DETECTION D'UN ANALYTE EN UTILISANT DEUX TYPES DE PARTICULES
La présente invention concerne un nécessaire pour la détection ou le dosage d'un analyte d'intérêt dans un échantillon ainsi que le procédé pour détecter ou doser ledit analyte d'intérêt. La détection d'analytes d'intérêt dans un échantillon biologique complexe est au centre des préoccupations des chercheurs et industriels aussi bien dans le domaine de la microbiologie industrielle (produits alimentaires ou pharmaceutiques, cosmétiques) que dans le domaine des sciences cliniques (détection d'infections bactériennes, parasitaires ou virales) ou encore dans la recherche de désordres non infectieux comme des dérèglements hormonaux.
Des particules solides ont été utilisées de différentes manières dans les procédés pour la mise en évidence de ces analytes et notamment pour isoler ou détecter ces analytes. Un des premiers exemples est la simple agglutination de particules de latex, sur lesquelles sont fixés des anticorps, en présence d'un antigène à détecter. Cependant, le manque de sensibilité de ces techniques est un inconvénient majeur.
Un certain nombre d'applications ont été décrites avec l'utilisation de deux sortes de particules pour des essais selon une technique dite "sandwich", fondée sur la formation de complexes du type première particule / analyte / seconde particule.
Dans les techniques d'immunofiltration que décrivent par exemple les brevets FR 2 664 704 ou EP 0 310 872. des particules de capture et des particules de détection, sur lesquelles sont fixées des entités susceptibles de réagir avec la substance recherchée (par exemple un antigène), sont mises en présence de l'échantillon analysé pour former un complexe si cette substance est présente. Après filtration sur une membrane dont les pores sont d'une taille contrôlée pour fixer le complexe formé, la présence de ladite substance est détectée par l'intermédiaire d'un marqueur présent sur la particule de détection.
Un autre exemple, utilisant deux types de particules, est le procédé décrit par Fujiwara et al (US 5 238 810), dans lequel on utilise un latex sur lequel est fixé un anticorps, et des microparticules magnétiques, sur lesquelles est fixé un anticorps. Les mi- croparticules magnétiques sont détectées par un laser.
Le document EP 0 352 139 décrit la détection d'antigène avec une technique sandwich dans laquelle un antigène réagit avec une particule magnétique sur laquelle est
fixé un premier anticorps avec une particule de détection sur laquelle est fixé un deuxième anticorps. On rassemble les complexes formés au fond du tube, par aimantation, et la détermination de la quantité de particules de détection qui restent dans le surnageant permet de mesurer indirectement la quantité d'antigène présent, puisque le signal est inversement proportionnel à la quantité d'antigène.
Dans les documents analysés ci-dessus, tous les systèmes mettant en œuvre deux sortes de particules utilisent un premier type de particules pour capturer l'analyte recherché et un second type de particules fournissant un signal permettant de détecter la présence, ou de déterminer la quantité, de l'analyte capturé. Les particules de capture peuvent être fixées sur un support solide par filtration ou par aimantation, et lorsqu'on veut déterminer la présence ou la quantité de particules de détection fixées sur le support (par l'intermédiaire du complexe formé avec l'analyte et avec les particules de capture), il convient d'effectuer un lavage pour éliminer les particules de détection non fixées. Tous ces systèmes ont une caractéristique commune : la particule de détection est d'une taille sensiblement plus petite que la particule de capture. En effet, il paraît intuitivement évident, d'une part, que la fixation de la particule de capture sur le support solide, que ce soit par aimantation, centrifugation ou filtration. sera facilitée si la particule de capture est plus grosse que la particule de détection, et, d'autre part, que lors du lavage il n'y aura alors pas de risque que la particule de détection entraîne le complexe formé, ce qui nuirait à la sensibilité.
Ainsi, l'étude de l'art antérieur montre l'existence d'un préjugé en faveur de l'emploi de particules de capture plus grosses que les particules de détection. Contrairement à ce préjugé, la présente invention concerne la détection d'analytes par une technique sandwich utilisant deux particules dans laquelle la particule de détection est notablement plus grosse que la particule de capture. On a découvert que la sensibilité de cette technique est très bonne. En outre, la mise en œuvre de cette technique se trouve simplifiée, puisque la présence de la particule de capture n'est pas gênante lors de la détection, ce qui permet d'éviter une étape de séparation des deux types de particules. En outre, on a découvert qu'il est possible d'éliminer par lavage les particules de détec- tion "libres" (non engagées dans le complexe sandwich) présentes sur un support solide sans éliminer les particules de détection immobilisées sur le support par l'intermédiaire dudit complexe, malgré les dimensions importantes des particules de détection (par rap-
port aux particules de capture). Ces dimensions importantes pouvaient faire redouter un entraînement par les eaux de lavage des particules de détection immobilisées sur le support, ce qui ne pouvait que renforcer le préjugé mentionné ci-dessus.
La présente invention concerne un nécessaire pour la détection ou le dosage d'un analyte d'intérêt dans un échantillon. Il s'agit d'un nécessaire du type comprenant :
- un réactif de capture comprenant un premier type de particules de même taille, ledit réactif de capture étant capable de se lier spécifiquement audit analyte.
- un réactif de détection comprenant un second type de particules de même taille, ledit réactif de détection étant capable de se lier spécifiquement audit analyte sans compétition avec le réactif de capture. ledit réactif de capture étant immobilisable sur un support solide tandis que le réactif de détection n'est pas immobilisable sur ledit support solide, sauf lorsqu'il est engagé dans un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection. Ce nécessaire est caractérisé par le fait que lesdites particules du second type ont une taille au moins 5 fois supérieure à la taille des particules du premier type.
Le réactif de capture comprend une entité de capture capable de se lier spécifiquement à l'analyte. L'entité de capture est fixée sur les particules du premier type (particules de capture), ou bien l'entité de capture et les particules de capture peuvent se fixer l'une sur l'autre notamment par une liaison covalente ou par une liaison spécifique du type ligand-antiligand.
De façon analogue, le réactif de détection comprend une entité de détection capable de se lier spécifiquement à l'analyte. L'entité de détection est fixée, ou apte à être fixée spécifiquement, sur les particules du deuxième type (particules de détection).
On donne ci-après une définition de certains termes utilisés dans la présente demande.
Par "échantillon", on entend tout prélèvement de préférence liquide dans lequel un ou plusieurs analytes d'intérêt peuvent être présents. Un prélèvement biologique comme : un échantillon du corps humain comme par exemple le sang, le sérum, le plasma, l'urine, le sperme, un tissu cutané, une biopsie, un lavage bronchoalvéolaire, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien, des colonies issues d'une étape de culture solide ou liquide, une culture liquide ou solide ; un échantillon industriel comme un produit alimentaire, cosmétique, pharmaceutique, un prélèvement d'eau, ces échantil-
Ions pouvant être testés directement ou enrichis par une étape de culture ou concentrés pour faciliter le dosage de l'analyte. Une étape de prétraitement comme la lyse, la flui- dification, la concentration peut être effectuée avant de mettre en œuvre le dosage de l'analyte. Dans tous les cas. on aboutit à un liquide, sur lequel on effectue les opérations de dosage ou de détection, et qui est appelé ci-après "échantillon liquide".
Par "analyte". on entend un composé ou une composition à détecter qui possède au moins un et préférentiellement deux sites de reconnaissance ou zones de complexation. A titre d'exemple, un analyte peut être un composé organique tel qu'une protéine, un anticorps, un peptide. un acide aminé, un sucre, une hormone, un stéroïde, une vitamine, une drogue, un médicament, une toxine, un nucléoside. un nucléotide ou ses dérivés, un antigène, un haptène ou une macromolécule (polynucléotide. polysac- charide. etc.).
L'analyte à détecter est notamment un acide nucléique, un antigène ou un anticorps. Parmi les acides nucléiques, on citera les acides nucléiques naturels comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert ou un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.
L'analyte détecté ou dosé selon l'invention n'est généralement pas marqué et, s'il est marqué, ce marquage n'est pas utilisé pour la détection ou le dosage conformément à l'invention. Par "zone de complexation" on entend un site sur lequel une molécule est capable de se fixer spécifiquement par un moyen chimique, covalent ou non covalent, ou par un moyen physique. Un épitope de protéine ou d'haptène est un exemple bien connu d'une zone de complexation sur laquelle peut se fixer de manière non covalente un anticorps. Une séquence d'acide nucléique de quelques bases nucléotidiques, par exemple 5 à 50 bases, est un autre exemple de zone de complexation sur laquelle peut se fixer de manière non covalente une séquence d'acide nucléique complémentaire. D'autres exemples de liaison entre une zone de complexation et une molécule sont possibles comme par exemple les liaisons biotine/streptavidine. lectine/sucre. effecteur/récepteur, cofacteur ou inhibiteur d'enzyme/enzyme, fonction nucléophile/électrophile, fonction alcoxyamine/fonction cétone. fonction thiol/fonction maléimide.
Par "entité de capture", on entend une molécule qui est liée (ou qui peut être liée spécifiquement) à une particule (particule de capture) et qui est capable de se fixer
spécifiquement sur une zone de complexation de l'analyte. En outre, les particules de capture sont aptes à être fixées sur une phase solide. Elles permettent donc de fixer aussi l'analyte. indirectement, sur la phase solide.
Par "entité de détection", on entend une molécule qui est liée (ou qui peut être liée spécifiquement) à une particule (particule de détection) et qui est capable de se fixer spécifiquement sur une zone de complexation de l'analyte. La présence de particules de détection, ou leur quantité, peut être déterminée, selon des méthodes connues en soi. Cette étape est appelée ici "détection". Grâce à la possibilité de séparer, à l'aide de l'étape de capture et de lavages, les particules de détection engagées dans un complexe avec l'analyte et les particules de détection non engagées dans un tel complexe, la détection de la présence (ou la détermination de la quantité) de particules de détection liées à l'analyte, permet donc de détecter ou de doser aussi l'analyte.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'analyte présente une première et une deuxième zones de complexation distinctes et les deux entités de cap- ture et détection reconnaissent chacune une zone de complexation distincte. Par exemple, on pourra utiliser deux anticorps différents comme entités de capture et de détection chacun reconnaissant un épitope différent d'un analyte qui sera par exemple une protéine. De même, on pourra utiliser comme entités de capture et de détection deux séquences d'oligonucléotides s'hybridant sur deux régions distinctes d'un analyte qui est alors un acide nucléique.
Dans un deuxième mode de réalisation, notamment lorsque l'analyte présente une seule zone de complexation. l'entité de capture est capable de se fixer à cette zone de complexation et l'entité de détection est capable de se fixer sur le complexe formé entre ladite zone de complexation et l'entité de capture. On peut aussi utiliser, inverse- ment, une entité de détection qui reconnaît la zone de complexation et une entité de capture qui est capable de se fixer sur le complexe formé entre ladite zone de complexation et l'entité de détection. A titre d'exemple, si l'analyte à doser est un haptène. un premier anticorps dirigé contre l'haptène et un deuxième anticorps dirigé contre le complexe haptène/premier anticorps peuvent servir chacun indifféremment d'entité de capture ou d'entité de détection.
De même, si l'analyte à doser est un ARN, un oligodésoxyribonucléotide complémentaire d'une région de TARN et un anticorps dirigé contre un hybride ADN/ARN peuvent servir chacun indifféremment d'entité de capture ou d'entité de détection.
De tels anticorps anti-hybrides ADN/ARN ont été décrits par exemple par Stollar et Rashtchian. Anal. Biochem.. 161 , pp. 387-394, 1987.
Par "particule", on entend de petites parties d'une substance insoluble en milieu liquide et notamment en milieu aqueux, et ayant une taille inférieure à 10 micromètres. Les particules peuvent être notamment constituées d'une substance solide, comme par exemple des particules de latex, de silice, d'agarose, de verre, de polymères acryliques tels que les polyacrvlamides ou les méthacrylates, etc. De préférence, les particules de l'invention sont monodisperses. Elles ont généralement une forme sphérique ou sensiblement sphérique.
La taille des particules, supposées sphériques, est définie comme le diamètre moyen mesuré par des techniques classiques comme la diffusion de lumière ou la mi- croscopie électronique. La méthode de référence utilisée pour caractériser le diamètre des particules dans la présente demande est une mesure par diffusion de la lumière à
20°C. à l'aide d'un granulomètre Malvern, modèle Zetasizer 3000HS.
Pour des particules non sphériques. la taille est définie comme la plus grande distance entre deux points quelconques de la particule. Les particules du réactif de capture ont par exemple une taille comprise entre
10 nm et 300 nm et préférentiellement entre 50 nm et 150 nm.
Les particules du réactif de détection ont par exemple une taille comprise entre 50 nm et 5 micromètres et préférentiellement entre 600 nm et 2 micromètres.
Les tailles des particules sont choisies de façon que le rapport des tailles entre la particule du réactif de détection et la particule du réactif de capture soit au moins égal à 5.
Les particules du réactif de capture peuvent être notamment des particules magnétiques comme des particules ferromagnétiques, ferrimagnétiques. paramagnétiques superparamagnétiques, ou analogues, qui peuvent contenir des métaux comme par exemple le fer. le nickel, le cobalt, le chrome, le manganèse, des lanthanides. ou leurs alliages, ou encore des oxydes comme Fe3θ4. Fe203 Cr02. CoO. Ni0 . Mn20 . Les moyens de préparation de telles particules sont connus, et sont décrits par exemple dans
le brevet FR 2 749 082 de la demanderesse ou dans les articles de Bacri. J.C. et al. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 85. pp. 7-35. 1990. ou d'Autenshlyus. A.I. et al. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 122. pp. 60-363. 1993.
Les particules du réactif de détection peuvent être en particulier des particules de latex préparées par des moyens connus, et notamment par polymérisation en émul- sion. en suspension, en dispersion ou par précipitation à partir de monomères choisis parmi les dérivés de type vinyliques comme le styrène, les alcools, esters et éthers viny- liques. ou parmi les dérivés acryliques ; voir par exemple R. Arshady et al.. Colloid Polym. Sci., 270, pp. 17-732. 1992 ou le brevet FR 2 676 451 de la demanderesse. Ces particules, aussi bien celles du réactif de capture que celles du réactif de détection, peuvent porter des fonctions réactives telles que par exemple des groupements thiol. aminé, carbonyle ; des groupements acide carboxylique ou dérivés d'acide carboxylique (chlorure d'acide, anhydride, ester) ; des groupements hydroxyles ou leurs dérivés comme les tosylates ou mésylates ; des groupements halogènes ; des doubles liaisons activées comme les liaisons divinylsulfone.
La liaison entre les particules et l'entité de capture ou de détection peut être de nature covalente ou non covalente.
De nombreuses méthodes pour le couplage covalent avec des particules sont disponibles ; voir par exemple "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", Wong S. S., CRC press. Boca Raton. 1991 ou "Bioconjugale techniques ", Hermanson G.T., Académie Press. San Diego. 1996 ou le brevet de la demanderesse FR 96 03412.
Pour une fixation non covalente. on peut utiliser tous moyens connus fondés par exemple sur les phénomènes d'affinité, notamment entre molécules biologiques, comme l'affinité antigène-anticorps ou les hybridations d'acides nucléiques complé- mentaires ; voir par exemple Andrade J.D. et al, Clinical Materials. 1 1. pp. 7-84, 1992.
On peut également utiliser d'autres interactions de type ligand/antiligand comme l'interaction biotine/streptavidine ou anticorps/haptène. A titre d'exemple, on peut utiliser une particule sur laquelle est fixée de la streptavidine et une entité comme un oligonucléotide sur lequel est fixée de la biotine ; voir par exemple les demandes de brevet WO 96/19729 ou WO 94/29723 de la demanderesse pour les différentes méthodes de fixation entre un oligonucléotide ou un haptène et la biotine. Un autre exemple
est l'utilisation d'une particule sur laquelle est fixée un oligonucléotide oligo-dT et d'une entité sur laquelle est greffée oligonucléotide oligo-dA.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, les particules du réactif de détection sont non marquées. La détection de l'analyte s'effectue par une mesure physi- que qui est fonction de la taille des particules. Une telle mesure est possible dans le cas de la présente invention. En effet, les particules du réactif de détection étant au moins
5 fois plus grosses que les particules de capture, lesdites particules de capture n'interfèrent pas dans cette mesure. Il est notamment possible, comme démontré dans les exemples ci-après, de détecter l'analyte par la mesure de la taille des particules de détection, en présence des particules de capture, sans affecter la sensibilité de la mesure.
En outre, le mode opératoire est simplifié puisque l'étape de séparation des particules de capture et des particules de détection peut être omise.
Dans un deuxième mode de réalisation de l'invention, les particules du réactif de détection sont marquées par un traceur. Par traceur on entend une molécule générant un signal détectable. Une liste non limitative de ces traceurs suit :
- les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ;
- les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants ; - les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité. l'impédance, ou celles mesurées par ampérométrie ou voltamétrie ;
- les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface ou l'ellipsométrie. ou des méthodes physiques comme la microscopie de force atomique ou à effet tunnel :
- les molécules radioactives comme le ^?, le J$S ou le '--M.
De préférence, le traceur est un composé fluorescent de faible encombrement stérique comme la fluorescéine, le dansyl. un chromophore du type IR (Li-COR Inc. Lincoln NE, USA). CY5 et CY3 (Randolph J.B. and al. Nucleic Acids Res.. 25( 14). pp. 923-2929, 1997) ou leurs dérivés. L'expression "composé de faible encombrement stérique" désigne ici un composé ayant une masse molaire inférieure à 1000.
Généralement, les particules du réactif de détection ne sont pas magnétiques.
Un autre objet de la présente invention est un procédé pour détecter un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide. Ce procédé peut être mis en œuvre notamment en utilisant un nécessaire tel que décrit précédemment. Il s'agit d'un procédé dans lequel on met en contact l'échantillon liquide avec un réactif de capture et avec un réactif de dé- tection tels que définis précédemment. On immobilise le réactif de capture sur un support solide et on détermine la présence ou la quantité de réactif de détection lié au support solide par l'intermédiaire d'un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection. Une caractéristique de ce procédé est que lesdites particules du second type ont une taille au moins 5 fois supérieure à la taille des particules du premier type.
L'invention concerne donc un procédé de détection ou de dosage d'un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide. dans lequel on met en contact l'échantillon avec un réactif de capture comprenant un premier type de particules de même taille, dites particules de capture, ledit réac- tif de capture étant capable de se fixer spécifiquement audit analyte. et avec un réactif de détection comprenant un deuxième type de particules de même taille, dites particules de détection, ledit réactif de détection étant capable de se fixer spécifiquement audit analyte sans compétition avec le réactif de capture, de façon à former, lorsque l'analyte est présent, un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection. ledit réactif de capture étant immobilisable sur un support solide tandis que le réactif de détection n'est pas immobilisable sur ledit support solide, sauf lorsqu'il est engagé dans un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection. dans lequel on immobilise sur ledit support solide le réactif de capture et/ou les complexes dans lesquels le réactif de capture est engagé. dans lequel on détecte la présence ou la quantité de réactif de détection immobilisé sur le support solide par l'intermédiaire dudit complexe. et dans lequel lesdites particules du second type ont une taille au moins 5 fois supérieure à la taille des particules du premier type.
Le réactif de détection peut être ajouté à l'échantillon étudié soit avant, soit après l'étape d'immobilisation sur le support solide.
Dans un mode particulier de réalisation du procédé, on met en contact l'échantillon liquide avec l'entité de capture et l'entité de détection pour former un premier
complexe. puis on met en contact ce premier complexe avec les particules de capture et les particules de détection pour former un deuxième complexe, type réactif de capture / analyte / réactif de détection, on immobilise sur un support solide les particules de capture et les complexes éventuellement formés avec elles, on effectue au moins un lavage du support solide de façon à éliminer les particules de détection non immobilisées sur le support solide par l'intermédiaire dudit deuxième complexe, et l'on détecte la présence ou l'on mesure la quantité, de l'analyte en déterminant la présence ou la quantité de particules du réactif de détection fixées sur le support solide par l'intermédiaire du deuxième complexe. L'immobilisation du complexe sur le support solide s'effectue notamment par aimantation si la particule du réactif de capture est une particule magnétique, mais d'autres méthodes comme la filtration ou les techniques d'affinité sont aussi utilisables.
Lorsque l'analyte est présent, une partie du réactif de détection est engagée dans la formation de complexes du type réactif de capture / analyte / réactif de détec- tion, tandis que l'excédent de réactif de détection, n'ayant pas réagi pour former un complexe, peut être également présent sur le support solide, mais peut être éliminé en effectuant au moins un lavage du support solide. Les particules du réactif de détection sont évidemment choisies de façon qu'elles n'aient aucune affinité particulière pour le support solide. II est possible de déterminer, par des expériences de routine, des conditions de lavage du support solide qui permettent d'éliminer le réactif de détection non lié à l'analyte, tandis que le réactif de détection lié à l'analyte. lui-même lié au support par l'intermédiaire du réactif de capture, n'est pas éliminé.
L'étape de détection, qui désigne ici aussi bien la détection de la présence que la mesure de la quantité d'analyte dans l'échantillon, est fondée, de façon connue en soi, sur la détermination de la présence ou de la quantité de particules de détection qui se sont fixées sur l'analyte et qui ont donc été immobilisées sur le support solide. Mais cette détermination peut être faite indirectement en déterminant la quantité de particules de détection qui n'ont pas été immobilisées sur le support solide. D'une façon générale, l'étape de détection du réactif de détection peut être effectuée en présence ou en l'absence du réactif de capture.
Si les particules du réactif de détection sont non marquées, l'étape de détection est mise en œuvre à l'aide d'une méthode permettant de mesurer la taille des particules ou d'une méthode fournissant une mesure liée à la taille des particules, comme la turbi- dimétrie. la néphélémétrie ou la microscopie optique. Compte tenu de la différence de tailles entre les particules de détection et les particules de capture, la présence de ces dernières n'est pas gênante pour l'étape de détection. Il n'est donc pas nécessaire de séparer les deux types de particules avant l'étape de détection.
Les particules du réactif de détection peuvent aussi être marquées, par exemple avec un fluorophore. La détection s'effectue dans ce cas par mesure de la fluorescence. Avantageusement, la méthode de détection est une méthode optique.
Dans un autre mode particulier de réalisation du procédé, on met en contact l'échantillon liquide avec l'entité de capture et l'entité de détection pour former un premier complexe du type entité de capture / analyte / entité de détection (si l'analyte est présent), puis avec les particules de capture et les particules de détection (on obtient alors, si l'analyte est présent, un complexe du type particule de capture / entité de capture / analyte / entité de détection / particule de détection, c'est-à-dire un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection) on immobilise sur un support solide les particules de capture et/ou les complexes formés avec elles, on élimine par lavage l'excédent de réactif de détection non fixé au support solide par l'intermédiaire d'un complexe du type réactif de capture / analyte / réactif de détection, et on détecte la présence ou la quantité de l'analyte par détermination de la présence ou de la quantité de particules du réactif de détection qui sont restées fixées sur le support solide.
Selon un autre mode de réalisation, on ajoute à l'échantillon liquide l'entité de capture et les particules de capture, et on n'ajoute l'entité de détection et/ou les particules de détection qu'après l'étape d'immobilisation sur un support solide des particules de capture et/ou des complexes formés avec celles-ci. Par exemple, on peut d'abord mettre en présence le premier complexe du type entité de capture / analyte / entité de détection avec les particules de capture pour former un deuxième complexe du type réactif de capture / analyte / entité de détection, et l'immobilisation peut alors être effectuée avant d'ajouter les particules de détection.
Avantageusement. l'on ajoute 20 fois moins et préférentiellement 100 fois moins de particules de détection que de particules de capture, ce qui permet de diminuer le bruit de fond sans affecter la sensibilité.
La détection peut être effectuée directement sur le support solide lorsque la méthode de détection choisie le permet. Dans d'autres modes de réalisation, le complexe final immobilisé sur le support solide peut être détaché du support solide, après le lavage destiné à éliminer le réactif de détection "libre", c'est-à-dire non engagé dans la formation d'un complexe. On effectue alors la détection, par exemple, sur une suspension liquide contenant le complexe ainsi séparé du support solide. Dans un autre mode de réalisation, le complexe est dissocié alors qu'il est immobilisé sur le support solide et seules les particules du réactif de détection sont dosées après élution.
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisée une particule de capture pour une utilisation dans des tests diagnos- tiques et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels ou de synthèse, modifiés ou non chimiquement peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que le dextran ou des matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, ou à base de dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose : des polymères tels que polychlorures de vinyle. polyéthylènes, polystyrènes, polyacryla- tes, polyamides, ou des copolymères à base de monomères du type styrène, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène. diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (comme l'acrylonitrile) ; des copolymères chlorure de vinyle/propylène, chlorure de vinyle/acétate de vinyle ; des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux inorganiques tels que la silice, le quartz des verres, des céramiques. Ces matériaux peuvent être sous la forme de puits, tubes, plaques comme les biopuces (voir par exemple G. Ramsay. Nature Biotechnology. 16. pp. 0- 44, 1998; F. Ginot. Human Mutation, 10, pp. -10. 1997 ; J. Cheng et al. Molecular dia- gnosis. 1 (3), pp. 83-200, 1996 : T. Livache et al, Nucleic Acids Research. 22(15), pp. 915-2921, 1994 ; J. Cheng et al. Nature Biotechnology, 16, pp. 41 -546, 1998), consommables jetables ou réutilisables (voir par exemple FR 2 749 663 de la demanderesse).
Les exemples suivants illustrent l'invention. Dans ces exemples :
- la Figure 1 représente la densité optique (DO) mesurée à l'issue du test de l'exemple 1. en fonction du nombre de copies de cible nucléotidique HIV (zéro, 108 et 10 copies par ml) ;
- la Figure 2 représente la densité optique mesurée à l'issue du test de l'exem- pie 2. en fonction du nombre de copies de cible nucléotidique HIV ;
- la Figure 3 représente le nombre de particules de latex, mesuré à l'issue du test de l'exemple 3, par unité de surface, en fonction du nombre de copies de cible nucléotidique HIV ;
- la Figure 4 représente la densité optique mesurée à l'issue du test de l'exem- pie 4. en fonction du nombre de copies de cible nucléotidique HIV ;
- et la Figure 5 représente le nombre de particules de latex, mesuré à l'issue du test de l'exemple 5, par unité de surface, en fonction du nombre de molécules d'anticorps (cible) par essai.
EXEMPLES
Exemple 1 :
Fabrication des conjugués particules magnétiques-oligo pT/Oligo HIV-pA
20 μl (soit 2.9.10" particules) de particules magnétiques-oligo pT (Microbeads oligo(dT). Miltenyi Biotec GmbH. Allemagne ; réf. 751 -21 ) d'une taille de 0.05 μm mis en présence de 9,6 μl d'une solution d'oligonucléotides HIV-pA représenté par la SEQ ID N°l (à 0.68 nmole/ml, soit 4.1012 copies) et de 20 μl de tampon SSPE (NaCl 0.9 M, Phosphate 0.06 M, EDTA 6 mM. pH 7.4. Triton® XI 00 0,05 %, lait 3 %). Ce tampon sera appelé dans la suite de la description SSPE + Triton® + lait. L'incubation a lieu du- rant 1 h à 37°C. Les conjugués sont ensuite purifiés sur les colonnes de séparation MACS type M (Miltenyi Biotec, GmbH. Allemagne), puis repris dans 200 μl en tampon SSPE + Triton® + lait.
Fabrication des conjugués latex-avidine/OIigo HIV-biotine 32 μl (soit 9.6.109 particules) de latex-avidine Pandex (Fluoricon. Pandex.
USA. taille de 0.82 μm. taux de solide = 5 % ; réf. 31 -040-2) sont mis en présence de
23 μl d'une solution d'oligonucléotides HIV -biotine (216 nmole/ml, SEQ ID N°2, marquée par la biotine en 5" par synthèse sur phase solide au phosphoramidite) diluée au l/1000eme (soit 3.1012 copies), et de 45 μl de PBS (tampon phosphate 50 mM. NaCl 0.15 M, pH 7.4, Tween® 20 0.05 %, albumine de sérum de bœuf 0.1 %). Ce tampon sera appelé dans la suite de la description : PBS + Tween + BSA/*. L'incubation a lieu durant 1 h à 37°C. Les conjugués sont ensuite purifiés par 2 centrifugations (7 min à 9000 rpm), puis repris dans 32 μl de tampon SSPE + Triton + lait.
Capture des cibles HIV 25 μl de conjugué particules magnétiques oligo-pT/oligo HIV-pA (7,2.101 particules), 4 microlitres de conjugué latex avidine/oligo HIV-biotine (1,2.109 particules) sont mis en présence de 0, 107, ou 1010 copies de cible HIV par ml (cible synthétique de séquence SEQ ID N° 3). Le volume total est ajusté à 1 ml par le tampon SSPE + Triton + lait. L'incubation a lieu durant 1 h à 37°C. Les complexes sont ensuite purifiés sur les colonnes de séparation MACS type M, puis élues par 100 μl d'une solution de NaOH 0,6 N. Ce procédé permet de déshybrider les complexes : seules les particules de latex spécifiques de la double réaction d'hybridation sont relarguées des colonnes.
Dosage turbiditnétrique La densité optique des solutions est mesurée à 410 nm à l'aide d'un spectro- photomètre. Les résultats sont représentés sur la Figure 1 avec en abscisse le nombre de copies de cible par ml et en ordonnée la densité optique à 410 nm. Le seuil de sensibilité se situe à 10 copies HIV/ml.
Exemple 2 :
Synthèse des conjugués latex-anticorps antiperoxydase
9 μl d'une solution d'anticorps monoclonal antiperoxydase (P6-38. solution commerciale à 3 mg/ml. Sigma. USA) sont dilués dans 300 μl de tampon phosphate 10 mM, pH = 6.8. 1 ,3 mg de N-hydroxy sulfosuccinimide (NHSS) et 0.05 mg de EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide) sont ajoutés. 60 μl de latex carboxylique (Bangs Laboratories Inc.. USA. taille de 0.85 μm, taux de solide = 10.1 % ; réf. PC03N) sont ensuite mis en présence des anticorps et on fait incuber
durant 1 h à 37°C. 500 μl de PBS + Tween 0.1 % + BSA 0,1 % sont ensuite ajoutés puis incubés durant 30 minutes à 37°C. Les solutions sont purifiées par 2 cycles de centrifu- gation (7 min à 8000 rpm) puis reprises dans 1 ml du même tampon et sont finalement stockées à + 4°C (volume de reprise final = 60 μl).
Hybridation des cibles en solution et capture sur particules 10 copies d'oligonucléotides HIV-biotine et 10 copies d'oligonucléotides HIV-HRP (de séquence SEQ ID N° 4) marquée par la peroxydase (HRP) selon la méthode décrite dans la demande de brevet WO 91/19812, en présence de concentrations croissantes en cible HIV de séquence SEQ ID N° 3 (0 à lθ'° copies), sont diluées dans 1 ml de tampon SSPE + Triton + lait et incubées durant 1 h à 37°C.
On ajoute ensuite, à cette solution, 1 μl soit 7.108 particules-streptavidine (Im- municon Corp., USA, streptavidin ferrofluide. diamètre de 0,145 μm +/- 0,020 μm donné par le fabricant ; réf. F3106) et 4 μl (soit 1,2.109 particules) de conjugués latex- anticorps antiperoxydase décrits ci-dessus, et le mélange est incubé durant 1 h à 37°C.
Pour vérification, le diamètre des particules est mesuré dans nos conditions de référence par diffusion de lumière à 20°C, à l'aide d'un granulomètre Malvern, modèle Zetasizer 3000Hs et les valeurs trouvées, mesurées sur deux lots différents sont respectivement de 0,146 et 0.152 μm. A l'issue de ces incubations, les solutions sont purifiées par aimantation sur des aimants permanents durant 30 min. L'opération est renouvelée une fois après reprise des complexes dans 1 ml de tampon SSPE + Triton. La reprise finale s'effectue dans 200 μl de tampon SSPE + Triton et la densité optique des complexes est mesurée par spectro- photométrie. Les résultats sont représentés sur la Figure 2. Le nombre de particules de latex, lié à la présence des cibles en solution, diminue dans un premier temps de 0 à 108 copies/ml. avant d'augmenter en fonction de la concentration de cible en solution.
La diminution du nombre des particules de latex (particules du réactif de détection qui mesurent la quantité de cible) pour les plus faibles concentrations en cible, est due à une perte des complexes au cours des étapes d'aimantation-lavage lorsque les complexes sont peu magnétiques, du fait du faible nombre de conjugués particules magnétiques streptavidine/oligo HIV-biotine liées à leur surface par l'intermédiaire des ci-
bles HIV. Néanmoins, cet aspect de la courbe est très reproductible et des mesures statistiques permettent de montrer que la limite de détection de ce dosage se situe à 5.106 copies/ml par évaluation de la pente à l'origine de la courbe représentative, même si cette pente est négative.
Exemple 3 :
La synthèse des conjugués latex-anticorps antiperoxydase est décrite dans l'exemple 2.
Hybridation des cibles en solution et capture sur particules.
1012 copies d'oligo HIV-biotine et 1012 copies d'oligo HIV-HRP, en présence de concentrations croissantes en cible HIV (0 à 10 copies), sont diluées dans 1 ml de tampon SSPE + Triton + lait et incubées durant 1 h à 37°C.
On ajoute ensuite 1 μl (soit 7.10 particules) de particules-streptavidine décrites dans l'exemple 2 (Immunicon Corp., USA) qui sont incubés durant 1 h à 37°C.
A l'issue de ces incubations, les solutions sont concentrées par aimantation sur des aimants permanents NdFeB (BLS Magnet. France) durant 30 min. Les conjugués sont repris dans 10 μl de tampon SSPE + Triton. On ajoute ensuite 4 μl de la solution de latex-anticorps antiperoxydase décrit dans l'exemple 2. dilué au centième (soit 1,2.10 particules). L'incubation a lieu durant 1 h à 37°C.
A l'issue de ces incubations, les solutions sont purifiées (élimination de l'excès de complexe latex / anticorps anti-peroxydase) par aimantation sur des aimants permanents durant 30 min. L'opération est renouvelée une fois après reprise des complexes par 20 μl de tampon SSPE + Triton. La reprise finale s'effectue dans 5 μl d'éthylèneglycol. Les solutions sont ensuite déposées entre lame et lamelle. Le nombre de particules de latex par unité de surface est évalué par comptage sous microscope optique grâce à une grille calibrée (objectif : x 40).
Les résultats sont représentés sur la Figure 3 avec en abscisse le nombre de copies de cible HIV par ml et en ordonnée le nombre de particules de latex par micromètre carré.
La densité surfacique des latex augmente en fonction de la concentration en cible dans le milieu dès 106 copies/ml. Par rapport à l'exemple 2. la sensibilité est amélio-
rée, avec un signal croissant pour des quantités de cible croissantes, ce qui simplifie le processus de détection.
Exemple 4 : Formation des conjugués latex avidine-oligo HIV-biotine
32 μl. soit 9.6.10 particules de latex-avidine décrites dans l'exemple 1 (Pandex, USA) sont mis en présence de 23 μl d'oligo HIV-biotine (dilution 1/1000) soit 3.1012 copies, et de 45 μl de PBS + Tween 0.05 % + BSA 0.1 %. L'incubation a lieu durant 1 h à 37°C. Les conjugués sont ensuite purifiés par 2 centrifugations (7 min. à 9000 rpm), puis repris dans 32 μl de tampon SSPE + Triton + lait.
Hybridation des cibles en solution et capture sur particules
10 copies d'oligo HIV-pA sont incubées en présence de concentrations croissantes en cible HIV (0 à 1010 copies) dans 1 ml de tampon SSPE + Triton + lait durant l h à 37°C.
On ajoute ensuite 5 μl soit 7,2.1010 particules magnétiques-oligo pT décrites dans l'exemple 1 (Miltenyi Biotec GmbH. Allemagne) et 4 μl (soit 1,2.10 particules) de conjugués latex-avidine/oligo HIV-biotine qui sont incubés durant 1 h à 37°C.
Les complexes sont ensuite purifiés sur les colonnes de séparation MACS type M. puis élues par 100 μl d'une solution de NaOH 0.6N.
Dosage turbidimétrique
La densité optique des solutions est mesurée à 410 nm sur un spectrophotomè- tre. Les résultats sont représentés sur la Figure 4 avec en abscisse le nombre de copies de la cible par ml et en ordonnée la densité optique.
Le seuil de détection de ce dosage se situe en deçà de 107 copies de la cible HIV par ml. Il se révèle ainsi plus sensible que le dosage décrit dans l'exemple 1. où les conjugués particules magnétiques-oligo pT/oligo HIV-pA étaient préparés et purifiés avant ajout de la cible : la préhybridation des oligonucléotides seuls est plus favorable.
Exemple 5 :
Biotinylation des anticorps anti-TSH
10 mg d'anticorps monoclonal anti-TSH (anticorps de souris, commercialisés par bioMerieux S.A.. France, 6 mg/ml) sont dialyses en tampon PBS. On dissout 1 mg de biotine-LC-NHS (Pierce Technology Corp., USA) dans 1 ml de DMF. On ajoute
40 μl de la solution de biotine à la solution d'anticorps, puis on laisse incuber durant 1 h à 37°C. Les anticorps biotinylés sont ensuite purifiés par dialyse en PBS.
Capture des anticorps anti-TSH biotinylés Des concentrations croissantes d'anticorps biotinylés (0 à 10 molécules) sont mises en présence de 2.2 μl. soit 10 particules-streptavidine de l'exemple 2 (Immuni- con Corp., USA) et de 2.2 μl (5.107 particules) de conjugués latex polystyrène car- boxylique/anticorps de chèvre anti-souris (Polyscience. Inc., USA, diamètre de 1 μm, taux de solide = 1 % ; réf. 17694). L'incubation a lieu durant 1 h à 37°C dans 50 μl de PBS + Tween 0, 1 % + BSA 0, 1 %.
Les complexes sont ensuite séparés par aimantation, lavés puis repris dans 10 μl. Ils sont déposés sur une lame de verre, séchés, puis observés sous microscope optique. La concentration des particules par unité de surface est évaluée grâce à une grille de calibration. Les résultats sont représentés sur la Figure 5 avec en abscisse le nombre de molécules d'anticorps (dans les 50 microlitres de solution testée) et en ordonnée le nombre de particules de latex par unité de surface arbitraire.
Une augmentation de la densité surfacique des particules de latex est visible dès 10' molécules d'anticorps par test.
Exemple 6 :
Influence de la taille des particules sur le bruit de fond et la sensibilité de détection.
Différents ratios D|at / Dmao entre les tailles des 2 types de particules ont été testés.
Diat / Dma2 est défini comme le rapport entre le diamètre de la particule du réactif de détection D|at et le diamètre de la particule du réactif de capture Dmag-
Dans cet exemple, les particules du réactif de détection sont magnétiques et les particules du réactif de capture sont des latex.
Particules magnétiques du réactif de capture :
* (D) : Dynal streptavidine. diamètre de 2,8 μm (réf. M280) * (S) : Seradyn dT14. diamètre de 1 μm (réf. MG-OL)
* (I) : Immunicon streptavidine. diamètre de 0.145 μm (décrites dans l'exemple 2)
* (M) : Miltenyi dT. diamètre de 0.05 μm (décrites dans l'exemple 1)
Particules non magnétiques du réactif de détection : * (B) : Bangs anticoφs antiperoxydase. diamètre de 0.85 μm (décrites dans l'exemple 2)
* (P) : Pandex avidine, diamètre de 0,82 μm (décrites dans l'exemple 1)
* (PS) : Polysciences anticoφs de chèvre antisouris, diamètre de 1 μm (décrites dans l'exemple 5)
Les résultats sont résumés dans le tableau suivant :
(§) la sensibilité S du test est donnée sous forme de fourchette pour prendre en compte les variations expérimentales.
(*) le numéro des protocoles correspond aux protocoles décrits dans les exemples ci- dessus. Les protocoles 3 , 4 et 5 correspondent respectivement aux protocoles des exemples 3, 4 et 5. Les protocoles 3' et 4' correspondent respectivement aux protocoles des exemple 3 et 4, modifiés de la façon suivante : on effectue la détection par dosage turbidimétrique à 410 nm, après déshybridation des complexes particule magnétique/latex non magnétique par lavage avec une solution de NaOH 0,6M.
Le tableau ci-dessus fait clairement apparaître la nécessité d'utiliser des particules du réactif de capture dont la taille est inférieure à celle des particules du réactif de détection pour obtenir une bonne sensibilité, et ce quel que soit l'analyte à doser ou le protocole utilisé.