CN110632148A - 一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法与应用，属于生物医学检测技术领域。基底电极由GH‑MB溶液修饰，自噬小体表面标志LC3B第一抗体溶液共价结合到修饰后的基底电极上，制备得到电化学免疫传感器。本发明还提供了一种基于GH‑MB信号放大的电化学免疫传感器的人外周血和小鼠外周血中分泌型自噬小体的检测方法，分泌型自噬小体由Fe3O4‑Au修饰的LC3B第二抗体捕获后特异性结合到LC3B第一抗体上，所述检测方法灵敏度高、特异性好、具有很宽的线性范围和较低的检测限且成本低廉。

Description

一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病，大量研究和临床资料证实，早期诊断和早期治疗是防治肿瘤与降低肿瘤患者死亡率的最有效办法。因此，寻找有助于早期诊断的肿瘤标志物是人们一直关注的焦点。肿瘤标志物(tumor marker,TM)是指在恶性肿瘤发生和增生过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成、分泌的，或因机体对肿瘤反应而异常产生和(或)升高的一类物质，这些物质能为肿瘤诊断、治疗和预后监测等提供有效信息。新型的肿瘤标志物可以为癌症的早期诊断提供更多可能，因此，新型肿瘤标志物的检测及应用具有良好的前景。
自噬是指吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。酵母细胞和哺乳动物细胞内形成的自噬小体能够释放至胞外，称之为分泌型自噬小体，自噬小体的特征性标记是LC3B(微管相关蛋白轻链3B)。而自噬与肿瘤的疾病进程、生存时间及疾病复发等密切相关。
目前现有检测细胞自噬的方法有透射电镜直接观察、GFP-LC3示踪、western blot检测自噬相关基因、免疫组化检测LC3B等，但尚未有快速、简便、直接检测分泌型自噬小体的方法。
电化学免疫传感器以离子导电为基础制备而成，利用抗原抗体特异性结合捕获目标检测物，从而实现对目标物定量的目的，具有灵敏度高、成本低廉、操作方便等优点，在不同领域已有应用，具有广阔的应用前景。
发明内容
发明目的：为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种基于GH-MB信号放大的电化学免疫传感器及其制备方法。本发明还提供了一种基于GH-MB信号放大的电化学免疫传感器的人外周血和小鼠外周血中分泌型自噬小体的检测方法，所述检测方法灵敏度高、特异性好、具有很宽的线性范围和较低的检测限且成本低廉。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，其基底电极由GH-MB(氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝)溶液修饰，LC3B(微管相关蛋白轻链3B)第一抗体溶液共价结合到修饰后的基底电极上，即得。
上述测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将基底电极进行打磨、抛光、超声清洗；
(2)将GH-MB溶液滴加到步骤(1)预处理后的基底电极表面，25～45℃放置0.5～3h，然后用PBS溶液清洗，晾干；其中，优选37℃下放置2h；
(3)共价连接LC3B第一抗体：将EDC/NHS(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺)溶液滴加到步骤(2)处理后的基底电极表面，室温放置0.5～3h，优选2h，然后用PBS溶液清洗，晾干；将LC3B第一抗体溶液滴加到清洗后的电极表面，1～10℃放置10～15h，优选12h，用PBS溶液清洗，晾干；
(4)封闭非特异性位点：滴加BSA溶液于步骤(3)处理后的基底电极表面，室温放置0.5～5h，优选0.5h，然后用PBS溶液清洗，晾干；
步骤(1)中基底电极分别用0.05和0.03μm Al2O3粉末抛光，然后分别用无水乙醇和超纯水超声清洗5min；步骤(2)中，所述GH-MB的滴加量为8～15μL，优选10μL；步骤(3)中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的浓度为15～30mg/mL，氮羟基琥珀酰亚胺的浓度为5～15mg/mL，溶剂为pH＝6.0的PBS；EDC/NHS溶液的滴加量为8～15μL；所述LC3B第一抗体溶液的溶剂为PBS，浓度为8～15μg/mL，滴加量为8～15μL，优选10μg/mL，10μL；步骤(4)中，所述BSA的溶剂为0.1M PBS，BSA的质量分数为0.2～2％，滴加量为8～15μL；
其中，所述基底电极为玻碳电极。
其中，所述GH-MB溶液的制备方法如下：
(Ⅰ)取2～8mg/mL的氧化石墨烯(GO)溶液，优选5mg/mL，超声20～40min，优选30min，再加入乙二醇，置于密闭容器中，于160～200℃反应10～15h，优选180℃反应12h，反应结束后，水洗，得到氧化石墨烯水凝胶；
(Ⅱ)将亚甲蓝加入步骤(Ⅰ)得到的氧化石墨烯水凝胶中，室温搅拌0.5～3h，优选2h，离心，将沉淀物水洗，每毫克沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，超声分散，获得GH-MB溶液。
步骤(Ⅰ)中，所述氧化石墨烯溶液的溶剂为水；控制乙二醇的添加量，使得氧化石墨烯溶液与乙二醇的体积比为5:1～5:4，优选5:2；所述密闭容器为Teflon高压灭菌器；所述水洗为采用双蒸馏水浸泡洗涤2～5次，优选3次；所述氧化石墨烯水凝胶的浓度为0.8～1.5mg/mL，优选1mg/mL；
步骤(Ⅱ)中，控制亚甲蓝的添加量，使得氧化石墨烯水凝胶与亚甲蓝的体积比为5:3～1:1，优选5:4；GH-MB溶液的浓度为1～5mg/mL。
上述的制备方法制备得到的电化学免疫传感器也在本发明保护范围之内。
上述的电化学免疫传感器在定量检测分泌型自噬小体中的应用也在本发明保护范围之内。
其中，所述的应用具体为自噬小体通过Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液磁性富集捕获后特异性结合到LC3B第一抗体上，其包括如下过程：
①磁性富集纯化自噬小体：将Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液滴加于自噬小体溶液，20～50℃反应10～120min，优选37℃反应100min，然后用PBS溶液清洗并重悬于PBS，捕获自噬小体；
②Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠特异性结合：将步骤①所捕获的自噬小体滴加到电化学免疫传感器的基底电极表面，进行特异性反应，20～50℃反应10～90min，优选37℃反应60min，然后用PBS溶液清洗，晾干。
步骤①中，所述Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液的的浓度为10～30μg/mL，优选10μg/mL；滴加量为80～150μL，优选100μL；自噬小体溶液量为500～1000μL，优选500μL；重悬于50～100μL PBS，优选50μL；步骤②中，所述捕获的自噬小体的滴加量为8～15μL，优选10μL。
其中，所述Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液的制备方法如下：
1)Fe3O4的制备：将FeCl3与柠檬酸钠溶于乙二醇，随后加入乙酸钠，剧烈搅拌10～40min，优选30min，倒入反应釜中，反应制备Fe3O4溶液；
2)AuNPs的制备：将HAuCl4溶液加热至沸腾，搅拌下加入柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸10～30min，优选15min，冷却，制备AuNPs溶液；
3)Fe3O4-Au的制备：将步骤(1)制备得到的Fe3O4溶液与PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵)混合震荡10～40min，优选30min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，优选1mL，加入AuNPs室温混合震荡5～10h，优选7h；离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中重悬于水，优选1mL，得到Fe3O4-Au溶液；
4)Fe3O4-Au第二抗体的制备：将步骤(3)所制备的Fe3O4-Au溶液加入到4-巯基丁酸中，室温震荡10～24h，优选震荡过夜；磁性分离，水洗，优选水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，优选1mL；加入1-丁硫醇，室温振荡40～80min，优选1h；磁性分离，水洗，优选水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL；加入EDC/NHS溶液室温振荡100～160min，优选2h，磁性分离，PBS洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL；加入LC3B第二抗体，2～10℃振荡10～24h，优选4℃震荡过夜；加入BSA，2～10℃搅拌40～80min，优选4℃搅拌1h，磁性分离，PBS洗，优选洗三遍，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL，获得Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液。
步骤1)中，FeCl3与柠檬酸钠的质量比为2:1～4:1，优选3.25:1，控制乙二醇的用量使得FeCl3浓度为0.01～0.05g/mL，优选0.0325g/mL，FeCl3与乙酸钠的质量比为1:1～1:4，优选6.5:12；搅拌速率为400-1000r/min，优选800r/min，反应温度为180～220℃，反应时间为6～12h，优选200℃反应10h；所述的反应釜为水热反应釜；反应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，即为Fe3O4溶液；所述Fe3O4溶液的浓度为0.5～2mg/mL，pH值为8.0～10；其中，Fe3O4溶液的浓度优选为1mg/mL，pH值优选为9.5。
步骤2)中，所述HAuCl4溶液的溶剂为水，质量百分比为0.005％～0.02％，优选0.01％；所述柠檬酸钠溶液的溶剂为水，质量百分比为0.05％～2％，优选1％；HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为55:1～40:1，优选50:1。
步骤3)中，所述PDDA的质量百分比为2％～5％，优选4％；Fe3O4溶液与PDDA的体积比为1:0.6～1:0.2，优选1:0.4；所述AuNPs的pH值为6.5～7.8，优选7.0；Fe3O4溶液与AuNPs的体积比为1:6～1:15，优选1:10；所述Fe3O4-Au溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选1mg/mL；所述水洗为水洗2～5次，优选3次；所述离心，其转速为8000～12000rpm，优选10000rpm。
步骤4)中，所述4-巯基丁酸的浓度为0.8～1.2mM，优选1mM，Fe3O4-Au溶液与4-巯基丁酸的体积比为6000:1～4000:1，优选5000:1；所述1-丁硫醇的浓度为0.8～1.2mM，优选1mM，Fe3O4-Au溶液与1-丁硫醇的体积比为6000:1～4000:1，优选5000:1；所述EDC/NHS溶液中EDC的浓度为15～30mg/mL，优选20mg/mL，NHS的浓度为5～15mg/mL，优选10mg/mL，溶剂为PBS(pH＝6.0)，Fe3O4-Au溶液与EDC/NHS溶液的体积比为1:0.8～1:1.5，优选1:1；所述LC3B第二抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL，优选1mg/mL，Fe3O4-Au溶液与LC3B第二抗体的体积比为50:1～200:1，优选100:1；所述BSA的质量百分比为0.2％～2％，优选1％；所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4-Au-LC3B第二抗体复合物。
一种检测人和小鼠肿瘤的试剂盒，包括上述的电化学免疫传感器。
肿瘤相关标志物为肿瘤细胞分泌的自噬小体，具体操作步骤为：取5mL抗凝全血离心后，取上清500～1000μL，优选500μL，按照上述方法磁性富集纯化后构建免疫传感器进行检测。
本发明中技术术语的缩写如下：
肿瘤细胞分泌的自噬小体：TRAP；氧化石墨烯水凝胶：GH；亚甲蓝：MB；四氧化三铁：Fe3O4；金纳米粒子：AuNPs；聚二烯丙基二甲基氯化铵：PDDA；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐：EDC；氮羟基琥珀酰亚胺：NHS；微管相关蛋白轻链3B：LC3B；牛血清白蛋白：BSA；差分脉冲伏安法：DPV。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的免疫传感器用于检测外周血中的分泌型自噬小体，填补了目前直接检测分泌型自噬小体的空缺，也不需要现有检测方法中对样品进行的复杂处理。
(2)本发明的免疫传感器具有优异的抗干扰性能，对分泌型自噬小体的测定具有很高的选择性。
(3)选择绿色化学试剂氧化石墨烯水凝胶和亚甲蓝复合材料作为分泌型自噬小体检测时玻碳电极的修饰材料，健康安全。同时，利用其高导电性提高了电化学免疫传感器的灵敏度。
(4)制备Fe3O4-Au纳米磁珠，并标记特异性抗体，特异性富集纯化自噬小体，对自噬小体的特异性免疫磁珠研发有重要的理论价值。
附图说明
图1本发明中Fe3O4的扫描电镜图。
图2本发明中Fe3O4-Au的扫描电镜图。
图3本发明中Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的激光共聚焦图。
图4本发明中Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的特异性验证。
图5为本发明的制备示意图。
图6为本发明的循环伏安图。
图7为本发明的目标物与抗体孵育时间与电流变化值之间的关系。
图8为本发明的电流变化值与目标物浓度的对数之间的线性关系图。
图9为本发明的选择性考察图。
图10为健康人与肿瘤患者外周血中自噬小体的含量。
图11为治疗和未治疗的4T1荷瘤小鼠以及健康小鼠外周血中自噬小体的含量。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
LC3B第一抗体和第二抗体分别购买自SIGMA，NOVUS生物技术有限公司。LC3B第一抗体编号1251A，LC3B第二抗体编号ABC432。
实施例1：Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的制备
(1)Fe3O4的制备
0.65g FeCl3与0.2g柠檬酸钠溶于20mL乙二醇，随后加入1.2g乙酸钠，剧烈搅拌30min，倒入水热反应釜，200℃反应10h，应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，得Fe3O4(浓度为1mg/mL，pH值为9.5)，其扫描电镜图如图1所示。
(2)AuNPs的制备
100mL质量分数0.01％HAuCl4水溶液加热至沸腾，搅拌下加入2mL质量分数1％柠檬酸钠水溶液，继续加热煮沸15min，得AuNPs，冷却待用。
(3)Fe3O4-Au的制备
将1mL步骤(1)所制备Fe3O4与400μL 4％PDDA混合振荡30min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于1mL水，加入10mL AuNPs(pH＝7.0)，室温振荡7h，10000rpm离心取沉淀，水洗3次，每克湿沉淀物重悬于1mL水中，得Fe3O4-Au溶液(浓度为1mg/mL)，其扫描电镜图如图2所示。
(4)Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的制备
向500uL步骤(3)制备的Fe3O4-Au溶液中加入0.1uL4-巯基丁酸(溶于Fe3O4-Au溶液的终浓度为1mM)，室温振荡过夜；磁性分离，水洗3次，按每克湿沉淀物1mL水重悬，加入0.1uL 1-丁硫醇(终浓度为1mM)，室温振荡1h；磁性分离，水洗3次，按每克湿沉淀物500uLPBS重悬；加入500uL EDC/NHS(20mg/mL，10mg/mL)，室温振荡2h；加入5uL 1mg/mL LC3B第二抗体，4℃振荡过夜；加入质量百分比为1％BSA，4℃搅拌1h，磁性分离，PBS洗三遍，按每克湿沉淀物重悬于1mL PBS，得Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液。所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4，其激光共聚焦图像如图3所示。
实施例2：Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的特异性验证
一组将Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠与干扰红色荧光蛋白室温共孵育2h，另一组将Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠与干扰红色荧光蛋白以及染了绿色荧光的TRAP室温共孵育2h，磁性分离，PBS洗3遍，重悬于PBS，发现纳米磁珠可以特异性捕获TRAP，而不会非特异性吸附干扰蛋白。激光共聚焦图像如图4所示。
实施例3：测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法及检测方法
电化学免疫传感器的制备方法如图5所示，包括以下步骤：
(1)电极预处理：将玻碳电极分别用0.05和0.03μm Al2O3粉末处理，然后分别用无水乙醇和超纯水超声清洗5min；
(2)滴加GH-MB：用移液枪取10μL 1mg/mL GH-MB溶液滴加在预处理后的玻碳电极表面，37℃放置2h干燥，PBS溶液清洗未结合的复合材料，晾干，利用其较大的比表面积优势使抗体更多的富集在电极表面；
(3)共价连接捕捉抗体LC3B第一抗体：在步骤(2)得到的玻碳电极表面滴加10μLEDC/NHS溶液(20mg/mL，10mg/mL)，室温放置2h，用PBS清洗，将10μL 10μg/mL LC3B第一抗体滴加在电极表面，在4℃冰箱中放置12h，利用酰胺键将捕捉抗体固定在电极表面，用PBS溶液清洗未结合的抗体，晾干；
(4)封闭非特异性位点：滴加10μL 10mg/mL BSA溶液到步骤(3)得到的电极表面，室温放置0.5h，封闭未被抗体结合的位点，防止待测样品中某些物质与之发生非特异性结合，降低背景信号，然后用PBS溶液清洗未结合的BSA，晾干；
(5)信号检测：将步骤(4)得到的电极放在除氧后的0.01M PBS溶液中测定DPV，记录峰电流值I0。
(6)捕获自噬小体：100μL 10μg/mL Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液滴加于500μL自噬小体目标物溶液，37℃反应100min，然后用PBS溶液清洗并重悬于50μL PBS，磁性富集纯化自噬小体；
(7)Fe3O4-Au第二抗体特异性结合：向步骤(4)得到的电极表面滴加Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液捕获的自噬小体(10μL)，进行特异性反应，37℃反应60min，然后用PBS溶液清洗，晾干。
(8)信号检测：将步骤(7)得到的电极放在除氧后的0.01M PBS溶液中测定DPV，记录峰电流值I1，分析结果。
实施例4：测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器循环伏安图
为探究分泌型自噬小体的电化学免疫传感器各修饰阶段传感器的信号响应，将实施例3中每个步骤得到的玻碳电极置于含有2mM K3[Fe(CN)6]的0.01M PBS溶液中以0.1V/s的速度进行循环伏安扫描，结果见图6所示。随着GH-MB修饰在玻碳电极表面，与裸电极相比较获得了一个增大的峰电流信号，因为复合材料增强了电子传递，提高了传感器的灵敏度。随后将LC3B第一抗体、BSA、Fe3O4-Au第二抗体捕获的自噬小体修饰在电极表面，传感器的响应信号逐渐降低，其原因是蛋白增大了电极表面的阻抗值，使电流降低。
实施例5：测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器免疫反应孵育时间与电流相对变化值关系的研究
探究Fe3O4-Au第二抗体与自噬小体的孵育时间对传感器峰电流的影响。电化学免疫传感器的制备方法同实施例3，不同的是步骤(6)中选用40min、60min、80min、100min、120min 5个不同的孵育时间进行本次实验。结果如图7，在40～100min时，电流相对变化值随时间的延长而急剧增加，在100min时达到最大值，故本次实验选用100min作为孵育时间。
实施例6：测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器电流相对变化值与目标物浓度之间的线性关系
电化学免疫传感器的制备方法同实施例3，不同的是步骤(6)中分泌型自噬小体的浓度不同。配制不同浓度的分泌型自噬小体标准溶液，分别为0.01ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL和100ng/mL，每个浓度平行对照三次。通过对数据分析，得到电流相对变化值与目标物浓度的对数之间的线性关系，结果见图8。随着自噬小体浓度的不断增大，电流相对变化值也随之不断增大。
实施例7：测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的选择性性能
考察自噬小体的结构类似物外泌体表面标志CD9、CD63、TSG101对自噬小体检测的影响，电化学免疫传感器的制备方法同实施例3，不同的是步骤(6)中所使用的的抗原不同，结果见图9。相同浓度即1ng/mL下，自噬小体的电流相对变化值是CD9、CD63、TSG101的5-6倍，说明本发明的免疫传感器具有较高的特异性，对分泌型自噬小体的测定具有很高的选择性。
实施例8：健康人与肿瘤患者外周血中自噬小体含量的检测
健康人和肿瘤病人EDTA抗凝外周全血均来自中大医院健康体检者和肿瘤病人，分别取5mL健康人和肿瘤患者的抗凝全血，离心后取上清500μL，按照实施例3构建免疫传感器进行检测，具体步骤为：步骤(1)～步骤(5)同实施例3。
(6)捕获自噬小体：100μL 10μg/mL Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液滴加于500μL全血离心后上清，37℃反应100min，然后用PBS溶液清洗并重悬于50μL PBS，磁性富集纯化自噬小体；
(7)Fe3O4-Au第二抗体特异性结合：向步骤(4)得到的电极表面滴加Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液捕获的自噬小体(10μL)，进行特异性反应，37℃反应60min，然后用PBS溶液清洗，晾干。
(8)信号检测：将步骤(7)得到的电极放在除氧后的0.01M PBS溶液中测定DPV，记录峰电流值I1，分析结果。
其中，检测范围为60pg/mL-600ng/mL，灵敏度为15.739pg/mL。
将所得的电信号按照实施例6中的标准曲线换算成浓度(图10)。从图10中可以发现健康人与肿瘤患者外周血中自噬小体含量有明显差别，肿瘤患者外周血中自噬小体含量明显高于健康人，说明外周血中自噬小体含量有作为新型肿瘤指标用于肿瘤检测的潜力。
实施例9：治疗和未治疗的4T1荷瘤小鼠以及健康小鼠外周血中自噬小体含量检测
分别取1mL治疗和未治疗的4T1荷瘤小鼠以及健康小鼠的EDTA抗凝外周血，离心后取上清300μL，按照实施例3构建免疫传感器进行检测，具体步骤为：步骤(1)～步骤(5)同实施例3。
(6)捕获自噬小体：60μL 10μg/mL Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液滴加于300μL全血离心后上清，37℃反应100min，然后用PBS溶液清洗并重悬于30μL PBS，磁性富集纯化自噬小体；
(7)Fe3O4-Au第二抗体特异性结合：向步骤(4)得到的电极表面滴加Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液捕获的自噬小体(10μL)，进行特异性反应，37℃反应60min，然后用PBS溶液清洗，晾干。
(8)信号检测：将步骤(7)得到的电极放在除氧后的0.01M PBS溶液中测定DPV，记录峰电流值I1，分析结果。
将所得的电信号按照实施例6中的标准曲线换算成浓度(图11)。从图11中可以发现，健康小鼠和荷瘤小鼠外周血中自噬小体含量有明显差别，荷瘤小鼠外周血中自噬小体含量明显高于健康小鼠；治疗和未治疗的荷瘤小鼠外周血中自噬小体含量有明显差别，未治疗的荷瘤小鼠外周血中自噬小体含量明显高于治疗组。说明小鼠外周血中自噬小体含量可以反映肿瘤发展情况。

Claims (10)

1.一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，基底电极由氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝修饰，微管相关蛋白轻链3B第一抗体溶液共价结合到修饰后的基底电极上，即得。
2.根据权利要求1所述的测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将基底电极进行打磨、抛光、清洗；
(2)将氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝溶液滴加到步骤(1)预处理后的基底电极表面，25～45℃放置0.5～3h，然后用PBS溶液清洗，晾干；
(3)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液滴加到步骤(2)处理后的基底电极表面，室温放置0.5～3h，然后用PBS溶液清洗，晾干；将微管相关蛋白轻链3B第一抗体溶液滴加到清洗后的电极表面，1～10℃放置10～15h，用PBS溶液清洗，晾干；
(4)滴加BSA溶液于步骤(3)处理后的基底电极表面，室温放置0.5～5h，然后用PBS溶液清洗，晾干，即得。
其中，所述基底电极为玻碳电极。
3.根据权利要求1或2所述的测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝溶液的制备方法如下：
(Ⅰ)取2～8mg/mL的氧化石墨烯溶液超声20～40min，再加入乙二醇，置于密闭容器中，于160～200℃反应10～15h，反应结束后，水洗，得到氧化石墨烯水凝胶；
(Ⅱ)将亚甲蓝加入步骤(Ⅰ)得到的氧化石墨烯水凝胶中，室温搅拌0.5～3h，离心，将沉淀物水洗，重悬于水中，超声分散，获得氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝溶液；
步骤(Ⅰ)中，所述氧化石墨烯溶液的溶剂为水；控制乙二醇的添加量，使得氧化石墨烯溶液与乙二醇的体积比为5:1～5:4；所述氧化石墨烯水凝胶的浓度为0.8～1.5mg/mL；步骤(Ⅱ)中，控制亚甲蓝的添加量，使得氧化石墨烯水凝胶与亚甲蓝的体积比为5:3～1:1；氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝溶液的浓度为1～5mg/mL。
4.根据权利要求2所述的测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氧化石墨烯水凝胶-亚甲蓝的滴加量为8～15μL；步骤(3)中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的浓度为15～30mg/mL，氮羟基琥珀酰亚胺的浓度为5～15mg/mL，溶剂为pH＝6.0的PBS，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液的滴加量为8～15μL；所述微管相关蛋白轻链3B第一抗体溶液的溶剂为PBS，浓度为8～15μg/mL，滴加量为8～15μL；步骤(4)中，所述BSA的溶剂为0.1M PBS，BSA的质量分数为0.2％～2％，滴加量为8～15μL。
5.权利要求1～4中任意一项所述的制备方法制备得到的电化学免疫传感器。
6.权利要求5所述的电化学免疫传感器在定量检测分泌型自噬小体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
①将Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液滴加于自噬小体溶液，20～50℃反应10～120min，然后用PBS溶液清洗并重悬于PBS，磁性富集捕获自噬小体；
②将步骤①所捕获的自噬小体滴加到电化学免疫传感器的基底电极表面，进行特异性反应，20～50℃反应10～90min，然后用PBS溶液清洗，晾干。
8.根据权利要求7所述的电化学免疫传感器在定量检测分泌型自噬小体中的应用，其特征在于，所述Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液的制备方法如下：
1)Fe3O4的制备：将FeCl3与柠檬酸钠溶于乙二醇，随后加入乙酸钠，搅拌10～40min，倒入反应釜中，反应制备Fe3O4溶液；
2)AuNPs的制备：将HAuCl4溶液加热至沸腾，搅拌下加入柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸10～30min，冷却，制备AuNPs溶液；
3)Fe3O4-Au的制备：将步骤1)制备得到的Fe3O4溶液与聚二烯丙基二甲基氯化铵混合震荡10～40min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，加入AuNPs室温混合震荡5～10h，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，重悬于水，得到Fe3O4-Au溶液；
4)Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠的制备：将步骤3)所制备的Fe3O4-Au溶液加入到4-巯基丁酸中，室温震荡10～24h；磁性分离，水洗，重悬于水，加入1-丁硫醇，室温振荡40～80min；磁性分离，水洗，重悬于PBS；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液室温振荡100～160min，磁性分离，PBS洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mLPBS中；加入LC3B第二抗体，2～10℃振荡10～24h；加入BSA，2～10℃搅拌40～80min，磁性分离，PBS洗，重悬于PBS，获得Fe3O4-Au第二抗体纳米磁珠溶液。
9.根据权利要求6所述的电化学免疫传感器在定量检测分泌型自噬小体中的应用，其特征在于，步骤1)中，FeCl3与柠檬酸钠的质量比为2:1～4:1，控制乙二醇的用量使得FeCl3浓度为0.01～0.05g/mL，FeCl3与乙酸钠的质量比为1:1～1:4，搅拌速率为400～1000r/min，反应温度为180～220℃，反应时间为6～12h；反应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，即为Fe3O4溶液；所述Fe3O4溶液的浓度为0.5～2mg/mL，pH值为8.0～10.0；
步骤2)中，所述HAuCl4溶液的溶剂为水，质量百分比为0.005％～0.02％；所述柠檬酸钠溶液的溶剂为水，质量百分比为0.05％～2％；HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为55:1～40:1；
步骤3)中，所述聚二烯丙基二甲基氯化铵的质量百分比为2％～5％；Fe3O4溶液与聚二烯丙基二甲基氯化铵的体积比为1:0.6～1:0.2；所述AuNPs的pH值为6.5～7.8；Fe3O4溶液与AuNPs的体积比为1:6～1:15；所述Fe3O4-Au溶液的浓度为0.5～2mg/mL；
步骤4)中，所述4-巯基丁酸的浓度为0.8～1.2mM，Fe3O4-Au溶液与4-巯基丁酸的体积比为6000:1～4000:1；所述1-丁硫醇的浓度为0.8～1.2mM，Fe3O4-Au溶液与1-丁硫醇的体积比为6000:1～4000:1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的浓度为15～30mg/mL，氮羟基琥珀酰亚胺的浓度为5～15mg/mL，溶剂为pH＝6.0的PBS，Fe3O4-Au溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1:0.8～1:1.5；所述LC3B第二抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL，Fe3O4-Au溶液与LC3B第二抗体的体积比为50:1～200:1；所述BSA的质量百分比为0.2％～2％；所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4-Au-LC3B第二抗体复合物。
10.一种检测肿瘤的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的电化学免疫传感器。
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