CN104730130A - 测定gpr70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法。本发明以玻碳电极为基底，在其表面修饰壳聚糖并吸附纳米金，再利用纳米金的特性吸附由真核细胞表达的GPR70抗体；以上电极干燥后表面滴加硫堇-壳聚糖复合物并置于纳米金-辣根过氧化物酶溶液中吸附，干燥后置于GPR70中吸附该受体，牛血清白蛋白封闭，即得。本发明检测灵敏度高、成本低、简单、快速，可以在不同配基筛选的应用上发挥重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术、电化学传感器领域，特别是涉及测定受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
G蛋白偶联受体(GPCR)是一类七次跨膜蛋白，它广泛分布在细胞表面，与其相互作用的分子称为配基。GPCR介导多种重要的生理功能，与很多疾病密切相关，是最重要的现代药物靶点家族。目前市场上约有50％的药物是以GPCR为靶点的筛选的。因此，GPCR分析方法和GPCR配体筛选方法的研究是当今世界新药研究的重点和热点。
目前，研究受体与配基相互作用的测定方法主要有放射性配基结合试验、酶联免疫吸附法、液烁近邻检测、时间分辨荧光和荧光相关光谱学或者通过计算机软件模拟等技术手段。这些方法虽然具有高效、可靠和微量化等特点,但昂贵的测定成本、复杂的操作方法限制了其具体的应用。因此，研制出一种灵敏度高、操作简便、非放射性的检测方法对研究受体-配基间的相互作用有重要的价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，发明了一种灵敏度高、操作方便、非放射性的检测受体-配基作用的传感器的制备方法。
本发明一种测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，包括下述步骤：
(1)将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5％的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45℃干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；
(2)干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为1mol/L的NaOH溶液中5min，中和膜中醋酸，使壳聚糖在电极表面形成稳固结合，用超纯水清洗掉残留的NaOH溶液，之后以超纯水淋洗电极表面，并将其浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；
(3)从超纯水中取出电极，自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；
(4)将纳米金电极置于含GPR70受体蛋白的细胞粗提物中4℃自组装至少24h，即得单层修饰的纳米金电极；
所述GPR70受体蛋白提取通过下述方法制备：
(1)CHO-K1细胞的培养：CHO-K1置于含10％胎牛血清的F12K培养基中培养，待细胞长满培养皿80％时以1:6传代，剩余细胞离心重悬于含10％二甲基亚砜的胎牛血清中，冷存管依次置于4℃10min→-20℃30min→-80℃16～18小时→液氮槽长期储存；
(2)GPR70质粒的制备：通过NCBI网站查询GPR70基因全序列(AF337040.1)，进行单链oligo的设计及合成，加Hind III/Age I克隆位点，将合成好的序列装入载体并转化至感受态细胞DH5α，测序验证重组克隆中基因序列与要求相符；PCR产物酶切，连接到含有amp抗性的真核质粒pcDNA3.1-mycHis B的载体上，重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素培养基筛选挑取阳性克隆菌株，送测序验证，确认正确的片段已克隆入载体。置于LB液体培养基中扩大培养，使用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，用OD280和OD260定量；
(3)细胞转染及瞬时表达蛋白：CHO细胞复苏培养，调整细胞至最优生长状态，铺板，pcDNA3.1/myc-His B-GPR70重组表达质粒转染CHO细胞，转染48h后，PBS洗板，收集细胞，加细胞裂解液破碎，10000g离心10min获得上清即含有目标蛋白，SDS-PAGE及Western Blot检测。
(5)再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于含有膜受体蛋白的细胞粗提物中4℃自组装至少24h，最后置于浓度为1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05％Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学型生物传感器。
所述步骤(1)中玻碳电极预处理包括下述过程：
将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为-1.0～1.0V、扫描速度为0.1mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至活化后的电极在10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液中的循环伏安曲线，扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s，电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV-64mV，最后置于氮气环境中干燥待用。
所述步骤(3)的纳米金溶胶通过下述方法得到:
①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5％二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；
②根据Frens法取浓度为0.01g/100mL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
所述步骤(5)的纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用0.1MK2CO3调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL 2.0g/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解的辣根过氧化物酶搅拌2h混匀，4℃静置18-24h。
所述步骤(5)的硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备：将2.5mL质量体积百分比为2％的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10％的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇溶液200μL，最后加入体积百分比为2％的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。
所述王水由浓HCl与浓HNO3按照体积比为3∶1的比例配置而成。
所述2.0g/L辣根过氧化物酶液的制备方法为：将0.02g辣根过氧化物酶溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液中。
所述自然晾干的双层纳米金修饰的测定GPR70与其配基相互作用强度的电化学型生物传感器保存于4℃PBS缓冲液中待用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的方法以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定GPR70(GPCRs的一种)；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于上述电极，并吸附GPR70构建了测定受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器。该传感器灵敏度高，操作方便，无需放射性及荧光标记、能够实现快速定量检测。
具体实施方式
以下以用于测定GPR70受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器的制备方法为实施例进行说明。
实施例1
1.玻碳电极的预处理：
将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用1∶1的HNO3、无水乙醇、超纯水清洗。在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V，扫描速度为0.1mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至活化后的电极在10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol/L KNO3)中的循环伏安曲线，扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s，电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV以下，并尽可能的接近64mV，电极方能使用，最后置于氮气环境中干燥待用。
2.纳米金(Nano-Au)溶胶的制备:
(1)制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，所用王水由浓HCl与浓HNO3按照体积比为3∶1混合而成。取出后用大量自来水冲洗残留酸液，然后用蒸馏水浸泡24h。
(2)取出上述步骤的玻璃器皿干燥后用含体积百分比为5％二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用。
(3)根据Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL于上述步骤的玻璃器皿，加入1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，待其自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
3.GPR70受体的制备：
(1)CHO-K1细胞的培养：CHO-K1置于含10％胎牛血清的F12K(F12是Ham's复合营养基的一类，F12K是在F12k基础上由Kaighn做的改进型，添加了氨基酸和丙酮酸。主要用来培养分化的大鼠和鸡细胞以及原代人肝细胞的生长。可以不修改，成分及配方可查，商业化产品较多)培养基中培养，待细胞长满培养皿80％时以1:6传代，剩余细胞离心重悬于含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清中，冷存管依次置于4℃10min→-20℃30min→-80℃16～18小时→液氮槽长期储存；
(2)GPR70质粒的制备：通过NCBI网站查询GPR70基因全序列(AF337040.1)，进行单链oligo的设计及合成，加Hind III/Age I克隆位点，将合成好的序列装入载体并转化至感受态细胞DH5α，测序验证重组克隆中基因序列与要求相符。PCR产物酶切，连接到含有amp抗性的真核质粒pcDNA3.1-mycHis B的载体上，重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素培养基筛选挑取阳性克隆菌株，送测序验证，确认正确的片段已克隆入载体。置于LB液体培养基中扩大培养，使用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，检测吸光度，用0D280和OD260的值对质粒纯度和浓度进行测定(测定方法：分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260与总含量和构型有关。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。
(3)细胞转染及瞬时表达蛋白：CHO-K1细胞复苏培养，调整细胞至最优生长状态，铺板，pcDNA3.1/myc-His B-GPR70重组表达质粒转染CHO-K1细胞，转染48h后，PBS洗板，收集细胞，加细胞裂解液破碎，10000g离心10min获得上清即含有目标蛋白，得到GPR70受体，做SDS-PAGE及Western Blot检测(分子实验，证明产物里面有GPR70)。
4.硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物的制备：
(1)将2g壳聚糖(Chit)溶于100mL体积百分比为2％的醋酸溶液中搅拌3h得到2％的壳聚糖溶液。
(2)将上述2.5mL质量体积百分比为2％的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10％的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇(Thi)溶液200μL，最后加入体积百分比2％(v/v)的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极，且该共聚物溶液需现用现配。
5、纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备：
(1)将0.02g辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，配置2.0g/L辣根过氧化物酶溶液。
(2)用0.1M K2CO3调节步骤2制备的纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL与上述2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜，待用。
6、测定GPR70受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器的制备:
(1)将0.5g壳聚糖溶于100mL体积百分数为1％的醋酸溶液，得到质量体积百分比为0.5％壳聚糖溶液。
(2)取5μL上述质量体积百分比为0.5％的壳聚糖溶液滴于步骤1预处理后的玻碳电极表面，置于45℃烘箱中干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶，待其自然冷却至室温后浸于1mol/L NaOH溶液中5min，用超纯水清洗后并浸于超纯水中30min，使NaOH全部进入水中。
(3)取出自然晾干后置于步骤2制备的纳米金溶胶中24h，得到纳米金电极。然后将该电极置于步骤3制备的GPR70受体中4℃自组装24h，即得单层纳米金修饰的电极。
(4)再取5μL步骤4中所制备的硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物溶液滴加于单层纳米金修饰的电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于步骤5所制备的纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装24h，超纯水冲洗后再置于步骤3制备的GPR70受体中4℃自组装24h，最后置于1g/100mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)中于37℃温育1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比0.05％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的GPR70与其配基作用关系测定的生物传感器，保存于4℃PBS缓冲液中。
将上述组装好的测定GPR70和其配基相互作用强度的生物传感器在1×10-12mol/mL谷氨酸钠的PBS稀释液中连续测定12次，结果相对标准偏差R.S.D为6.43％，证明该传感器的误差较小，定量效果较好。
将该传感器于0.01mol/L pH值为7.4的PBS缓冲液上方4℃保存，间歇性使用，第7天电流响应信号为初始电流的93.8％，14天电流响应信号为初始电流的87.5％，表明该传感器具有良好的稳定性。
取不同批次制备的受体传感器5支，在1×10-12mol/mL谷氨酸钠中进行测定，结果响应电流的相对标准偏差RSD＝6.15％，说明该传感器重现性良好。
利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在510～550nm波长范围内随胶体金颗粒大小而变化，据此可通过最大吸收峰处波长对所制备纳米金溶胶颗粒的大小进行粗略的表征；用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征。
本发明以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定GPR70受体蛋白，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-HRP复合物固定于上述电极并吸附第二层GPR70受体蛋白构建双层纳米金修饰的GPR70受体型生物传感器。利用循环伏安法、交流阻抗法表征电极组装的各个阶段，利用计时电流法对谷氨酸钠进行测定，该传感器的响应电流与谷氨酸钠在8×10-14～1×10-12mol/mL范围内呈线性关系，相关系数为0.991，检测限为6.5×10-14mol/mL，亲和常数为1.32×10-12mol/mL。
本发明结合电化学分析可实现在线检测，所需设备仪器相对简单，操作方便，稳定性高，可应用于受体与配体间的相互作用结合力的快速测定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5％的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45℃干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；
(2)干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为1mol/L的NaOH溶液中5min，中和膜中醋酸，使壳聚糖在电极表面形成稳固结合，用超纯水清洗掉残留的NaOH溶液，之后以超纯水淋洗电极表面，并将其浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；
(3)从超纯水中取出电极，自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；
(4)将纳米金电极置于含GPR70受体蛋白的细胞粗提物中4℃自组装至少24h，即得单层修饰的纳米金电极；
所述GPR70受体蛋白提取通过下述方法制备：
(1)CHO-K1细胞的培养：CHO-K1置于含10％胎牛血清的F12K培养基中培养，待细胞长满培养皿80％时以1:6传代，剩余细胞离心重悬于含10％二甲基亚砜的胎牛血清中，冷存管依次置于4℃10min→-20℃30min→-80℃16～18小时→液氮槽长期储存；
(2)GPR70质粒的制备：通过NCBI网站查询GPR70基因全序列(AF337040.1)，进行单链oligo的设计及合成，加Hind III/Age I克隆位点，将合成好的序列装入载体并转化至感受态细胞DH5α，测序验证重组克隆中基因序列与要求相符；PCR产物酶切，连接到含有amp抗性的真核质粒pcDNA3.1-mycHis B的载体上，重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素培养基筛选挑取阳性克隆菌株，送测序验证，确认正确的片段已克隆入载体。置于LB液体培养基中扩大培养，使用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，用OD280和OD260定量；
(3)细胞转染及瞬时表达蛋白：CHO细胞复苏培养，调整细胞至最优生长状态，铺板，pcDNA3.1/myc-His B-GPR70重组表达质粒转染CHO细胞，转染48h后，PBS洗板，收集细胞，加细胞裂解液破碎，10000g离心10min获得上清即含有目标蛋白，SDS-PAGE及Western Blot检测。
(5)再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于含有膜受体蛋白的细胞粗提物中4℃自组装至少24h，最后置于浓度为1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05％Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学型生物传感器。
2.根据权利要求1所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中玻碳电极预处理包括下述过程：
将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为-1.0～1.0V、扫描速度为0.1mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至活化后的电极在10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液中的循环伏安曲线，扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s，电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV-64mV，最后置于氮气环境中干燥待用。
3.根据权利要求1所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的纳米金溶胶通过下述方法得到:
①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5％二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；
②根据Frens法取浓度为0.01g/100mL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
4.根据权利要求1或3所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用0.1M K2CO3调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL 2.0g/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解的辣根过氧化物酶搅拌2h混匀，4℃静置18-24h。
5.根据权利要求1所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备：将2.5mL质量体积百分比为2％的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10％的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇溶液200μL，最后加入体积百分比为2％的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。
6.根据权利要求3所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述王水由浓HCl与浓HNO3按照体积比为3∶1的比例配置而成。
7.根据权利要求4所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述2.0g/L辣根过氧化物酶液的制备方法为：将0.02g辣根过氧化物酶溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液中。
8.根据权利要求1所述的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，所述自然晾干的双层纳米金修饰的测定GPR70与其配基相互作用强度的电化学型生物传感器保存于4℃PBS缓冲液中待用。
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