FR2760093A1 - Procede et trousse pour detecter la presence d'une immunoglobuline - Google Patents
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Abstract
Une trousse de détection d'anticorps anti-érythrocytaires, anti-leucocytaires ou anti-plaquetaires met en oeuvre un procédé de mise en évidence immunologique dans lequel on mélange, sur un support de visualisation, un échantillon susceptible de contenir l'anticorps recherché, un liquide contenant au moins un déterminant antigénique porté par un support antigénique stable telle qu'une membrane, contre lequel l'anticorps recherché est dirigé et une suspension de microparticules solides, éventuellement colorées, couplées à des anti-immunoglobulines. La détection se fait par comparaison visuelle avec un témoin positif et un témoin négatif.
Description
PROCEDE ET TROUSSE POUR DETECTER LA PRESENCE D'UNE
IMMUNOGLOBULINE
La présente invention concerne un procédé pour détecter la présence d'au moins une immunoglobuline d'un mammifère dans un liquide, ainsi qu'une trousse pour effectuer ce procédé.
IMMUNOGLOBULINE
La présente invention concerne un procédé pour détecter la présence d'au moins une immunoglobuline d'un mammifère dans un liquide, ainsi qu'une trousse pour effectuer ce procédé.
Des techniques de recherche, de détection et d'identification d'immoglobulines sont employées dans le cadre de nombreux laboratoires de recherches fondamentales et appliquées.
La détermination des groupes ABO en est une des applications les plus communes.
La recherche des anticorps irréguliers antiérythrocytaires fait également partie des bilans prétransfusionnels, prénataux et pré-greffe. Elle contribue à assurer la sécurité transfusionnelle et à prévenir une pathologie foetale et néonatale par incompatibilité sanguine entre un enfant et sa mère. Cette recherche s'intéresse en particulier aux allo-anticorps irréguliers anti-érythrocytaires naturels ou immuns et s'effectue normalement en deux étapes : le dépistage des anticorps irréguliers et leur identification si le dépistage est positif.
Dans les techniques habituellement mises en oeuvre, qu'il s'agisse d'essais en tube, en gel ou sur phase solide, le dépistage et l'identification des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires reposent sur une réaction d'hémagglutination utilisant un panel d'hématies représentatif des principaux antigènes érythrocytaires. Le panel est constitué d'hématies de groupe sanguin O prélevées chez des donneurs réguliers et phénotypés. De telles techniques ont été décrites par exemple par Lapierre et al, Transfusion, 1990, 30 : 19-113 ; Larua, Feuillets de biologie, 1988 ; 29 : 17-26 ; Koskinen S. et al , Immunol
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Pour la mise en oeuvre des techniques ci-dessus mentionnées, la conservation des hématies est réalisée à + 4"C pour les phénotypes courants et dans l'azote liquide pour les phénotypes rares. La constitution d'un panel érythrocytaire n'est à la disposition ni de tous les établissements de transfusion sanguine ni de la majorité des laboratoires d'analyses médicales en raison du grand nombre d'individus requis pour que soit effectué le choix et la conservation des phénotypes érythrocytaires. Par ailleurs, la conservation des hématies à + 40C est limitée au maximum à une période de 42 jours.
Cette contrainte fait que le dépistage des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires n'est pas encore réalisable en routine dans tous les laboratoires des pays industrialisés. Il est donc a fortiori négligé dans les pays en voie de développement.
Dans le cadre des transplantations d'organes, y compris de la moelle osseuse, ainsi que dans celui des transfusions de plaquettes, la recherche d'anticorps dirigés contre les antigènes du système HLA ou contre des antigènes spécifiquement anti-plaquettaires ou antilymphocytaires est indispensable. Elle se heurte aux mêmes difficultés de constitution d'un panel de donneurs et aux problèmes de conservation que dans le cas des tests d'anticorps anti-érythrocytaires mentionnés plus haut.
On constate notamment que l'identification des auto-anticorps est longue et difficile dans les maladies auto-immunes et qu'il est très difficile de conserver des cellules telles que par exemple des polynucléaires ou des constituants cellulaires.
Le but de la présente invention est d'offrir une technique de mise en évidence d'anticorps, tels que les anticorps irréguliers anti-érythrocytaires, les anticorps anti-plaquettaires, les anticorps anti-leucocytaires ou autres anticorps anti-constituants cellulaires qui soit rapide et facile à mettre en oeuvre même et surtout en dehors de laboratoires disposant de moyens d'investigations lourds.
Le but de la présente invention est également d'offrir une trousse de détection et d'identification constituée de matériaux et de réactifs stables, de longue conservation, même si l'on ne dispose pas de réservoirs cryogéniques. Les techniques mises en oeuvre à l'aide de telles trousses doivent donner un résultat rapide et facilement lisible, même sans disposer de moyens analytiques lourds de laboratoire.
Ces buts sont atteints grâce à un procédé pour détecter la présence d'au moins une première immunoglobuline d'un mammifère dans un premier liquide, dans lequel on mélange sur un support de visualisation, un premier volume du dit premier liquide, un deuxième volume d'un deuxième liquide contenant au moins un déterminant antigénique contre lequel la dite première immunoglobuline est dirigée, porté par un support antigénique stable, un troisième volume d'un troisième liquide, contenant une suspens ion de microparticules solides couplées à des antiimmunoglobulines dirigés contre le dit mammifère.
De préférence, on procède en comparant les réactions du premier liquide, dans lequel on soupçonne la présence de la, ou des immunoglobulines recherchées, et les réactions d'un temoin positif et d'un témoin négatif avec les réactifs de la trousse.
Eventuellement, on peut ajouter un quatrième volume d'un quatrième liquide contenant un agent bloquant non spécifique comme par exemple le Triton (marque déposée de
Sigma), le sérum de cheval, le Tween (marque déposée de
Fluka), le lait, la gélatine animale, l'albumine.
Sigma), le sérum de cheval, le Tween (marque déposée de
Fluka), le lait, la gélatine animale, l'albumine.
Ainsi, la présence de la dite première immunoglobuline peut être détectée en observant sur ledit support de visualisation les effet visuels de la réaction du dit premier liquide avec les dits deuxième et troisième liquide et en les comparant avec
les effets visuels de la réaction d'une solution contenant une immunoglobuline connue dudit mammifère avec les dits deuxième et troisième liquide et avec les effets visuels de la réaction d'une solution ne contenant aucun anticorps avec les dits deuxième et troisième liquide.
les effets visuels de la réaction d'une solution contenant une immunoglobuline connue dudit mammifère avec les dits deuxième et troisième liquide et avec les effets visuels de la réaction d'une solution ne contenant aucun anticorps avec les dits deuxième et troisième liquide.
Le support de visualisation peut être choisi parmi les plaques de verre, de carton, d'opaline, de marbre, de fibres naturelles, de matériaux synthétiques. Ce support de visualisation peut être en particulier une micro-plaque munie de puits.
Dans ces conditions, les volumes des liquides mis en oeuvre pour effectuer les essais sont très faibles. De l'ordre de une à dix gouttes et de préférence de l'ordre de une à deux gouttes chacun.
Les microparticules solides mises en oeuvre dans le cadre du procédé peuvent être choisis parmi les particules de latex, de gélatine ou de polymères et peuvent notamment être colorées, pour mieux visualiser les réactions d'agglutination antigène/support + anticorps recherché + antiimmunoglobuline/particule.
Le support antigénique stable utilisé dans le cadre du procédé est de préférence un constituant cellulaire. Ce constituant cellulaire peut être un organite cellulaire ou une partie d'un organite cellulaire. Il peut également être une membrane ou une fraction de membrane cellulaire ou encore un panel de membranes, une association de membranes ou de fractions de membranes cellulaires. Selon l'application visée, on utilise des membranes de leucocytes, des membranes de plaquettes ou des membranes d'érythrocytes encore appelées stromas ou ghosts.
Ces constituants entrent dans la composition des trousses selon l'invention.
La trousse peut contenir ces constituants à l'état solide, lyophilisé, ou sous forme de solutions ou de suspensions dans des vecteurs liquides appropriés.
La trousse peut contenir également l'immunoglobuline connue de comparaison et un ou plusieurs supports de visualisation.
Une trousse destinée à détecter la présence d'anticorps irréguliers anti-érythrocytaires comprend un panel de stromas provenant d'une pluralité de donneurs phénotypés, de phénotypes différents.
Une trousse destinée à l'identification d'un anticorps anti-érythrocytaire contient quant à elle, ou en plus des constitants ci-dessus, un échantillon de stromas provenant d'un donneur, d'un phénotype spécifique.
Les trousses destinées à la détection ou à l'identification d'anticorps tels que les anticorps des systèmes Rhésus, Kell, Lewis, P, MNSs, Luthéran, Duffy ou
Kidd comprennent des membranes correspondantes constituant les support s des antigènes correspondant à ces différents systèmes antigéniques.
Kidd comprennent des membranes correspondantes constituant les support s des antigènes correspondant à ces différents systèmes antigéniques.
La trousse selon l'invention peut rechercher les anticorps D, C, E, c, e, CW, K, k Kpa, Kpb, Fya, Fyb, Jka,
Jkb, Lea, Leb, M, N, S, s, P1, Lua, Lub, Doa, Dob, Yta,
Ytb, Coa, Cob, Xga.
Jkb, Lea, Leb, M, N, S, s, P1, Lua, Lub, Doa, Dob, Yta,
Ytb, Coa, Cob, Xga.
La présente invention sera mieux comprise de l'homme du métier grâce à la description d'un mode de réalisation particulier, à savoir une technique de dépistage et d'identification d'anticorps irréguliers antiérythrocytaires humains, et d'exemples qui l'illustrent.
La figure 1 illustre les différences visuelles observables grâce au procédé selon l'invention entre un sérum contenant un anticorps antiérythrocytaire recherché et un sérum ne le contenant pas.
La figure 2 illustre les différences visuelles observables grâce au procédé selon l'invention entre un sérum contenant un anticorps antiplaquettaire recherché et un sérum ne le contenant pas.
Compte-tenu de la lourdeur du dispositif pour maintenir constamment à disposition et en bon état de conservation un panel d'érythrocytes entiers de bonne qualité, c'est-à-dire de l'obligation de constituer et de maintenir une équipe de donneurs sélectionnés et fidèles, de disposer du matériel de congélation et que même dans ces conditions, on obtient un réactif labile, de conservation délicate, qui voyage mal, il est proposé, selon l'invention, de préparer des supports antigéniques stables.
Ceux-ci sont constitués de stromas de cellules entières.
Ces stromas peuvent être préparés par exemple par lyse d'érythrocytes en milieu hypotonique à l'aide de techniques de filtration sur fibres creuses et peuvent être facilement conservés à + 40C.
Pour la constitution d'un panel de stromas, on peut procéder soit à partir de plusieurs lots de stromas, soit en lysant un panel préconstitué d'érythrocytes entiers.
Ces membranes de cellules stabilisées ne pouvant aisément être utilisées dans une réaction classique d'agglutination, il est proposé, selon l'invention, d'utiliser, comme moyen de révéler la fixation de l'anticorps recherché à son antigène, des anticorps couplés à des microparticules. On utilise selon l'invention des microparticules, telles que les particules de latex, de gélatine ou de différents polymères, couplées à des immunoglobulines anti-humaines, telles que des anti-IgG, des anti-IgM ou des anti-IgG + IgM.
Comme les particules utilisées sont suffisamment grosses ou sont colorées, la réaction d'agglutination est visible à l'oeil nu. L'essai peut donc se pratiquer simplement en déposant sur une lame des gouttes de chaque réactif, de constater les différences par rapport aux solutions témoins. L'essai peut également être réalisé en micro-plaques de manière à pouvoir l'automatiser au niveau de l'agitation et de la lecture.
On dépose sur le support de visualisation les différents volumes de réactifs permettant de mettre en évidence la présence des anticorps recherchés dans un liquide tel qu'un plasma ou un sérum, par exemple une goutte de suspension antigénique, une goutte du liquide à tester et une goutte de liquide contenant des particules couplés à des immunoglobulines anti-humaines, éventuellement une goutte de solution d'albumine.
Simultanément, on réalise un témoin positif et un témoin négatif avec respectivement une goutte d'un sérum contenant un anticorps connu et une goutte d'un sérum ne contenant pas d'anticorps susceptibles d'être révélés par la suspension antigénique. Les mélanges sont obtenus à l'aide d'un agitateur, par mouvement manuel ou mécanisé. La réaction d'agglutination est lue après une période comprise entre 5s et 3mn. On compare les réactions obtenues respectivement avec le liquide à tester, le témoin positif et le témoin négatif.
Contrairement aux protocoles expérimentaux connus qui utilisent des antigènes fixés sur des supports solides, tel que par exemple du polystyrène, le procédé selon l'invention ne nécessite pas l'emploi d'une centrifugeuse pour différencier les résultats de la réaction du sérum à tester de celles des sérums témoins.
Exemple 1 : Préparation de stromas
REACTIFS
- sang humain de moins de 4 jours prélevé sur solution de conservation type citrate phosphate dextrose (CPD), conservé à + 40C
- solution de lavage isotonique type NaCl 0,9, pH 6,0 (Braun, France)
- solution de lyse hypotonique type Na2HPO4 (7,1 g/l) : 473,5 ml + NaH2PO4 (6 g/l) : 26,5 ml + eau distillée, qsp 5 litres
MATERIEL DE FILTRATION
- système de filtration sur fibres creuses type
Plasmacure, Kawasumilab, Tokyo, Japon
- centrifugeuse type J2-21 Beckman - Rotor JA 20 (Beckman, Gagny, France)
- Kit de dosage des protéines type BCA (Pierce,
Rockford, USA).
REACTIFS
- sang humain de moins de 4 jours prélevé sur solution de conservation type citrate phosphate dextrose (CPD), conservé à + 40C
- solution de lavage isotonique type NaCl 0,9, pH 6,0 (Braun, France)
- solution de lyse hypotonique type Na2HPO4 (7,1 g/l) : 473,5 ml + NaH2PO4 (6 g/l) : 26,5 ml + eau distillée, qsp 5 litres
MATERIEL DE FILTRATION
- système de filtration sur fibres creuses type
Plasmacure, Kawasumilab, Tokyo, Japon
- centrifugeuse type J2-21 Beckman - Rotor JA 20 (Beckman, Gagny, France)
- Kit de dosage des protéines type BCA (Pierce,
Rockford, USA).
On sépare les hématies du plasma par centrifugation à 1700 g pendant 5 mn et on les lave 3 fois avec la solution de lavage isotonique à + 4 C. Le surnageant est éliminé par aspiration en veillant à éliminer les globules blancs et les plaquettes. A + 40C et sous agitation douce, on ajoute goutte à goutte les globules rouges lavés dans un volume de solution de lyse hypotonique correspondant à 40 fois le volume de globules rouges lavés. On laisse hémolyser pendant 30 mn sous agitation lente.
Après hémolyse, la suspension est passée sur un système semi-automatique de filtration sur fibres creuses.
Après une heure, une suspens ion de membranes parfaitement blanches est obtenue.
La concentration protéique de la suspens ion de membranes est déterminée par une technique de type Lowry, puis ajustée à 1,5 g/l à l'aide de la solution isotonique.
Les membranes sont fractionnées en aliquots puis conservées, soit à l'état congelé à-800C, soit à -200C soit encore en suspension liquide à + 40C.
L'intégrité et la persistance des déterminants antigéniques sur les membranes de stromas est vérifié en comparant les échantillons de membranes congelés à -800C, à -200C ou encore conservés à +40C après 15 jours, 2 mois et une année de conservation, aux réactions antigéniques obtenues au moyen de suspensions d'érythrocytes frais et d'érythrocytes lyophilisés provenant du même donneur
on incube pendant 4 heures parallélement du sérum avec 200 yl d'érythrocytes, 200 yl de stromas et 200 yl de cellules lyophilisées provenant du même donneur, à 40, 200 et 350C. Après centrifugation (300 g/10 mn) le surnageant est dilué en progression géométrique par 2 jusqu'au 1/64e.
on incube pendant 4 heures parallélement du sérum avec 200 yl d'érythrocytes, 200 yl de stromas et 200 yl de cellules lyophilisées provenant du même donneur, à 40, 200 et 350C. Après centrifugation (300 g/10 mn) le surnageant est dilué en progression géométrique par 2 jusqu'au 1/64e.
Une goutte de chaque dilution sérique est mélangée avec une goutte d'érythrocytes phénotypés à 3%. Les IgG (rhésus Kell
Ss, Duffy et Kidd, Lub) sont détectés à l'aide d'une IgG anti-humaine spécifique (Bioclone, Orthodiagnostic System).
Ss, Duffy et Kidd, Lub) sont détectés à l'aide d'une IgG anti-humaine spécifique (Bioclone, Orthodiagnostic System).
Les anticorps MNSs, Lewis, Lu, A B H et P 1 sont détectés directement après une heure d'incubation. Ces techniques de détection sont connues de l'homme du métier.
Les tableaux 1 à 5 montrent que les stromas présentent et conservent les mêmes activités antigéniques que les cellules entières fraiches.
Tableau 1 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques sur la surface des stromas conservés à -200C pour une durée allant de 15 jours à 1 an
Tableau 2 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques sur des cellules lyophilisées conservées à 40C pendant 15 jours et 6 mois
Tableau 3 : Exemple d'un essai comparant l'adsorption sur des érythrocytes, des membranes, des cellules lyophilisées d'un même donneur
Tableau 4 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques à la surface des lyophilisats conservés 6 mois et 1 an à +40C
Tableau 5 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques à la surface des membranes conservées 1 an à 800C.
Tableau 2 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques sur des cellules lyophilisées conservées à 40C pendant 15 jours et 6 mois
Tableau 3 : Exemple d'un essai comparant l'adsorption sur des érythrocytes, des membranes, des cellules lyophilisées d'un même donneur
Tableau 4 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques à la surface des lyophilisats conservés 6 mois et 1 an à +40C
Tableau 5 : Vérification de l'intégrité des motifs antigéniques à la surface des membranes conservées 1 an à 800C.
Tous les tableaux montrent des valeurs qui correspondent à des moyennes des titres effectués sur plusieurs lots de membranes de globules rouges
(+) indique que l'antigène est présent sur les stromas
(-) indique que l'antigène est absent des stromas
Tableau 1 :
(+) indique que l'antigène est présent sur les stromas
(-) indique que l'antigène est absent des stromas
Tableau 1 :
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Tableau 2
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Tableau 2
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<tb>
Tableau 4
<tb> <SEP> ADSORPTION <SEP> ADSORPTION <SEP> ADSORPTION <SEP> ADSORPTION
<tb> ANTIGENE
<tb> SUR <SEP> ERYTHRO- <SEP> SUR <SEP> MEMBRA- <SEP> SUR <SEP> CELLULES
<tb> TESTE
<tb> CYTES <SEP> NES <SEP> LYOPHILISEES
<tb> <SEP> D <SEP> 8 <SEP> O <SEP> 0 <SEP> <SEP> O <SEP>
<tb> <SEP> C <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 2
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<tb>
Tableau 4
<tb> <SEP> Antigènes <SEP> Titres <SEP> des <SEP> sérums
<tb> <SEP> érythrocytaires
<tb> <SEP> Systèmes <SEP> Spécificit <SEP> Témoins <SEP> Lyophilisa <SEP> Témoins <SEP> Lyophilisa
<tb> antigéniqu <SEP> és <SEP> ts <SEP> ts
<tb> <SEP> es <SEP> conservés <SEP> conservés
<tb> <SEP> 6 <SEP> moins <SEP> un <SEP> an
<tb> D <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 1
<tb> <SEP> Rhésus
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<tb> <SEP> Jkb <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb>
Remarque : Phénotype du donneur : DCcEe, K- k+ Kpa- Kpb+, MNSs, Lea
Leb+, Jka+ Jkb+, Fya+ Fyb+, Lua- Lub+, P1+.
<tb> <SEP> érythrocytaires
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<tb> antigéniqu <SEP> és <SEP> ts <SEP> ts
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Remarque : Phénotype du donneur : DCcEe, K- k+ Kpa- Kpb+, MNSs, Lea
Leb+, Jka+ Jkb+, Fya+ Fyb+, Lua- Lub+, P1+.
Tableau 5
<SEP> Systèmes <SEP> Spécifici <SEP> Nombre <SEP> Titres <SEP> Titres <SEP> des <SEP> Titres <SEP> des
<tb> <SEP> antigéniques <SEP> tés <SEP> d'essais <SEP> des <SEP> sérums <SEP> avec <SEP> sérums <SEP> avec
<tb> <SEP> témoins <SEP> des <SEP> membranes <SEP> des <SEP> membranes
<tb> <SEP> possédant <SEP> ne <SEP> possédant
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<tb> <SEP> Lewis <SEP> Le <SEP> a <SEP> <SEP> 6 <SEP> 13,3 <SEP> 0,66 <SEP> 13,33
<tb> <SEP> Leb <SEP> 5 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 12
<tb> <SEP> MNSs <SEP> M <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 8
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<tb> Duffy
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<tb> <SEP> Kîdd <SEP> <SEP> Jka <SEP> 3 <SEP> 6,66 <SEP> o <SEP> 6,66
<tb> <SEP> Jkb <SEP> ~ <SEP> 3 <SEP> 6,66 <SEP> 0
<tb>
Tous les résultats montrent une nette diminution, parfois même totale, du titre de l'anti-sérum test après adsorption sur les membranes ou les lyophilisats érythrocytaires.
<tb> <SEP> antigéniques <SEP> tés <SEP> d'essais <SEP> des <SEP> sérums <SEP> avec <SEP> sérums <SEP> avec
<tb> <SEP> témoins <SEP> des <SEP> membranes <SEP> des <SEP> membranes
<tb> <SEP> possédant <SEP> ne <SEP> possédant
<tb> <SEP> l'antigène <SEP> pas
<tb> <SEP> l'antigène
<tb> <SEP> Rhésus <SEP> D <SEP> 12 <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP> 20
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<tb> <SEP> Lewis <SEP> Le <SEP> a <SEP> <SEP> 6 <SEP> 13,3 <SEP> 0,66 <SEP> 13,33
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<tb> <SEP> MNSs <SEP> M <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 8
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<tb>
Tous les résultats montrent une nette diminution, parfois même totale, du titre de l'anti-sérum test après adsorption sur les membranes ou les lyophilisats érythrocytaires.
La température et la méthode d'isolement des motifs antigéniques ne semblent pas endommager les antigènes de groupes sanguins.
Donc les antigènes présents avant préparation des supports antigéniques ne sont altérés, ni par la préparation des membranes et des lyophilisats, ni par la conservation des membranes à -800C, et à +40C ou des lyophilisats à +40C, pendant une durée de 1 an.
Exemple 2 : Préparation de suspensions de microparticules couplées à des immunoqlobulines
REACTIFS
- tampon de couplage : NaH2PO4 20 mM + NaCl 140 mM pH = 6,0
- tampon de dilution : NaH2PO4 20 mM + KH2PO4 20 mM + NaCl 140 mM + glycine 100 mM + albumine bovine 10/00 + azide de sodium 0,1 ; pH = 7,4.
REACTIFS
- tampon de couplage : NaH2PO4 20 mM + NaCl 140 mM pH = 6,0
- tampon de dilution : NaH2PO4 20 mM + KH2PO4 20 mM + NaCl 140 mM + glycine 100 mM + albumine bovine 10/00 + azide de sodium 0,1 ; pH = 7,4.
- immunoglobuline anti-IgG + IgM humaine, F (ab')2 (Interchim, France à 2,5 mg/ml).
- particules de latex hydrophobes de 0,1-10 ym (Interchim, France).
On incube les particules avec les immunoglobulines dans les conditions suivantes : à 2,5 ml de suspension de particules à 2% de solides + 20 ml de tampon de couplage, on ajoute 0,35 ml de solution d'immunoglobuline. Après une heure d'incubation, les particules sont centrifugées pendant 10 mn à 3500 g puis lavées 2 fois avec le tampon de couplage, et suspendues dans le tampon de dilution pour obtenir une concentration de solides de 0,2%.
Exemple 3 : La procédure de l'exemple 2 est effectuée pour coupler des IgG antihumaines (Interchim,
France) à des particules de latex de granulométrie moyenne 0,86 y (White latex Estapor, Rhone Poulenc, France).
France) à des particules de latex de granulométrie moyenne 0,86 y (White latex Estapor, Rhone Poulenc, France).
Exemple 4 : réalisation d'un réactif destiné à désister un ou plusieurs anticorps antiérythrocytaires
La sélection des globules rouges utilisés obéit aux mêmes règles que dans la technique d'hémagglutination. Les stromas ou suspensions d'antigènes préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 1, à partir de poches de sang de donneurs ne peuvent être toujours strictement identiques, mais les kits ou trousses de dépistage doivent comporter tous les antigènes érythrocytaires connus pour lesquels l'incidence d'immunisation existe.
La sélection des globules rouges utilisés obéit aux mêmes règles que dans la technique d'hémagglutination. Les stromas ou suspensions d'antigènes préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 1, à partir de poches de sang de donneurs ne peuvent être toujours strictement identiques, mais les kits ou trousses de dépistage doivent comporter tous les antigènes érythrocytaires connus pour lesquels l'incidence d'immunisation existe.
Les stromas peuvent être conservés à l'état lyophilisé à +4 C et remis en suspension pour réaliser les tests de dépistage.
Des mélanges d'érythrocytes sont envisageables afin de diminuer le nombre de réactions à effectuer. Le tableau 2 donne un exemple du phénotype des érythrocytes choisis pour un test de ce type.
Exemple 5 : Détection des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires spécifiques de l'antigène rhésus D
Le procédé selon l'invention a été testé vis-à-vis d'anticorps anti-érythrocytaires spécifiques de l'antigène rhésus D.
Le procédé selon l'invention a été testé vis-à-vis d'anticorps anti-érythrocytaires spécifiques de l'antigène rhésus D.
La photographie numérisée de la plaque obtenue, montrée sur la figure 1, indique qu'il existe des différences significatives entre un sérum renfermant des anti-D, c'est-à-dire les cercles A, D, F, un sérum ne contenant pas d'anticorps anti-D (cercle B et C) et une solution tampon (cercle E). On constate sur la photographie que en A, D et F, il y a fixation de l'anti-D sur les stromas présentant l'antigène D alors qu'en B C et E, il n'y a pas de fixations car les stromas ou le tampon ne possèdent pas l'antigène D.
Exemple 6 : Détection d'anticorps antiplapuettaires spécifiques de l'antigène A2
La sélection des échantillons de sang obéit aux mêmes critères que dans les exemples 1 et 4. Les plaquettes sont préparées par centrifugation différentielle à partir de sang total ou par une technique de cytophérèse. Ces techniques sont connues de l'homme utilisés pour éclairer la plaque pour la prise de la photographie.
La sélection des échantillons de sang obéit aux mêmes critères que dans les exemples 1 et 4. Les plaquettes sont préparées par centrifugation différentielle à partir de sang total ou par une technique de cytophérèse. Ces techniques sont connues de l'homme utilisés pour éclairer la plaque pour la prise de la photographie.
Exemple 7 : Composition d'une trousse
- 1 à 3 flacons compte-goutte de suspens ion antigénique,
- 1 flacon d'immunoglobuline couplée à des particules de latex,
- 1 plaque,
- 1 agitateur,
- 1 flacon de sérum témoin positif,
- 1 flacon de sérum témoin négatif.
- 1 à 3 flacons compte-goutte de suspens ion antigénique,
- 1 flacon d'immunoglobuline couplée à des particules de latex,
- 1 plaque,
- 1 agitateur,
- 1 flacon de sérum témoin positif,
- 1 flacon de sérum témoin négatif.
En conclusion, l'invention propose un bio-réactif nouveau utilisant conjointement des antigènes cellulaires stabilisés et une méthode de détection simple et automatisable.
La présente invention n'est pas restreinte à l'immunohématologie érythrocytaire mais fournit également un procédé et une trousse de mise en évidence immunologique d'anticorps anti-leucocytaires ou anti-plaquettaires ou de manière plus générale anti-cellulaire ou anti-constituants cellulaires.
Claims (21)
1. Procédé pour détecter la présence d'au moins une première immunoglobuline dun mammifère dans un premier liquide caractérisé en ce qu'on mélange, sur un support de visualisation, un premier volume du dit premier liquide, un deuxième volume d'un deuxième liquide contenant au moins un déterminant antigénique contre lequel la dite première immunoglobuline est dirigée, porté par un support antigénique stable, un troisième volume d'un troisième liquide, contenant une suspension de microparticules solides couplées à des antiimmunoglobulines dirigés contre le dit mammifère.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence de la dite première immunoglobuline est détectée en comparant sur ledit support de visualisation les effet visuels de la réaction du dit premier liquide avec les dits deuxième et troisième liquide avec
les effets visuels de la réaction d'une solution contenant une immunoglobuline connue dudit mammifère avec les dits deuxième et troisième liquide et avec
les effets visuels de la réaction d'une solution ne contenant aucun anticorps avec les dits deuxième et troisième liquide.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on ajoute un quatrième volume dun quatrième liquide contenant un agent bloquant non spécifique.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit agent bloquant est choisi parmi le Triton, le sérum de cheval, le tween, le lait, la gélatine animale, l'albumine.
5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que ledit support de visualisation est choisi parmi les plaques de verre, de carton, d'opaline, de marbre, de fibres naturelles, de matériaux synthétiques.
6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que le dit support de visualisation est une microplaque munie de puits.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que les dits premier, deuxième et troisième volumes sont compris entre 1 et 10 gouttes.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dites microparticules solides sont choisies parmi les particules de latex, de gélatine, de polymères.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les dites microparticules sont colorées.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dit support antigénique stable est un constituant cellulaire
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le dit constituant cellulaire est un organite cellulaire ou une partie d'un organite cellulaire.
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le d en ce que le dit constituant cellulaire est une fraction de membrane cellulaire ou une association de membranes ou de fractions de membranes cellulaires.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite membrane est une membrane de plaquette.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite membrane est une membrane de leucocyte.
15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la dite membrane est une membrane d'érythrocyte.
16. Trousse pour effectuer un procédé selon l'une quelconque des revendications 1-15, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un échantillon du dit deuxième liquide et un échantillon du dit troisième liquide.
17. Trousse pour effectuer un procédé selon l'une quelconque des revendications 1-15 caractérisé en ce qu'elle comprend les constituants à l'état solide suffisants pour réaliser un échantillon dudit deuxième liquide et un échantillon du dit troisième liquide.
18. Trousse selon les revendications 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comprend également un échantillon de la dite immunoglobuline connue et au moins un des dits supports de visualisation.
19. Trousse selon l'une des revendications 16-18, destinée à la détection d'anticorps irréguliers antierythrocitaires caractérisée en ce qu'elle comprend un panel de stromas provenant d'une pluralité de donneurs phénotypés, de phénotypes différents.
20. Trousse selon l'une des revendications 16-18, destiné à l'identification d'un anticorps antierythrocitaire caractérisée en ce qu'elle comprend un échantillon de stromas provenant d'un donneur phénotypé.
21. Trousse selon la revendication 20, destinée à l'identification d'un ou plusieurs anticorps choisis parmi les anticorps D, C, E, c, e, CW, K, k Kpa, Kpb, Fya, Fyb,
Jka, Jkb, Lea, Leb, M, N, S, s, P1, Lua, Lub, Doa, Dob,
Yta, Ytb, Coa, Cob, Xga.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702258A FR2760093B1 (fr) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | Procede et trousse pour detecter la presence d'une immunoglobuline |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702258A FR2760093B1 (fr) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | Procede et trousse pour detecter la presence d'une immunoglobuline |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| FR2760093A1 true FR2760093A1 (fr) | 1998-08-28 |
| FR2760093B1 FR2760093B1 (fr) | 1999-05-14 |
Family
ID=9504171
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR9702258A Expired - Lifetime FR2760093B1 (fr) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | Procede et trousse pour detecter la presence d'une immunoglobuline |
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| Country | Link |
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| FR (1) | FR2760093B1 (fr) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0350233A2 (fr) * | 1988-07-05 | 1990-01-10 | Immucor, Inc. | Article pour la réalisation d'essais immunologiques utilisant des colorants organiques et méthodes pour sa production et son utilisation |
| EP0367468A1 (fr) * | 1988-11-04 | 1990-05-09 | Immucor, Inc. | Méthode de séchage de cellules mammifères pour l'utilisation en essais immunologiques sur phase solide et articles incorporant cette méthode |
| EP0516529A2 (fr) * | 1991-05-28 | 1992-12-02 | Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. | Détection des anticorps spécifiques |
| WO1993024839A1 (fr) * | 1992-05-27 | 1993-12-09 | The National Blood Authority | Detection immunologique en phase solide |
-
1997
- 1997-02-21 FR FR9702258A patent/FR2760093B1/fr not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0350233A2 (fr) * | 1988-07-05 | 1990-01-10 | Immucor, Inc. | Article pour la réalisation d'essais immunologiques utilisant des colorants organiques et méthodes pour sa production et son utilisation |
| EP0367468A1 (fr) * | 1988-11-04 | 1990-05-09 | Immucor, Inc. | Méthode de séchage de cellules mammifères pour l'utilisation en essais immunologiques sur phase solide et articles incorporant cette méthode |
| EP0516529A2 (fr) * | 1991-05-28 | 1992-12-02 | Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. | Détection des anticorps spécifiques |
| WO1993024839A1 (fr) * | 1992-05-27 | 1993-12-09 | The National Blood Authority | Detection immunologique en phase solide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2760093B1 (fr) | 1999-05-14 |
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