JP4087200B2 - 粒子複合体及び該粒子複合体の作製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質と反応し得る反応物質を表面に有する第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備えた粒子複合体、及び該粒子複合体の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
標的遺伝子の発現、変異、多型性等の解析の際には、標的遺伝子と相補的な塩基配列を有するプローブが固定された固体支持体が使用される。標的遺伝子の解析は、例えば、プローブが固体された固体支持体と標的遺伝子を含む液体試料とを接触させた後、プローブと標的遺伝子とのハイブリダイズの有無を検出することによって行われる。この際、プローブを固定する固体支持体として粒子を使用し、標的遺伝子を含む液体試料中に、プローブが固定された粒子を分散させることによって、標的遺伝子とプローブとの反応効率を向上させることができる。
【０００３】
それぞれ異なる種類のプローブが固定された複数の粒子を利用し、１つの液体試料中において、標的遺伝子とプローブとの複数種類の反応を並行して行なうことができれば、ハイスループットスクリーニング等のハイスループット解析が可能となるが、このようなハイスループット解析を実現するためには、各粒子に固定されたプローブの種類を識別することが必要となる。
【０００４】
例えば、蛍光標識したナノ粒子をプローブが固定されたミクロ粒子の表面に結合させた複合粒子が開発されており（特許文献１）、この複合粒子を利用すれば、ミクロ粒子の表面に固定されたプローブの種類をナノ粒子の蛍光標識に基づいて識別できる。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００２−５０１１８４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ミクロ粒子の表面のうち、プローブを結合させる領域と、蛍光標識したナノ粒子を結合させる領域とを制御することは困難である。したがって、図３に示すように、ミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰが、ミクロ粒子ＭＢの表面に結合させたナノ粒子ＮＢに覆われ、ナノ粒子ＮＢが立体障害となってミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰと標的遺伝子Ｔとの反応効率が低下するおそれがある。これでは、プローブを固定する固体支持体として粒子を使用する意義が損なわれてしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、第一に、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備え、標的物質を含む液体試料中に分散可能な粒子複合体であって、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止した粒子複合体を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、上記粒子複合体を効率よく作製できる粒子複合体の作製方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の粒子複合体及び該粒子複合体の作製方法を提供する。
（１）標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とが、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする粒子複合体。
（２）前記固体支持体の表面に、前記第一の粒子及び前記第二の粒子がそれぞれ複数個固定されていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（３）前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１以上であることを特徴とする前記（２）記載の粒子複合体。
（４）前記反応物質の種類と、前記標識物質による標識とが対応付けられていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（５）それぞれ異なる種類の標識物質で標識された複数個の第二の粒子が前記固体支持体の表面に固定されており、前記反応物質の種類と前記異なる種類の標識物質の組み合わせ及び／又は量比とが対応付けられていることを特徴とする前記（４）記載の粒子複合体。
（６）前記第一の粒子、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
【０００９】
（７）前記固体支持体は磁性を有さず、前記第一の粒子又は前記第二の粒子のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（６）記載の粒子複合体。
（８）前記標識物質が蛍光物質であり、前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１よりも大きく、前記第一の粒子が光透過性を有することを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（９）前記第一の粒子は磁性を有さず、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（８）記載の粒子複合体。
（１０）前記固体支持体は磁性を有さず、前記第二の粒子が磁性を有することを特徴とする前記（９）記載の粒子複合体。
（１１）前記固体支持体が、粒子又は細長形状部材の切断片であることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（１２）前記第一の粒子及び第二の粒子が、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
【００１０】
（１３）前記反応物質が、生体関連物質であることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（１４）前記生体関連物質が、核酸又はタンパク質であることを特徴とする前記（１３）記載の粒子複合体。
（１５）標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを固体支持体の表面の所定領域に固定し、前記領域の一部又は全部を含む微小片であって、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な前記微小片を前記固体支持体から切り出すことを特徴とする粒子複合体の作製方法。
（１６）前記固体支持体が、細長形状部材であることを特徴とする前記（１５）記載の作製方法。
（１７）前記第一の粒子と前記第二の粒子とを前記細長形状部材の表面全体に固定した後、前記細長形状部材を複数の微小片に切断することを特徴とする前記（１６）記載の作製方法。
（１８）前記第一の粒子及び第二の粒子を、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定することを特徴とする前記（１５）記載の作製方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の粒子複合体及び粒子複合体の作製方法について詳細に説明する。
本発明の粒子複合体においては、第一の粒子と、第二の粒子とが、液体試料中に分散可能な固体支持体の表面に固定されている。
【００１２】
「粒子」とは、表面に反応物質、標識物質等を固定できる微小な三次元構造体を意味し、その形状、サイズ等は特に限定されるものではない。粒子の形状は、例えば球形であり、好ましい粒径は、直径約０．１μｍ〜約１００μｍである。
【００１３】
粒子の材質は、液体試料に対して不溶性の材質であり、液体試料の溶媒の種類等に応じて適宜選択できる。粒子の材質としては、例えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類又はアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等のビニル系単量体の１種以上を重合して得られるポリマー；アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体；ガラス、セラミックス等の無機材料；鉄、シリコン等の金属；これらの複合材料等が挙げられる。粒子は非膨潤性であることが好ましいが、膨潤性であってもよい。粒子表面は多孔質であっても無孔質であってもよいが、粒子表面が多孔質である場合には無孔質である場合よりも多くの反応物質、標識物質等を固定できる。
【００１４】
「固体支持体」とは、表面に第一の粒子及び第二の粒子を固定できる三次元構造体を意味し、その形状、サイズ等は、液体試料中に分散可能である限り特に限定されるものではない。
【００１５】
固体支持体の材質は、液体試料に対して不溶性の材質であり、液体試料の溶媒の種類等に応じて適宜選択できる。固体支持体の材質としては、例えば、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオライド等）、金属（例えば、鉄、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、コバルト、シリコン等）、ガラス、セラミックス、これらの複合材料等が挙げられる。固体支持体は非膨潤性であることが好ましいが、膨潤性であってもよい。固体支持体表面は多孔質であっても無孔質であってもよいが、固体支持体表面が多孔質である場合には無孔質である場合よりも多くの粒子を固体支持体表面に固定できる。
【００１６】
液体試料中に分散可能な固体支持体としては、例えば、粒子、細長形状部材の切断片等が挙げられる。細長形状部材としては、例えば、糸状、紐状、棒状、テープ状等の部材が挙げられる。固体支持体が粒子である場合、好ましい粒径は、直径約１０μｍ〜約１０００μｍであり、固体支持体が細長形状部材の切断片である場合、好ましい切断片長は、約１０μｍ〜約２０００μｍである。
【００１７】
「固体支持体の表面」とは、液体試料と接触し得る面を意味し、固体支持体の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体試料が浸潤し得る固体支持体の内面（内部表面）（例えば、固体支持体が有する細孔の内部表面）も含まれる。
【００１８】
固体支持体の表面に固定される第一の粒子及び第二の粒子の個数は特に限定されるものではなく、それぞれ１個であっても複数個であってもよいが、それぞれ複数個であることが好ましい。固体支持体に第一の粒子が複数個固定される場合、反応物質の種類は粒子間又は粒子群間で異なっていてもよいし、同一であってもよい。また、固体支持体に第二の粒子が複数個固定される場合、標識物質による標識の種類（例えば、標識物質の組み合わせや量比）は粒子間又は粒子群間で異なっていてもよいし、同一であってもよい。
【００１９】
固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定できるように、固体支持体の大きさは第一の粒子及び第二の粒子の大きさよりも大きいことが好ましい。
【００２０】
固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定する場合、第二の粒子が第一の粒子を覆い、第二の粒子が立体障害となって、標的物質と反応物質との反応効率が低下する可能性があるが、図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、第二の粒子が立体障害となり難くなり、標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できる。すなわち、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径よりも小さい場合（図１（ａ））よりも、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径と同程度である場合（図１（ｂ））の方が上記反応効率の低下を効果的に防止でき、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径よりも大きい場合（図１（ｃ））の方が上記反応効率の低下をさらに効果的に防止できる。なお、図１中、１は第一の粒子、２は第二の粒子、３は固体支持体、Ｒは反応物質を示す。
【００２１】
したがって、固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定する場合には、標的物質と反応物質との反応効率の低下を防止する点から、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるように、第一の粒子の粒径及び第二の粒子の粒径を設定することが好ましく、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比は、好ましくは１以上であり、さらに好ましくは２以上である。
【００２２】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましい。例えば、水酸化鉄、酸化鉄水和物、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４等の磁性体を粒子又は固体支持体に含有させることにより、粒子又は固体支持体に磁性を付与できる。第一の粒子、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有する場合、磁力を作用させることにより本発明の粒子複合体の挙動を容易に制御できるので、本発明の粒子複合体を利用した標的物質の解析の自動化を容易に実現できる。
【００２３】
粒子又は固体支持体に磁性体を含有させる場合、粒子又は固体支持体の表面の化学修飾が不十分となり、第一の粒子への反応物質の固定効率、第二の粒子への標識物質の固定効率、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率が低下する可能性がある。第一の粒子及び第二の粒子においては、各粒子における反応物質又は標識物質の固定効率が低下しても、固体支持体に固定する粒子数を増加させることにより、各粒子における固定効率の低下を補うことができるが、固体支持体においては第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を補うことは困難である。したがって、固体支持体には磁性体を含有させず、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止することが好ましい。すなわち、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止する点から、固体支持体は磁性を有さず、第一の粒子又は第二の粒子のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましい。
【００２４】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子の表面には、標的物質と反応し得る反応物質が固定されている。
【００２５】
「第一の粒子の表面」とは、液体試料と接触し得る面を意味し、粒子の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体試料が浸潤し得る粒子の内面（内部表面）（例えば、粒子が有する細孔の内部表面）も含まれる。
【００２６】
「標的物質」とは、検出、分離、解析等の対象となる物質を意味し、本発明の粒子複合体を用いて行なう試験、検査、解析等の目的に応じて、構造や機能等が公知の物質又は未知の物質が適宜選択される。標的物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体関連物質が挙げられる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの他、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸の塩基長は特に限定されるものではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのいずれであってもよい。また、核酸は一本鎖及び二本鎖のいずれの状態であってもよく、これらの混合状態であってもよい。
【００２７】
「反応物質」とは、標的物質と反応し得る物質を意味し、本発明の粒子複合体を用いて行なう試験、検査、解析等の目的に応じて、標的物質との反応性を有する物質又は標的物質との反応性を有する可能性がある物質が適宜選択される。反応物質は、構造や機能等が公知の物質及び未知の物質のいずれであってもよい。反応物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体関連物質が挙げられる。反応物質が有する（又は有する可能性がある）標的物質との反応性はいかなる反応性であってもよく、例えば、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力、水素結合、配位結合、化学的吸着、物理的吸着等の結合様式によって標的物質と結合する性質が挙げられる。
【００２８】
標的物質と反応物質との組み合わせの具体例としては、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。
【００２９】
第一の粒子の表面に固定される反応物質の個数は特に限定されるものではないが、第一の粒子の表面に複数個の反応物質が固定されていること、すなわち、第一の粒子の表面に反応物質が集積化されていることが好ましい。第一の粒子の表面に複数個の反応物質が固定されている場合、反応物質の種類は同一であっても異なっていてもよいが、通常は同一である。
【００３０】
本発明の粒子複合体において、第二の粒子は、標識物質で標識されている。
【００３１】
標識物質は、第二の粒子の表面に結合していてもよいし、第二の粒子の内部に埋め込まれていてもよい。
標識物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、蛍光色素（例えば、Marine Blue，Cascade Blue，Cascade Yellow，Fluorescein，Rhodamine，Phycoerythrin，CyChrome，PerCP，Texas Red，Allophycocyanin，PharRed等の他、Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy7等のCy系色素、Alexa-488，Alexa-532，Alexa-546，Alexa-633，Alexa-680等のAlexa系色素、BODIPY FL，BODIPY TR-等のBODIPY系色素）等の蛍光性物質、放射性同位元素（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ）等の放射性物質等が挙げられる。標識物質として蛍光色素を用いる場合、蛍光色素の種類と量比とを組み合わせることにより多種多様な標識が可能となる。蛍光色素が発する蛍光の検出は、例えばフローサイトメトリーを利用して行なうことができる。
【００３２】
蛍光色素による標識化は、例えば、予め表面にアミノ基を導入しておいた粒子に活性エステルを有する蛍光色素を反応させることにより、あるいは、予め表面にカルボキシル基又はアミノ基を導入しておいた粒子に、カルボキシル基との結合反応が可能な官能基（例えばアミノ基）を有する蛍光色素又はアミノ基との結合反応が可能な官能基（例えばカルボキシル基）を有する蛍光色素を、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類の存在下で反応させることにより行なうことができる。また、重合反応によって粒子を合成する際に反応液中に蛍光色素を添加しておくことにより、あるいは、ラジカル重合の重合反応の終了直後でラジカルが残存している間に当該ラジカルと反応性を有する蛍光色素を添加することにより、蛍光色素による粒子の標識化を行なうことができる。
【００３３】
本発明の粒子複合体において、反応物質の種類と標識物質による標識とを対応付けておくことにより、反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できる。それぞれ異なる種類の反応物質が固定された複数個の粒子複合体について、各粒子複合体に固定された反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できれば、標的物質と反応物質との複数種類の反応について並列して解析でき、これによってハイスループットスクリーニング等のハイスループット解析が可能となる。例えば、それぞれ異なる種類の標識物質で標識された複数個の第二の粒子が、固体支持体の表面に固定されており、反応物質の種類と、異なる種類の標識物質の組み合わせ及び／又は量比とが対応付けておくことにより、各粒子複合体に固定された反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できる。また、標識物質の組み合わせ及び／又は量比を変化させることにより、数少ない標識物質を使用する場合であっても多種多様な標識が可能となる。
【００３４】
本発明の粒子複合体において、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きく、第一の粒子が光透過性を有しない場合には、蛍光色素が発する蛍光の検出精度が低下する可能性がある。すなわち、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、第二の粒子が第一の粒子に覆われるため（図１（ｃ）参照）、第二の粒子に含まれる蛍光色素が発する蛍光が、光透過性を有しない第一の粒子によって遮光される可能性がある。したがって、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、蛍光の検出精度の低下を防止する点から、第一の粒子が光透過性を有することが好ましい。
【００３５】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子が磁性を有する場合、第一の粒子に含有される磁性体によって第一の粒子の光透過性は低下する可能性がある。したがって、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、蛍光の検出精度の低下を防止する点から、第一の粒子は磁性を有しないことが好ましい。このとき、本発明の粒子複合体の操作性を向上させる点から、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましく、さらに、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止する点から、固体支持体は磁性を有さず、第二の粒子が磁性を有することが好ましい。
【００３６】
本発明の粒子複合体において、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定、並びに第一の粒子への反応物質の固定は、種々の結合様式によって行なうことができる。結合様式の具体例としては、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合等）の形成、架橋剤による架橋等が挙げられる。これらの結合様式による固定が可能となるように、公知の技術を用いて、固体支持体表面、粒子表面又は反応物質に適当な化学修飾を施すことができる。なお、第一の粒子への反応物質の固定は、第一の粒子を固体支持体に固定する前に行なわれる。
【００３７】
ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定、並びに第一の粒子への反応物質の固定を行なうこともできる。
【００３８】
固体支持体と第一の粒子及び第二の粒子との結合様式、並びに第一の粒子と反応物質との結合様式は、結合パートナー同士（固体支持体と粒子、粒子と反応物質）が容易に離脱しない結合様式であることが好ましい。このような結合様式としては、例えば、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用、共有結合の形成、架橋剤による架橋、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーによる接着、ＵＶ照射により接着力を発揮するポリマーによる接着等が挙げられる。
【００３９】
アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用を利用する場合には、例えば、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた粒子を、ビオチンでコーティングされた固体支持体に結合させることができる。また、ビオチンを導入した反応物質（例えば、５’末端をビオチン化したプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより得られたビオチン化核酸）を、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた粒子に結合させることができる。なお、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとを逆にして、例えば、ビオチンでコーティングされた粒子をアビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合させることができる。粒子と反応物質との結合についても同様である。
【００４０】
共有結合の形成を利用する場合には、固体支持体表面、粒子表面又は反応物質に存在する官能基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、固体支持体の表面にカルボキシル基が存在する場合には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、粒子の表面に存在するアミノ基と反応させることにより、固体支持体と粒子とをアミド結合させることができる。また、固体支持体の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、粒子の表面に存在するアミノ基と反応させることにより、固体支持体と粒子とをアミド結合させることができる。粒子と反応物質との結合についても同様にして行なうことができる。なお、反応物質が核酸である場合、核酸の反応性（相補的核酸とのハイブリダイズ性）を損なわないように、核酸の５’末端又は３’末端に導入したリンカー配列を介して核酸を粒子に結合させることが好ましい。
【００４１】
架橋剤による架橋を利用する場合には、架橋対象物質が有する官能基と反応し得る種々の架橋剤を使用できる。架橋剤の具体例としては、二官能性試薬、三官能性試薬等の多官能性試薬が挙げられる。このような多官能性試薬の具体例としては、N-スクシンイミジル(4-イオードアセチル)アミノベンゾエート（N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate）（SIAB）、ジマレイミド（dimaleimide）、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸（dithio-bis-nitrobenzoic acid）（DTNB）、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate）（SATA）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate）（SPDP）、スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）（SMCC）、6-ヒドラジノニコチミド（6-hydrazinonicotimide）（HYNIC）等が挙げられる。
【００４２】
乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの接着を利用する場合、含水状態にあるポリマーを固体支持体と粒子との間に介在させ、当該ポリマーを乾燥させることにより、粒子を固体支持体の表面に容易に固定することができる。乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーとしては、例えば、タンパク質、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらのポリマーが乾燥状態を経ることにより発揮する接着力は、乾燥状態が継続する場合はもちろん、粒子が固定された固体支持体の表面に液体が浸潤する場合でも保持される。乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーは、粒子又は固体支持体のいずれが有していてもよいし、両者が有していてもよい。また、粒子又は固体支持体のいずれもが有しておらず、固体支持体へ粒子を固定する段階で付加してもよい。
【００４３】
本発明の粒子複合体においては、反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とが別個の粒子として固体支持体の表面に固定されているので、第一の粒子及び第二の粒子がそれぞれ本発明の粒子複合体の表面を構成する。すなわち、第一の粒子の表面に固定された反応物質は露出した状態にある。したがって、本発明の粒子複合体においては、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できる。本発明の粒子複合体における当該効果は、上述したように、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、大きくなる。
【００４４】
また、本発明の粒子複合体を構成する第一の粒子、第二の粒子及び固体支持体は、いずれも液体試料中に分散可能であるので、本発明の粒子複合体は全体としても液体試料中に分散可能である。したがって、本発明の粒子複合体を、標的物質を含む液体試料中に分散させることにより、標的物質と反応物質とを効率よく反応させることができる。
【００４５】
本発明の粒子複合体は、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを固体支持体の表面の所定領域に固定し、前記領域の一部又は全部を含む微小片であって、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な前記微小片を前記固体支持体から切り出すことにより効率よく作製できる。
【００４６】
特に、図２に示すように、固体支持体として糸状、紐状、棒状、テープ状等の細長形状部材を使用し、第一の粒子及び第二の粒子を細長形状部材の表面全体に固定した後、当該細長形状部材を複数の微小片に切断することによって、多数の粒子複合体を効率よく作製できる。なお、図２中、１は第一の粒子、２は第二の粒子、３ａは細長形状部材、４は微小片を示す。
【００４７】
第一の粒子及び第二の粒子を細長形状部材の表面全体に固定する際には、第一の粒子及び第二の粒子を含む液体中に細長形状部材を浸漬した後、当該液体中において又は当該液体から取り出して、所定の固定化処理を施せばよい。
【００４８】
乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの接着力を利用して固体支持体へ第一の粒子及び第二の粒子を固定する場合、含水状態にあるポリマーを乾燥させる工程が必要となるが、粒子状の固体支持体の液相中以外における取り扱いは困難であるため、ポリマーの乾燥工程の実施は困難である。これに対して、微小片に成形する前の固体支持体は、液相中以外における取り扱いも容易であるので、ポリマーの乾燥工程の実施を容易に行なうことができる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備え、標的物質を含む液体試料中に分散可能な粒子複合体であって、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止した粒子複合体が提供される。また、本発明によれば、上記粒子複合体を効率よく作製できる粒子複合体の作製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の粒子複合体において、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、第二の粒子が立体障害となり難くなり、標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できることを説明する模式図である。
【図２】細長形状部材を使用して複数の粒子複合体を作製する場合の説明図である。
【図３】蛍光標識したナノ粒子ＮＢをプローブＰが固定されたミクロ粒子ＭＢの表面に結合させた複合粒子において、ミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰが、ミクロ粒子ＭＢの表面に結合させたナノ粒子ＮＢに覆われ、ナノ粒子ＮＢが立体障害となってミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰと標的遺伝子Ｔとの反応効率が低下することを説明する模式図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質と反応し得る反応物質を表面に有する第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備えた粒子複合体、及び該粒子複合体の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
標的遺伝子の発現、変異、多型性等の解析の際には、標的遺伝子と相補的な塩基配列を有するプローブが固定された固体支持体が使用される。標的遺伝子の解析は、例えば、プローブが固体された固体支持体と標的遺伝子を含む液体試料とを接触させた後、プローブと標的遺伝子とのハイブリダイズの有無を検出することによって行われる。この際、プローブを固定する固体支持体として粒子を使用し、標的遺伝子を含む液体試料中に、プローブが固定された粒子を分散させることによって、標的遺伝子とプローブとの反応効率を向上させることができる。
【０００３】
それぞれ異なる種類のプローブが固定された複数の粒子を利用し、１つの液体試料中において、標的遺伝子とプローブとの複数種類の反応を並行して行なうことができれば、ハイスループットスクリーニング等のハイスループット解析が可能となるが、このようなハイスループット解析を実現するためには、各粒子に固定されたプローブの種類を識別することが必要となる。
【０００４】
例えば、蛍光標識したナノ粒子をプローブが固定されたミクロ粒子の表面に結合させた複合粒子が開発されており（特許文献１）、この複合粒子を利用すれば、ミクロ粒子の表面に固定されたプローブの種類をナノ粒子の蛍光標識に基づいて識別できる。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００２−５０１１８４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ミクロ粒子の表面のうち、プローブを結合させる領域と、蛍光標識したナノ粒子を結合させる領域とを制御することは困難である。したがって、図３に示すように、ミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰが、ミクロ粒子ＭＢの表面に結合させたナノ粒子ＮＢに覆われ、ナノ粒子ＮＢが立体障害となってミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰと標的遺伝子Ｔとの反応効率が低下するおそれがある。これでは、プローブを固定する固体支持体として粒子を使用する意義が損なわれてしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、第一に、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備え、標的物質を含む液体試料中に分散可能な粒子複合体であって、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止した粒子複合体を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、上記粒子複合体を効率よく作製できる粒子複合体の作製方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の粒子複合体及び該粒子複合体の作製方法を提供する。
（１）標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とが、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする粒子複合体。
（２）前記固体支持体の表面に、前記第一の粒子及び前記第二の粒子がそれぞれ複数個固定されていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（３）前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１以上であることを特徴とする前記（２）記載の粒子複合体。
（４）前記反応物質の種類と、前記標識物質による標識とが対応付けられていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（５）それぞれ異なる種類の標識物質で標識された複数個の第二の粒子が前記固体支持体の表面に固定されており、前記反応物質の種類と前記異なる種類の標識物質の組み合わせ及び／又は量比とが対応付けられていることを特徴とする前記（４）記載の粒子複合体。
（６）前記第一の粒子、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
【０００９】
（７）前記固体支持体は磁性を有さず、前記第一の粒子又は前記第二の粒子のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（６）記載の粒子複合体。
（８）前記標識物質が蛍光物質であり、前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１よりも大きく、前記第一の粒子が光透過性を有することを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（９）前記第一の粒子は磁性を有さず、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする前記（８）記載の粒子複合体。
（１０）前記固体支持体は磁性を有さず、前記第二の粒子が磁性を有することを特徴とする前記（９）記載の粒子複合体。
（１１）前記固体支持体が、粒子又は細長形状部材の切断片であることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（１２）前記第一の粒子及び第二の粒子が、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
【００１０】
（１３）前記反応物質が、生体関連物質であることを特徴とする前記（１）記載の粒子複合体。
（１４）前記生体関連物質が、核酸又はタンパク質であることを特徴とする前記（１３）記載の粒子複合体。
（１５）標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを固体支持体の表面の所定領域に固定し、前記領域の一部又は全部を含む微小片であって、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な前記微小片を前記固体支持体から切り出すことを特徴とする粒子複合体の作製方法。
（１６）前記固体支持体が、細長形状部材であることを特徴とする前記（１５）記載の作製方法。
（１７）前記第一の粒子と前記第二の粒子とを前記細長形状部材の表面全体に固定した後、前記細長形状部材を複数の微小片に切断することを特徴とする前記（１６）記載の作製方法。
（１８）前記第一の粒子及び第二の粒子を、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定することを特徴とする前記（１５）記載の作製方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の粒子複合体及び粒子複合体の作製方法について詳細に説明する。
本発明の粒子複合体においては、第一の粒子と、第二の粒子とが、液体試料中に分散可能な固体支持体の表面に固定されている。
【００１２】
「粒子」とは、表面に反応物質、標識物質等を固定できる微小な三次元構造体を意味し、その形状、サイズ等は特に限定されるものではない。粒子の形状は、例えば球形であり、好ましい粒径は、直径約０．１μｍ〜約１００μｍである。
【００１３】
粒子の材質は、液体試料に対して不溶性の材質であり、液体試料の溶媒の種類等に応じて適宜選択できる。粒子の材質としては、例えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類又はアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等のビニル系単量体の１種以上を重合して得られるポリマー；アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体；ガラス、セラミックス等の無機材料；鉄、シリコン等の金属；これらの複合材料等が挙げられる。粒子は非膨潤性であることが好ましいが、膨潤性であってもよい。粒子表面は多孔質であっても無孔質であってもよいが、粒子表面が多孔質である場合には無孔質である場合よりも多くの反応物質、標識物質等を固定できる。
【００１４】
「固体支持体」とは、表面に第一の粒子及び第二の粒子を固定できる三次元構造体を意味し、その形状、サイズ等は、液体試料中に分散可能である限り特に限定されるものではない。
【００１５】
固体支持体の材質は、液体試料に対して不溶性の材質であり、液体試料の溶媒の種類等に応じて適宜選択できる。固体支持体の材質としては、例えば、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオライド等）、金属（例えば、鉄、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、コバルト、シリコン等）、ガラス、セラミックス、これらの複合材料等が挙げられる。固体支持体は非膨潤性であることが好ましいが、膨潤性であってもよい。固体支持体表面は多孔質であっても無孔質であってもよいが、固体支持体表面が多孔質である場合には無孔質である場合よりも多くの粒子を固体支持体表面に固定できる。
【００１６】
液体試料中に分散可能な固体支持体としては、例えば、粒子、細長形状部材の切断片等が挙げられる。細長形状部材としては、例えば、糸状、紐状、棒状、テープ状等の部材が挙げられる。固体支持体が粒子である場合、好ましい粒径は、直径約１０μｍ〜約１０００μｍであり、固体支持体が細長形状部材の切断片である場合、好ましい切断片長は、約１０μｍ〜約２０００μｍである。
【００１７】
「固体支持体の表面」とは、液体試料と接触し得る面を意味し、固体支持体の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体試料が浸潤し得る固体支持体の内面（内部表面）（例えば、固体支持体が有する細孔の内部表面）も含まれる。
【００１８】
固体支持体の表面に固定される第一の粒子及び第二の粒子の個数は特に限定されるものではなく、それぞれ１個であっても複数個であってもよいが、それぞれ複数個であることが好ましい。固体支持体に第一の粒子が複数個固定される場合、反応物質の種類は粒子間又は粒子群間で異なっていてもよいし、同一であってもよい。また、固体支持体に第二の粒子が複数個固定される場合、標識物質による標識の種類（例えば、標識物質の組み合わせや量比）は粒子間又は粒子群間で異なっていてもよいし、同一であってもよい。
【００１９】
固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定できるように、固体支持体の大きさは第一の粒子及び第二の粒子の大きさよりも大きいことが好ましい。
【００２０】
固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定する場合、第二の粒子が第一の粒子を覆い、第二の粒子が立体障害となって、標的物質と反応物質との反応効率が低下する可能性があるが、図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、第二の粒子が立体障害となり難くなり、標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できる。すなわち、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径よりも小さい場合（図１（ａ））よりも、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径と同程度である場合（図１（ｂ））の方が上記反応効率の低下を効果的に防止でき、第一の粒子の粒径が第二の粒子の粒径よりも大きい場合（図１（ｃ））の方が上記反応効率の低下をさらに効果的に防止できる。なお、図１中、１は第一の粒子、２は第二の粒子、３は固体支持体、Ｒは反応物質を示す。
【００２１】
したがって、固体支持体の表面に第一の粒子及び第二の粒子をそれぞれ複数個固定する場合には、標的物質と反応物質との反応効率の低下を防止する点から、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるように、第一の粒子の粒径及び第二の粒子の粒径を設定することが好ましく、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比は、好ましくは１以上であり、さらに好ましくは２以上である。
【００２２】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましい。例えば、水酸化鉄、酸化鉄水和物、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４等の磁性体を粒子又は固体支持体に含有させることにより、粒子又は固体支持体に磁性を付与できる。第一の粒子、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有する場合、磁力を作用させることにより本発明の粒子複合体の挙動を容易に制御できるので、本発明の粒子複合体を利用した標的物質の解析の自動化を容易に実現できる。
【００２３】
粒子又は固体支持体に磁性体を含有させる場合、粒子又は固体支持体の表面の化学修飾が不十分となり、第一の粒子への反応物質の固定効率、第二の粒子への標識物質の固定効率、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率が低下する可能性がある。第一の粒子及び第二の粒子においては、各粒子における反応物質又は標識物質の固定効率が低下しても、固体支持体に固定する粒子数を増加させることにより、各粒子における固定効率の低下を補うことができるが、固体支持体においては第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を補うことは困難である。したがって、固体支持体には磁性体を含有させず、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止することが好ましい。すなわち、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止する点から、固体支持体は磁性を有さず、第一の粒子又は第二の粒子のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましい。
【００２４】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子の表面には、標的物質と反応し得る反応物質が固定されている。
【００２５】
「第一の粒子の表面」とは、液体試料と接触し得る面を意味し、粒子の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体試料が浸潤し得る粒子の内面（内部表面）（例えば、粒子が有する細孔の内部表面）も含まれる。
【００２６】
「標的物質」とは、検出、分離、解析等の対象となる物質を意味し、本発明の粒子複合体を用いて行なう試験、検査、解析等の目的に応じて、構造や機能等が公知の物質又は未知の物質が適宜選択される。標的物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体関連物質が挙げられる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの他、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸の塩基長は特に限定されるものではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのいずれであってもよい。また、核酸は一本鎖及び二本鎖のいずれの状態であってもよく、これらの混合状態であってもよい。
【００２７】
「反応物質」とは、標的物質と反応し得る物質を意味し、本発明の粒子複合体を用いて行なう試験、検査、解析等の目的に応じて、標的物質との反応性を有する物質又は標的物質との反応性を有する可能性がある物質が適宜選択される。反応物質は、構造や機能等が公知の物質及び未知の物質のいずれであってもよい。反応物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体関連物質が挙げられる。反応物質が有する（又は有する可能性がある）標的物質との反応性はいかなる反応性であってもよく、例えば、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力、水素結合、配位結合、化学的吸着、物理的吸着等の結合様式によって標的物質と結合する性質が挙げられる。
【００２８】
標的物質と反応物質との組み合わせの具体例としては、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。
【００２９】
第一の粒子の表面に固定される反応物質の個数は特に限定されるものではないが、第一の粒子の表面に複数個の反応物質が固定されていること、すなわち、第一の粒子の表面に反応物質が集積化されていることが好ましい。第一の粒子の表面に複数個の反応物質が固定されている場合、反応物質の種類は同一であっても異なっていてもよいが、通常は同一である。
【００３０】
本発明の粒子複合体において、第二の粒子は、標識物質で標識されている。
【００３１】
標識物質は、第二の粒子の表面に結合していてもよいし、第二の粒子の内部に埋め込まれていてもよい。
標識物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、蛍光色素（例えば、Marine Blue，Cascade Blue，Cascade Yellow，Fluorescein，Rhodamine，Phycoerythrin，CyChrome，PerCP，Texas Red，Allophycocyanin，PharRed等の他、Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy7等のCy系色素、Alexa-488，Alexa-532，Alexa-546，Alexa-633，Alexa-680等のAlexa系色素、BODIPY FL，BODIPY TR-等のBODIPY系色素）等の蛍光性物質、放射性同位元素（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ）等の放射性物質等が挙げられる。標識物質として蛍光色素を用いる場合、蛍光色素の種類と量比とを組み合わせることにより多種多様な標識が可能となる。蛍光色素が発する蛍光の検出は、例えばフローサイトメトリーを利用して行なうことができる。
【００３２】
蛍光色素による標識化は、例えば、予め表面にアミノ基を導入しておいた粒子に活性エステルを有する蛍光色素を反応させることにより、あるいは、予め表面にカルボキシル基又はアミノ基を導入しておいた粒子に、カルボキシル基との結合反応が可能な官能基（例えばアミノ基）を有する蛍光色素又はアミノ基との結合反応が可能な官能基（例えばカルボキシル基）を有する蛍光色素を、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類の存在下で反応させることにより行なうことができる。また、重合反応によって粒子を合成する際に反応液中に蛍光色素を添加しておくことにより、あるいは、ラジカル重合の重合反応の終了直後でラジカルが残存している間に当該ラジカルと反応性を有する蛍光色素を添加することにより、蛍光色素による粒子の標識化を行なうことができる。
【００３３】
本発明の粒子複合体において、反応物質の種類と標識物質による標識とを対応付けておくことにより、反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できる。それぞれ異なる種類の反応物質が固定された複数個の粒子複合体について、各粒子複合体に固定された反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できれば、標的物質と反応物質との複数種類の反応について並列して解析でき、これによってハイスループットスクリーニング等のハイスループット解析が可能となる。例えば、それぞれ異なる種類の標識物質で標識された複数個の第二の粒子が、固体支持体の表面に固定されており、反応物質の種類と、異なる種類の標識物質の組み合わせ及び／又は量比とが対応付けておくことにより、各粒子複合体に固定された反応物質の種類を標識物質による標識に基づいて識別できる。また、標識物質の組み合わせ及び／又は量比を変化させることにより、数少ない標識物質を使用する場合であっても多種多様な標識が可能となる。
【００３４】
本発明の粒子複合体において、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きく、第一の粒子が光透過性を有しない場合には、蛍光色素が発する蛍光の検出精度が低下する可能性がある。すなわち、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、第二の粒子が第一の粒子に覆われるため（図１（ｃ）参照）、第二の粒子に含まれる蛍光色素が発する蛍光が、光透過性を有しない第一の粒子によって遮光される可能性がある。したがって、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、蛍光の検出精度の低下を防止する点から、第一の粒子が光透過性を有することが好ましい。
【００３５】
本発明の粒子複合体において、第一の粒子が磁性を有する場合、第一の粒子に含有される磁性体によって第一の粒子の光透過性は低下する可能性がある。したがって、第二の粒子を標識する標識物質が蛍光色素であり、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が１よりも大きい場合には、蛍光の検出精度の低下を防止する点から、第一の粒子は磁性を有しないことが好ましい。このとき、本発明の粒子複合体の操作性を向上させる点から、第二の粒子又は固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することが好ましく、さらに、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定効率の低下を防止する点から、固体支持体は磁性を有さず、第二の粒子が磁性を有することが好ましい。
【００３６】
本発明の粒子複合体において、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定、並びに第一の粒子への反応物質の固定は、種々の結合様式によって行なうことができる。結合様式の具体例としては、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合等）の形成、架橋剤による架橋等が挙げられる。これらの結合様式による固定が可能となるように、公知の技術を用いて、固体支持体表面、粒子表面又は反応物質に適当な化学修飾を施すことができる。なお、第一の粒子への反応物質の固定は、第一の粒子を固体支持体に固定する前に行なわれる。
【００３７】
ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、固体支持体への第一の粒子及び第二の粒子の固定、並びに第一の粒子への反応物質の固定を行なうこともできる。
【００３８】
固体支持体と第一の粒子及び第二の粒子との結合様式、並びに第一の粒子と反応物質との結合様式は、結合パートナー同士（固体支持体と粒子、粒子と反応物質）が容易に離脱しない結合様式であることが好ましい。このような結合様式としては、例えば、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用、共有結合の形成、架橋剤による架橋、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーによる接着、ＵＶ照射により接着力を発揮するポリマーによる接着等が挙げられる。
【００３９】
アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用を利用する場合には、例えば、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた粒子を、ビオチンでコーティングされた固体支持体に結合させることができる。また、ビオチンを導入した反応物質（例えば、５’末端をビオチン化したプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより得られたビオチン化核酸）を、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた粒子に結合させることができる。なお、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとを逆にして、例えば、ビオチンでコーティングされた粒子をアビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合させることができる。粒子と反応物質との結合についても同様である。
【００４０】
共有結合の形成を利用する場合には、固体支持体表面、粒子表面又は反応物質に存在する官能基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、固体支持体の表面にカルボキシル基が存在する場合には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、粒子の表面に存在するアミノ基と反応させることにより、固体支持体と粒子とをアミド結合させることができる。また、固体支持体の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、粒子の表面に存在するアミノ基と反応させることにより、固体支持体と粒子とをアミド結合させることができる。粒子と反応物質との結合についても同様にして行なうことができる。なお、反応物質が核酸である場合、核酸の反応性（相補的核酸とのハイブリダイズ性）を損なわないように、核酸の５’末端又は３’末端に導入したリンカー配列を介して核酸を粒子に結合させることが好ましい。
【００４１】
架橋剤による架橋を利用する場合には、架橋対象物質が有する官能基と反応し得る種々の架橋剤を使用できる。架橋剤の具体例としては、二官能性試薬、三官能性試薬等の多官能性試薬が挙げられる。このような多官能性試薬の具体例としては、N-スクシンイミジル(4-イオードアセチル)アミノベンゾエート（N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate）（SIAB）、ジマレイミド（dimaleimide）、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸（dithio-bis-nitrobenzoic acid）（DTNB）、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate）（SATA）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate）（SPDP）、スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）（SMCC）、6-ヒドラジノニコチミド（6-hydrazinonicotimide）（HYNIC）等が挙げられる。
【００４２】
乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの接着を利用する場合、含水状態にあるポリマーを固体支持体と粒子との間に介在させ、当該ポリマーを乾燥させることにより、粒子を固体支持体の表面に容易に固定することができる。乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーとしては、例えば、タンパク質、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらのポリマーが乾燥状態を経ることにより発揮する接着力は、乾燥状態が継続する場合はもちろん、粒子が固定された固体支持体の表面に液体が浸潤する場合でも保持される。乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーは、粒子又は固体支持体のいずれが有していてもよいし、両者が有していてもよい。また、粒子又は固体支持体のいずれもが有しておらず、固体支持体へ粒子を固定する段階で付加してもよい。
【００４３】
本発明の粒子複合体においては、反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とが別個の粒子として固体支持体の表面に固定されているので、第一の粒子及び第二の粒子がそれぞれ本発明の粒子複合体の表面を構成する。すなわち、第一の粒子の表面に固定された反応物質は露出した状態にある。したがって、本発明の粒子複合体においては、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できる。本発明の粒子複合体における当該効果は、上述したように、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、大きくなる。
【００４４】
また、本発明の粒子複合体を構成する第一の粒子、第二の粒子及び固体支持体は、いずれも液体試料中に分散可能であるので、本発明の粒子複合体は全体としても液体試料中に分散可能である。したがって、本発明の粒子複合体を、標的物質を含む液体試料中に分散させることにより、標的物質と反応物質とを効率よく反応させることができる。
【００４５】
本発明の粒子複合体は、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを固体支持体の表面の所定領域に固定し、前記領域の一部又は全部を含む微小片であって、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な前記微小片を前記固体支持体から切り出すことにより効率よく作製できる。
【００４６】
特に、図２に示すように、固体支持体として糸状、紐状、棒状、テープ状等の細長形状部材を使用し、第一の粒子及び第二の粒子を細長形状部材の表面全体に固定した後、当該細長形状部材を複数の微小片に切断することによって、多数の粒子複合体を効率よく作製できる。なお、図２中、１は第一の粒子、２は第二の粒子、３ａは細長形状部材、４は微小片を示す。
【００４７】
第一の粒子及び第二の粒子を細長形状部材の表面全体に固定する際には、第一の粒子及び第二の粒子を含む液体中に細長形状部材を浸漬した後、当該液体中において又は当該液体から取り出して、所定の固定化処理を施せばよい。
【００４８】
乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの接着力を利用して固体支持体へ第一の粒子及び第二の粒子を固定する場合、含水状態にあるポリマーを乾燥させる工程が必要となるが、粒子状の固体支持体の液相中以外における取り扱いは困難であるため、ポリマーの乾燥工程の実施は困難である。これに対して、微小片に成形する前の固体支持体は、液相中以外における取り扱いも容易であるので、ポリマーの乾燥工程の実施を容易に行なうことができる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを備え、標的物質を含む液体試料中に分散可能な粒子複合体であって、第二の粒子が立体障害となって標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止した粒子複合体が提供される。また、本発明によれば、上記粒子複合体を効率よく作製できる粒子複合体の作製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の粒子複合体において、第一の粒子の粒径／第二の粒子の粒径の比が大きくなるほど、第二の粒子が立体障害となり難くなり、標的物質と反応物質との反応効率が低下することを効果的に防止できることを説明する模式図である。
【図２】細長形状部材を使用して複数の粒子複合体を作製する場合の説明図である。
【図３】蛍光標識したナノ粒子ＮＢをプローブＰが固定されたミクロ粒子ＭＢの表面に結合させた複合粒子において、ミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰが、ミクロ粒子ＭＢの表面に結合させたナノ粒子ＮＢに覆われ、ナノ粒子ＮＢが立体障害となってミクロ粒子ＭＢの表面に固定されたプローブＰと標的遺伝子Ｔとの反応効率が低下することを説明する模式図である。
Claims (18)
- 標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とが、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする粒子複合体。
- 前記固体支持体の表面に、前記第一の粒子及び前記第二の粒子がそれぞれ複数個固定されていることを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１以上であることを特徴とする請求項２記載の粒子複合体。
- 前記反応物質の種類と、前記標識物質による標識とが対応付けられていることを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- それぞれ異なる種類の標識物質で標識された複数個の第二の粒子が前記固体支持体の表面に固定されており、前記反応物質の種類と前記異なる種類の標識物質の組み合わせ及び／又は量比とが対応付けられていることを特徴とする請求項４記載の粒子複合体。
- 前記第一の粒子、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記固体支持体は磁性を有さず、前記第一の粒子又は前記第二の粒子のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする請求項６記載の粒子複合体。
- 前記標識物質が蛍光物質であり、前記第一の粒子の粒径／前記第二の粒子の粒径の比が１よりも大きく、前記第一の粒子が光透過性を有することを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記第一の粒子は磁性を有さず、前記第二の粒子又は前記固体支持体のいずれか１種類以上が磁性を有することを特徴とする請求項８記載の粒子複合体。
- 前記固体支持体は磁性を有さず、前記第二の粒子が磁性を有することを特徴とする請求項９記載の粒子複合体。
- 前記固体支持体が、粒子又は細長形状部材の切断片であることを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記第一の粒子及び第二の粒子が、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記反応物質が、生体関連物質であることを特徴とする請求項１記載の粒子複合体。
- 前記生体関連物質が、核酸又はタンパク質であることを特徴とする請求項１３記載の粒子複合体。
- 標的物質と反応し得る反応物質が表面に固定された第一の粒子と、標識物質で標識された第二の粒子とを固体支持体の表面の所定領域に固定し、前記領域の一部又は全部を含む微小片であって、前記標的物質を含む液体試料中に分散可能な前記微小片を前記固体支持体から切り出すことを特徴とする粒子複合体の作製方法。
- 前記固体支持体が、細長形状部材であることを特徴とする請求項１５記載の作製方法。
- 前記第一の粒子と前記第二の粒子とを前記細長形状部材の表面全体に固定した後、前記細長形状部材を複数の微小片に切断することを特徴とする請求項１６記載の作製方法。
- 前記第一の粒子及び第二の粒子を、乾燥状態を経ることにより接着力を発揮するポリマーの前記接着力により前記固体支持体の表面に固定することを特徴とする請求項１５記載の作製方法。
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