CN103713028A - 一种纳米结构电化学细胞传感器制法及其制得的传感器和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种复合纳米结构的电化学细胞传感器,它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成。用于进行电化学细胞传感的多功能混合纳米探针(HRP-TRAIL-Fe3O4Au)由通过共固定化作用固定了重组人TRAIL蛋白及辣根过氧化氢气化酶(HRP)的金纳米粒子修饰的磁性Fe3O4纳米球构成;电极接口是以层层组装的方法构建的集成了具有高度生物相容性的以树状聚合物稳定的金纳米粒子(AuDSNPs)、高电阻率的氮掺杂碳纳米管(CNx)和高特异性的细胞定位寡核苷酸适配子的具有纳米层状结构的电极细胞传感界面。本发明可对白血病细胞及其表面的DR4/DR5死亡受体表达进行选择性的量化检测。本发明公开了其制法。
Description
技术领域
本发明涉及四氧化三铁/金复合纳米结构电化学细胞传感器以及在白血病细胞及其表面死亡受体表达选择性定量分析方法。
背景技术
白血病主要影响骨髓,血细胞和淋巴系统的其他部分,是最常见的致死性癌症之一[参见:(a) Nordlund, J.; Milani, L.; Lundmark, A.; Lonnerholm, G.; Syvanen, A.-C. PLoS ONE 2012, 7 (4), 9.]。其具有的先天和后天的抗化疗、放疗的特性一直是治疗白血病的主要障碍之一,为克服这一障碍,一种潜在的辅助常规治疗方法是直接通过激活细胞凋亡的死亡受体介导来诱导细胞的死亡[参见:(b) Ghobrial, I. M.; Witzig, T. E.; Adjei, A. A., Ca-a Cancer Journal for Clinicians 2005, 55 (3), 178-194.]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( TRAIL )是最近发现的日益扩大的肿瘤坏死因子超级家族中的一员,其与同源的死亡受体DR4和DR5的特异性结合具有很强的亲和力。将TRAIL蛋白与白血病细胞表面的DR4/DR5相结合,能够引发独立于p53状态的各种白血病细胞株的快速凋亡 [参见:(c) Lee, H. W.; Lee, S. H.; Ryu, Y. W.; Kwon, M. H.; Kim, Y. S., Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 330 (4), 1205-1212. (d) Mitsiades, C. S.; Treon, S. P.; Mitsiades, N.; Shima, Y.; Richardson, P.; Schlossman, R.; Hideshima, T.; Anderson, K. C., Blood 2001, 98 (3), 795-804. (e) Newsom-Davis, T.; Prieske, S.; Walczak, H., Apoptosis 2009, 14 (4), 607-623. (f) Bouralexis, S.; Findlay, D. M.; Evdokiou, A., Apoptosis 2005, 10 (1), 35-51. (g) Plasilova, M.; Zivny, J.; Jelinek, J.; Neuwirtova, R.; Cermak, J.; Necas, E.; Andera, L.; Stopka, T., Leukemia 2002, 16, 7. (h) Gonzalvez, F.; Ashkenazi, A., Oncogene 2010, 29 (34), 4752-4765. (i) Spencer, S. L.; Gaudet, S.; Albeck, J. G.; Burke, J. M.; Sorger, P. K., Nature 2009, 459 (7245), 428-U144.]。这种TRAIL 蛋白诱导的细胞凋亡并不发生在正常的细胞系中,最近完成的临床III期实验显示,重组人类TRAIL 蛋白(rhTRAIL)在中国已经显示出对癌症有良好的治疗效果并且对其他细胞没有明显的毒性。然而,某些类型的肿瘤细胞对TRAIL蛋白的不敏感导致了TRAIL蛋白疗法治疗失效。它本质上是DR4 / DR5在各种类型的白血病细胞表面表达水平的不同,产生了其对TRAIL蛋白的敏感性的变化[参见:(j) Cheng, J. R.; Hylander, B. L.; Baer, M. R.; Chen, X.; Repasky, E. A., Molecular Cancer Therapeutics 2006, 5 (7), 1844-1853. (k) Mahalingam, D.; Szegezdi, E.; Keane, M.; de Jong, S.; Samali, A., Cancer Treatment Reviews 2009, 35 (3), 280-288. (l) Pan, G. H.; Ni, J.; Wei, Y. F.; Yu, G. L.; Gentz, R.; Dixit, V. M., Science 1997, 277 (5327), 815-818. (m) Pan, G. H.; Orourke, K.; Chinnaiyan, A. M.; Gentz, R.; Ebner, R.; Ni, J.; Dixit, V. M., Science 1997, 276 (5309), 111-113. (n) Sheridan, J. P.; Marsters, S. A.; Pitti, R. M.; Gurney, A.; Skubatch, M.; Baldwin, D.; Ramakrishnan, L.; Gray, C. L.; Baker, K.; Wood, W. I.; Goddard, A. D.; Godowski, P.; Ashkenazi, A., Science 1997, 277 (5327), 818-821.]。因此,在以DR4 / DR5为基础对白血病进行个性化治疗过程中,发展定量检测细胞膜表面DR4 / DR5表达的新方法非常重要。
目前,最常用的方法为DR4 / DR5检测的免疫印迹分析和流式细胞术,通常只提供相对浓度或分布,不是在白血病细胞表面DR4 / DR5的确切数量或其表达动力学 [参见:(o) Kurita, S.; Mott, J. L.; Almada, L. L.; Bronk, S. F.; Werneburg, N. W.; Sun, S. Y.; Roberts, L. R.; Fernandez-Zapico, M. E.; Gores, G. J., Oncogene 2010, 29 (34), 4848-4858. (p) Park, S. J.; Wu, C. H.; Choi, M. R.; Najafi, F.; Emami, A.; Safa, A. R., Biochemical Pharmacology 2006, 72 (3), 293-307.]。同这些方法相比,电化学方法具有高灵敏度、固有的简单性、低成本、能很快转化为定量生物测定法实现临床应用等吸引人的优势,在电化学细胞传感过程中利用多功能纳米探针也可以排除的其它现有方法通常需要的细胞溶菌作用、标记细胞或复杂的仪器[参见:(q) Liu, T.; Zhu, W.; Yang, X.; Chen, L.; Yang, R. W.; Hua, Z. C.; Li, G. X., Anal. Chem. 2009, 81 (6), 2410-2413. (r) Chen, D.; Zhang, H.; Li, X.; Li, J. H., Anal. Chem. 2010, 82 (6), 2253-2261. (s) .Du, D.; Zou, Z. X.; Shin, Y. S.; Wang, J.; Wu, H.; Engelhard, M. H.; Liu, J.; Aksay, I. A.; Lin, Y. H., Anal. Chem. 2010, 82 (7), 2989-2995. (t) Zhang, J. J.; Zheng, T. T.; Cheng, F. F.; Zhang, J. R.; Zhu, J. J., Anal. Chem. 2011, 83 (20), 7902-7909. (u) Zheng, T. T.; Zhang, R.; Zou, L. F.; Zhu, J. J., Analyst 2012, 137 (6), 1316-1318.]。但至今尚未有基于Fe3O4/Au复合纳米结构的电化学细胞传感器对白血病细胞及其表面死亡受体的表达进行选择性定量分析方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于四氧化三铁/金复合纳米结构的电化学细胞传感器,可以对白血病细胞及其在细胞表面上DR4 / DR5死亡受体的表达进行高灵敏的选择性定量分析。
本发明的技术方案如下:
一种纳米结构电化学细胞传感器的制法,所述的纳米结构的电化学细胞传感器,它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成,如图1所示,其制法包括如下步骤:
步骤1. 多功能混合纳米探针的制备:
取1.35 g六水合三氯化铁,3.2 g无水醋酸钠和0.5mL聚丙烯酸(数均分子量: 3000)加入到38mL乙二醇超声混合后,将混合物在473 K下水热反应6小时后进行磁分离、洗涤、干燥后得黑色磁性Fe3O4纳米球,磁性Fe3O4纳米球直径为500 nm±20 nm,取Fe3O4纳米球10 mg分散于1 mL去离子水中,加入1%邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)1mL超声反应30分钟后在磁场下对产品进行分离,洗涤后得Fe3O4/PDDA纳米复合材料;金纳米粒子(Au NPs)以四氯合金酸水溶液和柠檬酸钠通过脱氧反应获得,其直径为13 nm±2 nm;搅拌下将金纳米粒子加至Fe3O4/PDDA纳米复合材料中,通过静电吸引作用使其与Fe3O4/PDDA纳米结合,吸附完全后金胶酒红色褪去后进行磁分离,再加入金纳米粒子重复上述操作数次直至加入金纳米粒子后溶液颜色不变为止,磁分离样品并重新分散在纯水中,得到Fe3O4/PDDA/AuNPs纳米复合材料;将上述所得悬浊液以0.1 M氢氧化钠溶液将pH调至9.0后,加入1 mg mL-1辣根过氧化物歧化酶50 μL和50 μL 20 μg mL-1的重组人TRAIL蛋白,4℃下搅拌过夜后经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后即得到HRP-TRAIL-Fe3O4Au多功能混合纳米探针,如图2所示;
步骤2. 细胞传感纳米电极接口的组装
将浓度为4.86 mM的四氯合金酸水溶液5 mL与5 mL 聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM, G=4)的水溶液混合均匀至黄色褪去,使PAMAM的终端氨基与金生成络合阴离子,室温下将络合物与还原剂20 mM硼氢化钠溶液1.8 mL搅拌30分钟后,溶液颜色变为深红色即为上述的以树状聚合物稳定的金纳米粒子(Au DSNPs),树状聚合物稳定的金纳米粒子直径为10 nm±2 nm,其在283 nm和5处有紫外吸收峰,如图3所示[参见:(w) Shi, X. Y.; Ganser, T. R.; Sun, K.; Balogh, L. P.; Baker, J. R., Nanotechnology 2006, 17 (4), 1072-1078.],将玻炭电极(直径3 mm)分别以粒径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉末进行机械抛光并超声清洁后,滴加5.0 mg mL-1 的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的氮掺杂碳纳米管(PDCNx,将氮掺杂碳纳米管分散在体积比3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合物中超声3小时后离心洗涤至pH为7.0,分散至0.20% PDDA水溶液中使其浓度为0.5 mg mL-1,超声反应30分钟后离心、洗净,分散于水中得到5.0 mg mL-1 PDCNx)[参见:(x). Zhang, J. J.; Cheng, F. F.; Zheng, T. T.; Zhu, J. J., Anal. Chem. 2010, 82 (9), 3547-3555] 5 μL至电极表面并在室温下干燥;将干燥后的电极浸入制好的Au DSNPs溶液中1小时后,室温下浸入2.5%戊二醛溶液1小时后以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)冲洗,吹干;滴加5μL的HL-60细胞特异性识别适配体(KH1C12适配体)(5μM),或5μL 抗CD3单克隆抗体(5μM) 4℃过夜培养后以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)小心冲洗,即在电极表面组装完成细胞传感纳米电极接口。
上述的纳米结构电化学细胞传感器的制法,所述的细胞传感纳米电极接口的组装,所用层层组装多功能混合纳米探针过程以zeta电位仪测定其组装过程中各复合物zeta电位表征,其中Fe3O4球的zeta电位为-37.3 mV,Fe3O4/PDDA复合物为+34.60 mV,结果表明,通过静电作用能够成功的实现混合纳米探针层层组装。
一种按上述的纳米结构电化学细胞传感器的制法制得的纳米结构电化学细胞传感器。
上述的纳米结构电化学细胞传感器在对白血病细胞及其在细胞表面上DR4 / DR5死亡受体的表达进行高灵敏的选择性定量分析中的应用。
一种上述的电化学细胞传感器用于对白血病细胞及其在细胞表面上DR4 / DR5死亡受体的表达进行高灵敏的选择性定量分析方法,其包括如下步骤:
步骤1. 37℃下,将按上述组装了细胞传感纳米电极接口的玻炭电极浸入1% BSA溶液中1小时,封闭非特异性结合位点后,以PBS(pH=7.4)冲洗干净;
步骤2. 将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100 μg mL-1和链霉素100 μg mL-1)的RPMI 1640培养基中的HL-60细胞与Jurkat细胞以1000转每分钟的速度离心2分钟进行分离后,重新分散于结合缓冲液(4.5 g L-1葡萄糖,5mM MgCl2,0.1 mg L-1 tRNA和1 mg mL-1 BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中)中得到均匀细胞悬液,细胞悬液浓度为1.0×103~1.0×106 cells mL-1;
步骤3. 将60 μL步骤2中所述细胞悬液滴至经步骤1处理的电极表面,37℃下孵育50分钟,通过KH1C12适配体与HL-60细胞之间及抗CD3单克隆抗体与Jurkat细胞之间的特异性识别实现细胞捕获,以孵育缓冲液洗去未捕获的细胞;
步骤4. 取10 μL上述制得的HRP-TRAIL-Fe3O4Au纳米探针滴于经步骤3捕获细胞的电极表面,37℃下孵育60分钟,以PBS(pH 7.4)仔细冲洗电极表面,电解池中加入包含1 mM H2O2和25 μM 硫瑾的PBS(pH 7.4,0.01 M),在氮气氛围下用电化学分析仪以设定扫描区间为50 mV至550 mV(vs. SCE),脉冲放大为50 mV的参数进行循环伏安扫描,分析其峰电流信号的大小进行细胞的量化检测;
步骤5. 按步骤3方法,将经过褪黑激素治疗0小时和24小时的HL-60细胞(1.0×105 cells mL-1)37℃下以不同的孵育时间进行孵育、洗涤后,以步骤5所述方法进行检测,分析电流信号大小实现动态监测DR4 / DR5死亡受体表达对褪黑激素的响应;同时将经褪黑素处理24小时的HL-60细胞与未经处理的的HL-60细胞经离心、清洗后重新分散于500 μL冷的PBS中,经TRAIL-异硫氰酸荧光素染色后,以排序流式细胞仪及共聚焦荧光显微镜在激发波长为488 nm处进行检测,未作处理的HL-60细胞作为阴性对照,评价自体荧光。
本发明中所使用细胞悬液其细胞浓度是由Petroff-Hausser细胞计数器(美国)计数获得。
本发明所述细胞电化学传感器其特异性细胞捕获与细胞识别能力通过明视场光学显微镜进行表征。结果表明,本发明所述细胞电化学传感器所构建的纳米电极接口有很好的特异性,如图4A、4B;所述混合纳米探针也有优秀的细胞识别能力,如图4C、4D所示。
本发明构建的细胞传感纳米电极接口其电极界面的生物相容性通过视频光学接触角测量仪表征。结果表明,将上述细胞传感纳米电极接口组装后,电极界面亲水性显著增强,即显著提高了其生物相容性,如图5。
附图说明
图1为本发明所用纳米结构电化学细胞传感器原理图。
图2 为本发明所用多功能混合纳米探针扫描电子显微镜表征图,其中A为磁性四氧化三铁纳米球,B为制备的多功能混合纳米探针。
图3 为本发明所用Au DSNPs的紫外吸收光谱(曲线c)和透射电子显微镜图片
图4 为明视场光学显微镜下本发明所用组装纳米电极接口的电极表面上靶细胞(HL-60细胞,图A)、非靶细胞(K562细胞,图B)、与Fe3O4Au纳米复合物孵育的HL-60细胞(图C)和与HRP-TRAIL-Fe3O4Au多功能混合纳米探针孵育的HL-60细胞(图D)。
图5为本发明所用在将纳米电极接口组装在电极表面过程中,电极表面的接触角变化图,其中依次为:左上图为裸玻炭电极界面;右上图为组装了PDCNx后电极界面;左下图为Au DSNPs/PDCNx组装后电极界面;右下图为经KH1C12/Au DSNPs/PDCNx组装后的电极界面。
图6 为本发明中电化学检测条件优化结果,其中图6A为探针HRP和TRAIL比例的优化,图6B为细胞捕获时间的优化结果,图6C为探针识别时间的优化结果。
图7 为本发明所述电化学细胞传感器对HL-60细胞的检测结果分析图。其中A中曲线a到d分别为HL-60细胞浓度为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106 cells mL-1时的循环伏安曲线,附图为峰电流与细胞浓度对数值的线性相关图,B为峰电流大小与捕获细胞数量线性相关图,C为峰电流减小值受DR4用量变化影响的线性相关曲线图。
图8为本发明所用纳米结构电化学细胞传感器在检测Jurkat细胞表面DR4/DR5死亡受体表达时示意图(图A)、检测结果峰电流大小与捕获细胞数量线性相关曲线(图B)及峰电流减小值受DR4用量变化影响的线性相关曲线(图C)。
图9 为本发明所用在1.0 mM褪黑激素下治疗HL-60细胞随培养不同时间催化峰电流强度变化图(图A)和经褪黑素处理24小时的HL-60细胞(右)、未经处理的的HL-60细胞(中)及自发荧光的无标号HL-60细胞(左)流式细胞仪分析图;图B为不同浓度的褪黑素下将HL-60细胞孵育24小时后进行电化学检测的循环伏安曲线和褪黑素浓度与催化电流值的的线性相关曲线。
具体实施方式
下面结合附图所示实施例进一步说明本发明的具体内容:
实施例1. 细胞传感器多功能混合纳米探针的制备
称取1.35 g六水合三氯化铁,3.2 g无水醋酸钠和0.5mL聚丙烯酸(数均分子量: 3000)加入到38mL乙二醇超声混合后,将混合物加入聚四氟乙烯反应釜中473 K下水热反应6小时后进行磁分离,分别以乙醇、去离子水洗涤数次,干燥后得黑色磁性Fe3O4纳米球,粒径为500 nm±20 nm。取Fe3O4纳米球10 mg分散于1 mL去离子水中,加入1%PDDA 1mL超声反应30分钟后在磁场下对产品进行分离,以去离子水洗涤三次后得Fe3O4/PDDA纳米复合材料;金纳米粒子(Au NPs)以四氯合金酸水溶液和柠檬酸钠通过脱氧反应获得,其直径为13 nm±2 nm。搅拌下将金纳米粒子加至Fe3O4/PDDA纳米复合材料中,通过静电吸引作用使其至Fe3O4/PDDA纳米结合,吸附完全后金胶酒红色褪去,示金纳米粒子已完全吸附,后进行磁分离,再次加入金纳米粒子至体系中,重复上述操作数次直至加入金纳米粒子后溶液颜色不变为止,磁分离样品并重新分散在纯水中,得到Fe3O4/PDDA/AuNPs纳米复合材料。将上述所得悬浊液以0.1 M氢氧化钠溶液将pH调至9.0后,加入1 mg mL-1辣根过氧化物歧化酶50 μL和50μL 20μg mL-1的重组人TRAIL蛋白4℃下搅拌过夜后经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后即得到HRP-TRAIL-Fe3O4Au多功能混合纳米探针,表征结果见图2。
实施例2. 细胞传感纳米电极接口的组装
将浓度为4.86 mM的四氯合金酸水溶液5 mL与5 mL 聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM, G=4,Sigma-Aldrich公司提供)的水溶液混合均匀至黄色褪去,使PAMAM的终端氨基与金生成络合阴离子,室温下将络合物与还原剂20 mM硼氢化钠溶液1.8 mL剧烈搅拌30分钟后,溶液颜色变为深红色,即为上述的以树状聚合物稳定的金纳米粒子(Au DSNPs),其粒径为10 nm±2 nm。将玻炭电极(直径3 mm)分别以粒径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉末进行机械抛光,以去离子水冲洗后,分别以8 mol L-1硝酸、丙酮、去离子水进行超声清洁并吹干后,滴加5.0 mg mL-1 的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的氮掺杂碳纳米管(PDCNx,将氮掺杂碳纳米管分散在体积比3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合物中超声3小时后离心洗涤至pH为7.0,分散至0.20% PDDA水溶液中使其浓度为0.5 mg mL-1,超声反应30分钟后离心、洗净,分散于水中得到5.0 mg mL-1 PDCNx)5 μL至电极表面并在室温下干燥。将干燥后的电极浸入制好的Au DSNPs溶液中1小时后,在室温下浸入2.5%戊二醛溶液1小时,以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)冲洗并吹干。滴加5μL的KH1C12适配体(5μM),或5μL 抗CD3单克隆抗体(5μM) 4℃过夜培养后以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)小心冲洗干净即在电极表面组装完成细胞传感纳米电极接口,Au DSNPs表征结果如图3。
实施例3. 装配的电极界面细胞识别及其特异性测试
将HL-60细胞及K562细胞悬液分别滴至经实施例1处理的电极表面,37℃下孵育,通过明视场光学显微镜观察,结果显示95%的HL-60细胞被捕获并保持了活性,而K562细胞几乎未见捕获;向HL-60细胞悬液中加入HRP-TRAIL-Fe3O4Au混合纳米探针及Fe3O4Au纳米材料,滴至上述电极表面,再次通过明视场光学显微镜观察,结果显示大量的混合纳米探针能够成功的固定HL-60细胞表面,表征结果见图4。
实施例4. 电化学检测条件的优化
37℃下,将按实例2过程处理的滴加KC1H12适配体的玻炭电极浸入1% BSA溶液中1小时,封闭非特异性结合位点后,以PBS(pH=7.4)冲洗干净;将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100 μg mL-1和链霉素100 μg mL-1)的RPMI 1640培养基中的HL-60细胞以1000转每分钟的速度离心2分钟进行分离后,重新分散于结合缓冲液(4.5 g L-1葡萄糖,5mM MgCl2、0.1 mg L-1 tRNA和1 mg mL-1 BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中)中得到均匀细胞悬液,使细胞悬液浓度为1.0×106 cells mL-1;将60 μL步骤2中所述细胞悬液滴至经步骤1处理的电极表面,37℃下分别孵育20、40、50、60、70 min,以进行细胞捕获时间的优化,以孵育缓冲液洗(D-PBS)去未捕获的细胞;改变实施例1中制得的HRP-TRAIL-Fe3O4Au纳米探针HRP/TRAIL比例为1/5、1/50、1/100、1/200、1/300、1/400,对探针识别能力进行优化;各取上述混合纳米探针分别滴10 μL于已进行细胞捕获的电极表面,37℃下孵育,分别培养20、40、50、60、70 min,对探针识别时间进行优化,以PBS(pH 7.4)仔细冲洗电极表面。电解池中加入包含1 mM H2O2和25 μM 硫瑾的PBS(pH 7.4,0.01 M),在氮气氛围下用电化学分析仪以设定扫描区间为50 mV至550 mV(vs. SCE),脉冲放大为50 mV的参数进行循环伏安扫描,分析其电流信号的大小进行实验条件的优化;分析结果如图6所示,细胞捕获时间为50分钟、纳米探针HRP/TRAIL为1/50、探针识别时间为60分钟为最佳实验条件。
实施例5. HL-60细胞的量化检测
37℃下,将按实例2过程处理的滴加KC1H12适配体的玻炭电极浸入1% BSA溶液中1小时,封闭非特异性结合位点后,以PBS(pH=7.4)冲洗干净;将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗的RPMI 1640培养基中的HL-60细胞以1000转每分钟的速度离心2分钟进行分离后,重新分散于结合缓冲液中得到均匀细胞悬液,通过细胞计数器计数,分别使细胞悬液浓度为1.0×103、5.0×103、1.0×104、5.0×104、1.0×105、5.0×105、1.0×106 cells mL-1,按实施例4中所述最优实验条件进行细胞捕获与识别。在电解池中加入包含1 mM H2O2和25 μM 硫瑾的PBS(pH 7.4,0.01 M),在氮气氛围下用电化学分析仪以设定扫描区间为50 mV至550 mV(vs. SCE),脉冲放大为50 mV的参数进行循环伏安扫描,对其峰电流信号进行分析。分析结果表明,在HL-60细胞浓度为1.0×103到1.0×106 cells mL-1区间内,催化峰电流信号大小与细胞浓度对数值呈线性相关,其相关系数为0.995,按3σ计算其检测限为660 cells mL-1,表征结果如图7A所示。
实施例6. 对HL-60细胞表面DR4/DR5死亡受体表达的量化评价
37℃下,按实施例5步骤,固定HL-60细胞悬液浓度不变,对进行细胞捕获后洗下的自由细胞进行计数,计算可得细胞传感接口实际捕获的细胞数目,按实施例4中所得最优条件实验,通过催化电流大小分析HL-60细胞表面DR4/DR5死亡受体表达。分析结果表明,在捕获HL-60数目在800到8700个之间时,催化电流值与HL-60数目成线性相关,其相关系数为0.993,如图7B所示;为量化细胞表面DR4/DR5表达,采用绑定竞争法用DR4部分封闭纳米探针上与DR4 / DR5-TRAIL的结合位点使其催化电流小于使用未经封闭的纳米探针的细胞传感器[参见:(y) Zhang, J. J.; Gu, M. M.; Zheng, T. T.; Zhu, J. J., Anal. Chem. 2009, 81 (16), 6641-6648.]。分析结果表明,在封闭用DR4的量为1.5-7.5 fmol 时,催化电流的降低值(Δip)与DR4的量成线性相关,相关系数为0.999,如图7C所示。
实施例7. 对Jurkat细胞表面DR4/DR5死亡受体表达的评价
同实施例6所述步骤,将电极接口识别用KC1H12适配体更换为抗CD3单克隆抗体,以固定浓度的Jurkat细胞悬液进行检测。分析结果表明,在Jurket细胞捕获数量在800到8900个之间时,催化电流值与细胞数目呈正相关,线性相关系数为0.999,n=7,如图8B;在DR4用量为1.5-9.0 fmol时,催化电流减小值与DR4用量呈正相关,相关系数0.998,n=6,如图8C所示。
实施例8. 动态监测细胞表面DR4/DR5表达对褪黑素的响应
通过实施例4步骤获得均匀的HL-60细胞悬液,加入褪黑素使其浓度为1 mM,改变不同的孵育时间,按实施例5所述步骤检测电化学信号;同时,使细胞悬液中褪黑素浓度分别为0、0.15、0.32、0.49、 0.66、0.83和1.0 mM,培养24小时后,按实施例5所述步骤检测电化学信号;另取将经过褪黑激素治疗及未治疗的HL-60细胞悬液(1.0×105 cells mL-1)37℃下以不同的孵育时间进行孵育、洗涤后,以步骤5所述方法进行检测,分析电流信号大小实现动态监测DR4 / DR5死亡受体表达对褪黑激素的响应。分析结果表明,随培养时间的增加,褪黑素诱导DR4 / DR5死亡受体表达效果逐渐增加,至24小时达到平台,结果表明了褪黑素能显著促进DR4/DR5在HL-60细胞表面的表达,如图9A所示;而在培养时间不变时,在0.15 mM到1.0 mM的区间内,催化电流信号与褪黑素浓度呈正比例关系,如图9B。同时将经褪黑素处理24小时的HL-60细胞与未经处理的的HL-60细胞经离心、清洗后重新分散于500 μL冷的PBS中,经TRAIL-异硫氰酸荧光素染色后,以排序流式细胞仪及共聚焦荧光显微镜在激发波长为488 nm处进行检测,未作处理的HL-60细胞作为阴性对照,评价自体荧光,表征结果说明,经褪黑素治疗的HL-60细胞其对FTIC–TRAIL的结合能力得到了增强,如图9所示。
Claims (5)
1.一种纳米结构电化学细胞传感器的制法,其特征是:所述的纳米结构的电化学细胞传感器它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成,其制法包括如下步骤:
步骤1. 多功能混合纳米探针的制备:
取1.35 g六水合三氯化铁,3.2 g无水醋酸钠和0.5mL聚丙烯酸加入到38mL乙二醇超声混合后,将混合物在473 K下水热反应6小时后进行磁分离、洗涤、干燥后得黑色磁性Fe3O4纳米球,磁性Fe3O4纳米球直径为500 nm±20 nm,取Fe3O4纳米球10 mg分散于1 mL去离子水中,加入1%邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)1mL超声反应30分钟后在磁场下对产品进行分离,洗涤后得Fe3O4/PDDA纳米复合材料;金纳米粒子(Au NPs)以四氯合金酸水溶液和柠檬酸钠通过脱氧反应获得,其直径为13 nm±2 nm;搅拌下将金纳米粒子加至Fe3O4/PDDA纳米复合材料中,通过静电吸引作用使其与Fe3O4/PDDA纳米结合,吸附完全后金胶酒红色褪去后进行磁分离,再加入金纳米粒子重复上述操作数次直至加入金纳米粒子后溶液颜色不变为止,磁分离样品并重新分散在纯水中,得到Fe3O4/PDDA/AuNPs纳米复合材料;将上述所得悬浊液以0.1 M氢氧化钠溶液将pH调至9.0后,加入1 mg mL-1辣根过氧化物歧化酶50 μL和50 μL 20 μg mL-1的重组人TRAIL蛋白,4℃下搅拌过夜后经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后即得到HRP-TRAIL-Fe3O4Au多功能混合纳米探针;
步骤2. 细胞传感纳米电极接口的组装
将浓度为4.86 mM的四氯合金酸水溶液5 mL与5 mL 聚酰胺-胺型树枝状高分子的水溶液混合均匀至黄色褪去,使PAMAM的终端氨基与金生成络合阴离子,室温下将络合物与还原剂20 mM硼氢化钠溶液1.8 mL搅拌30分钟后,溶液颜色变为深红色即为上述的以树状聚合物稳定的金纳米粒子(Au DSNPs),树状聚合物稳定的金纳米粒子直径为10 nm±2 nm,其在283 nm和5处有紫外吸收峰,将玻炭电极分别以粒径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉末进行机械抛光并超声清洁后,滴加5.0 mg mL-1 的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的氮掺杂碳纳米管(PDCNx) 5 μL至电极表面并在室温下干燥;将干燥后的电极浸入制好的Au DSNPs溶液中1小时后,室温下浸入2.5%戊二醛溶液1小时后以pH=7.4的磷酸盐缓冲液冲洗,吹干;滴加5μL的KH1C12适配体5μM,或5μL 抗CD3单克隆抗体5μM, 4℃过夜培养后以pH=7.4的磷酸盐缓冲液小心冲洗,即在电极表面组装完成细胞传感纳米电极接口。
2.根据权利要求1所述的纳米结构电化学细胞传感器的制法,其特征是:步骤1中所述的聚丙烯酸的数均分子量为3000。
3.根据权利要求1所述的纳米结构电化学细胞传感器的制法,其特征是:所述的细胞传感纳米电极接口的组装,所用层层组装多功能混合纳米探针过程以zeta电位仪测定其组装过程中各复合物zeta电位表征,其中Fe3O4球的zeta电位为-37.3 mV,Fe3O4/PDDA复合物为+34.60 mV,结果表明,通过静电作用能够成功的实现混合纳米探针层层组装。
4.一种按权利要求1所述的纳米结构电化学细胞传感器的制法制得的纳米结构电化学细胞传感器。
5.权利要求3所述的纳米结构电化学细胞传感器在对白血病细胞及其在细胞表面上DR4 / DR5死亡受体的表达进行高灵敏的选择性定量分析中的应用。
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