KR20200137666A - 자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 높은 민감도로 항원을 검출할 수 있는 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법은, 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계; 상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계; 상기 용액에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체가 결합하여 검출 대상체를 형성하는 단계; 상기 검출 대상체에 전자 발생체를 투입하는 단계; 및 상기 과산화 효소에 의하여 상기 전자 발생체가 산화되면서 전자를 발생시키고, 상기 전자를 측정하여 상기 검출 대상체를 검출하는 단계;를 포함한다.
Description
본 발명의 기술적 사상은 센서를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 대한 것으로서, 구체적으로 자성 지지체 기반으로 하는 바이오 센서를 이용하여 높은 감도로 항원을 검출하는 방법에 대한 것이다.
최근 의료분야에서 바이오 센서를 이용하여 미량의 생물학적 요소(항원, 항체, 효소 등)를 정확하게 감지하는 기술의 중요도가 점점 증가하고 있다. 이러한 바이오 센서를 이용한 생물학적 요소의 정밀한 감지는 질병의 정확한 진단 및 치료에 필수적으로 필요한 중요한 요소이다.
예를 들어 통상적으로 치매로 지칭되는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)의 정확한 진단을 위해서는 알츠하이머 병을 유발하는 원인에 대한 정확한 분석이 필요하다. 알츠하이머 병의 경우, 뇌에서 아밀로이드 베타(Amyloid beta)가 비정상적으로 과잉으로 생성되고 축적되어 발병하는 것으로 알려져 있다. 이러한 알츠하이머 병의 원인을 밝혀 직접적 치료 방법 및 치료제를 개발하고, 더 나아가 조기 진단을 통해 발병 전에 미리 예방하기 위해서는 우선적으로 발명의 원인이 되는 아밀로이드 베타의 생성 및 축적에 대한 정밀한 감지 및 분석이 필요하다. 이러한 항원에 대한 정확한 감지 및 분석을 위해서는 높은 감도를 가지는 바이오 센서의 활용이 필요함은 물론이다.
본 발명의 기술적 사상이 이루고자 하는 기술적 과제는 높은 민감도로 항원을 검출할 수 있는 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 제공하는 것이다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 의하면, 자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법이 제공된다.
상기 항원 검출 방법은, 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세 우물을 포함하는 바이오 센서를 준비하는 단계; 상기 미세 우물 내에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체를 투입하는 단계; 상기 미세 우물 내로 전자 발생체를 투입하는 단계; 및 상기 과산화 효소와 상기 전자 발생체의 반응에 의해 발생된 전자를 상기 바이오 센서가 전기적 신호로 검출하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 다른 관점에 의하면, 상기 항원 검출 방법은, 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세 우물을 포함하는 바이오 센서를 준비하는 단계; 상기 미세 우물 내에 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체를 투입하는 단계; 및 상기 검출 대상체에 전기장을 인가하여 임피던스를 측정하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측는 자성 지지체의 표면과 결합된 구조를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 미세 우물은, 바닥면을 구성하는 기판을 포함하고, 상기 기판의 일면 상에는 상기 작용 전극 및 상대 전극이 형성되며, 상기 작용 전극 및 상대 전극 각각의 상부에 상기 자성 지지체를 외부와 격리하여 수용할 수 있는 우물 형태의 내부 공간을 형성하는 부동태층을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 과산화 효소는 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP), NADH 과산화 효소(NADH peroxidase), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase) 및 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 전자 발생체는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 항원은 아밀로이드 베타, 타우 항원(Tau), 뉴로필라멘트 라이트 항원(Neurofilament light ), PSA 항원(Prostate-Specific Antigen) 및 트로포닌 항원(Troponin) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포획 항체 및 상기 검출 항체 중 어느 하나 이상은 안티 아밀로이드 베타 항체, 안티 타우 항체(anti-Tau antibody), 안티 뉴로필라멘트 라이트 항체(anti-Neurofilament light antibody), 안티 PSA 항체(anti Prostate-Specific Antigen antibody) 및 안티 트로포닌 항체(anti Troponin antibody) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 검출 대상체를 형성하는 방법은, 상기 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계; 상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계; 및 상기 용액에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체를 결합시키는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 검출 대상체를 형성하는 방법은, 상기 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계; 상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계; 및 상기 용액에 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체를 결합시키는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 분자량이 10 kDa 이상인 물질은, 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP), NADH 과산화 효소(NADH peroxidase), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase) 및 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 나노 입자는, 금속 또는 세라믹를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 나노 입자는, 10nm 내지 200nm 범위를 가질 수 있다.
본 발명의 기술적 사상에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법은 높은 신호 대 노이즈 비율로 1 pg/ml 수준 또는 그 이하까지의 농도의 항원을 검출할 수 있으므로, 매우 높은 민감도를 제공할 수 있다.
상술한 본 발명의 효과들은 예시적으로 기재되었고, 이러한 효과들에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 도시하는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 도 1의 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 개략적으로 도시하는 모식도들이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 도 1의 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 수행하는 바이오 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4는 미세 우물이 형성된 바이오 센서를 이용하여 측정한 결과를 도시한다.
도 5는 미세 우물이 형성되지 않은 바이오 센서를 이용하여 측정한 결과를 도시한다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법의 순환전류전압 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 7은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 도시하는 흐름도이다.
도 8은 본 발명의 제 2 실시예 및 비교예 의한 임피던스 측정 방법을 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 제 2 실시예 및 비교예 의한 임피던스 측정 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 도 1의 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 개략적으로 도시하는 모식도들이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 도 1의 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 수행하는 바이오 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4는 미세 우물이 형성된 바이오 센서를 이용하여 측정한 결과를 도시한다.
도 5는 미세 우물이 형성되지 않은 바이오 센서를 이용하여 측정한 결과를 도시한다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법의 순환전류전압 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 7은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 도시하는 흐름도이다.
도 8은 본 발명의 제 2 실시예 및 비교예 의한 임피던스 측정 방법을 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 제 2 실시예 및 비교예 의한 임피던스 측정 결과를 도시한 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 기술적 사상을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 기술적 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다. 본 명세서에서 동일한 부호는 시종 동일한 요소를 의미한다. 나아가, 도면에서의 다양한 요소와 영역은 개략적으로 그려진 것이다. 따라서, 본 발명의 기술적 사상은 첨부한 도면에 그려진 상대적인 크기나 간격에 의해 제한되지 않는다.
효소결합 면역흡착제 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)은 면역 측정법(immunoassay)으로 현대 생명공학 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 상기 효소결합 면역흡착제 검정법은 항원이나 항체에 효소를 결합하고, 상기 효소의 활성을 측정하여, 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법이다.
그러나, 종래의 효소결합 면역흡착제 검정법은 수십 pg/ml 이상의 항원 농도를 요구하므로, 체액 내에 매우 낮은 농도로 존재하는 항원을 검출하기에는 부적합하다. 따라서, 아밀로이드 베타 올리고머와 같이 체액 내에 매우 낮은 농도로 존재하는 항원을 검출하기 위하여는, 보다 민감하고 정밀한 검출 방법이 필요하다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법(S100)을 도시하는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 도 1의 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법(S100)을 개략적으로 도시하는 모식도들이다.
도 1을 참조하면, 제 1 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법(S100)은, 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계(S110); 상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계(S120); 상기 용액에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체가 결합하여 검출 대상체를 형성하는 단계(S130); 상기 검출 대상체에 전자 발생체를 투입하는 단계(S140); 및 상기 과산화 효소에 의하여 상기 전자 발생체가 산화되어 전자를 발생시키고, 상기 전자를 전기적 신호로서 측정하여 상기 검출 대상체를 검출하는 단계(S150);를 포함한다.
도 1 및 도 2의 (a)를 참조하면, 상기 포획 항체를 부착하는 단계(S110)에서는, 자성 지지체(110)에 포획 항체(120)를 부착한다.
자성 지지체(110)는 그 표면에 포획 항체(capture antibody)(120)를 부착하기 위한 구조체로서 자성을 가지는 물질, 또는 자화가 가능한 물질로 이루어진다. 예를 들어 철, 코발트, 니켈 등으로 포함하는 금속 또는 합성 소재를 포함할 수 있다. 이러한 자성 지지체(110)로는 자성 비드(bead)나 자성 입자를 포함할 수 있다. 도 2에는 예시적으로 자성 지지체(110)로서 자성 비드를 사용한 경우나 나타나 있다. 비드 형태의 자성 지지체(110)는, 예를 들어 약 1 μm 내지 4 μm 범위의 직경을 가질 수 있고, 예를 들어 2.8 μm의 직경을 가질 수 있다.
자성 지지체(110)은 그 표면에 포획 항체(capture antibody)(120)를 부착하기 위하여 표면 기능화될 수 있다. 예를 들어 토실레이트가 활성화된 비드(tosylactivated bead)나 스트렙타비딘이 활성화된 비드(Streptavidin bead)를 준비한다. 상기 토실레이트가 활성화된 비드에는 아민기(NH2)가 활성화된 포획항체가 부착될 수 있으며, 스트렙타비딘이 활성화된 비드에는 바이오틴(biotin)이 활성화된 포획항체가 부착될 수 있다. 자성 지지체(110)는 원하는 양의 포획 항체(120)가 부착되도록 준비된다. 또한, 자성 지지체(110)의 측정되지 않는 부착 가능위치들은 차단될 수 있다.
포획 항체(120)는, 알츠하이머 병의 검진을 위하여는, 안티 아밀로이드 베타 항체(anti-Aβ antibody)를 포함할 수 있다. 그러나, 이는 예시적이며, 포획 항체(120)가 다른 다양한 물질을 포함하는 경우도 본 발명의 기술적 사상에 포함된다. 예를 들어, 포획 항체는 포획하고자 하는 항원에 따라 안티 타우 항체(anti-Tau antibody), 안티 뉴로필라멘트 라이트 항체(anti-Neurofilament light antibody), 안티 PSA 항체(anti Prostate-Specific Antigen antibody), 안티 트로포닌 항체(anti Troponin antibody) 등 다양한 항체가 가능하다.
도 1 및 도 2의 (b)를 참조하면, 상기 항원을 포획하는 단계(S120)에서는, 자성 지지체(110)를 항원(130)을 포함하는 용액에 투입하여, 포획 항체(120)가 항원(130)을 포획한다. 상기 항원을 포획하는 단계(S120)는, 포획 항체(120)와 항원(130) 사이의 항원-항체 반응을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 항원을 포획하는 단계(S120)는 자성 지지체(110)를 투입한 상기 용액을 일정 시간 동안 유지하여 인큐베이션(incubation)함으로써 이루어질 수 있다. 상기 인큐베이션은, 예를 들어 1 분 내지 1 시간 범위의 시간동안 수행될 수 있고, 예를 들어 30 분 동안 수행될 수 있다.
항원(130)은, 알츠하이머 병의 검진을 위한 것으로, 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid beta oligomer)를 포함할 수 있다. 상기 아밀로이드 베타 올리고머는 재조합형(recombinant) Aβ42 올리고머를 포함할 수 있다. 그러나, 이는 예시적이며, 항원(130)이 다른 다양한 물질을 포함하는 경우도 본 발명의 기술적 사상에 포함된다. 예를 들어, 타우 항원(Tau),뉴로필라멘트 라이트 항원(Neurofilament light ), PSA 항원(Prostate-Specific Antigen), 트로포닌 항원(Troponin) 등 다양한 항원의 사용이 가능하다. 항원(130)을 포함하는 상기 용액은 혈액, 림프액, 조직액 등을 포함하는 체액일 수 있고, 세포내액과 세포외액을 포함할 수 있다.
도 1 및 도 2의 (c)를 참조하면, 상기 검출 대상체를 형성하는 단계(S130)에서는, 자성 지지체(110)의 포획 항체(120)에 포획된 항원(130)을 포함하는 상기 용액에 검출 항체(detection antibody)(140)를 투입하고, 항원(130)과 검출 항체(140)가 결합하여 검출 대상체(100)가 형성된다.
상기 검출 대상체를 형성하는 단계(S130)는, 검출 항체(140)와 항원(130) 사이의 항원-항체 반응을 통하여 이루어질 수 있다. 검출 항체(140)는 항원(130)의 측정 위치에 부착될 수 있고, 예를 들어 비오틴-결합(biotin-conjugated)으로 부착될 수 있다. 참고로, 포획 항체(120)에 결합된 항원(130)의 농도가 낮은 경우에는 검출 항체(140)가 결합하지 않을 수 있다.
검출 대상체(100)는 항원(130)을 중심으로, 항원(130)의 일측에 포획 항체(120)가 결합되고, 항원(130)의 타측에 검출 항체(140)가 부착됨으로써, 대칭형의 샌드위치 구조를 형성할 수 있다. 만일, 항원(130)이 없는 경우에는 상기 샌드위치 구조가 형성되지 않는다. 또한, 항원(130)과 검출 항체(140)의 부착은 검출 항체(140)를 투입한 후에 일정 시간 동안 유지하여 인큐베이션(incubation)함으로써 이루어질 수 있다.
검출 항체(140)는 알츠하이머 병의 검진을 위하여는, 안티 아밀로이드 베타 항체(anti-Aβ antibody)를 포함할 수 있다. 그러나, 이는 예시적이며, 검출 항체(140)가 다양한 물질을 포함하는 경우도 본 발명의 기술적 사상에 포함된다. 예를 들어, 검출항체는 측정하고자 하는 항원의 종류에 따라 안티 타우 항체(anti-Tau antibody), 안티 뉴로필라멘트 라이트 항체(anti-Neurofilament light antibody), 안티 PSA 항체(anti Prostate-Specific Antigen antibody), 안티 트로포닌 항체(anti Troponin antibody) 등 다양한 항체가 가능하다.
검출 항체(140)는 과산화 효소(150)가 표지(tagged)될 수 있다. 과산화 효소(150)는 후술하는 전자 발생체를 산화시켜 전자를 발생시키는 역할을 수행하게 된다. 과산화 효소(150)는, 예를 들어 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP)를 포함할 수 있다. 상기 서양고추냉이 과산화 효소는 서양고추냉이의 뿌리에서 발견되는 효소로서, 생화학적 응용에 광범위하게 사용되며, 많은 형태를 가지는 금속 효소이고 가장 많이 사용되는 유형은 C 유형이다. 포함된 과산화수소(hydrogen peroxide)에 의하여 많은 유기 기질의 산화 반응에서 촉매 작용을 한다. 그러나, 이는 예시적이며, 과산화 효소(150)가 다양한 물질을 포함하는 경우도 본 발명의 기술적 사상에 포함된다. 예를 들어, 과산화 효소로는 NADH 과산화 효소(NADH peroxidase), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase, 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase) 등을 이용할 수 있다.
선택적으로, 상기 검출 대상체를 형성하는 단계(S130)를 수행한 후에, 검출 대상체(100)를 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 1 및 도 2의 (d)를 참조하면, 상기 검출 대상체(100)를 바이오 센서(200)에 투입한다. 검출 대상체(100)는 액적(droplet) 형태로 투입될 수 있고, 작용 전극(WE)과 상대 전극(CE) 사이의 우물에 투입될 수 있다. 자성체(magnetic bar)는 검출 대상체(100)의 자성 지지체(110)를 상기 우물 내로 이동시켜 고정할 수 있다. 바이오 센서(200)에 대하여는 도 3을 참조하여 하기에 상세하게 설명하기로 한다.
도 1 및 도 2의 (e)를 참조하면, 상기 전자 발생체를 투입하는 단계(S140)는 바이오 센서(200)의 상기 우물 내에 수용된 검출 대상체(100)에 전자 발생체를 투입한다.
전자 발생체는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB)를 포함한다. 상기 TMB는 면역조직화학(immunohistochemistry)에서의 분별 염색에 사용되는 발색 기질(chromogenic substrate)이며, ELISA 에서 사용될 때에는 가시성 시약으로 사용된다. 상기 TMB는 희색 분말이고, 아세트산 에틸(ethyl acetate)에 용해시 약한 청녹색 용액이 된다. 상기 TMB는 태양광선과 형광에 의하여 열화될 수 있다.
상기 TMB는 용매, 예를 들어 과산화수소에 용해된 용액으로 투입될 수 있다.
도 1 및 도 2의 (e)를 참조하면, 상기 검출 대상체를 검출하는 단계(S150)에서는, 과산화 효소(150)에 의하여 상기 전자 발생체가 산화되면서 전자를 발생시킨다. 이와 같이 발생한 상기 전자를 바이오 센서(200)가 측정하여 검출 대상체(100)를 검출한다. 상기 전자는 바이오 센서(200)의 전극에 의하여 유동하여 전류를 발생시킨다. 이와 같이 발생한 전류는 순환전류전압측정법(Cyclic Voltammogram, CV) 및 전류측정법(amperometric measurement)에 의하여 측정이 가능하며, 전류의 발생 유무 및 크기로부터 상기 항원, 예를 들어 아밀로이드 베타 올리고머의 농도를 산출할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법을 수행하는 바이오 센서(200)를 개략적으로 도시한다.
도 3에서, (a)는 바이오 센서(200)를 여러 단계로 확대하여 도시하고, (b)는 바이오 센서(200) 내에 검출 대상체(100)가 수용되어 검출되는 상태를 도시한다.
도 3을 참조하면, 바이오 센서(200)는 항원의 검출을 위한 바이오 센서로서, 기판(290) 상에 배치된 작용 전극(210), 상대 전극(220), 기준 전극(230), 및 미세 우물 어레이(240)을 포함한다. 도 3의 바이오 센서(200)의 구조는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.
미세 우물(250)의 바닥면을 구성하는 기판(290)은 전기적으로 부도체인 물질로서, 예를 들어 유리, 폴리머 등을 포함할 수 있다. 기판(290) 상에 작용 전극(210)과 상대 전극(220)이 배치되어 있다. 작용 전극(210)과 상대 전극(220)은 각각 전도성 물질, 예를 들어 금속을 포함할 수 있고, 예를 들어 티티늄 또는 백금 등을 포함할 수 있다. 작용 전극(210)과 상대 전극(220) 각각의 상부에 부동태층(280)이 형성되어 있다. 부동태층(280)은 자성 지지체를 외부와 격리하여 수용할 수 있는 우물 형태의 내부 공간을 형성하는 벽과 같은 구조체로서의 역할을 수행할 수 있다. 부동태층(280)은 전기 절연성을 가지는 물질로서, 예를들어 전기 절연성 수지 등을 포함할 수 있다.
기판(290)은 기 설정된 두께를 가지면서 평면 형상으로 형성되어, 작용 전극(210), 상대 전극(220), 기준 전극(230) 및 부동태층(280)을 지지할 수 있다.
작용 전극(210)과 상대 전극(220)은 검출 대상체(100)와 전기적으로 연결될 수 있다. 이에 따라, 검출 대상체(100)에서 발생하는 전자를 흐르게 하여 전류량을 측정할 수 있고, 또는 검출 대상체(100)에 전기장을 인가하여 임피던스를 측정할 수 있다. 이러한 방법은 미세한 양의 항원을 검출할 수 있다. 이를 위해 바이오 센서(200)에는 미세 우물 내에서 발생된 전자를 전기적 신호로 검출하는 측정부 혹은 검출 대상체(100)의 임피던스를 측정할 수 있는 측정부가 구비된다.
부동태층(280)에 의하여 한정된 미세 우물(250)이 형성될 수 있다. 미세 우물(250)은 검출 대상체(100)가 수용될 수 있는 크기를 가지며, 예를 들어 3 μm 내지 10 μm 범위의 직경을 가질 수 있다. 미세 우물(250)의 형상은 원형, 타원형, 다각형 등 다양한 형상이 가능하다. 자성체를 이용하여 자성 지지체(110)를 미세 우물(250)에 수용시켜 기판(290)의 표면에 부착시킬 수 있다. 미세 우물(250)은 하나 또는 그 이상의 검출 대상체(100)를 수용할 수 있고, 전기장과 산화에 의하여 발생한 전자를 국한시킬 수 있다.
미세 우물 어레이(240)에는 복수의 미세 우물(250)들이 배열되어 있다. 각각의 미세 우물(250)에는 작용 전극(210)과 상대 전극(220)이 배치되어 있다. 도 3의 미세 우물 어레이(240)에는 직경 8 μm의 미세 우물(250)들이 가로 20개 세로 20개로 배치되어 있다. 미세 우물 어레이(240)에 의하여 전류 량을 증가시킬 수 있고, 자성 지지체(110)의 위치 편차에 의한 오차를 감소시킬 수 있다. 또한, 미세 우물(250) 내에 전기장이 집중될 수 있어 자성 지지체(110)에 국부화되고, 따라서 검출 민감도를 향상시킬 수 있다. 또한 미세 우물(250)이 형성될 경우, 미세 우물(250)의 벽에 의해 항원 및 반응에 의해 생성된 전자의 확산이 제한되어 측정 전극 사이의 항원 및 전자의 농도가 증가됨에 따라 검출 한계 및 신호 감도가 증가되는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 제 1 실시예를 따르는 바이오 센서는, 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세우물; 및 상기 미세 우물 내에 각각 또는 혼합하여 투입되는, 전자 발생체와 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체간에 일어나는 상기 전자 발생체 및 상기 과산화 효소의 반응에 의해 발생된 전자를 전기적 신호로 검출하는 측정부;를 포함한다. 이때 상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측에는 자성비드의 표면과 결합된 구조를 가지게 된다.
이하에서는, 본 발명의 제 1 실시예를 따르는 바이오 센서를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 대한 구체적인 실험결과에 대해서 기술하기로 한다. 하기의 실험에서는, 자성 지지체로서 자성 비드를 사용하였다. 항원으로서 아밀로이드 베타 올리고머를 사용하였고, 과산화 효소로서 HRP을 사용하였고, 전자 발생체로서 TMB를 사용하였다. 바이오 센서는 도 3의 미세 우물이 형성된 것을 사용하였으며, 비교예로서 미세 우물이 없이 금속 배선만이 형성된 바이오 센서를 사용하였다.
도 4의 (a)에는 미세 우물이 형성된 바이오 센서를 이용하여 측정한 항원의 농도에 따른 전압-전류 그래프가 나타나 있으며, (b)에는 항원의 농도에 따른 전류가 나타나 있으며, (c)에는 항원의 농도에 따른 전류의 변화량(change)이 도시되어 있다. 한편, 비교예로서 도 5의 (a), (b) 및 (c)에는 각각 미세 우물이 형성되지 않은 바이오 센서를 이용하여 측정한 전압-전류 그래프, 항원의 농도에 따른 전류 및 항원의 농도에 따른 전류 변화량(change)이 도시되어 있다. 도 4의 (a) 및 도 5의 (a)의 "control"은 항원을 포함하지 않는 기준 신호를 지칭한다.
도 4의 (b) 및 도 5의 (b)를 참조하면, 미세 우물이 형성되지 않은 바이오 센서를 사용한 경우 항원의 검출 한계는 10pg/ml임에 비해 미세 우물이 형성된 바이오 센서를 사용한 경우에는 1pg/ml까지도 검출이 가능함을 알 수 있다.
또한 도 4의 (c) 및 도 5의 (c)를 참조하면, 바이오 센서의 신호 감도에 해당되는 기울기에 있어서, 미세 우물이 형성된 바이오 센서의 기울기가 7.2%dec로서 미세 우물이 형성되지 않은 바이오 센서의 기울기인 4.6%dec에 비해 더 우수한 값을 나타냄을 확인할 수 있다. 이러한 검출 한계 및 신호 감도의 차이는 미세 우물에 의한 전기장의 집중, 항원 및 전자의 확산 방지 효과에 의해 기인하는 것으로 판단된다.
도 6은 도 4의 순환전류전압 측정 결과 중 인가되는 전압을 -0.2V로 고정한 상태에서 항원 농도에 대한 반응 전류를 측정한 결과이다. 도 6의 그래프에서, "control"은 항원을 포함하지 않는 기준 신호를 지칭하며, 농도는 항원의 농도를 의미한다.
도 6를 참조하면, 기준 신호와 항원 농도에 대한 신호들은 큰 차이의 전류값을 나타내었다. 기준 신호는 매우 낮은 전류값을 가지며, 이는 항원이 없고 전극 영역이 최소화되었기 때문으로 분석된다. 각각의 항원 농도에서 명확한 전류 신호가 측정되었다. 항원 농도가 증가함에 따라 전류가 증가하였다. 이러한 결과는 효소-기질 상호반응에 의하여 형성된 전자들의 수가 증가하였기 때문으로 분석된다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법은 높은 신호 대 노이즈 비율로 1 pg/ml 수준 또는 그 이하까지의 농도의 항원을 검출할 수 있으므로, 매우 높은 민감도를 제공할 수 있다. 따라서, 체액 속에 매우 낮은 농도로 존재하는 아밀로이드 베타 올리고머를 매우 높은 민감도로 검출함으로써, 알츠하이머 병을 조기에 진단하기에 매우 유용하다.
본 발명의 제 2 실시예를 따르는 바이오 센서는, 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세우물; 및 상기 미세 우물 내에 투입되는 검출 대상체의 임피던스를 측정할 수 있는 측정부;를 포함한다. 이때 상기 검출 항체는 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 것이며, 이때 상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측에는 자성비드의 표면과 결합된 구조를 가지게 된다.
이하에서는, 본 발명의 제 2 실시예를 따르는 바이오 센서를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 대한 구체적인 실험결과에 대해서 기술하기로 한다.
도 7에는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법(S200)을 도시하는 흐름도가 나타나 있다. 도 7를 참조하면, 제 2 실시예의 경우, (S210) 단계 내지 (S230)는 상술한 제 1 실시예의 (S110) 단계 내지 (S130) 단계와 동일하며, 다만, (S230) 단계에 있어, 검출 항체에는 검출 대상체의 임피던스를 증가시킬 수 있는 물질이 표지된다는 점에서만 차이가 있다. 이러한 물질로서, 분자량이 큰 물질 혹은 나노 입자를 포함한다.
본 제 2 실시예에 있어서, 상기 검출 항체에는 검출대상체의 임피던스를 크게 증가시킬 수 있는 물질이 표지되는 것을 특징으로 한다. 본 실시예를 따르는 바이오 센서는 자성 지지체의 표면에 전계(electric field)를 집중시킬 수 있는 특징을 가진다. 자성 지지체에 항원, 검출 항체 등이 부착되는 경우, 이로 인해 자성 지지체 표면에 존재하는 전하 및 유전율의 변화가 나타나게 되며, 따라서 이에 연동하여 자성 지지체에서의 전계 변화가 나타나게 된다. 항원과 같이 크기가 작고 분자량이 작은 유기물이 부착되는 경우, 자성 지지체 표면에서의 전계 변화량을 무시할 정도의 수준이다. 그러나 수준 검출 항체에 표지되는 물질로서 분자량이 큰 물질이나 소정의 크기를 가지는 나노 입자를 사용할 경우, 자성 지지체 표면에서의 현저한 전계 변화를 일으키게 되며, 이러한 전계 변화에 따라 검출 대상체의 임피던스의 증가가 나타나게 된다. 따라서 검출 항체에 표지된 표지 물질에 의해 검출 대상체(100)의 임피던스가 증가함에 따라 센싱 감도는 종래의 이러한 표지 물질을 사용하지 않은 것에 비해 현저하게 증가하게 된다.
상기 검출 항체에 표지되는 분자량이 큰 물질은 분자량이 10 kDa 이상인 물질을 의미한다. 분자량이 10 kDa 미만일 경우에는 임피던스 증가에 따른 센싱 감도 증가 효과를 기대하기 어렵다. 분자량이 10 kDa이상의 표지 물질로는 대표적으로 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP, 44 kDa), NADH 과산화 효소(NADH peroxidase, 4Х50 kDa), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases, 40 kDa), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase, -50 kDa), 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase, -17 kDa) 등이 해당될 수 있다.
한편, 검출 항체에 표지되는 나노 입자는 금속 또는 세라믹이 가능하다. 금속은 예를 들어, 금, 백금 등을 포함할 수 있다. 세라믹으로는 실리콘 산화물, 알루미늄 산화물, 망간산화물, 산화철 등을 포함할 수 있다.
상기 나노 입자의 크기는 10nm 내지 200nm의 범위를 가질 수 있다. 10nm 미만의 크기를 가질 경우에는 경우에는 임피던스 증가에 따른 센싱 감도 증가 효과를 기대하기 어렵다. 반면 200nm 이상을 초과할 경우, 나노 입자가 표지되어 자성 지지체 상에 부착되는 검출 항체의 수가 제한됨에 따라 센싱 감도를 증가시키는 효과를 기대할 수 없다.
검출 항체에 나노 입자를 표지하기 위하여 나노 입자의 표면을 활성화시킨 후 검출항체와 반응시켜 표지시킬 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자의 경우, 금 나노입자 표면에, 비특이적 흡착을 최소화할 수 있는 물질로 말단이 -SH기이고 카르복실기(-COOH)와 하이드록실기(-OH)가 결합되어 있는 에틸렌글라이콜 화합물을 반응시킨 후 EDC/NHS [(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)/(N-hydroxylsuccinimide)] 물질로 표면을 활성한 후 검출 항체와 반응시켜 표지할 수 있다.
(S230) 단계가 완료되어 검출 대상체가 형성되면, 이를 바이오 센서(200)에 투입한 후 작용 전극(210) 및 상대 전극(220) 사이에 전기장을 인가하여 임피던스를 측정한다(S240). 이러한 측정된 임피던스 값으로부터 검출 대상이 되는 항원의 유무를 감지할 수 있으며, 항원이 존재할 경우에는 그 농도를 유추할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 제 2 실시예에 따른 자성 지지체를 이용한 항원 검출 방법의 실험 결과를 설명하기로 한다. 본 실험에서는 제 1 실시예의 실험에서와 동일한 검출 대상체(100)를 사용하였다. 다만, 본 실험예에 사용된 검출 항체에 표지된 서양고추냉이 과산화 효소는 제 1 실시예에서의 전자 발생체를 산화시키는 역할이 아닌 검출 대상체의 임피던스를 증가시켜 센싱 감도를 향상시키기 위한 표지로 이용된다.
도 8의 (a)에는 종래의 방법으로서 포획 항체와 항원만이 결합된 자성 지지체를 이용하여 임피던스를 측정하는 방법이 나타나 있으며, 도 9의 (a)에는 이에 따른 항원의 농도에 대한 임피던스의 측정값이 나타나 있다. 한편, 도 8의 (b)에 본 발명의 제 2 실시예에 의한 임피던스 측정방법이 나타나 있으며, 도 9의 (b)에는 이에 따른 항원의 농도에 대한 임피던스의 측정값이 나타나 있다.
도 9의 (a) 및 (b)를 참조하면, 검출 항체가 없는 경우의 기울기는 10.2%dec임에 비해 검출 항체가 있는 경우에는 27.3%dec으로서, 신호 감도가 약 3배 정도 증폭되었음을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 기술적 사상이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명의 기술적 사상이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
100: 검출 대상체, 110: 자성 지지체, 120: 포획 항체,
130: 항원, 140: 검출 항체, 150: 과산화 효소,
200: 바이오 센서, 210: 작용 전극, 220: 상대 전극
230: 기준 전극, 240: 미세 우물 어레이,
250: 미세 우물, 280: 부동태층, 290: 기판
130: 항원, 140: 검출 항체, 150: 과산화 효소,
200: 바이오 센서, 210: 작용 전극, 220: 상대 전극
230: 기준 전극, 240: 미세 우물 어레이,
250: 미세 우물, 280: 부동태층, 290: 기판
Claims (15)
- 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세 우물을 포함하는 바이오 센서를 준비하는 단계;
상기 미세 우물 내에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체를 투입하는 단계;
상기 미세 우물 내로 전자 발생체를 투입하는 단계; 및
상기 과산화 효소와 상기 전자 발생체의 반응에 의해 발생된 전자를 상기 바이오 센서가 전기적 신호로 검출하는 단계;를 포함하고,
상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측는 자성 지지체의 표면과 결합된 구조를 가지는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세 우물을 포함하는 바이오 센서를 준비하는 단계;
상기 미세 우물 내에 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체를 투입하는 단계; 및
상기 검출 대상체에 전기장을 인가하여 임피던스를 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측는 자성 지지체의 표면과 결합된 구조를 가지는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 미세 우물은,
바닥면을 구성하는 기판을 포함하고,
상기 기판의 일면 상에는 상기 작용 전극 및 상대 전극이 형성되며,
상기 작용 전극 및 상대 전극 각각의 상부에 상기 자성 지지체를 외부와 격리하여 수용할 수 있는 우물 형태의 내부 공간을 형성하는 부동태층을 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 과산화 효소는 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP), NADH 과산화 효소(NADH peroxidase), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase) 및 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase) 중 어느 하나를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 전자 발생체는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB)를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 항원은 아밀로이드 베타, 타우 항원(Tau), 뉴로필라멘트 라이트 항원(Neurofilament light ), PSA 항원(Prostate-Specific Antigen) 및 트로포닌 항원(Troponin) 중 어느 하나를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 포획 항체 및 검출 항체 중 어느 하나 이상은, 안티 아밀로이드 베타 항체(anti-Aβ antibody), 안티 타우 항체(anti-Tau antibody), 안티 뉴로필라멘트 라이트 항체(anti-Neurofilament light antibody), 안티 PSA 항체(anti Prostate-Specific Antigen antibody) 및 안티 트로포닌 항체(anti Troponin antibody) 중 어느 하나를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 자성 지지체는 자성 비드 또는 자성 입자를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 검출 대상체를 형성하는 방법은,
상기 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계;
상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계; 및
상기 용액에 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체를 결합시키는 단계;를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 검출 대상체를 형성하는 방법은,
상기 자성 지지체에 포획 항체를 부착하는 단계;
상기 자성 지지체를 항원을 포함하는 용액에 투입하여, 상기 포획 항체가 상기 항원을 포획하는 단계; 및
상기 용액에 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 검출 항체를 투입하여, 상기 항원과 상기 검출 항체를 결합시키는 단계;를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 분자량이 10 kDa 이상인 물질은,
서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP), NADH 과산화 효소(NADH peroxidase), 황색효소 과산화 효소(flavoprotein oxidases), 망간 과산화 효소(manganese peroxidase) 및 리그닌 과산화 효소(lignin peroxidase) 중 어느 하나를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 나노 입자는,
금속 또는 세라믹를 포함하는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 나노 입자는,
10nm 내지 200nm 범위를 가지는,
자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법. - 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세우물; 및
상기 미세 우물 내에 각각 또는 혼합하여 투입되는, 전자 발생체와 과산화 효소가 표지된 검출 항체를 포함하는 검출 대상체간에 일어나는 상기 전자 발생체 및 상기 과산화 효소의 반응에 의해 발생된 전자를 전기적 신호로 검출하는 측정부;를 포함하며,
상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측에는 자성비드의 표면과 결합된 구조를 가지는,
자성 지지체 기반 바이오센서. - 내부에 작용 전극 및 상대 전극이 배치된 미세우물; 및
상기 미세 우물 내에 투입되는 검출 대상체의 임피던스를 측정할 수 있는 측정부;를 포함하며,
상기 검출 항체는 분자량이 10 kDa 이상인 물질 혹은 나노 입자가 표지된 것이며,
상기 검출 대상체는, 항원을 중심으로, 상기 항원의 일측에 상기 포획 항체가 결합되고, 상기 항원의 타측에 상기 검출 항체가 결합되며, 상기 포획 항체의 타측에는 자성비드의 표면과 결합된 구조를 가지는,
자성 지지체 기반 바이오센서.
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| KR1020190064397A KR102286211B1 (ko) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | 자성 지지체 기반 바이오 센서를 이용한 항원 검출 방법 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20210072425A (ko) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 연세대학교 산학협력단 | 원스텝 임뮤노어세이 키트 및 이를 이용한 측정 방법 |
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