供对特定物质组成的深入了解。
在一些情况下，可以分析样品而无需进行大量可能需要专门的设备的处理技术(例如，过滤或离心)。因此，用户可以更容易地和/或以更具成本效益的方式分析样品。在一些情况下，用户可以快速检查每个样品，使得可以高效检查许多样品中是否存在一种分析物或多种不同的分析物。在一些情况下，非专业用户可以在没有经验丰富的技术人员的帮助下自行进行检查，而无需昂贵的设备。
此外，在一些情况下，细胞特异性细胞外囊泡(例如，外泌体、微泡、膜颗粒和凋亡小泡或囊泡)可以直接从复杂培养基中分离，而无需大量过滤或离心。此外，该测定可以通过磁性富集和酶促扩增实现高检测灵敏度。此外，通过电检测方案，传感器可以被小型化和扩展以用于平行测量。
除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入。如果发生冲突，以包括定义的本说明书为依据。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在限制。
除非另有说明，“目标分析物”是指特定类型的单个目标分析物或相同类型的多个目标分析物。
除非另有说明，“特异性结合”是指在结合部分和特定类型的分析物之间形成键。
在附图和以下描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求，其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1是用于检查分析物的磁性电化学传感系统的实例的示意图。
图2是使用磁性电化学传感系统的实例的图表。
图3是用于检查分析物的仪器的另一个实例的图表。
图4A和4B是用于检查分析物的仪器的另一个实例的图表。
图4C是图4A和图4B中所示仪器的示意图。
图5A和5B是用于检查分析物的仪器的另一个实例的图表。
图5C是图5A和图5B中所示仪器的示意图。
图6A-6C是用于检查分析物的仪器的另一个实例的图表。
图6D是样品卡的实例的图表。
图6E和6F是显示装置的实例的图表。
图7A-7C是控制应用程序的图形用户界面(GUI)的实例的图表。
图8是样品处理工具的实例的图表。
图9是使用图8中所示的样品处理工具的实例的图表。
图10是计算机系统的实例的图表。
图11是小型化磁性电化学传感系统(集成的磁-电化学外泌体系统，iMEX)的实例的图表。
图12A是低通滤波器的实例的示意图。
图12B示出了iMEX传感器和商业系统(SP200,Bio-Logic)之间的测量结果的比较。
图13A-13D是iMEX系统的电路图。
图14是包装的iMEX系统的图表。
图15是用于定制软件与iMEX系统交互的示例图形用户界面的图表。
图16是iMEX测定的示意图。
图17是iMEX测定的另一示意图。
图18是iMEX测定中的电化学测量的示意图。
图19A示出了磁珠尺寸对测量电流的影响。
图19B示出了磁性富集对测量信号的影响。
图20示出了癌症细胞外囊泡中三种四次跨膜蛋白标志物(CD63、CD9和CD81)的信号比较。
图21示出了iMEX和ELISA之间的比较。分析了在两种卵巢癌细胞系(OV90和OVCA420)中的六种表面蛋白。
图22示出了当将不同数量的细胞外囊泡掺入人血浆中时iMEX和ELISA测定之间的比较。
图23示出了卵巢癌细胞中表面蛋白及其分泌的细胞外囊泡的分析。
图24示出了用于临床样品分析的iMEX测定。
图25示出了使用iMEX测定获得的来自卵巢癌患者(n＝11)和健康对照组(n＝5)的血浆样品的分析。
图26示出了使用iMEX测定获得的来自卵巢癌患者的血浆样品中的EpCAM、CD24和CA125水平。
图27示出了使用iMEX测定对药物治疗反应的纵向监测。
图28是肾中T细胞衍生的细胞外囊泡(EV)分泌小管的示意图。
图29示出了肾移植排斥患者活组织检查样品的组织学。
图30示出了用于检测Jurkat T细胞衍生的细胞外囊泡的96孔板形式的iMEX系统、由CD3抗体功能化的磁珠捕获的EV的扫描电子显微镜(SEM)图像、通过iMEX的Jurkat衍生的EV检测的滴定曲线的示意图和iMEX的示意图。
图31A示出了当在发现组中用iMEX测定检测具有CD3表达的EV时的测量电流。
图31B示出了用于确定发现组中CD3标志物的灵敏度、特异性和准确性的ROC曲线。
图32A示出了当在验证组中用iMEX测定检测具有CD3表达的EV时的测量电流。
图32B示出了用于确定验证组中CD3标志物的灵敏度、特异性和准确性的ROC曲线。
图33A：磁性电化学传感系统(集成外源抗原检测系统，iEAT)。
图33B是示例性iEAT测定技术的图表。
图34是iEAT系统的示意图。
图35示出了iEAT性能与商业设备(SP-200,Bio-Logic)之间的比较基准。
图36A示出了用2-ME缓冲液提取Ara h1的实例。
图36B和36C示出了三种提取缓冲液对于五种测试抗原的性能。
图37示出了加热装置的实例。
图38A示出了花生过敏原滴定的电流测量值。
图38B示出了在对样品施加还原电位之后的动态电流响应。
图39A和39B示出了储存后冻干试剂的活性。
图40A和40B示出了各种过敏原的生成响应曲线。
图40C示出了通过测量三种不同浓度的标准品所估计的测定内变化。
图40D示出了iEAT结果和ELISA测量值之间的比较。
图40E示出了各种目标和非目标样品之间的信号响应的比较。
图41A和41B示出了使用iEAT系统获得的分析结果。
图41C示出了用于与iEAT系统交互的智能手机应用程序的示例性图形用户界面。
图41D示出了使用iEAT系统(左)获得的分析结果，以及用于与iEAT系统交互的智能手机应用程序的示例性图形用户界面。
图42是检测目标分析物的存在的方法的实例的流程图。
具体实施方案
本发明描述了使用磁性电化学传感检查分析物的系统和技术。本发明描述的一个或多个实施方案可用于鉴别分析物诸如细胞、细胞外囊泡(EV)(诸如微泡、膜颗粒、凋亡小泡或囊泡)或外泌体(例如，跨膜和胞质蛋白、mRNA、DNA和微小RNA)、肽、蛋白质、脂质、代谢物和其它分子，其为自由漂浮的(例如，在血清或溶液中)或在生物结构的表面上表达的(例如，在细胞外囊泡或细胞的表面上)。
在实施方案的实例中，从受试者中收集样品(例如，生物流体样品，诸如血液或尿液)。使用磁性分离处理样品，使得感兴趣的特定分析物(例如，指示特定生物或致病过程、特定疾病的特定进展或一些其它生物学条件的分析物)在测量仪器的样品探针附近被分离和/或聚集。随后使用测量仪器经由电化学检测来研究样品中这些分析物的存在和/或普遍性。所得的信息可用于为受试者提供更有效的护理(例如，通过使护理人员能够以更明智的方式进行诊断和/或施用治疗)。
在实施方案的另一个实例中，从物质收集样品。使用磁性分离处理样品，使得感兴趣的特定分析物(例如，指示特定材料或抗原的分析物)在测量仪器的样品探针附近被分离和/或聚集。随后使用测量仪器经由电化学检测来研究样品中这些分析物的存在和/或普遍性。所得的信息可用于提供对物质组成的深入了解。作为实例，可以分析食品的样品中是否存在特定的过敏原，使得消费者可以对他的饮食做出更明智的选择。
在一些情况下，可以分析样品而无需进行大量可能需要专门的设备的处理技术(例如，过滤或离心)。因此，用户可以更容易地和/或以更具成本效益的方式分析样品。在一些情况下，用户可以快速检查每个样品，使得可以高效检查许多样品中是否存在一种分析物或多种不同的分析物。在一些情况下，非专业用户可以在没有经验丰富的技术人员的帮助下自行进行检查，而无需昂贵的设备。
用于检查分析物的系统100的实例示意性地示于图1。系统100包括电耦合到探针120的恒电位仪110。系统100还包括模数转换器(ADC)130、微控制器单元(MCU)140、数模转换器(DAC)150和磁体组件160。
探针120包括三个电极：“参比”电极122a，“对”电极122b和“工作”电极122c。在系统100的操作期间，这些电极122a-c中的每一个被放置成与待分析的流体样品接触。磁体组件160(例如，放置在探针120附近)将流体样品中的磁性标记颗粒吸引到电极122a-c(例如，通过引入穿过电极延伸的磁场)。在一些情况下，表面或电极122a-c中的一个或多个可以统称为样品检测区域。
恒电位仪110电耦合到电极122a-c中的每一个，并且被配置为在操作期间维持工作电极122c和参比电极122a之间的预定电位差。此外，恒电位仪110被配置为测量从工作电极122c穿过对电极122b感应的电流。
如图1所示，恒电位仪110包括两个运算放大器112a和112b。第一运算放大器112a电耦合到工作电极122c，并且被配置为维持工作电极122c和参比电极122a之间的预定电位差(例如，通过向工作电极122c施加电位作为相对于参比电极122a的电位的偏差)。在一些情况下，电位可以在大约-1.65V和大约1.65V之间。在一些情况下，电位可以是大约-0.1V。第二运算放大器112b电耦合到参比电极122a和对电极122b，并且被配置为跨阻放大器，以将从工作电极122c穿过对电极122b感应的电流转换为电压信号。
电极122a-c可以由各种材料制成。在一些情况下，工作电极122c和对电极122b可以部分地或全部地由第一材料(例如，金)制成，并且参比电极122a可以部分地或全部地由第二材料(例如，银或氯化银)制成。在一些情况下，不同的材料可用于一些或所有电极122a-c。在一些情况下，不同的材料可以通过增加电极的有效表面积来增加信号水平。
恒电位仪110电耦合到ADC 130，使得电压信号(指示从工作电极122c穿过对电极122b的电流)被传输到ADC 130。ADC 130将电压信号数字化(例如，成为表示电压信号的数字信号)，并将数字化的电压信号传输到MCU 140进行处理。
MCU 140处理数字化的电压信号。在一些情况下，MCU 140可以基于数字化的电压信号确定样品的特定特征。例如，基于数字化的电压信号，MCU140可以确定样品中是否存在特定分析物。作为另一个实例，基于数字化的电压信号，MCU可以确定样品中分析物的绝对浓度和/或相对浓度。
MCU 140还被配置为经由DAC 150控制恒电位仪110的操作。例如，MCU 140可以将数字控制信号传输到DAC 150，并且DAC 150可以将数字控制信号转换成相应的模拟信号。这些模拟信号可用于控制恒电位仪110的操作。作为实例，MCU 140经由DAC 150可以增加和/或减小工作电极122c相对于参比电极122a的电位，并通过将模拟信号应用到运算放大器112a和112b的输入端来控制从工作电极122c穿过对电极122b的电流采样。
尽管参考图1描述了三电极的实施方案，但可以理解，可以使用其它结构来测量样品内的感应电流。例如，可以使用诸如双工作电极的结构(例如，交叉指型电极阵列(IDA))或双电极的结构(例如，不包括对电极)。
图2中示出了系统100的示例性用法。在该实例中，系统100用于分析流体样品202中是否存在分析物204。
如小图200所示，流体样品202(包含分析物204)与含有磁珠206的溶液混合。每个磁珠206包括磁芯208，以及一个或多个涂覆在磁芯208的表面上的特异于分析物204的结合部分210。
在混合时，由于结合部分210和分析物204之间的相互作用，分析物204被磁珠206捕获。可以洗涤样品202以去除未结合的分析物204(例如，通过磁性收集磁珠206，和将收集的磁珠206转移到新鲜的样品缓冲液中)。
如小图240所示，样品202与含有第二分子242的溶液混合。每个第二分子242包括特异于分析物204的结合部分244。在混合时，由于结合部分244与分析物204之间的相互作用，第二分子242也被磁珠206捕获。可以洗涤样品202以除去未结合的第二分子242。
如小图260所示，样品202与含有第三分子262的溶液混合。每个第三分子262包括特异于第二分子242的结合部分264和活性酶266。示例性活性酶266包括氧化酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在混合时，由于结合部分264和第二分子242之间的相互作用，第三分子262也被磁珠206捕获。可以洗涤样品202以去除未结合的第三分子262。
如小图280所示，样品202与电子介体溶液混合，并应用到探针120。根据活性酶266，可以使用不同的电子介体溶液。例如，如果活性酶266包括HRP，则电子介体溶液可包括诸如ABTS(2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)、OPD(邻苯二胺二盐酸盐)和/或TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)的水溶性底物。作为另一个实例，如果活性酶266包括碱性磷酸酶，则电子介体溶液可以包括诸如PNPP(对硝基苯磷酸盐)的水溶性底物。作为另一个实例，如果活性酶266包括β-半乳糖苷酶，则电子介体溶液可以包括诸如ONPG(邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)、Nap-Gal(萘酚-AS-B1-β-D-吡喃半乳糖苷酶)和/或MUm-Gal(4-甲基-伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷酶)的水溶性底物。
由于磁体组件160在探针120下方引起的磁场，磁珠206被吸引朝向探针120。此外，由于穿过探针120的工作电极122c和参比电极122a感应的电位，在电子介体和氧化酶之间诱导了氧化还原反应。结果，从探针120的工作电极122c穿过对电极122b感应出电流。相应地，该电流由运算放大器112a转换成电压信号，电压信号由ADC 130数字化，并且由MCU 140解读数字化的电压信号。
通常，在探针120中感应的电流可以与样品202中分析物204的存在和/或浓度相关。例如，如果样品202包含相对高浓度的分析物204，则更多数量的分析物将被磁珠206捕获。相应地，更多数量的第二分子242和第三分子262也将被磁珠206捕获，并且使其与探针120接近。这导致更多数量的氧化酶可用于与电子介体溶液反应。因此，氧化还原反应在对电极122b处产生相对较高的电流。
相反，如果样品202含有相对低浓度的分析物204，则较少数量的分析物204将被磁珠206捕获。相应地，较少数量的第二分子242和第三分子262将被磁珠206捕获，并且使其与探针120接近。这导致只有较少数量的氧化酶可用于与电子介体溶液反应。因此，氧化还原反应在对电极122b处产生相对较低的电流。
此外，如果样品202不含任何分析物202，则基本上没有分析物将被磁珠204捕获。相应地，基本上没有第二分子242和第三分子262将被磁珠捕获。因此，基本上没有氧化酶可用于与电子介体溶液反应。因此，在对电极122b处基本上不会感应出电流。
在一些情况下，MCU 140可以基于感应电流估计分析物204的绝对浓度和/或相对浓度。例如，在一些实施方案中，可以凭经验确定感应电流和分析物浓度之间的相关性(例如，通过获得具有已知分析物浓度的样品，测量由分析过程产生的感应电流，并导出描述浓度与感应电流之间的关系的函数)。随后，可以通过根据确定的相关性校准观察到的电流测量值来估计未知样品的浓度。在一些情况下，根据分析物、磁珠、第二和第三分子和/或其它参数，感应电流和分析物浓度之间的相关性可以不同。因此，可以为每组参数确定不同的相关性，并且可以适当地进行选择性应用以解读当前测量值。
通常，磁珠206包括一个或多个内磁芯和外涂层，例如封盖聚合物(cappingpolymer)。磁芯可以是单金属(例如，Fe、Ni、Co)，双金属(例如，FePt、SmCo、FePd、FeAu)，或者可以由铁氧体(例如，Fe2O3、Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4、CoFe2O4)制成。磁性颗粒的尺寸可以是纳米或微米级，并且可以是反磁性的、铁磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，其中尺寸对应于平均直径或平均长度。例如，磁性颗粒可具有约10μm、约1μm、约500nm、约300nm或约100nm的尺寸。在一些情况下，尺寸为约10μm的磁性颗粒可有利于降低测定期间的沉降程度。其它粒径也是可能的。颗粒的外涂层可以增加其水溶性和稳定性，并且还可以提供用结合部分进一步表面处理的位点。
通常，结合部分是合成的或天然的分子，其特异性结合或以其它方式连接至目标分子(例如与其共价或非共价结合或与其杂交)，或与另一结合部分(或者，在一些实施方案中，与聚集诱导分子)相连。例如，结合部分可以是与特异互补的核酸目标杂交的合成寡核苷酸。结合部分也可以是针对抗原或任何蛋白质-蛋白质相互作用的抗体。而且，结合部分可以是结合相应目标的多糖。在一些实施方案中，可以设计或选择结合部分以在与另一个结合部分结合时用作目标分子(例如溶液中的酶)的底物。结合部分包括例如寡核苷酸、多肽、抗体和多糖。例如，链霉抗生物素蛋白每个分子具有四个将被生物素识别的位点(结合部分)。对于任何给定的分析物，例如具有特异性表面标志物的特定类型的细胞，通常存在许多相关领域的技术人员已知的已知结合部分。
在一些情况下，系统可以作为分析仪器实施。作为实例，图3示出了用于使用磁性电化学传感检查分析物的仪器300。仪器300包括壳体310，壳体310包围图1中所示的恒电位仪110、ADC 130、MCU 140和DAC 150。仪器300还包括沿壳体300的外部暴露的孔320，探针120沿着孔320的底部定位，并且磁体组件160定位在探针120的下方。这种配置使用户能够将流体样品(例如，已经根据图2描述的方法处理的样品)应用到孔320，使得其停留在探针120的顶上，并使用仪器300确定流体样品中特定分析物的存在和/或普遍性。在一些情况下，仪器300可以将关于分析的流体样品的信息输出到显示装置330(例如，显示屏或显示器)上和/或将信息输出到计算装置340用于进一步分析(例如，计算机、智能电话、服务器系统或其它计算装置)。
在图3所示的实例中，仪器包括具有单个探针的单个孔，用于一次分析单个样品。然而，在一些情况下，仪器可以包括多个不同的孔和探针，使得可以同时或顺序地分析多个样品。这可以是有用的，因为例如，它使用户能够以更有效的方式处理多个样品。
作为实例，图4A和4B分别以组装视图和分解视图示出了仪器400。如图4A和4B所示，仪器400包括壳体410、沿壳体400的外部暴露的若干孔420a-h、以及位于每个孔410a-h下方的磁体组件160a-h。此外，仪器400包括多个恒电位仪110a-h，每个恒电位仪电耦合到沿相应的孔420a-h的底部定位的相应探针120a-h。以与图3描述的类似方式，用户可以将一个或多个流体样品(例如，已经根据图2描述的方法处理的样品)应用到一个或多个孔420a-h中，并使用仪器400确定流体样品中的特定分析物的存在和/或普遍性。类似地，仪器400可以将关于分析的流体样品的信息输出到显示装置430(例如，显示屏或显示器)上和/或将信息输出到计算装置440用于进一步分析(例如，计算机、智能手机、服务器系统或其它计算装置)。
在一些情况下，每个磁性组件160a-h可包括对应于每个孔420a-h的一个或多个单独的磁体(例如，每个孔420a-h下方的嵌入式磁体。在一些情况下，磁性组件160a-h可包括在多个不同的孔420a-h之间延伸的一个或多个磁体)。
在一些情况下，仪器400可以包括多路复用器以将恒电位仪的输出电耦合到MCU，使得MCU可以选择性地从每个恒电位仪恢复信号，并选择性地确定孔中每个样品的特性。
作为实例，在图4C中示意性地示出仪器400。仪器400包括若干恒电位仪110a-h(例如，在图4C中的“x8”标记所示总共8个)，每个恒电位仪电耦合到相应的探针120a-h。仪器400还包括ADC 130、MCU 140、DAC 150和磁体组件160a-h。这些组件中的每一个可以如图1所描述的那样类似地操作。
然而，在该实例中，仪器400包括多路复用器450，其将恒电位仪110a-h的输出电耦合到MCU 140(经由ADC 130)。多路复用器450选择来自恒电位仪110a-h之一的电压信号，并将信号转发到ADC 130和MCU 140。因此，单个ADC 130和MCU 140可以被配置为选择性地恢复来自多个不同探针120a-h的信号，并选择性地确定孔中每个样品的性质。在一些情况下，多路复用器450可以由用户控制(例如，通过开关、拨号盘、按钮、触摸屏或其它控制机制)。在一些情况下，多路复用器450可以由MCU 140控制(例如，通过从MCU 140传输到多路复用器450的指示特定选定孔的控制信号)。这可以是有用的，因为例如，它使MCU 140能够自动选择孔进行分析(例如，以顺序方式或根据一些其它模式自动地从孔中收集测量值)。
尽管图4中示出的仪器400包括八个孔(和八个相应的探针和恒电位仪)，这仅仅是说明性的实例。在实践中，装置可包括任何数量的孔、探针和恒电位仪(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)。
此外，在一些情况下，多路复用器可用于将多个不同探针的输出电耦合到公共恒电位仪。这可以是有用的，因为例如，它使单个恒电位仪能够测量多个不同样品的性质，这可以降低生产仪器的复杂性和/或成本。
仪器500的另一个实例示于图5A-C中。仪器500包括壳体510、沿壳体510的外部暴露的多个孔520、以及定位在每个孔520下方的磁体组件160。此外，仪器500包括多个恒电位仪110，每个恒电位仪电耦合到沿着相应的孔520的底部定位的相应探针120。
孔520可具有与标准化96孔板类似的布置和类似尺寸(例如，根据美国国家标准协会ANSI和/或实验室自动化与筛选协会SLAS制定的规范制造的96孔板)。这可以是有用的，因为例如，它使用户能够使用通常可用的设备(例如，标准化的多通道移液管)来从仪器500加载和卸载样品。
如图5B所示，孔520和恒电位仪110的电极可以使用一系列层来实现。例如，孔520可以设置在顶层530中，并且恒电位仪110的电极可以设置在底层540(例如，基板，诸如印刷电路板)上。顶层530可以定位在底层540上方，使得每个孔520与下面的相应电极对齐。这可以是有用的，因为例如，可以更容易地制造仪器500(例如，因为可以使用单个PCB制造工艺制造多组电极)。
在一些情况下，恒电位仪110的电极可以形成在基板上，诸如陶瓷基板、玻璃基板、刚性塑料基板、纸基板、柔性聚合物基板(例如，PDMS)、硅酮基板和/或PCB。在一些情况下，磁体组件可包括相对于基板定位的一个或多个磁体，使得来自磁体的磁场延伸穿过基板(例如，以将磁珠吸引到基板和在其上形成的电极)。在一些情况下，磁体组件也可以形成在基板上(例如，与一个或多个电极相同的基板，或独立的基板)。
仪器500在图5C中示意性地示出。以与图4C描述的类似方式，仪器500包括多个恒电位仪110，每个恒电位仪110电耦合到相应的探针120。仪器500还包括ADC 130、MCU 140、DAC 150和磁体组件160。类似地，仪器500包括多路复用器450，其将恒电位仪110的输出电耦合到MCU 140(经由ADC 130)。多路复用器450选择来自恒电位仪110之一的电压信号，并将信号转发到ADC 130和MCU 140。因此，单个ADC 130和MCU 140可以被配置为选择性地恢复来自多个不同探针120的信号，并且选择性地确定孔中每个样品的性质。
仪器500还包括可编程的增益放大器(PGA)550，其在多路复用器450和ADC 130之间电耦合。PGA 500可以被配置为自动改变来自多路复用器450的信号的放大增益，并且最大化或以其它方式增加仪器500的检测动态范围。
仪器500还包括驱动器560，其在DAC 150和恒电位仪110之间电耦合。驱动器560可以被配置为基于从DAC 150接收的信号将电流传送到恒电位仪的电极。这可以是有益的，例如，因为一些DAC可能无法或不适合向大量装置传送电流。
在一些情况下，系统可以实现为便携式装置。作为实例，图6A示出了用于使用磁性电化学传感检查分析物的便携式装置600。装置600包括包封ADC 130、MCU 140和DAC 150的壳体610。装置600还包括电池模块620、通信接口630、样品接口640a和640b以及显示装置650。
通常，恒电位仪110、ADC 130、MCU 140和DAC 150可以以与图1描述的那些类似的方式起作用。例如，ADC 130可以从恒电位仪110接收电压信号(该电压信号对应于从工作电极122c穿过对电极122b感应的电流)、数字化电压信号、并将数字化的信号传输到MCU 140进行处理。类似地，MCU140可以处理数字化的电压信号以确定特定分析物的存在和/或普遍性，并且经由DAC 150控制恒电位仪的操作。
在该实例中，装置600不包括壳体610内的样品探针。相反，装置600包括两个样品接口640a和640b(例如，通信端口或连接器)，用户可以通过其插入包含一个或多个探针的样品卡(以及一个或多个相应的孔和磁体组件)。
例如，如图6B所示，用户可以将具有单个探针(以及单个相应的孔和磁体组件)的样品卡650a插入样品接口640a中，并且探针可以电耦合到壳体610内的相应恒电位仪。样品卡650a例如可以经由作为基板的一部分包括或位于样品卡650a的基板上的卡缘连接器(例如，针头、插座或插口)耦合到样品接口640a。这使得基板能够被可拆卸地连接到装置600的其余部分(例如，壳体和/或装置600的其它部分)，使得在将基板连接到装置600(例如，壳体)时电极被耦合到恒电位仪。
作为另一个实例，如图6C所示，用户可以将具有多个探针(以及多个相应的孔和磁体组件)的样品卡650b插入到样品接口640b中，并且每个探针可以电耦合到壳体610内的相应恒电位仪。类似地，样品卡650b例如可以经由作为基板的一部分包括或位于样品卡650b的基板上的卡缘连接器(例如，针头、插座或插口)耦合到样品接口640b。类似地，这使得基板能够被可拆卸地连接到装置600的其余部分(例如，壳体和/或装置600的其它部分)，使得在将基板连接到装置600(例如，壳体)时电极被耦合到恒电位仪。
这可以是有用的，因为例如，它使用户能够根据他的需要定制装置600。此外，这使得用户能够部分地拆卸装置600，这可以便于维护，并且可以更方便地存储或运输。在一些情况下，一个或多个恒电位仪也可以包括在样品卡上(例如，而不是包括在壳体610内)。
在一些情况下，样品卡可以由多个可拆卸部件构成。例如，如图6D所示，样品卡650a可具有电极部分660a和包含磁体组件160的套管部分660b。电极部分660a可插入套管部分660b中，使得电极位于磁体组件上方(例如，使得磁体组件的一个或多个磁体位于每个电极位置下方)。此外，电极部分660a可以与套管部分660b分离，这允许电极部分660a和/或套管部分660b部分被单独替换(例如，将具有电极的基板与磁体组件分离)。
在一些情况下，样品接口640a和样品接口640b均可包括具有触针或其它电触点的插座，所述触针或其它电触点被布置成电连接到卡缘连接器的相应电极。
在一些情况下，该装置可以被配置为使用样品接口640a和650b的触针自动地在被插入样品接口中的样品卡之间和/或在样品卡上的探针之间选择。例如，样品接口640a和650b中的每个都可以包括用于检测样品卡的存在的触针(例如，当插入样品卡时从样品卡接收信号的触针)，以及用于选择样品卡上的一个或者探针的触针(例如，将鉴别特定探针的信号传输到插入的样品卡的触针)。
通信接口630使装置600能够与其它计算装置通信(例如，将测量数据传输到其它计算装置和/或从其它计算装置接收命令)。例如，通信接口630可以是通信端口或连接器(例如，电子通信接口，诸如通用串行总线、USB、连接器、插头、插口或插座)，其在装置600和另一种计算装置之间提供通信通道。在一些情况下，通信接口630可以是无线通信接口(例如，无线收发器，诸如Wi-Fi或蓝牙收发器)，其使得装置600能够无线地与其它计算装置通信。
显示装置650可视地向用户呈现信息。在一些情况下，显示装置650可以是液晶显示器(LCD)、发光二极管(LED)显示器或有机发光二极管(OLED)显示器。在一些实施方案中，显示装置650可以显示由MCU 140进行的分析的结果(例如，显示样品中是否存在特定分析物和/或关于样品中分析物的普遍性的信息。作为实例，图6E示出了指示样品中分析物的第一浓度(例如，相对安全量的特定分析物)的显示装置650，并且图6F示出了指示样品中分析物的第二浓度(例如，相对危险量的特定分析物)的显示装置650。
在一些情况下，可以经由诸如计算机、智能电话、服务器系统或其它计算装置的计算装置来控制本发明描述的一个或多个系统。例如，装置600可以经由通信接口630与计算装置建立通信通道，并使用该通道将测量数据传输到计算装置并从计算装置接收命令。
在一些情况下，计算装置可以执行与磁性电化学传感系统相关联的控制应用程序。控制应用程序可以提供与系统操作有关的各种功能。例如，控制应用程序可以向用户呈现用户界面，该用户界面呈现操作系统的各种选项和命令，并且接收来自用户选择特定选项和命令的输入。此外，控制应用程序可以处理从系统接收的测量数据(例如，将数字化的电压信号转换为电流测量的指示，基于电流确定特定分析物是否存在，和/或基于电流确定特定分析物的浓度)。
为了说明，图7A示出了执行与磁性电化学传感系统相关联的控制应用程序的智能手机700。控制应用程序向用户呈现图形用户界面(GUI)710，该图形用户界面(GUI)710呈现用于配置系统的各种选项(例如，选择特定样品或“通道”以用于测量的选项，以及输入特定待分析的分析物的选项)。此外，GUI 710显示与每个所选孔相关联的测量信息(例如，在所选样品中测量的电流的指示，以及基于该测量的相应分析物浓度的指示)。此外，GUI 710可以向用户显示警告或通知(例如，如果特定分析物的浓度足够高，从而可能不安全，或者如果特定分析物的浓度超过特定阈值或参考值)。
作为另一个实例，如图7B所示，控制应用程序可以向用户呈现GUI 720，其呈现关于特定样品的更多详细信息。例如，如果用户使用系统针对若干不同分析物(例如，过敏原)分析特定物质(例如，食物)，则GUI 720可以总结这些分析的结果，并且可视化地将结果呈现给用户(例如，以显示每种过敏原相对于彼此的浓度的图表的形式)。这使用户能够快速鉴别样品中一些分析物的存在和普遍性。
作为另一个实例，如图7C所示，控制应用程序可以向用户呈现GUI 730，其呈现关于样品的地理信息。例如，GUI 730可以显示地理地图，并显示鉴别一些样品的收集位置的兴趣点。这使得用户能够快速鉴别特定样品的来源，例如他可以在将来搜索和/或避免这些位置。例如，用户可以输入他从中获得食物样品的各种商店和餐馆的位置，并将样品分析的结果与每个适当的位置相关联。如果来自特定位置的样品含有高浓度的特定过敏原，则GUI730可以在视觉上向用户指示(例如，使用颜色编码图标)，使得用户可以在将来避免该位置。如果来自特定位置的样品含有低浓度的特定过敏原，则GUI 730可以在视觉上向用户指示(例如，使用不同颜色的图标)，使得用户可以容易地鉴别该位置以供将来访问。
在一些情况下，磁性电化学传感系统可以作为分析试剂盒的一部分提供。除传感系统外，该试剂盒还可包括便于制备样品进行分析的材料。
例如，如图8所示，试剂盒可包括样品处理工具，诸如样品管800、套管810和磁条820。
样品管800被配置为使用传感系统，诸如本发明所述的任何传感系统接收待分析的流体样品。样品管800在第一端802a处密封，并在第二端802b处限定开口804b，样品可通过该开口804b沉积。
套管810限定细长通道812。通道812在第一端814a处密封，并在第二端814b处限定开口816。通道812的尺寸适于接纳通过开口816插入的磁条820(例如，通道812的直径略大于磁条820的直径)。套管810还包括帽818，帽818配置为物理地连接到样品管800(例如，通过每个上的螺纹)。
磁条820包括定位在其尖端上的磁体822，并且被配置为经由开口816插入到套管810中。
样品管800、套管810和磁条820可用于处理样品以供传感系统分析(例如，通过从样品管收集磁珠，将收集的磁珠转移到另一个样品管)。
作为实例，如图9所示，用户可以将待分析的样品(例如，食品的一部分)插入含有提取缓冲液的第一样品管800a中。提取缓冲液用于提取目标分析物(例如蛋白质)用于后续分析(例如，通过将蛋白质和/或肽溶解于缓冲液中)。多种物质可用作提取缓冲液，包括2-巯基乙醇、用胍增强的三-(2-羧乙基)膦(TECP/GUA)、具有N-月桂酰肌氨酸的TECP、磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液、Tris-HCl缓冲液和/或乙醇(例如，60％乙醇)。作为实例，2-巯基乙醇缓冲溶液可以增加一些样品(例如，加热或未加热的食品)的蛋白质可提取性，并且可以适合于还原蛋白质二硫键和裂解分子间二硫键(例如，亚基之间的那些)，以允许蛋白质的亚基分离，使得每种肽都迁移到缓冲溶液中。作为另一个实例，无气味的三-(2-羧乙基)膦可用于还原蛋白质和肽二硫化物。作为又一个实例，盐酸胍是强离液剂，并且可用于蛋白质的变性和随后的重折叠。这种强烈的变性剂可以溶解不溶性或变性蛋白质。作为又一个实例，N-月桂酰肌氨酸是阴离子表面活性剂，可用于蛋白质和肽的溶解和分离。在一些情况下，混合的提取缓冲溶液(例如，含有多种不同类型的组分缓冲溶液的提取缓冲溶液)可用于提取。例如，这可以是有益的，因为它使得能够在各种用途例子中进行提取，简化了提取过程，和/或增强了用户体验。
用户随后将从第一样品管800a提取的材料转移到含有样品缓冲液(例如，PBS或含有1％牛血清白蛋白BSA的PBS)的第二样品管800b。用户还将含有磁珠(例如，涂覆有特异于特定目标分析物(诸如特定的过敏原)的结合部分的磁珠)的溶液添加到样品管800b中。用户混合第二样品管800b的内容物(例如，通过用帽和套管810密封第二样品管800b，并摇动第二样品管800b。
用户通过将磁条820插入套管810中来分离磁珠(并捕获的分析物)。来自条820的磁体822将磁珠吸引到套管810的周边，由此将其保留。用户随后在仍然插入磁条820的情况下提取套管810，从而从第二样品管800b移除磁珠(和捕获的分析物)。
用户将套管810(仍然插入磁条820)插入含有电子介体溶液(例如，含有TMB、ABTS、OPD、PNPP、ONPG、Nap-Gal和/或Mum-Gal的溶液)的第三样品管800c。用户随后从套管810移除磁条820。这使得磁珠从套管810释放并分散到第三样品管800c中。以这种方式，用户可以从一个样品管中选择性地去除磁珠(以及与磁珠结合的任何分子)，将它们转移到另一个样品管而无需额外的过滤或离心设备。
用户还添加含有特异于分析物的第二分子(例如，结合部分)和对第二分子特异的第三分子并且在第三样品管800c中具有活性酶(例如，图2描述的第二分子242和第三分子262)的溶液。这些第二分子242和第三分子262与磁珠结合。用户摇动第三样品管800c，并将第三样品管800c的内容物转移到传感装置进行分析(例如，通过将第三样品管800c的内容物沉积到恒电位仪的探针上)。
在一些情况下，试剂盒还可以包括加热装置，例如如图37所示。加热装置可以被配置为在提取过程中加热样品管(例如，通过在约60℃加热样品管及其内容物约2分钟)以加速提取过程。在一些情况下，可使用其它加热装置(例如，微波炉、烘箱或加热灯)以在提取过程中加热样品管及其内容物。
如本发明所述，由于在探针下方的磁体组件引起的磁场，磁珠被吸引朝向探针。此外，由于穿过探针的工作电极和参比电极感应的电位，在电子介体和氧化酶之间诱导了氧化还原反应。结果，从工作电极穿过探针的对电极感应出电流。相应地，该电流由运算放大器转换为电压信号，该电压信号由ADC数字化，并且数字化的电压信号由MCU解读。
在一些实施方案中，用户可在本发明描述的一些或所有步骤之间洗涤样品。例如，当在样品管之间转移样品时，用户可以使用套管810和磁条820从管中收集磁珠(和任何结合的分子)，并将磁珠转移到含有洗涤缓冲液的样品管中。用户可以移除磁条820以将样品分散到洗涤缓冲液中。用户随后可以将磁条820重新插入套管810中以重新收集磁珠，并继续进行样品制备过程。以这种方式，用户可以在本发明所述的一些或所有处理步骤之间洗涤磁珠(例如，去除未结合的分子)。
本说明书中描述的主题和操作的一些实施方案可以在数字电子电路中实现，或者在计算机软件、固件或硬件中实现，包括本说明书中公开的结构及其结构等同物，或者它们中的一个或多个的组合。例如，在一些实施方案中，系统100、300、400、500、600和700可以至少部分地使用数字电子电路，或者在计算机软件、固件或硬件中，或者以它们中的一个或多个的组合的方式实现。在一些实施方案中，恒电位仪(例如，恒电位仪110)、ADC(例如，ADC130)、MCU(例如，MCU 140)和/或DAC(例如，DAC 150)和/或数模转换器(DAC)150可以至少部分地使用数字电子电路，或者在计算机软件、固件或硬件中，或者以它们中的一个或多个的组合来实现。
本说明书中描述的一些实施方案可以实现为数字电子电路，计算机软件、固件或硬件，或者它们中的一个或多个的组合的一个或多个组或模块。尽管可以使用不同的模块，但是每个模块不一定是不同的，并且可以在相同的数字电子电路、计算机软件、固件或硬件或其组合上实现多个模块。
本说明书中描述的一些实施方案可以实现为一个或多个计算机程序，即计算机程序指令的一个或多个模块，其编码在计算机存储介质上，由数据处理装置执行或控制数据处理装置的操作。例如，这里参照图7描述的控制应用程序可以实现为计算机程序。计算机存储介质可以是或可以包括在计算机可读存储装置、计算机可读存储基板、随机或串行存取存储器阵列或装置或者它们中的一个或多个的组合中。此外，虽然计算机存储介质不是传播信号，但是计算机存储介质可以是在人工生成的传播信号中编码的计算机程序指令的源或目的地。计算机存储介质也可以是或包括在一个或多个单独的物理组件或介质(例如，多个CD、磁盘或其它存储装置)中。
术语“数据处理装置”包括用于处理数据的所有类型的仪器、装置和机器，包括例如可编程处理器、计算机、单片系统或前述的多个或前述的组合。该仪器可以包括专用逻辑电路，例如FPGA(场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。除了硬件之外，该仪器还可以包括为所讨论的计算机程序创建执行环境的代码，例如，构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行环境、虚拟机或它们中的一个或多个的组合的代码。装置和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础结构，诸如web服务、分布式计算和网格计算基础结构。
计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、脚本或代码)可以用任何形式的编程语言编写，包括编译或解释语言，声明式或过程语言。计算机程序可以对应于文件系统中的文件，但不是必须的。程序可以存储在保存其它程序或数据(例如，存储在标记语言文档中的一个或多个脚本)的文件的一部分中，存储在专用于所讨论的程序的单个文件中，或存储在多个协调文件中(例如，存储一个或多个模块、子程序或代码部分的文件)。可以部署计算机程序以在一个计算机上或在位于一个站点上或分布在多个站点上并通过通信网络互连的多个计算机上执行。
本说明书中描述的一些过程和逻辑流程可以由执行一个或多个计算机程序的一个或多个可编程处理器执行，以通过对输入数据进行操作并生成输出来执行动作。过程和逻辑流程也可以由专用逻辑电路执行，并且仪器也可以实现为专用逻辑电路，例如FPGA(场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。
例如，适合于执行计算机程序的处理器包括通用和专用微处理器，以及任何类型的数字计算机的处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机包括用于根据指令执行动作的处理器和用于存储指令和数据的一个或多个存储装置。计算机还可以包括或可操作地耦合以从一个或多个用于存储数据的大容量存储装置接收数据或将数据传输到一个或多个用于存储数据的大容量存储装置，或者两者，所述大容量存储装置例如为磁盘、磁光盘或光盘。但是，计算机不必须具有这样的装置。适用于存储计算机程序指令和数据的装置包括所有形式的非易失性存储器，介质和存储装置，包括例如半导体存储装置(例如，EPROM、EEPROM、闪存装置等)、磁盘(例如，内部硬盘、可移动磁盘等)，磁光盘、CD ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由专用逻辑电路补充或并入专用逻辑电路中。
为了提供与用户的交互，可以在具有用于向用户显示信息的显示装置(例如，显示器或其它类型的显示装置)和键盘以及用户可以通过其向计算机提供输入的指示装置(例如，鼠标、轨迹球、平板电脑、触敏屏幕或其它类型的指示装置)的计算机上实现操作。其它类型的装置也可用于提供与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈，例如视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈；并且可以以任何形式接收来自用户的输入，包括声学、语音或触觉输入。另外，计算机可以通过向用户使用的装置发送文档和从用户使用的装置接收文档来与用户交互；例如，通过响应于从网页浏览器接收的请求将网页发送到用户的客户端装置上的网页浏览器。
计算机系统可以包括单个计算装置，或者在彼此附近操作或通常彼此远离地操作并且典型地通过通信网络交互的多个计算机。通信网络的实例包括局域网(“LAN”)和广域网(“WAN”)、互联网(例如，因特网)、包括卫星链路的网络和点对点网络(例如，ad hoc点对点网络)。客户端和服务器的关系可以通过在各个计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序而产生。
图10示出了示例计算机系统1000，其包括处理器1010、存储器1020、存储装置1030和输入/输出装置1040。组件1010、1020、1030和1040中的每一个可以例如通过系统总线1050互连。处理器1010能够处理在系统1000内执行的指令。在一些实施方案中，处理器1010是单线程处理器、多线程处理器或其它类型的处理器。处理器1010能够处理存储在存储器1020中或存储装置1030上的指令。存储器1020和存储装置1030可以在系统1000内存储信息。
输入/输出装置1040为系统1000提供输入/输出操作。在一些实施方案中，输入/输出装置1040可以包括以下的一个或多个：网络接口装置，例如以太网卡；串行通信装置，例如RS-232端口；和/或无线接口装置，例如802.11卡、3G无线调制解调器、4G无线调制解调器等。在一些实施方案中，输入/输出装置可以包括被配置为接收输入数据并且将输出数据发送到其它输入/输出装置的驱动器装置，例如键盘、打印机和显示装置1060。在一些实施方案中，可以使用移动计算装置、移动通信装置和其它装置。
检测流体样品中目标分析物的存在的示例性方法4200在图42中示出。
在方法4200中，将多个磁珠提供给第一流体样品(4202)。多个磁珠包括特异性结合目标分析物的第一结合部分。
允许多个磁珠结合第一流体样品内的目标分析物(4204)。
将磁珠从第一流体样品转移到第二流体样品(4206)。第二流体样品包括特异性结合目标分析物的第二结合部分，并且第二结合部分与活性酶结合。转移磁珠包括将护套浸入第一流体样品内，将磁体放置在浸入第一流体样品内的护套内使得磁珠粘附到护套上，从第一流体样品中移除包含磁体的护套，并将包含磁体的护套浸入第二流体样品中。
允许第二流体样品内的第二结合部分结合与磁珠的第一结合部分结合的目标分析物(4208)。
将包含多个磁珠和第二结合部分的第二流体样品与电子介体溶液组合以获得第三流体样品(4210)。
将第三流体样品提供给基板的样品检测区域(4212)。样品检测区域被布置在第一电极上。
将第三流体样品暴露于磁场以将多个磁珠保留在第三流体样品中靠近第一电极的位置(4214)。第一电极电耦合到恒电位仪。
在第三流体样品中诱导电子介体和活性酶之间的氧化还原反应(4216)。
监测恒电位仪的输出以确定第三流体样品中目标分析物的存在(4218)。通过氧化还原反应改变恒电位仪的输出。
可以使用本发明描述的装置和试剂盒中的一个或多个来至少部分地执行方法4200。在一些情况下，可以执行方法4200以鉴别分析物，诸如细胞、细胞外囊泡诸如微泡、膜颗粒、凋亡小泡或囊泡或外泌体(例如，跨膜和胞质蛋白、mRNA、DNA和微小RNA)、肽、蛋白质、脂质、代谢物和其它分子，其自由漂浮(例如，在血清或溶液中)或在生物结构的表面上(例如，在细胞外囊泡或细胞的表面上)表达。在一些情况下，方法4200可用于向患者提供更有效的护理(例如，通过使护理人员能够以更加明智的方式进行诊断和/或施用治疗)。在一些情况下，可以执行方法4200以提供对物质(例如食品)的组成的了解。
新探测器装置的应用实例
本发明描述的实施方案可用于多种不同的应用，包括对自由漂浮(例如，在血清或溶液中)或在生物结构的表面(例如，在细胞外囊泡或细胞的表面上)表达的各种肽、蛋白质、脂质代谢物和其它分子的检测和定量。在一些情况下，分子的检测和定量可以提供对特定的生物学或致病过程、特定疾病的特定进展或一些其它生物学状况的了解。
在以下和在实施例部分更详细地讨论了各种应用的实例。
细胞外囊泡筛查-癌症诊断
例如，磁性电化学传感可用于检测细胞外囊泡上癌症的生物标志物的存在。
越来越多的证据表明细胞外囊泡(Ev)是癌症治疗的有效读出。例如，外泌体已成为有效的生物标志物。外泌体是由细胞主动分泌的纳米级囊泡。这些囊泡携带其来源细胞的分子成分，包括跨膜和胞质蛋白、mRNA、DNA和微小RNA，并因此可用作细胞替代物。结合它们在体液(例如血清、腹水、尿液、脑脊液)中的相对丰度和普遍存在，外泌体可以为纵向监测提供独特的优势。外泌体分析是微创的，并且提供相对无偏的整个肿瘤负荷的读出，受样品稀缺或肿瘤内异质性的影响较小。
电化学传感可以是一种有效的检测方式，其易于应用于临床环境。通过将氧化还原活性报道分子的信号放大，电化学传感可以实现高灵敏度。如本发明所述，传感系统可以测量由氧化还原活性报道分子诱导的电流，并且可以实现为紧凑且低功耗的便携式装置。
如本发明所述，传感系统的实施方案提供各种益处。例如，细胞特异性外泌体可以直接从复杂培养基中分离，无需大量过滤或离心。此外，该测定可通过磁性富集和酶促扩增实现高检测灵敏度。此外，通过电检测方案，传感器可以被小型化和扩展以用于并行测量。
例如，卵巢癌外泌体通常富含CD63。因此，感测系统的实施方案可用于分析表达CD63的EV群体(例如，外泌体)以作为诊断卵巢癌的手段。
例如，磁珠可以与对CD63特异性的抗体缀合。这些磁珠可以与含有外泌体的生物样品(例如血浆)混合，使得可以磁性捕获表达CD63的外泌体。相应地，可以用对表达CD63的外泌体特异的第二分子(例如，标记配体，诸如对CD63特异性的生物素化抗体)处理样品，并用对第二分子特异并具有氧化酶(例如，链霉抗生物素蛋白-HRP)的第三分子处理。然后可以将样品与电子介体溶液(例如，含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB的溶液)混合。
随后可以使用本发明描述的传感系统分析样品。由于表达CD63的外泌体已经被磁珠捕获，它们集中在传感系统的电极附近。此外，由于穿过电极(例如，工作电极和参比电极)所感应的电位，在电子介体和氧化酶之间诱导了氧化还原反应。结果，在一个电极(例如，对电极)上感应出电流，这与表达CD63的外泌体的存在和普遍性相关。相应地，该电流可以由MCU或其它计算装置测量，并且所得到的信息可以用于调查或诊断目的。例如，相对高的电流可以对应于相对高浓度的表达CD63的外泌体，并且可以是患者中卵巢癌的指示。
在一些情况下，可以将恒电位仪的输出与阈值或参考水平进行比较，并且可以基于该比较来诊断患者体内是否存在癌症。例如，如果恒电位仪的输出足够高(例如，电流超过参考或阈值水平)，则可以提出关于癌症存在的诊断。然而，如果恒电位仪的输出相对较低(例如，电流不超过参考或阈值水平)，则可以提出关于不存在癌症的诊断。在一些情况下，仪器可以根据测量值自动或半自动地进行诊断。
尽管上面描述了检测血液中表达CD63的外泌体，但这仅仅是一个实例。在实践中，传感系统的实施方案可用于检测任何生物标志物(例如，与不同生物或致病过程、疾病或其它生物学状况相关的生物标志物)，其为自由漂浮的(例如，在血浆、尿液或任何其它生物学样品中自由漂浮者)或者在生物结构的表面上(例如，在细胞外囊泡或细胞的表面上)表达的。作为实例，在一些实施方案中，传感系统可以用于检测一个或多个以下的生物标志物：CD2、CD3、CD45、CD52、HLA-ABC、CD81、CXCL10或CXCL9或任何其它免疫细胞标志物。作为另一实例，在一些实施方案中，传感系统可以用来检测以下一种或多种的生物标志物：CD24、EpCAM、CA125、EGFR、HER2、MUC1、CD44、CD44v6、CEA、间皮素、Trop2、GPC1、WNT2、Grp94、SSTR2、EGFRv3、IDH1-R132、GPA33、KRAS、CD166、CD133、MET、B7H3、CD63、CD9或CD81。
细胞外囊泡筛查-器官排斥试验
作为另一个实例，磁性电化学传感可用于检测患者中的移植器官排斥。
例如，在经历移植肾排斥的患者中，经常在患者的尿液中发现表达CD3的EV。因此，传感系统的实施方案可用于分析表达CD3的EV群体(例如，外泌体)，以作为在排斥的早期阶段检测移植肾排斥的手段。
例如，磁珠可以与对CD3特异性的抗体缀合。这些磁珠可以与含有外泌体(例如尿液)的生物学样品混合，使得可以磁性捕获表达CD3的外泌体。相应地，可以用对表达CD3的外泌体特异的第二分子(例如，标记配体，诸如对CD3具有特异性的生物素化抗体)处理样品，并用对第二分子特异并具有氧化酶(例如，链霉抗生物素蛋白-HRP)的第三分子处理。然后可以将样品与电子介体溶液(例如，含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB的溶液)混合。
随后可以使用本发明描述的传感系统分析样品，并且所得到的信息可以用于研究或诊断目的。例如，相对高的电流可以对应于相对高浓度的表达CD3的外泌体，并且可以指示患者的肾脏排斥。在一些情况下，可以在肾移植后定期筛查患者，使得在早期阶段快速检测到肾脏排斥。由于监测方法是非侵入性的，因此可以以对患者最小的风险并且以成本有效的方式重复监测方法。
在一些情况下，可以将恒电位仪的输出与阈值或参考水平进行比较，并且可以基于该比较来确定患者是否排斥器官移植。例如，如果恒电位仪的输出足够高(例如，电流超过参考或阈值水平)，则可以做出患者已排斥器官的结论。但是，如果恒电位仪的输出相对低(例如，电流不超过参考或阈值水平)，则可以做出患者没有排斥器官的结论。在一些情况下，仪器可以根据测量值自动或半自动地做出结论。
尽管上面描述了对尿液中表达CD3的外泌体的检测，但这仅仅是说明性的实例。如本发明所述，传感系统的实施方案可用于检测任何生物标志物，其为自由漂浮的或在生物结构的表面上表达，以探测移植肾脏排斥或对其它移植器官的排斥。
食品测试
作为另一个实例，磁性电化学传感可用于检测食品中过敏原的存在。
超过5000万美国人有一些种类的食物反应。此外，即使是微量的食物抗原也会引发急性过敏反应，这是一种可能危及生命的超敏反应，需要注射肾上腺素。虽然免疫治疗试验的结果令人鼓舞，但主要方法仍然依赖于避免食物。“食品过敏原标签和消费者保护法”(FALCPA)要求食品标签告知消费者产品中的过敏性物质。即便如此，制造业中的错误标签或交叉污染仍然会带来监管挑战。此外，FALCPA仅监督包装食品，而不监管餐馆提供的食品。美国境外的食品标签不太严格，食品过敏通常会影响旅行者。因此，快速测试食物中常见过敏原的能力可以为消费者带来显著的益处。
作为实例，可以向消费者提供具有磁性电化学传感系统和样品制备系统的检查试剂盒，诸如本发明图6-9描述的试剂盒。消费者可以使用该试剂盒准备食品样品进行检查，使用抗原特异性磁珠从样品中提取感兴趣的食品抗原(例如，用户可能过敏的过敏原，诸如小麦、花生、榛子、牛奶和蛋清)，并将抗原聚集到传感系统的电极上。然后，消费者可以使用传感系统(例如，使用第二分子、第三分子和电子介导溶液)分析样品，以确定食品中抗原的存在和/或普遍性，使得他们可以关于他们的饮食做出更明智的决定。
在一些情况下，还可以向消费者提供用于计算装置(例如，智能电话)的控制应用程序，其使得消费者能够控制传感系统和/或查看来自传感系统的测量信息。例如，控制应用程序可用于定制特定过敏原的传感应用程序(例如，通过校准对特定过敏原的测量及其相应的样品制备过程)。作为另一个实例，控制应用程序可用于记录测量值以供将来查看。作为另一个实例，控制应用程序可用于跟踪特定食品的来源，使得用户可以稍后再次访问特定位置(例如，获得不含特定过敏原的食品)或在将来避免特定位置(例如，避免获得含有特定过敏原的食品)。
在一些情况下，可以将恒电位仪的输出与阈值或参考水平进行比较，并基于比较确定特定过敏原是否存在于食品中。例如，如果恒电位仪的输出足够高(例如，电流超过参考或阈值水平)，则可以做出食品含有特定过敏原(例如，足以引起或可能引起过敏反应的程度)的结论。然而，如果恒电位仪的输出相对较低(例如，电流不超过参考或阈值水平)，则可以做出食品不含特定过敏原(例如，不引起或不可能引起过敏反应的程度)的结论。在一些情况下，仪器可以根据测量结果自动或半自动地进行测定。
尽管上文描述了示例性过敏原，但这些仅仅是说明性实例。在实践中，传感系统的实施方案可用于使用适当的过敏原特异性磁珠检测任何过敏原。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，但其不限制本发明权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1-癌症诊断
该实施例的目的是证明使用磁性电化学传感来筛选外泌体作为与卵巢癌进展相关的生物标志物，诸如CD63。
装置总结
构建了具有八个独立通道的小型化磁性电化学传感系统(集成的磁-电化学外泌体系统，在此称为“iMEX”)(参见图11)。每个通道都配有一个恒电位仪，该恒电位仪能够测量宽范围的电流(±7.5μA)。传感器可以同时测量来自八个电极的信号。小圆柱形磁体位于电极下方以聚集免疫磁性捕获的外泌体。
输入信号由低通滤波器(截止频率，5Hz)调节，以抑制高频噪声。嵌入每个恒电位仪的低通滤波器的电路示意图。Vw-set连接到数模转换器以进行电位控制，Vw连接到工作电极，并且Vout连接到模数转换器以进行信号数字化(参见图12A)。低通滤波器的截止频率被设定为5Hz(Rf＝300kΩ,Cf＝0.1μF)。iMEX传感器和商业设备(SP200,Bio-Logic)之间的测量结果的比较示于图12B中。将200mV的电位(相对于Ag/AgCl参比电极)应用于0.2mM亚铁氰化物(在0.1M KCl中)的溶液中。使用iMEX传感器和商用设备测量的电流水平显示出良好的一致性。使用低通滤波器，噪声水平显著下降。
将八个恒电位仪连接到数模转换器用于电位控制，连接到模数转换器用于信号数字化，连接到多路复用器用于通道选择，以及连接到微控制器单元用于系统操作(参见图4C和13A-D)。传感器系统具有八个恒电位仪、一个8:1多路复用器、一个模数转换器(ADC)、一个数模转换器(DAC)和一个微控制器单元(MCU)。每个恒电位仪具有三个电极：参比(R)、对(C)和工作(W)。如图13B所示，该系统包括两个恒电位仪(AD8608，Analog装置)。R2和C2(或R4和C4)的并联电路形成一个跨阻放大器，其具有截止频率为5Hz的低通滤波器。如图13C中所示，微控制器单元(Arduino Nano,Arduino)用于通过USB与外部装置进行串行通信。如图13D中所示，该系统还包括数模转换器单元(DAC8552,Texas Instruments)。一个输出连接到模数转换器单元(DAC_OUT1)，另一个连接到所有恒电位仪(DAC_OUT2)。每个输出端口连接到低通滤波器(对于DAC_OUT1为L1、C15、C17、R20，以及对于DAC_OUT2为L2、C19、C20、R22)，以最大限度地降低噪声。如图13E中所示，系统还包括8通道多路复用器(ADG708,Analog Devices)和模数转换器单元(ADC161S626,Texas Instruments)。多路复用器通过其三个地址端口(MUX_A0-MUX_A2)由微控制器单元控制。
如图14所示，我们将该装置包装为手持式装置。该装置外形小巧(9×6×2cm3)。卡缘连接器用于快速连接电极盒。将包含8个圆柱形磁体的磁体保持器放置在电极盒下方。这些磁铁用于将磁珠集中到传感器表面。通过快速轮询(polling)每个通道(每通道50毫秒)，iMEX有效提供了所有电极的同时读数。
通过定制设计的软件监控和分析所有数据。通过USB接口经由计算机控制iMEX传感器。在所选择的通道上监测由电化学反应产生的电流。在60秒之后，显示40-45秒范围内的电流的平均水平(参见图15)。
分析方案
图16总结了iMEX测定方案。首先将外泌体捕获到免疫磁珠上。然后使用具有氧化酶(辣根过氧化物酶；HRP)的二级抗体，然后将珠子与显色电子介体(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；TMB)混合，当遇到HRP时产生电流。在图17中更详细地显示了测定方案。将与针对CD63的抗体缀合的磁珠加载到体液(或PBS)中用于外泌体分离。用针对目标蛋白标志物(例如EpCAM或HER2)的抗体标记捕获的外泌体。将抗体与生物素缀合。将与链霉抗生物素蛋白缀合的HRP酶与珠子混合。每个步骤之后进行一分钟的磁力洗涤步骤。全部测定在室温下在1小时内进行。
使用磁珠显著简化了测定程序：经由磁力洗涤除去过量的试剂(例如抗体、酶)，并将捕获的外泌体磁性聚集在电极上以提高检测灵敏度。
我们应用计时电流法进行信号检测：监测由TMB还原产生的电流，同时将还原电位(相对于Ag/AgCl参比电极-100mV)应用到工作电极。在应用还原电位后1分钟内电流水平(I)达到稳定水平(参见图18)。CD63-珠子和IgG-珠子样品之间的电流差异(ΔIM)被用作目标蛋白质标志物的代表值。Abs，抗体。M，标志物。我们将电流水平(I)从40到45秒平均作为代表值。
为了捕获外泌体，我们使用涂有针对四次跨膜蛋白(外泌体中富含的跨膜蛋白)的抗体的磁珠。我们首先将不同大小的珠子(直径，2.7μm和8.8μm)的信号水平进行比较。当珠子的总表面积匹配以捕获相似量的外泌体时，测量的信号水平几乎相同(参见图19A)。使用不同尺寸(直径为2.7和8.8μm)的磁珠进行iMEX测定。珠子浓度分别为6×107/mL和6×106/mL，以提供相同的捕获面积。从OV90细胞培养物中收集外泌体，并在PBS中稀释，浓度为8×108/mL。该结果可以用多孔介质中的扩散率来解释：堆叠珠子的有效扩散率(De)可以表示为De＝D0·εm，其中D0是自由介质中的扩散率，ε是结构的孔隙率。在尺寸均匀的珠子的情况下，ε(≤0.47)和m(＝3/2)都与珠子尺寸无关；因此预期iMEX信号保持不变。我们选择使用2.7μm的珠子；较大的珠子倾向于沉淀，需要经常摇动样品。与非富集方案相比，磁性富集导致分析信号增加～72％(参见图19B)。在有和没有磁性富集的情况下进行iMEX测定。对于磁性富集，在工作电极的背面放置一个小硬币形状的永磁体。所有测量均一式两份进行，数据显示为平均值±标准偏差(SD)。
我们接下来测试了三种代表性的四次跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81)作为目标物；据报道，在外泌体中富含这些标志物。我们制备了对每种标志物特异的2.7μm磁珠。当应用于来自不同细胞系的外泌体时，基于CD63的捕获显示始终如一的高信号。图20显示癌症外泌体中三种四次跨膜蛋白标志物(CD63、CD9和CD81)的信号比较。来自CD63的信号远高于从卵巢癌细胞系(CaOV3、OV90和OVCAR3)收集的外泌体中的其它标志物的信号。因此，我们选择使用CD63作为外泌体富集的标志物。
对于每个目标标志物(M)，我们制备了一对磁珠：一个与针对CD63的抗体缀合(CD63-珠)，另一个与针对同型匹配的IgG的抗体缀合(IgG-珠)。将外泌体与每种珠子类型混合，随后用针对目标标志物的抗体标记；然后获得净信号差ΔIM(＝ICD63+M-IIgG+M；参见图18)。我们使用ΔICD63估计总外泌体负荷，并将归一化度量ξM(＝ΔIM/ΔICD63)定义为目标标志物(M)的表达水平。注意，这种缩放将补偿样品中外泌体数量的变化。
iMEX验证
我们应用开发的iMEX流程来分析外泌体的跨膜蛋白。对于该验证研究，我们通过常规方法从细胞培养物(OV90、OVCA420)中收获外泌体，并将它们掺入磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(～109外泌体/mL)中。将样品等分，并通过iMEX和酶联免疫吸附测定(ELISA)处理。比较分析显示两种方法之间的高度相关性(参见图21；R2＝0.931)，证实了iMEX的分析能力。然而，iMEX测定比ELISA(5小时，100μL)更快(1小时)并消耗更少量的样品(10μL)。
我们进一步测试了iMEX用于检测生物流体中的外泌体。从细胞培养物(OV90)收集癌外泌体，并将不同数量的外泌体掺入未稀释的人血浆中。滴定实验建立了3×104外泌体的检测限(LOD)，动态范围跨越四个数量级(参见图22)。用ELISA进行的类似测量需要超过107个外泌体用于可靠检测。使用匹配的对照(IgG-珠)对于补偿产生自样品依赖性、非特异性外泌体结合的背景信号是重要的。检测限为3×104(iMEX)和3×107(ELISA)。所有测量一式三份进行，数据显示为平均值±SD。
细胞衍生外泌体中蛋白质标志物的分析
我们应用iMEX以筛选来自一组卵巢癌细胞系的外泌体表面标志物。因为iMEX富集CD63-阳性(CD63+)外泌体并将它们标记为目标蛋白，我们能够检查CD63+外泌体如何紧密地反映它们的起源细胞。我们根据先前的研究选择了六种代表性表面标志物：上皮细胞粘附分子(EpCAM)、CD24、癌抗原125(CA125)、人表皮生长因子受体2(HER2)、粘蛋白18(MUC18)和表皮生长因子受体2(EGFR)。用流式细胞术测量这些标志物的细胞表达水平；从条件细胞培养基中收获外泌体，并用iMEX分析。细胞和CD63+外泌体的分子分析高度相关(参见图23，显示平均荧光强度(MFI)，较暗区域表示较高MFI，较亮区域表示较低MFI)，这支持了使用外泌体作为细胞替代物。筛选四种卵巢癌细胞系(CaOV3、OV90、OVCAR3和OVCA420)和一种正常细胞系(TIOSE6)用于六种推定的癌症标志物(经由流式细胞术，图23，左小图)。细胞衍生的外泌体被免疫磁性捕获(CD63特异性)并通过iMEX测定(图23，右小图)。分析数据显示细胞和CD63阳性外泌体之间的良好匹配。iMEX测定一式两份进行，且显示平均值。
临床：对卵巢癌患者的血浆的直接分析
iMEX测定直接从血浆或血清中分离EV，并允许以快速、高通量的方式进行分析-这是成功整合到临床工作流程中的关键。为了证明临床可行性，我们定制了用于血液中卵巢癌EV检测的iMEX测定(参见图24)。将临床血浆样品等分，无需任何纯化，并将每个等分试样(每个标志物10μL)与磁珠一起温育用于EV捕获(15分钟)，然后磁力洗涤。将结合珠子的EV相继标记目标标志物(15分钟)和HRP(15分钟)，并加载到装置上。通过独立操作的8电极，我们能够同时测量四种不同的标志物(CD63、EpCAM、CD24和CA125)以及它们各自的IgG-对照。IgG-对照有益于非纯化临床样品中目标分子的特异性检测。整个测定在1小时内完成，无需过滤和离心过程。
我们测试了来自11名卵巢癌患者和5名健康对照的单时间点血浆样品。卵巢癌患者中EV中EpCAM和CD24的表达水平远高于健康对照，并且两种指标均显示高相关性(R2＝0.870)(参见图25和26)。我们接下来通过测量四名接受药物治疗的卵巢癌患者在两个时间点(间隔2个月)收集的血浆中的EpCAM和CD24来检查iMEX连续EV测试的潜力。对治疗反应不知情地进行iMEX测定。对于“无反应”患者，EpCAM和CD24的表达水平增加，而“反应”患者显示两种标志物显著减少(参见图27)。对于无反应者，CD24水平显示比EpCAM更急剧地增加。所有测量均一式两份进行。a.u.，任意单位。
iMEX系统的制造
该装置包括一个微控制器(Atmega328,Atmel Corporation)、一个数模转换器(DAC8552,Texas Instruments)、一个模数转换器(ADC161S626,TexasInstruments)、一个多路复用器(ADG708,Analog Devices)和八个恒电位仪。每个恒电位仪包括两个运算放大器(AD8606,Analog Devices)：一个放大器保持工作电极和参比电极之间的电位差，另一个用作跨阻放大器以将电流转换为电压信号。跨阻放大器的电流测量范围为±7.5μA。八通道电极可商购得到(DropSens,Spain)。
免疫磁珠的制备
将5mg涂有环氧基团(Dynabeads M-270Epoxy,Invitrogen)的磁珠在室温下悬浮于1mL 0.1M磷酸钠溶液中10分钟。用永磁体将磁珠与溶液分离，并重悬于100μL相同的溶液中。加入100μg针对CD63(Ancell)或相应的IgG(Ancell)的抗体并充分混合。加入100μL的3M硫酸铵溶液，并将整个混合物在4℃下温育整夜，并伴有缓慢的倾斜旋转。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤珠子两次，最后重悬于2mL含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。更多细节可以在磁珠制造商提供的手册中找到。
标记抗体的生物素化
将PBS中的10mM N-羟基磺酸基琥珀生物素(Pierce)溶液与抗体在室温下温育2小时。使用Zeba脱盐离心柱，7K MWCO(Thermo Scientific)除去未反应的N-羟基磺酸基琥珀生物素。将抗体保持在4℃直至使用。
iMEX测定
将10μL掺入外泌体的PBS溶液(或血浆)与50μL免疫磁珠溶液在室温下混合15分钟。根据以下标准测定珠子浓度：[Cb×Vb×4πRb 2]/[Ce×Ve×πRe 2]>100，其中Cb和Ce分别是珠子和外泌体浓度；Vb和Ve分别是珠子溶液和掺入外泌体的溶液(或血浆)的体积；Rb和Re分别是珠子和外泌体的平均半径。该要求确保了足够的珠子表面可用于外泌体捕获。在我们的实验条件下，Re～50nm，Rb＝1.4μm，Ce～1010/mL。因此，我们将珠子浓度调整到～108/mL。用永磁体将磁珠从溶液中分离，并重悬于80μL PBS(1％BSA)中。涡旋5秒后，分离珠子并重悬于80μL PBS(1％BSA)中。将10μL感兴趣的抗体(在PBS中为20μg/mL)与珠子在室温下混合15分钟。如前所述分离和洗涤磁珠，并将它们重悬于50μL PBS(1％BSA)中。将5μL链霉抗生物素蛋白缀合的HRP酶(以1:100在PBS中稀释)与珠子在室温下混合15分钟。如前所述分离和洗涤磁珠，并将它们重悬于7μL PBS中。将制备的珠子溶液和20μL UltraTMB溶液(ThermoFisher Scientific)加载到丝网印刷电极的顶部。3分钟后，用电化学传感器开始计时电流法测量。对40-45秒范围内的电流水平进行平均。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
将CD63抗体(Ancell)和IgG1抗体(Ancell)在PBS中稀释至5μg/mL浓度，并加入到Maxisorp 96孔板(Nunc)中，在4℃下温育过夜。用PBS洗涤后，将含2％BSA的PBS封闭溶液加入到板中，在室温下温育1小时。随后，将含108个外泌体的100μL PBS加入到每个孔中，在室温下温育1小时。弃去封闭溶液后，向各孔中加入针对各种标志物的抗体(1μg/mL)，并在室温下温育1小时。用PBS洗涤未结合的抗体三次。将链霉抗生物素蛋白-HRP分子在室温下加入各孔中1小时。用PBS洗脱后，测量化学发光信号。
流式细胞仪
每种抗体5×105个细胞被用于流式细胞术实验。细胞用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟，然后用PBS(0.5％BSA)洗涤。随后，用BSA(在PBS中0.5％)封闭细胞，然后与一级抗体(4μg/mL)温育。在一级抗体温育后，洗涤细胞，与缀合荧光团的二级抗体(2μg/mL；Abcam)一起温育并洗涤。使用BDLSRII流式细胞仪(BD Biosciences)测量来自标记细胞的荧光信号。记录的平均荧光强度(MFI)使用下式[(信号-IgG同型对照)/二级]归一化。在室温下进行用抗体(一级和二级)的封闭和温育各30分钟。每个洗涤步骤包括用PBS(0.5％BSA)在300g下洗涤5分钟共3次。
细胞培养物
使OV90、OVCAR3、OCVA420和TIOSE6细胞在RPMI-1640培养基(Cellgro)中生长。使CaOV3在Dulbecco改良的必需培养基(DMEM,Cellgro)中培养。所有培养基补充有10％FBS和青霉素-链霉素(Cellgro)。测试所有细胞系并且没有支原体污染(MycoAlert MycoplasmaDetection Kit,Lonza,LT07-418)。
从培养细胞中分离外泌体
我们使用常规方法从细胞培养基中收获外泌体。将第1-15代传代的细胞在囊泡耗尽的培养基(5％耗尽的FBS)中培养48小时。从条件培养基中收集约107个细胞，以300g离心5分钟。将上清液通过0.2-μm膜滤器(Millipore)过滤，并以100,000g浓缩1小时。除去上清液后，用PBS洗涤外泌体沉淀，并以100,000g离心1小时。将外泌体沉淀重悬于PBS中。
临床样品制备
该研究得到了Dana-Farber/Harvard Cancer Center的机构审查委员会的批准，所遵循的程序符合机构指南。从所有受试者获得知情同意书(n＝11)。从患有卵巢癌的患者中取出外周血(～15mL)并以400g离心15分钟以从红细胞和血沉棕黄层中分离血浆。对于每种表面标志物分析使用10μL血浆。
结论
该实施例证明了使用磁性电化学传感来筛选外泌体的与卵巢癌的进展相关的生物标志物，诸如CD63。
传感系统的一个有益特征是将囊泡分离和检测集成到单个平台中。磁驱动的使用简化了囊泡分离和随后的测定步骤，并且电化学传感促进了高通量筛选和传感器小型化。目前的研究验证了这些概念：i)实现了具有并行测量能力的便携式检测系统；ii)系统直接从血液中富集外泌体，并分析其分子信息；iii)整个系统测定(即外泌体分离、标记、检测)在1小时内完成，同时每个标志物仅消耗10μL血浆。我们还通过分析从卵巢癌患者采集的血液中的EV来证明该系统的临床潜力。
基于珠子的磁性富集在传感系统中带来了若干优点。首先，该方法提供了一种在电极上集中信号源的便利方式，这提高了检测灵敏度。其次，与其中抗体被固定在芯片表面上的基于表面的捕获相比，基于珠子的方法适合于可靠且更简单的缀合化学，并且受益于抗体和外泌体之间更快的结合动力学。第三，可以容易地回收结合珠子的囊泡用于与传感系统串联的下游分子分析。例如，可以洗脱或裂解结合珠子的EV以分析它们的核酸含量。
在这个实施例中，我们专注于分析CD63+EV群体(外泌体)，这是由两个因素驱动的：i)来自CD63捕获的信号是测试的四次跨膜蛋白标志物中最高的；和ii)我们和其它人先前已经表明，卵巢癌外泌体富含CD63。该系统的分析发现CD63阳性外泌体与其亲本细胞之间的蛋白质表达高度相关；该结果验证了CD63阳性外泌体作为细胞替代物的潜在用途。然而，我们注意到，考虑到患者样品中可能存在不同的EV类型(例如CD63阴性)，可以扩展外泌体-捕获策略。检查这些群体可以产生更准确的信息以捕获肿瘤异质性。通过改变捕获抗体，可以容易地将传感方法用于此目的。
我们设想了进一步推进该技术的多个方向。首先，可以通过增加检测位点的数量来提高测定通量。电化学传感理想地适用于这种放大：传感元件(电极)可以容易地被微制造成大阵列格式，并且信号(电流)可以通过紧凑的电子装置以高速多路复用来读出。其次，通过探索电化学信号检测的新设计可以提高检测灵敏度。信号水平与传感器的表面积和与目标实体结合的酶量相关；因此，通过使用纳米结构的传感器表面或多标记纳米颗粒可以实现更高的灵敏度。第三，可以扩展检测目标以包括其它外泌体成分。例如，外泌体携带各种核酸(例如mRNA、微小RNA)；分析核酸和外泌体蛋白将提供更准确的肿瘤状态快照。已经应用电化学传感在没有PCR扩增的情况下检测痕量的核酸(<1pM)。我们期望可以采用类似的方法来分析外泌体核酸。由此产生的iMEX可以成为一种功能强大的临床工具，用于经济实惠、可扩展且全面的外泌体分析，从而深化我们对肿瘤生物学的理解并加速有效的癌症管理。
实施例2-器官排斥测试
该实施例的目的是证明使用磁性电化学传感来筛选外泌体的与移植肾排斥相关的生物标志物。
细胞培养物
使OV90、OVCAR3、OVCA420和TIOSE6细胞在RPMI-1640培养基(Cellgro)中生长。使CaOV3在Dulbecco改良的必需培养基(Cellgro)中培养。所有培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素(Cellgro)。测试所有细胞系并且没有支原体污染(MycoAlertMycoplasma Detection Kit,Lonza,LT07-418)。
从培养细胞中分离EV
我们使用常规方法从细胞培养基中收获EV。将第1-15代传代的细胞在囊泡耗尽的培养基(含5％耗尽的FBS)中培养48小时。从条件培养基中收集约107个细胞，以300×g离心5分钟。将上清液通过0.2μm膜滤器(Millipore)过滤，并以100,000×g浓缩1小时。除去上清液后，用PBS洗涤EV沉淀，并以100,000×g离心1小时。将EV沉淀重悬于PBS中。
标记抗体的生物素化
将PBS中的N-羟基磺酸基琥珀生物素(10mM,Pierce)溶液与抗体在室温下温育2小时。使用Zeba脱盐离心柱，7K MWCO(Thermo Scientific)除去未反应的N-羟基磺酸基琥珀生物素。将抗体保持在4℃直至使用。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
将CD63抗体和IgG1抗体(Ancell)分别在PBS中稀释至5μg/mL浓度，并加入到Maxisorp 96孔板(Nunc)中，在4℃下温育过夜。用PBS洗涤后，将含2％BSA的PBS封闭溶液加入到板中，在室温下温育1小时。随后，将含～108个外泌体的100μL PBS加入到每个孔中，在室温下温育1小时。弃去封闭溶液后，向各孔中加入针对各种标志物的抗体(1μg/mL)，并在室温下温育1小时。用PBS洗涤未结合的抗体三次。将链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)分子在室温下加入各孔中1小时。用PBS洗脱后，测量化学发光信号。
iMEX测定
将10μL的掺入外泌体的PBS溶液与50μL免疫磁珠溶液在室温下混合30分钟。根据以下标准测定珠子浓度：[Cb×Vb×4πRb 2]/[Ce×Ve×πRe 2]>100，其中Cb和Ce分别是珠子和外泌体浓度；Vb和Ve分别是珠子溶液和掺入外泌体溶液的体积；Rb和Re分别是珠子和外泌体的平均半径。该要求确保了足够的珠表面可用于外泌体捕获。在我们的实验条件下，Re～50nm，Rb＝1.4μm，且Ce～1010/mL。因此，我们将珠子浓度调整到～108/mL。用永磁体将磁珠从溶液中分离，并重悬于80μL PBS(1％BSA)中。涡旋5秒后，分离珠子并重悬于80μL PBS(1％BSA)中。将10μL感兴趣的抗体(在PBS中20μg/mL)与珠子在室温下混合30分钟。如前所述分离和洗涤磁珠，并将它们重悬于50μL PBS(1％BSA)中。将5μL缀合链霉抗生物素蛋白的HRP酶(以1:100在PBS中稀释)与珠子在室温下混合15分钟。如前所述分离和洗涤磁珠，并将它们重悬于7μL的PBS中。将制备的珠子溶液和20μL UltraTMB溶液(ThermoFisherScientific)加载到丝网印刷电极的顶部。3分钟后，用电化学传感器开始计时电流法测量。对40-45秒范围内的电流水平进行平均。
从临床样品分离EV
所进行的研究得到了研究机构的机构审查委员会的批准，所遵循的程序符合机构指南。从所有受试者(n＝xx)获得知情同意书。从肾移植患者收集尿液样品(～15mL)，并以400g离心15分钟，以从红细胞和血沉棕黄层中分离血浆。对于每种表面标志物分析使用10μL血浆。
图28是肾中T细胞衍生的EV分泌小管的示意图。图29示出了肾移植排斥患者活组织检查样品的组织学。图30示出了用于检测Jurkat T细胞衍生的外泌体的96孔板形式iMEX系统的示意图。传感器可以同时测量96个样品的信号。扫描电子显微镜显示由CD3抗体功能化磁珠捕获的EV。还显示了iMEX测定的示意图。来自jurkat细胞或患者尿液的EV由抗CD3抗体缀合的磁珠捕获。随后的生物素化的抗CD63抗体和HRP酶标记产生电化学信号。
图31A示出了当在发现组中用iMEX测定检测具有CD3表达的EV时的测量电流。图31B示出了用于确定发现组中CD3标志物的灵敏度、特异性和准确性的ROC曲线。
图32A示出了当在验证组中用iMEX测定检测具有CD3表达的EV时的测量电流。图32B示出了用于确定验证组中CD3标志物的灵敏度、特异性和准确性的ROC曲线。
结论
该实施例证明了使用磁性电化学传感来筛选外泌体的与移植肾排斥相关的生物标志物作为在其早期阶段检测排斥的手段。
实施例3-食品测试
该实施例的目的是证明使用磁性电化学传感来检测食品中过敏原的存在。
不良食物反应，包括食物过敏、食物敏感性和自身免疫反应(如乳糜泻)影响了5-15％的人口，并且仍然是一个相当大的公共卫生问题，需要严格的食物避免，并且对于紧急事件还需要肾上腺素的可用性。鉴于今天对预制食品和在外用餐的依赖，避免有问题的食物说起来容易做起来难。我们开发了一种便携式、即用型技术，用于快速的外源性食物抗原测试(本发明称为“iEAT”)。该系统包括一次性抗原提取装置，其与电子钥匙链读取器耦合，用于快速传感和通信。我们对原型iEAT系统进行了优化，以检测花生、榛子、小麦、牛奶和鸡蛋中的五种主要食物抗原。使用iEAT进行抗原提取和检测所需的时间不到10分钟，检测灵敏度低于0.003ppm，远低于监管限值。在餐厅条件下进行测试时，我们能够检测隐藏的食物抗原，诸如在“无谷蛋白”食品中的谷蛋白。iEAT系统的小尺寸和快速、简单的测试不仅有助于消费者，也有助于临床医生、食品行业和监管机构提高食品安全性
超过5000万美国人有某种食物反应。仅在美国，食物过敏每年就要花费250亿美元。即使是微量的食物抗原也会引发急性过敏反应，这是一种可能危及生命的超敏反应，且需要注射肾上腺素。虽然免疫治疗试验的结果令人鼓舞，但主要方法仍然依赖于避免食物。“食品过敏原标识和消费者保护法案”(FALCPA)要求食品标识告知消费者产品中的过敏物质。即使如此，制造中的错误标识或交叉污染仍然会带来监管挑战。此外，FALCPA仅监督包装的食品，而不监管餐馆提供的食品。美国以外的食品标识不太严格，食物过敏通常会影响旅行者。因此，快速测试食物中常见过敏原的能力是一个主要的未满足的需求。
该系统包括一次性过敏原提取装置和用于传感和通信的电子钥匙链读取器。提取试剂盒捕获并聚集来自分散食物的食物抗原。然后使用小型化的钥匙链读取器对捕获的过敏原进行定量。总之，iEAT系统能够在短且可操作的时间范围内(即，整个测定<10分钟)进行定量过敏原检测。我们专门设计了iEAT以促进基于消费者的操作：i)提取试剂盒使用简单、价格低廉且是一次性的；ii)检测快速、可靠和准确；以及iii)嵌入式通信协议允许用户使用时间和地点标记记录并上传信息到云服务器。我们对iEAT原型进行了优化，以检测来自小麦、花生、榛子、牛奶和蛋清的五种代表性过敏原。快速iEAT测定实现了高灵敏度，远远超过黄金标准的ELISA。我们还展示了iEAT在常见食物中测量这些过敏原的实际用途。
iEAT分析
图33A描绘了便携式iEAT系统，其包括钥匙链读取器、提取试剂盒和智能手机App，如本发明图6-9所描述的。该系统包括钥匙链大小检测器、电极芯片和用于过敏原提取的一次性试剂盒。检测器与智能手机连接，用于系统控制和将数据上传到云服务器。
传感的第一步是经由使用免疫磁性富集的特别设计的一次性试剂盒提取过敏原(参见图33B)。将过敏原捕获在磁珠上并用与氧化酶(辣根过氧化物酶，HRP)缀合的第二抗体标记。已开发出一次性试剂盒来处理样品；收集包封磁体并重新分散MB。当与显色电子介体(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB)混合时，珠子由于TMB氧化产生电流。然后通过电极测量电流。通过酶促反应以及MB的磁性富集来扩增信号。电检测方案使得可以利用小型化电子装置进行定量测量。此外，使用磁珠作为固体基板以两种方式改善了测定性能。
首先，经由磁驱动简化了提取过程和样品处理。为了实现便携式操作，我们设计了一种用于珠子收集和再悬浮的简单包封磁条(参见图8)，这消除了对专用设备(例如，离心机、移液管)的需要。提取试剂盒简化了过敏原提取和标记过程。在玻璃棒的末端附着磁体，并用石英管包封。将该组件插入含有食物提取液和免疫磁珠的混合物的样品管中。将收集的珠子容易地转移到不同的管中进行洗涤和标记。
其次，通过在电极顶部磁聚集珠子来放大电化学信号。为此，我们设计了一个装有小磁体的电极支座(见图6D)。支座有一个小磁体，每个电极一个，用于聚集磁珠。示出了用于单个电极的支座。
我们将iEAT读数器设计为钥匙链大小的装置，以便于携带(参见图6A-6C)。迷你读数器不仅检测并显示结果，还经由蓝牙与智能手机无线通信，将测试结果和其它信息传输到云服务器，以便在用户之间进行基于Web的数据收集和共享。智能手机应用程序通过蓝牙与iEAT装置通信，并将数据上传到云服务器。功能包括：(i)拍摄用户和分析食物的照片；(ii)设置检测通道(例如，过敏原类型)；(iii)显示测量结果；(iv)跟踪食物摄入量；以及(v)存储测量时间和在地图上的位置。
此外，该通信能力为系统控制、数据存储和无线电池充电提供扩展的用户界面。该装置具有多个组件，包括用于电流测量的恒电位仪、用于信号处理的微控制器单元(MCU)、迷你显示屏、可充电电池和用于插入电极板的卡缘连接器。这种小型化装置是一个独立的装置单元，测量电流并根据预加载的查找表显示过敏原浓度。
如图34所示，iEAT读数器包括定制设计的恒电位仪，其连接到数模转换器以用于电位控制，连接到模数转换器以用于信号数字化。对MCU进行编程以测量从工作电极(W)到对电极(C)的电流，同时在工作和参比(R)电极之间保持恒定电位。该电路被设计用于容纳单个电极或电极阵列。对于单个电极，在卡缘连接器的顶侧发生电接触；对于多通道阵列，通过卡缘连接器的底侧发生接触。iEAT读数器自动传感操作模式(即，单通道或多通道)。对于多通道检测，MCU通过多路复用器顺序轮询电极。
我们使用亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6]标准品对iEAT性能与商用台式恒电位仪(SP-200,Bio-Logic)进行了基准测试。我们为每个系统生成了K4Fe(CN)6校准曲线。接下来，我们测量了不同K4Fe(CN)6浓度下的测试样品，并且我们从校准曲线获得它们的浓度。我们观察到两个系统之间的良好匹配(R2＝0.995；参见图35)。iEAT读数器也显示出良好的精确度：五次重复测量的变异系数(CV)<4.1％，与使用台式系统获得的CV(<4.9％)相当。然而，iEAT读数器的外形尺寸(5.5×2.5×2.4cm3,35g)比台式系统(38×21×17cm3,6kg)小得多，并且能够进行8个平行测量。
抗原提取
我们首先优化了抗原提取方案。我们的目标是尽可能缩短提取时间和成本，同时最大限度地提高回收率。我们使用五种主要的蛋白质抗原作为提取目标：麦醇溶蛋白(小麦)、Ara h1(花生)、Cor a1(榛子)、酪蛋白(牛奶)和卵清蛋白(蛋清)。通过将已知量(10ppm)的蛋白质掺入白米中来制备模拟食物。我们测试了三种提取缓冲液：2-巯基乙醇(2-ME)、用胍增强的三-(2-羧乙基)膦(TECP/GUA)和具有N-月桂酰肌氨酸的TECP(TECP/肌氨酰)。2-ME还原缓冲液通常用于从高度加工的食物中提取蛋白质，但具有强烈的气味。我们准备了基于TECP的还原剂作为潜在的用户友好替代品。
对于给定的提取缓冲液，我们改变了温育时间和温度，并且我们监测了回收率。图36A示出了用2-ME缓冲液提取Ara h1的实例。即使在室温下提取也是有效的；在温育2分钟内回收了超过60％的抗原。提取率随温度升高而增加。例如，在微波炉(1100W)中加热20秒后，在提取缓冲液中温育1分钟，产率增加至80％。所有三种提取缓冲液对五种测试抗原显示出相似的性能(参见图36B和36C)。因此，我们选择使用无味、低成本的TECP/肌氨酰提取缓冲液(见表1)
表1.五种食物抗原的iEAT检测限
过敏原 检测限(ppm) 行动阈值1(ppm)*
麦醇溶蛋白 0.076 20
Ara h1 0.007 8
Cor a1 0.090 10
酪蛋白 0.812 50
卵清蛋白 0.003 20
*VITAL(Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling)创建了一系列行动级别。行动阈值1不要求食物制造商贴标签或声明。
我们还构建了一个小型加热装置(参见图37)以加速提取过程。将提取条件设定为在～60℃温育2分钟。
测量
为了捕获预定的抗原，我们通过将单克隆抗体与磁珠缀合来制备免疫磁珠(直径2.8μm)。将对照珠缀合至同种型匹配的IgG抗体。使用花生过敏原滴定测定的最佳珠子浓度为～8×106珠子/mL(参见图38A)。对花生过敏原(Arah1)特异的磁珠被用于检测20ppm Arah1。珠子浓度>107mL-1导致信号饱和。最佳珠子浓度设定为8×106mL-1。对其它过敏原重复类似的实验。示出的数据为从重复测量得到的平均值±标准差。
在室温下与食物提取物一起温育(3分钟)后，用包封磁体收集珠子并转移到新鲜缓冲液中进行洗涤。随后，用缀合HRP的抗体标记珠子(在室温下3分钟)，洗涤并与TMB混合以产生信号。在应用还原电位(-0.1V)之后60秒内电流稳定(参见图38B，动态电流响应)。测量的信号在50和60秒之间取平均值。背景和目标样品之间的净电流差被用作分析测量。因此，我们对iEAT读数器进行了编程以平均在50到60秒之间的电流水平。来自对照珠的电流水平在不同的过敏原中约为-110nA，并且目标样品和背景之间的电流差被定义为净信号。包括过敏原提取在内的总测定时间<10分钟。
为了促进试剂的储存和运输，我们进一步冻干了免疫磁珠和抗体。我们测试了不同的冻干培养基(PBS、蔗糖)和储存条件(冷藏、室温)。试剂活性无显著差异；所有冻干试剂在储存四周后保持其活性(>96％)(参见图39A和39B)。参照图39B，将免疫磁珠和检测抗体在PBS或蔗糖中冻干。将冻干产物在室温或4℃下储存，并用于检测10ppm花生过敏原。无论赋形剂类型和储存条件如何，试剂都保持其活性。所有测量均重复，数据显示为平均值±标准差。鉴于其易于获得，我们选择PBS作为赋形剂，并且为了易于使用，我们选择环境条件用于储存的冻干试剂。
分析性能
我们接下来通过变化目标过敏原剂量生成响应曲线(对于Ara h1参见图40A，对于其它参见图40B)；这些曲线作为查找表被加载到iEAT读数器中。iEAT测定具有高度灵敏度、精确性，允许鲁棒的过敏原定量。检测限(LOD)，定义为3σ·m-1(其中σ和m分别是标准偏差和校准曲线的斜率)，其比引发剂量(ED)阈值低超过220倍(见表1)。通过测量具有六次重复的三种不同浓度的标准品(1、5和10ppm)估计的测定内差异<5％(参见图40C)，并且测定间差异<5％。为了比较，我们还通过ELISA测试了相同的样品。iEAT结果与ELISA测量结果良好相关(参见图40D，R2＝0.995)。然而，iEAT测定要快得多(10分钟相比于ELISA的2小时)。为了测试测定的特异性，我们将目标探针应用于不同的过敏原标准品(5ppm)。如图43E所示，特异性信号比非目标样品大20倍。
现场测试
我们接下来应用iEAT平台测试消费食品。我们首先测试了一组包装主食(面包、牛奶、谷物)和甜点(饼干、冰淇淋)。如上所述，在2分钟内处理小份量食物(约1g)，并测定提取物的麦醇溶蛋白、Ara h1(花生)、Cor a1(榛子)、酪蛋白(牛奶)和卵清蛋白(蛋清)。分析结果总结在图41A中。如所预期的，具有特定标记的产品(例如，“无谷蛋白”、“无坚果”)基本上没有列出的过敏原。然而，大多数产品含有至少一种未指明的抗原；例如，无坚果饼干的品牌含有谷蛋白，而无谷蛋白品牌含有花生过敏原。
我们接下来测定从餐馆获得的食物(汉堡、配酱沙拉、披萨和啤酒)。分析结果(参见图41B)示出了预期的过敏原，诸如汉堡包和比萨饼中的谷蛋白，但我们还检测到由食品加工带来的意外抗原。例如，沙拉含有谷蛋白，其可能来自沙拉酱。我们还在啤酒中发现了卵清蛋白和酪蛋白，这并不奇怪，因为蛋清用于改善泡沫特性，酪蛋白用于在酿造过程中稳定啤酒。
利用iEAT与智能手机的接口，我们跟踪个人饮食摄入，在云服务器中记录具有时间点的抗原数据(参见图41C)。作为一个实例，我们调查了来自七家当地餐馆的无谷蛋白菜单商品并记录了具有区域信息的结果(例如，食物名称、谷蛋白含量)。在“无谷蛋白”商品中，我们观察到广谱抗原水平(1ppm至>100ppm)；三个商品的谷蛋白远远超过监管限度(参见图41D，左)。然后将这些结果用于创建基于证据的餐馆地图(参见图41D，右)。可以共享和扩展这些地图以包括其它抗原，从而用于个性化。
材料
按原样使用以下化学和生物化学试剂：超顺磁珠(6.7×107珠/mg，M-270Epoxy,Invitrogen)；牛血清白蛋白(≥98％,BSA,Sigma)；卵清蛋白(OVA,InvivoGen)，来自小麦的麦醇溶蛋白(Sigma)；来自牛奶的酪蛋白(Sigma)；硫酸(1N,Fluka)；高灵敏度链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(strep-HRP,ThermoScientific)；单克隆小鼠IgG1(1.0mg/mL,Ancell)；单克隆小鼠IgG2a(1.0mg/mL,Ancell)；麦醇溶蛋白肽抗体(14D5,1.0mg/mL,单克隆小鼠IgG2a,Enzo Life Sciences)；抗麦醇溶蛋白抗体(15.5mg/mL，与HRP缀合，多克隆兔IgG，abcam；与来自MIoBS的麦醇溶蛋白ELISA试剂盒的HRP缀合)；卵清蛋白抗体(6C8，0.98mg/mL，单克隆小鼠IgG1，Thermo Fisher)；抗OVA多克隆抗体(与HRP缀合，来自MIoBS的卵清蛋白ELISA试剂盒)；天然纯化的Arachis hypogaea过敏原(花生蛋白Ara h1，IndoorBiotechnologies)；抗Ara h1抗体(2C12，2.7mg/mL，单克隆小鼠IgG1，IndoorBiotechnologies)；生物素化的抗Ara h1抗体(2F7，单克隆小鼠IgG1，IndoorBiotechnologies)；花生标准品(Diagnostic Automation,Inc.)，兔抗牛酪蛋白多克隆抗体(2mg/mL，AGRO-BIO)；抗酪蛋白多克隆抗体(与HRP缀合，来自MIoBS的酪蛋白ELISA试剂盒)；榛子蛋白质标准品(榛子ELISA试剂盒和DiagnosticAutomation,Inc.)；抗榛子蛋白的兔多克隆抗血清(抗榛子抗体，Accurate Chemical&Scientific Corporation)；HRP缀合的抗榛子抗体(榛子ELISA试剂盒)；蔗糖(≥99.5％,Sigma)；1-步的超3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)ELISA底物溶液(ThermoScientific)；三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,≥99％,Sigma)；2-巯基乙醇(2-ME,≥99％,Aldrich)；盐酸胍(GUA,≥99％,Sigma)；十二烷基硫酸钠(SDS,≥99％,Sigma-Aldrich)；N-月桂酰肌氨酸(≥95％,Sigma)；三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,≥98％,Aldrich)；吐温20(Sigma)和亚铁氰化钾(≥98.5％,Sigma-Aldrich)。除非另有说明，否则所有溶液均在25℃下制备，使用的超纯水的电阻率为18.2MΩ.cm，并在4℃下储存。
iEAT读数器的制作
钥匙链检测(5.5×2.5×2.4cm3)围绕微控制器单元(MCU,ATSAMD21G18,AtmelCorporation)构建。使用数模转换器(DAC8552,TexasInstruments)来设定参比电极和工作电极之间的电位。对于电流测量，将数模转换器(ADS1115,Texas Instruments)和恒电位仪连接到MCU的外设接口。恒电位仪包括两个运算放大器(AD8608,Analog Devices)：一个放大器保持工作电极和参比电极之间的电位差，另一个放大器用作跨阻放大器以将电流转换为电压信号。其它外围装置包括用于与外部装置进行蓝牙连接的通信模块(Bluefruit EZ-Link)、显示模块和可充电电池。
智能手机应用程序
使用MIT App Inventor 2，我们创建了一个Android应用程序，以方便系统操作和数据记录。该应用程序允许用户控制装置，拍摄样品照片，并记录测量详细信息(时间点、电流值、估计的分析物浓度和GPS位置)。数据存储在云存储(Google云端硬盘)中。
抗体标记的免疫磁珠(Ab-MBs)的制备
将磁珠(～3.4×108)重悬于1mL磷酸钠缓冲液中。将珠子溶液短暂涡旋，并通过放置磁体收集珠子。弃去上清液。该洗涤步骤重复两次。接下来，将珠子与约100μg捕获抗体或参比IgG以及含1M硫酸铵的磷酸钠缓冲液混合。总体积为300μL，使珠子浓度为～1.1×109珠子/mL。将珠子溶液在4℃下温育16小时，伴有缓慢倾斜旋转以避免珠子沉降。磁珠的表面环氧基团允许经由伯氨基直接共价结合抗体。然后，收集包覆的珠子并用1mL PBS洗涤三次。然后将制备的Ab-MB重悬于200μL PBS,1％BSA中，将其用作储备溶液。
免疫磁珠和检测抗体的冻干
蔗糖和PBS被用于制备Ab-MB和抗体的冻干。将比抗体浓度高300倍的蔗糖摩尔浓度(在PBS中)的量或相同体积的PBS溶剂(如制备蔗糖)加入到Ab-MB或抗体储备溶液中。将混合物在液氮中冷冻，然后在VirTisFreezemobile 25EL冷冻干燥器(SP Scientific)中干燥。将冻干的试剂在室温或4℃下储存，并在使用前通过加入200μL超纯蒸馏水重新配制。
抗原标准品
我们用白米粉作为模型食品基质。在10mL PBS中制备1.0g米粉并煮沸以制备均匀混合的溶液。然后我们将五种过敏原(麦醇溶蛋白、Ara h1、Cora1、酪蛋白、卵清蛋白)中的每一种加入米溶液中。
提取缓冲液
制备三种提取缓冲液：(1)50mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05％20,250mM2-ME,2M GUA,1％SDS,pH 7.4；(2)50mMTris-HCl,150mM NaCl,0.05％20,20mMTCEP,2M GUA,pH 7.4；(3)50mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05％20,5mM TCEP,2％N-月桂酰肌氨酸，pH7.4。
食物样品制备
食物样品来自当地超市和餐馆。将食物样品(约1g)切成小块并与19mL提取缓冲液混合。在过敏原提取后，将上清液作为样品提取物用于随后的iEAT检测。通过乘以20倍稀释倍数回复样品中的过敏原量。
iEAT测定
将20μL食物提取物与50μL Ab-MB溶液混合，并在室温下温育3分钟。为了洗涤，使用玻璃包封的磁条收集珠子并在PBS(100μL)中释放。然后将珠子与HRP缀合的抗体(10μL)一起温育3分钟并如上所述洗涤。将HRP-珠复合物与TMB底物混合，并加载到电极上。1分钟后，开始计时电流法测量。对50至60秒之间的电流水平进行平均。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
将存储的捕获抗体和参比IgG抗体在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(15mM Na2CO3,35mMNaHCO3,pH 9.6)中稀释至～3μg/mL，并加入96孔聚苯乙烯无菌平底微孔板(100μL/孔)中，在4℃下温育过夜。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)将包覆的板洗涤三次以除去未结合的抗体。然后加入含有1％BSA的PBS(100μL/孔)以封盖未占据的结合位点。用PBST冲洗板三次。将过敏原标准品和样品提取物(100μL/孔)一式两份地分配到板孔中，在室温下温育1小时。将板用PBST洗涤三次。然后加入100μL等份的生物素化检测抗体，并在室温下温育1小时。用PBST洗涤三次后，在室温下用100倍稀释的strept-HRP溶液(100μL/孔)填充30分钟。用PBST冲洗板三次。通过添加100μL TMB底物来生成化学发光信号。在室温下温育10分钟后，向每个孔中加入100μL硫酸(1N)以终止酶反应。使用读板器(TECAN)在450nm下测量每个孔的光学吸光度。
统计分析
获得的所有数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用GraphPad Prism 6进行统计学分析。低于0.05的p值被认为是显著的。
讨论
我们开发了即时食品测试系统(iEAT)，可灵敏地检测多种食物抗原，检验“安全”食物，消除不必要的避免，从而为消费者提供支持。我们进一步设想该系统被食品工业、食品反应诊所和监管机构使用。基于电化学反应的信号检测是快速、可扩展的，非常适合于紧凑的电子装置并且适合于多路复用。我们将钥匙链读数器原型化为可独立运行，也可以通过无线方式进行充电，并实现与云的蓝牙通信。该装置相对便宜，并且在当前装置中每个抗原的测定成本约为3美元。随着规模扩大和生产冻干试剂盒的能力，我们预计这些成本将大大降低。有了这些功能，iEAT系统与世界卫生组织的即点装置指南密切配合，即ASSURED，其被定义为价格合理、灵敏、特异、用户友好、快速和稳定、无设备(即无大电力依赖性仪器)和可交付使用的。
我们选择量化五种代表性模型抗原，这些抗原通常存在于消费者食品中并且是大多数食物反应的原因。虽然这些抗原被选择用于验证原理，但仍存在许多其它潜在的抗原，诸如贝类(虾、龙虾)，鳍鱼(金枪鱼、鲑鱼)，坚果(核桃、山核桃、腰果)，花粉和水果等等。将这些和其它过敏原添加到检测列表中是相对简单的。iEAT读数器具有单通道和多通道电极，后者可同时测量八种过敏原。顺序测量或扩大通道数是允许更广泛测试的可行方法。
虽然我们专注于特定的蛋白质抗原，但也可以通过改变亲和配体(例如，适体、寡核苷酸)来修改当前的测定形式以检测小分子、毒素或核酸；创建用于食品安全(例如农药)和用于食品源鉴别(例如，基于DNA的测试)的检测板。该装置可以有许多有趣的应用，诸如验证食物来源、确认没有污染物或支持宗教目的的饮食限制。通过系统集成可以进一步增强这些和其它应用，例如，通过开发一次性射流器以简化样品处理。无论具体应用如何，我们设想便携式iEAT技术将允许对食品进行更严格和循证的分析，增强消费者保护，减少意外过敏暴露，并鉴别我们的食品供应链中的问题。
其它实施方案
虽然本说明书包含许多细节，但这些细节不应被解释为对可要求保护的范围的限制，而是作为特定实例特有的特征的描述。还可以组合在独立的实施方案的上下文中在本说明书中描述的一些特征。相反，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合来实现。
已经描述了许多实施方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其它实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种目标分析物检测装置，包括：
壳体，含有恒电位仪和耦合到恒电位仪的微控制器；
基板，包含在基板的第一表面上的多个电极，其中所述多个电极中的第一组电极限定第一样品检测区域，其中所述基板被可拆卸地连接到壳体，使得在将基板连接到壳体时所述第一组电极耦合到恒电位仪；和
磁体组件，其可耦合到基板的第二表面，其中所述磁体组件包括位于磁体组件中的磁体，使得在将磁体组件耦合到基板时，来自磁体的磁场穿过基板和第一组电极延伸到第一样品检测区域上方的区域中。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述壳体还包含：
数模转换器(DAC)电路，其中DAC的输出电耦合到恒电位仪的输入；
模数转换器(ADC)电路，其中ADC电路的输入耦合到恒电位仪的输出；和
微控制器，其电耦合到DAC电路和ADC电路，其中微控制器被配置为向DAC电路的输入提供电压信号，且其中微控制器被配置为从ADC电路的输出接收测量信号。
3.如权利要求2所述的装置，还包括多个恒电位仪：
其中多个电极包括至少一组另外的电极，每组电极耦合到多个恒电位仪的不同的相应恒电位仪，并且每组电极限定不同的相应样品检测区域。
4.如权利要求3所述的装置，包括电耦合到多个恒电位仪中的每个恒电位仪的输出的多路复用器，其中所述多路复用器被配置为将所选输出电耦合到ADC电路的输入。
5.如权利要求3所述的装置，包括布置在基板表面上的孔板，所述孔板具有多个孔，其中所述多个孔中的每个孔可以直接布置在不同的相应样品检测区域上。
6.如权利要求3所述的装置，其中磁体组件包括多个磁体，且其中在将磁体组件耦合到基板时，多个磁体中的每个磁体可以定位在基板附近并与相应的一组电极对齐，使得磁场从磁体穿过基板和相应的电极组延伸到由相应的一组电极限定的样品检测区域上方的区域中。
7.如权利要求1所述的装置，其中基板包括卡缘连接器，且所述装置还包括卡缘连接器插座。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述装置还包括电子通信接口。
9.如权利要求8所述的装置，其中电子通信接口包括至少一个通用串行总线连接器或无线收发器。
10.如权利要求1所述的装置，其中第一组电极包括三个独立的电极。
11.如权利要求10所述的装置，其中三个独立的电极中的第一电极和第二电极是第一金属，且三个独立的电极中的第三电极是第二金属。
12.如权利要求1所述的装置，其中第一组电极由两个独立的电极组成。
13.如权利要求1所述的装置，其中第一组电极包括交叉指型电极。
14.如权利要求1所述的装置，其中所述壳体进一步包含电源和耦合到微控制器的收发器。
15.如权利要求1所述的装置，其中所述装置还包括耦合到微控制器的显示器。
16.一种检测目标分析物在第一流体样品中的存在的方法，包括：
向第一流体样品提供多个磁珠，其中多个磁珠包括特异性结合目标分析物的第一结合部分；
使所述多个磁珠结合第一流体样品中的目标分析物；
将磁珠从第一流体样品转移到第二流体样品，其中第二流体样品包括特异性结合目标分析物的第二结合部分，且其中第二结合部分与活性酶结合，
其中转移磁珠包括：
将护套浸入第一流体样品中；
将磁体放置在浸入第一流体样品中的护套内，使得磁珠粘附到护套上；
从第一流体中移除包含磁体的护套；和
将含有磁体的护套浸入第二流体样品中；
允许第二流体样品中的第二结合部分结合到与磁珠的第一结合部分结合的目标分析物；
将包含多个磁珠的第二流体样品和第二结合部分与电子介体溶液组合以获得第三流体样品；
将第三流体样品提供给基板的样品检测区域，其中样品检测区域布置在第一电极上；
将第三流体样品暴露于磁场以将多个磁珠保持在第三流体样品中靠近第一电极的位置，其中第一电极电耦合到恒电位仪；
在第三流体样品中的电子介体和活性酶之间诱导氧化还原反应；
监测恒电位仪的输出以确定第三流体样品中目标分析物的存在，其中通过氧化还原反应改变恒电位仪的输出。
17.如权利要求16所述的方法，其中诱导氧化还原反应包括将电位施加到第二电极，使得发生氧化还原反应，其中第二电极电耦合到恒电位仪。
18.如权利要求17所述的方法，其中监测恒电位仪的输出包括测量来自第一电极的电压或电流，其中来自第一电极的电压或电流根据氧化还原反应而变化。
19.如权利要求16所述的方法，其中监测恒电位仪的输出包括：
从多个不同的恒电位仪的输出中选择恒电位仪的输出；
将所选择的输出提供给微控制器单元；
在显示器上呈现所选择的输出。
20.如权利要求16所述的方法，其中活性酶包括辣根过氧化物酶(HRP)，以及电子介体溶液包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
21.如权利要求16所述的方法，其中目标分析物包括细胞外囊泡。
22.如权利要求16所述的方法，其中细胞外囊泡包括外泌体。
23.如权利要求16所述的方法，其中目标分析物包括CD24、EpCAM、CA125、EGFR、HER2、MUC1、CD44、CD44v6、CEA、间皮素、Trop2、GPC1、WNT2、Grp94、SSTR2、EGFRv3、IDH1-R132、GPA33、KRAS、CD166、CD133、MET、B7H3、CD63、CD9和CD81生物标志物中的任一种。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，还包括：
将恒电位仪的输出与参考水平进行比较以确定输出是高于还是低于参考水平；
基于该比较诊断患者体内是否存在癌症。
25.如权利要求16所述的方法，其中目标分析物包括免疫细胞标志物。
26.如权利要求25所述的方法，其中免疫细胞标志物包括CD2、CD3、CD45、CD52、HLA-ABC、CD81、CXCL10或CXCL9生物标志物。
27.如权利要求26所述的方法，还包括：
将恒电位仪的输出与参考水平进行比较以确定输出是高于还是低于参考水平；
基于该比较诊断患者是否排斥器官移植。
28.如权利要求16所述的方法，其中第一流体样品包括血液或尿液。
29.如权利要求16所述的方法，其中目标分析物包括蛋白质、细胞、肽、蛋白质、脂质、毒素、核酸、微生物、食物抗原或代谢物。
30.如权利要求16所述的方法，还包括：
将食物样品与提取缓冲液组合以提供第一流体样品；
将食物样品与提取缓冲液一起温育以从食物样品中提取目标分析物。
31.一种试剂盒，包括：
样品管；
样品管帽；
包含第一磁体的细长杆；和
目标分析物检测装置，包括：
壳体；
壳体中的恒电位仪；
包括多个电极的第一基板，所述多个电极包括限定第一样品检测区域的第一组电极，其中第一基板被配置为可拆卸地连接到壳体，使得当第一基板连接到壳体时第一组电极耦合到恒电位仪；和
被配置为邻近第一基板放置的第二磁体，使得来自磁体的磁场穿过基板和第一组电极延伸到第一样品检测区域上方的区域中。
32.如权利要求26所述的试剂盒，其中样品管帽包括延伸到细长护套中的开口，其中细长杆的尺寸被设计成配合在细长护套内。
33.如权利要求26所述的试剂盒，还包括：
包含多个磁珠的提取缓冲溶液；
洗涤缓冲溶液；
目标分析物缓冲溶液；和
氧化酶缓冲溶液。
34.如权利要求26所述的试剂盒，其中目标分析物检测装置进一步包括：
数模转换器(DAC)电路，其中DAC的输出电耦合到恒电位仪的输入；
模数转换器(ADC)电路，其中ADC电路的输入耦合到恒电位仪的输出；
微控制器，其电耦合到DAC电路和ADC电路，其中微控制器被配置为向DAC电路的输入提供电压信号，且其中微控制器被配置为从ADC电路的输出接收测量信号。
35.如权利要求26所述的试剂盒，其中目标分析物检测装置包括显示器。
36.如权利要求26所述的试剂盒，还包括第二基板，所述第二基板包括限定第二样品检测区域的附加的多个电极，其中第二基板被配置为可拆卸地连接到壳体。
37.如权利要求31所述的试剂盒，还包括第三磁体，其被配置为可拆卸地连接到第二基板。
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